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8/17/2019 Pruebas Rápidas Para La Obtención de Microorganismos
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PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA OBTENCIÓN DEMICROORGANISMOS
INTRODUCCIÓN
Una de la tareas fundamentales del laboratorio de microbiología
es la aplicaciónde una metodología precisa que permita la
identificación de los microorganismoscon el objetivo de identificar
el agente etiológico responsable del procesoinfeccioso y para
conocer las implicaciones patológicas, la evolución clínica,
yaplicar una terapia antimicrobiana eficaz, un pilar fundamental en
la práctica de lamicrobiología clínica lo constituye la asignación
de especie a un aislamientomicrobiano.
Las pruebas bioquímicas se emplean para identificar de forma
clara yprecisa, la presencia o ausencia de una enzima, de un grupo
de enzimas, o deuna vía metabólica completa en uno o más
microorganismos.
MÉTODOS FENOTÍPICOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por
medio de mtodosconvencionales, basados en las características
fenotípicas, puesto que surealización y coste los !ace más
asequibles. Los mtodos genotípicos suelenreservarse para las
bacterias que no se pueden identificar con
mtodosconvencionales.
CARACTERISTICAS DE UN MÉTODO RÁPIDO/AUTOMATIZADO IDEAL
• "reciso• #ápido y productivo• $conómico• Aceptable•
#ealización simple• $ntrenamiento
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• #eactivos comunes• #eputación de la compa%ía• &uen
servicio tcnico• #equerimientos de espacio y utilidad óptimos
1. IDENTIFICACIÓN
1.1. Caracter!t"ca! #"cr$!c%&"ca!.
$l estudio microscópico en fresco y tras tinción revela la
forma, la manera deagruparse, la estructura de las clulas y su
tama%o. Las tinciones son el primer paso, y ocasionalmente el
'nico, para la identificación bacteriana. Las tincionesmás
utilizadas e imprescindibles son la del azul de metileno y la de
(ram. Latinción de (ram es, a menudo, la primera y 'nica
!erramienta de la que nosservimos para !acer un diagnóstico
provisional en el proceso de identificación dela mayoría de las
bacterias teniendo en cuenta tambin el tipo de muestra y el
diagnóstico presuntivo del proceso infeccioso.
)lasificación en áreas de acuerdo a lo que se busca*
• +istemas para facilitar la toma de muestras• todos para ayudar
al procesamiento de las muestras• +istemas de cuantificación
microbiológica• todos para identificación y cuantificación de
microorganismos• +istemas especiales para análisis de muestras de
aguas, ambientales y• superficies•
+istemas de identificación mediante mtodos moleculares• todos
inmunológicos para detección y-o cuantificación de
microorganismos• tros mtodos misceláneos
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1.'. Caracter!t"ca! #acr$!c%&"ca!
M$r($)$*a
La morfología de las colonias es fundamental en la
identificación preliminar ypara la diferenciación de los
microorganismos. "ara la observación morfológicaes preferible
e/aminar colonias de cultivos frescos crecidas en medios
noselectivos. $n este paso de la identificación es muy importante
el aislamiento
de las bacterias en cultivo puro ya que esta debería estar
compuesta por unsolo tipo de microorganismos y procedería de una
'nica clula. Las colonias deuna 0nica especie, cuando crecen en
medios específicos y bajo condicionesidóneas se describen por sus 1
características de tama%o, forma, consistencia,y a veces por su
color. $l tama%o de las colonias bacterianas es
generalmenteuniforme entre una misma especie. "or ejemplo, las
colonias de estreptococostienen un tama%o más peque%o que las de
los estafilococos y lasenterobacterias. La forma esta2 determinada
por los bordes y el grosor de lacolonia. $l borde puede ser liso o
rugoso e irregular3 la colonia, abultada oplana. La te/tura de la
colonia es tambin importante. "uede variar desde seca
a viscosa, con superficie lisa o granular. Algunos
microorganismos producenuna colonia pigmentada, lo que puede ser de
ayuda en el proceso deidentificación 4ejemplo* "seudomonas
aeruginosa 4pigmento verde5, +erratiamarcescens 4pigmento rojo5
aunque en una misma especie puede !aber cepasno pigmentadas.
+e#$)"!"!
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Algunas bacterias producen !emolisinas que causan la lisis
de los !emat6es enmedios que contienen sangre. $sta !emólisis puede
ser beta 4zona claraalrededor de la colonia5 o alfa 4!alo de color
verdoso alrededor de la colonia5.
C,)t"-$
edios de cultivo. $n los medios de cultivo las bacterias se
multiplican y esnecesario esperar al menos 789:; !oras para
visualizarlas. $n trminosgenerales todas las bacterias tienen unos
requerimientos nutricionalesimprescindibles para su
crecimiento.
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• +"2r%)"!"! 2e) 8"&,rat$. @emuestra la capacidad de algunas
bacterias para!idrolizar el !ipurato de sodio ácido benzoico y
glicina por la acción de laenzima !ipuricasa. )omo indicador de la
reacción se utiliza nin!idrina. $staprueba se utiliza en la
identificación de Campylobacter jejuni, Listeriamonocytogenes,
Gardnerella vaginalis y Streptococcus agalactiae.
• 9:*a)act$!"2a!a ;ONPG
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• I2$). ediante esta prueba se detecta la liberación de
indol en un cultivobacteriano. @ic!a liberación se debe a la
degradación del aminoácidotriptófano mediante el enzima
triptofanasa.
Pr,ea! )eta!3 c$ )ect,ra 2e 1> a ?>8
• Ó5"2$:Fer#etac"%. ediante esta prueba se va a determinar si
lautilización de los !idratos de carbono por parte de un
microorganismo serealiza por vía o/idativa 4proceso aeróbico,
presencia de o/ígeno5 o por víafermentativa 4proceso anaeróbico,
ausencia de o/ígeno5.
• Re2,cc"% 2e "trat$!. +irve para determinar la capacidad
de unorganismo de reducir el nitrato en nitritos. +e utiliza para
asignar bacterias ala familia $nterobacteriaceae, en la
diferenciación de ora/ella catarr!alisdel gnero
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c. "roducción de ácido sulf!6drico 4+B:5. $l medio de Hligler
contiene como!idratos de carbono la glucosa y la lactosa. $/iste
otro medio, el triplesugar iron 4=+I5 que posee un tercer !idrato
de carbono, la sacarosa.
• Fer#etac"% 2e a0care!. Las bacterias anaerobias o
anaerobias
facultativas a menudo fermentan carbo!idratos ácidos orgánicos y
gas 4B:o ):5. $stos pueden detectarse incluyendo en el medio un
indicador depB.
• +"2r%)"!"! 2e )a e!c,)"a. Bay microorganismos con
capacidad de!idrolizar la esculina en esculetina y glucosa. La
esculetina reacciona conuna sal de !ierro para formar un compuesto
casta%o oscuro o negro. $lcitrato frrico act'a como indicador de la
!idrolisis de la esculina. +i sea%ade bilis al medio se in!ibe el
crecimiento de la mayoría demicroorganismos del gnero
Streptococcus pero no de la especie
Streptococcus bovis y tampoco in!ibe el crecimiento de
microorganismosde los gneros Enterococcus y Listeria.
• C$a*,)a!a. "ermite determinar la capacidad de coagular el
plasma por laacción de la enzima coagulasa. +e utiliza para
diferenciar S. aureus4coagulasa positivo5 de otras especies de
Staphylococcus. La prueba de lacoagulasa en tubo se puede leer
tras incubación de ;!, pero si es negativadebe incubarse !asta
:;!.
• Fe")a)a"a:2e!a#"a!a. $sta prueba determina la capacidad
de unmicroorganismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en
ácidofenilpir'vico por la actividad enzimática de la fenilalanina
desaminasa, conla consiguiente acidez resultante. $sta actividad
enzimática escaracterística de todas las especies de los gneros
"roteus, "rovidencia yorganella por lo que se utiliza para separar
estos tres gneros de otrosgneros de enterobacterias.
• ADNa!a. +e basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias
para!idrolizar enzimáticamente el A@< produciendo una mezcla de
mono ypolinucleótidos.
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• +"2r%)"!"! 2e )a *e)at"a. $sta prueba muestra la capacidad de
ciertosmicroorganismos para !idrolizar la gelatina a pptidos y
aminoácidos,mediante la acción de enzimas específicas denominadas
gelatinasas.
• De!car$5")a!a!. La descarbo/ilación es un proceso en el cual
lasdescarbo/ilasas atacan el e/tremo carbo/ilo de los aminoácidos,
formandola correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se
ensayan en laidentificación de enterobacterias son arginina, lisina
y ornitina. Ladescarbo/ilación de lisina y ornitina da cadaverina y
putrescina 4diaminas5,mientras que la descarbo/ilación de arginina
da citrulina por acción de unade!idrolasa. $sta prueba se debe
realizar con un tubo control que contieneel medio base sin
aminoácido. )omo la descarbo/ilación es una reacciónanaeróbica, se
debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estril.$l
proceso se produce en dos etapas* por fermentación de la glucosa
se
produce una acidificación del medio 4pB J E,K5, apareciendo
color amarillo.La acidificación es necesaria para que ocurra la
descarbo/ilación. $ste0'ltimo proceso da lugar a la formación de
las aminas que elevan el pB conel consiguiente viraje del indicador
a color violeta. $sta prueba se utilizatanto en la identificación
de bacilos gramnegativos como de bacilos y cocosgrampositivos.
• L"&a!a. +e basa en la capacidad que tienen ciertas
bacterias dedescomponer las grasas en ácidos grasos y glicerol, por
acción de laenzima lipasa.
• Lec"t"a!a. La prueba de la lecitinasa pone de manifiesto
la producción dedic!a enzima por determinados microorganismos,
capaces de actuar sobrela lecitina, sustancia orgánica nitrogenada
y fosfatada, contenidaprincipalmente en la yema de !uevo.
• Ut")"0ac"% 2e c"trat$. $sta prueba sirve para determinar si
unmicroorganismo es capaz de utilizar citrato como 'nica fuente de
carbono y
compuestos amoniacales como 'nica fuente de nitrógeno en
sumetabolismo, provocando una alcalinización del medio. $ntre
lasenterobacterias estas características se dan en los siguientes
gneros*Enterobacter , %lebsiella, Serratia,
Citrobacter y algunas especies de+almonella. +in
embargo, Escherichia, Shigella, &ersinia, Salmonella
typhi ySalmonella paratyphi son incapaces de
crecer utilizando citrato como 0nicafuente de carbono.
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• Ut")"0ac"% 2e #a)$at$. "one de manifiesto la capacidad que
poseendeterminadas bacterias de utilizar el malonato de sodio como
'nica fuentede carbono, con la consiguiente liberación del catión,
que en presencia deiones agua produce alcalinidad. +olamente los
microorganismos que
pueden usar simultáneamente malonato de sodio como fuente de
carbono ysulfato de amonio como fuente de nitrógeno son capaces de
ejercer unaacción tampón produciendo !idró/ido de sodio. $l aumento
de la alcalinidadresultante !ace que el azul de bromotimol cambie
de verde a azul. Losmicroorganismos malonato negativos que
fermentan glucosa !acen que elindicador cambie de verde a amarillo.
+e utiliza en la diferenciación deespecies entre las
$nterobacteriaceae. La mayoría de las especies de$nterobacter y
Hlebsiella utilizan malonato de sodio.
•
Pr,ea 2e CAMP. +irve principalmente para determinar la capacidad
de unmicroorganismo para producir una proteína conocida como factor
)A". Laproteína produce un efecto sinrgico con la 9!emolisina de +.
aureussobre eritrocitos ovinos y bovinos que se observa como un
fenómeno líticoen la intersección de los dos microorganismos cuando
se siembran enpro/imidad. )omo alternativa se puede utilizar el )A"
inverso. $n estaprueba la !emólisis producida por algunos
microorganismos se in!ibe por la9!emolisina de +. aureus 4por
ejemplo, la producción de fosfolipasa @ de
Arcanobacterium !aemolyticum o la fosfolipasa $ de
#!odococcus spp.5
Pr,ea! a!a2a! e )a re!"!tec"a a c"erta! !,!tac"a!
• O&t$,"a. $l clor!idrato de etil!idro/icupre6na
4optoquina5 in!ibe a muybaja concentración 41 g-ml o menos5 el
crecimiento de +. pneumoniae,mientras que no afecta al crecimiento
de otros +treptococcus alfa9!emolíticos.
• Bac"trac"a. $sta prueba puede utilizarse como diagnóstico
presuntivo enla identificación de +treptococcus beta !emolítico del
grupo A de Lancefield,ya que, a diferencia de la mayoría de los
estreptococos, suelen ser
sensibles a bajas concentraciones de bacitracina.
• S$),")"2a2 e ")"!. +e basa en la capacidad de
determinadas especiesbacterianas de lisarse en presencia de sales
biliares, las más utilizadas delas cuales son el taurocolato y el
deso/icolato de sodio. Ambas provocan undescenso de la tensión
superficial, que, unido a la actuación de enzimas
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autolíticos, destruyen la clula. $l efecto de esta enzima
autolítica se ponede manifiesto sobre colonias de +. pneumoniae
crecidas en medios sólidos,en las que se aprecia una umbilicación
central, y tambin en coloniasmucoides.
• Crec"#"et$ e ca)2$ 8"&er!a)"$. @etermina la
capacidad de algunosmicroorganismos de desarrollarse en medios de
cultivo con unaconcentración de cloruro sódico del E,1M.
PRUEBAS RAPIDAS PARA LA DETECCION DE MICROORGANISMOS EN LA
LEC+E
I#,$e!a$!
La prueba de inmunoensayo se basa en una interacción de
antígenos yanticuerpos que pueden ser visualizada por aglutinación
o formación de grumos,desarrollo de colores a partir de sustratos
cromogticos, formación de unainmunobanda o fluorescencia. $l test
de $LI+A para detectar +almonella y Listeriase desarrolló sobre los
a%os 8K, este test emplea micro $LI+A acompa%ada de Acmonoclonales
para +almonella o Listeria. $n estudios efectuados sobre las
muestras contaminadas artificialmente con +almonella, para
evaluar Nit de $LI+Acon el mtodo convencional no se encontraron
diferencias significativas ni en susensibilidad ni especificidad.
4Oune, 7PP:5.
A*),t"ac"% Late5
$ste es el mtodo más simple de los Inmunoensayos desarrollados
recientemente.$l test usa partículas de "olietileno late/ las
cuales contactan con el anticuerpo.$n presencia deantígenos en la
muestra, la reacción se verifica despus de laincubación, si no
e/iste antígenos las partículas late/ formaran un
sedimento4#eybroecN, 7PPE5.
I#,$ c$te$ #a*t"c$
Un nuevo enfoque para facilitar la inmunocaptura de antígeno en
muestras dealimentos lo constituye el Inmuno conteo magntico. $n
este mtodo, una muestrade alimento se liga con un contador
ferrometálico cubierto en plástico con losanticuerpos 4Ac5
específicos para el . patógeno, despus de un período deincubación
para que permita la inmunocaptura, el material no unido al
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inmunoconteo puede ser rápidamente eliminado mediante fuerza
magntica. @ostest para detectar Listerias !an sido ensayado y los
mismos no requieren períodosde preenriquecimiento, el mtodo !a sido
capaz de detectar una Listeria enmuestras que contienen Q7/7K ;
ufc-mL banales. La sensibilidad se mantuvo por debajo de 7K;
para Listerias totales y K.E ufc-g para la L.monocitogenes
4OacNson
et al, 7PP:5.Reacc"% e0"#6t"ca e ca2ea c$ I#,$e!a$
(),$re!cete.
Los 'ltimos avances en la detección rápida de patógenos en los
alimentos fueintroducida en 7PP:, es una versión de la tecnología
$LI+A que emplea medidafluorescente como indicador de reacción
positiva. )on esta tcnica se !anensayado sistemas de
inmunodiagnóstico multiparamtrico para la deteccióndirecta de
antígeno de +almonella, Listeria, o enteroto/inas en los alimentos.
$lsistema emplea un receptáculo de fase sólida, una pipeta
revestida conanticuerpos en su superficie interior para ayudar a la
captura del antígeno
específico, además cuenta con un esquema especialmente dise%ado
para ello,conteniendo todos los reactivos predispensados que son
requeridos para elcontraste. A diferencia del protocolo de $LI+A el
Inmunocontraste fluorescente encadena enzimática es completamente
automatizado y no requiere ningunamanipulación manual 4>asavada,
7PPF5.
+"r"2ac"% 2e )$! Ác"2$! N,c)e"c$!.
La tcnica de !ibridación de Rcidos
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$l ")# es una tcnica utilizada para amplificar un segmento de
@
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"uede ser*
@irecta* intervienen antígenos o anticuerpos que forman parte de
maneranatural de una partícula de mayor tama%o
Indirecta* los antígenos o los anticuerpos se adsorben de
forma artificial a
una partícula, por ejemplo, una partícula de láte/.ELISA
Acrónimo del ingls $nzyme9LinNed Immuno+orbent Assay,
$nsayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. =cnica de
inmunoensayo en la cual unantígeno inmovilizado se detecta mediante
un anticuerpo enlazado a una enzimacapaz de generar un producto
detectable como cambio de color o alg'n otro tipo.
Se&arac"% "#,$#a*t"ca ;IMS<
Berramienta de laboratorio eficaz que puede aislar las clulas de
fluidoscorporales o clulas cultivadas.
+e utiliza como un mtodo de cuantificación de la patogenicidad
de los alimentos.
Los anticuerpos revestidos de perlas paramagnticas se unen a los
antígenospresentes en la superficie de clulas así captura las
clulas y facilita laconcentración de estas a las perlas
adjuntas.
$l proceso de concentración es creado por un imán colocado en el
lado del tubo
de ensayo llevando las perlas a la misma.
Reacc"% e ca2ea 2e )a &$)"#era!a ;PCR<
=cnica de laboratorio utilizada para amplificar secuencias de
A@
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FILM +IDRATABLE4 FILM M
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SISTEMA SIMPLATE 4 BIOCONTROL MICROBIOLOGICO
SISTEMAS BASADOS EN ATP
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CONCLUSIÓN
$n sentido general los mtodos rápidos e/puestos presentan una
serie deaspectos en com'n*
• Sáciles de automatizar• "oseen una alta sensibilidad• +on
mtodos simples
+e pueden obtener lecturas no destructibles
B")"$*ra(a4
• Sernández, A. (arcia.).+az, O W >aldezate, +. 4:K7K5.
etodos de
identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología.
ayo 7:, :K7E,de seimc +itio
Xeb*!ttps*--XXX.seimc.org-contenidos-documentoscientificos-procedimientosmicrobiologia-seimc9procedimientomicrobiologiaFT.pdf .
• #edvet. 4:KKE5. todos de ensayos rápidos de detección
demicroorganismos en la lec!e. ayo KT, :K7E. +itio
Xeb*!ttp*--XXX.veterinaria.org-revistas-redvet-nKTKTKE-KTKEKF.pdf
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdfhttps://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdfhttp://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdfhttp://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdfhttps://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdfhttps://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf
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