PUNTO ISOELECTRICO DE AMINOCIDOS Y PROTENAS Alvaro Rueda 4-772-1613 Bolvar Chen 4-773-587 Krisly Snchez 4-771-654

Facultad de Medicina, Escuela de Medicina BIOQUMICA

OBJETIVOS:

Determinar los pKa de un aminocido y utilizarlo como punto de referencia para determinar su punto isoelctrico.

Establecer la importancia del punto isoelctrico de las protenas en el desarrollo de procesos fisiolgicos en nuestro cuerpo.

Determinar el punto isoelctrico de una protena mediante la tcnica de precipitacin.

Determinar la importancia de algunos aminocidos y protenas como sustancias amortiguadoras. MARCO TERICO: Aunque la mayora de los grupos carboxilo y grupos amnicos de los aminocidos se bloquean cuando estos se unen para formar las uniones peptdicas, siempre quedan libres algunos de estos grupos, ya sea en los extremos de las cadenas polipeptdicas, o en las cadenas laterales de los aminocidos cidos y bsicos. La disociacin de los grupos ionizables que estn presentes en las protenas, ocurre como en el caso de los grupos ionizables de los aminocidos individuales, y es gobernada por el pH del medio en el que se encuentra la protena. A pH 7,0 o en valores cercanos a esta condicin, que son los habituales en la mayora de la clulas, los grupos carboxilo de los cidos asprtico y glutmico se encuentran en sus formas bsicas cargadas negativamente, mientras que los aminocidos lisina y arginina estn presentes en sus formas acdicas, cargadas positivamente. La contribucin de los grupos sulfhdrico de la cistena y fenlico de la tirosina, es mnimo; por ejemplo el grupo fenlico de la tirosina se encuentra ionizado en un 0,1 %. La carga total de la molcula proteica depende pues, del pH de la solucin y del nmero relativo de cada aminocido en la molcula. As cuando el pH de la solucin es tal que la carga neta de la molcula proteica es cero, es decir, cuando el nmero total de cargas positivas presentes en la molcula iguala al nmero de cargas negativas, se llama a este valor de pH, punto isoelctrico o pH isoelctrico de la protena. (Bioquimica, Antonio Pea, Limusa 2004) MATERIALES

Descripcin Capacidad Cantidad

Bureta 25 mL 1

Soporte - 1

Pinzas de bureta - 1

Vasos qumicos 250y 500 mL 2

Pipeta 25 mL 1

Potencimetro de pH

- 1

REACTIVOS

Descripcin Frmula Concentracin

Cantidad Toxicidad Propiedades fisicoqumicas

cido Glutmico

C5H504 0.5% 25 mL No txica Pertenece al grupo de los llamados aminocidos cidos, o con carga negativa a pH fisiolgico, debido a su segundo grupo carboxlico en su cadena secundaria

Lisina C6H14N2O2 0.5% 25 mL No txica Acta como neurotransmisor inhibidor en el central. Utilizada -in vitro- como medio gstrico, en solucin 0.4M, amortiguada al pH estomacal para determinar bioaccesibilidad

cido clorhdrico

HCl 2% 7 mL Irritante, provoca quemaduras

Disolucin acuosa del gas cloruro de hidrgeno (HCl). Es muy corrosivo y cido. Punto de ebullicin de 48C; lquido incoloro o amarillento.

Hidrxido de sodio

NaOH 0.2 M 44 mL Irritante Slido blanco cristalino sin olor que absorbe humedad del aire. Corrosivo, se usa para fabricar jabones, rayn, papel, explosivos, pinturas y productos de petrleo

Leche - 50 mL No txica Est compuesta principalmente por agua, materia grasa, protenas, hidratos de carbono (lactosa), calcio, minerales y sal

Etanol C2H5OH 95% 50 mL Txico Lquido incoloro, con punto de ebullicin a 100C y punto de congelacin de 0C.

PROCEDIMIENTO

1. TITULACIN DE AMINOCIDOS

2. DETERMINACIN DEL PH DE LA CESENA DE LA LECHE

RESULTADOS 1. Titulacin de aminocidos

1.1 Lisina 1.2 Acido Glutmico

Volumen NaOH (mL)

Norma-lidad

mEq= (v (mL))(N)

pH Volumen NaOH (mL)

Norma-lidad

mEq= (v (mL))(N)

pH

0 0.2 0.00 2.2 0 0.2 0.00 3

1 0.2 0.20 2.2 1 0.2 0.20 3.4

2 0.2 0.40 2.2 2 0.2 0.40 3.5

3 0.2 0.60 2.2 3 0.2 0.60 3.9

4 0.2 0.80 2.2 4 0.2 0.80 4.2

5 0.2 1.00 2.3 5 0.2 1.00 4.4

6 0.2 1.20 2.4 6 0.2 1.20 4.7

7 0.2 1.40 2.4 7 0.2 1.40 5.1

8 0.2 1.60 2.5 8 0.2 1.60 8.1

9 0.2 1.80 3.1 9 0.2 1.80 9.3

10 0.2 2.00 9.7 10 0.2 2.00 9.9

Colocar 25 mL de solucin de Lisina

en vaso quimico de 250 mL

Titular con NaOH al 2 M 1 mL cada vez.

Medir el pH con un potenciometro hasta

alcanzar 10

Repetir el procedimiento con

una solucin de cido glutmico.

Graficar los resultados.

Diluir 50 mL de leche en 150 mL de agua en un

vaso qumico de 500 mL

Titular con HCl al 2% hasta

obtener un pH de 4.8

Graficar los resultados.

11 0.2 2.20 11.7 11 0.2 2.20 10.4

12 0.2 2.40 12.3 12 0.2 2.40 10.8

13 0.2 2.60 12.5 13 0.2 2.60 11.5

14 0.2 2.80 12.7 14 0.2 2.80 12.2

15 0.2 3.00 12.9 15 0.2 3.00 12.5

16 0.2 3.20 12.9 16 0.2 3.20 12.8

17 0.2 3.40 13.0 17 0.2 3.40 12.9

18 0.2 3.60 13.1 18 0.2 3.60 12.9

19 0.2 3.80 13.1 19 0.2 3.80 13.0

20 0.2 4.00 13.1 20 0.2 4.00 13.0

21 0.2 4.20 13.1 21 0.2 4.20 13.0

22 0,2 4.40 13.1

23 0,2 4.60 13.1

ACIDO GLUTMICO

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 2 3 4 5

pH

mEq de NaOH

pH vs mEq

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 2 3 4 5

pH

mEq de NaOH

pH vs mEq

LISINA

LISINA ACIDO GLUTAMICO

= +

= , + ,

= ,

= ,

= +

= . + ,

= .

= .

= +

= +

=

=

= +

= +

=

=

Determinacin de pI de la casena de la leche

HCl al 2% / Ml pH

0 6.5

1 6.6

2 6.3

3 6.1

4 5.5

5 5.3

6 5.2

7 4.8

DISCUSION Al graficar el pH obtenido al agregar cierto mEq de NaOH a un volumen de aminocido en este caso lisina y acido glutmico, se puedo observar que ambas curvas iniciaban con un lento ascenso, seguido por un rpido y un lento y estacionario ascenso finalmente. A pH bajos, todos los grupos del

aminocido estn en su forma protonada, de forma que la carga neta del aminocido es de signo positivo. A pH altos estos mismos grupos se encuentran en forma de base conjugada, por lo que la carga neta en este caso ser de signo negativo. Entre esta zona y la otra habr un pH en el que la cantidad de carga negativa ser igual a la positiva; llamado punto isoelctrico o pH isoelctrico de la protena, que es una contaste caracterstica de la misma. (Biomleculas, Enrique Battaner Arias,2009). En base a esto podemos decir que la curva de lento crecimiento se debe a la capacidad amortiguadora de ambos aminocidos. Al encontrarse en un pH acido los aminocidos tendrn una carga positiva porque el grupo carboxilo es capaz de aceptar iones H, y el grupo amino queda cargado positivamente. Al agregarse pequeas cantidades de base el grupo amino comienza a despotronarse para unirse a los iones hidroxilo de la base agregada y el aminocido queda cargado negativamente. El punto medio entre los dos puntos de rpido ascenso en la grfica representa el punto isoelctrico. En este punto las cargas positivas y negativas del aminocido son iguales. Los aminocidos que poseen grupos aminos o grupos carboxilos adicionales en sus molculas presentan puntos isoelctricos que reflejan su tendencia a ser protonados o a perder un protn adicional, respectivamente. La lisina tiene tres valores de pKa, pKa: 2,18 para el grupo carboxilo, 8,95 para el grupo alfa amino y 10,53 para el grupo amino del carbono 6, el grupo-amino. El punto isoelctrico de la lisina es 9,74, el grupo -amino de la lisina es ms bsico que el grupo amino en posicin alfa y que, por lo tanto, el zwterion de la lisina tiene protonado el grupo amino del carbono6, la representacin de la variacin de concentracin de distintas formas de la lisina frente al pH muestra de cruce ya que la forma completamente protonado de la lisina posee tres puntos que pueden perder un protn y por lo tanto, tres valores de pKa. El punto isoelctrico de la lisina sugiere que este aminocido debe poseer una carga neta positiva a pH 7, un pH similar al de las clulas. nicamente cuando el pH de la solucin aumenta por encima de 9,74 la mayora de las molculas de lisina se convertirn en la forma zwitterinica y no tendrn carga neta. El cido glutmico posee un punto isoelctrico de 3,2. El grupo carboxlico en el carbono 4 es similar a un grupo carboxlico aliftico y tiene un pKa de 4,25. El otro grupo carboxlico aliftico tiene un pKa de 2,19 y el grupo amino protonado un pKa de 9,67 (Qumica Orgnica: Estructura y Reactividad, Volumen 2, Seyhan Ege, pg. 1201-1202) En el cuadro de la determinacin del pI de la casena se aprecia las variaciones de pH de la casena a medida que se le adicionaban 1,0 mL de HCl 2%. Partimos de un pH de 6.5; adicionamos 7 mL de, HCl 2% para que se diera la formacin de la casena llegando a un pH de 4.80. El pH en el que precipitan las protenas de la leche (casena) es el punto isoelctrico (pI), en este caso nuestro valor de pI (experimental) es de 4.80, consultando encontramos el valor de pI (terico) corresponde a 4.60 para la leche, nuestro valor es muy cercano al terico, de diferencia solo tenemos 0.20. Este resultado cercano se puede deber a posibles errores en la titulacin, o bien diferentes propiedades en la leche, como la marca la cual pudo haber influido debido a que a veces no se conservan las mismas concentraciones proteicas en las diferentes marcas de la leche, y tienden a variar un poco en la CONCLUSIONES

El pKa es la fuerza que tienen las molculas de disociarse, un cido ser ms fuerte cuanto menor es su pKa y en una base ocurre al revs, siendo ms fuerte cuanto mayor es su pKa.. Las curva de titulacin nos permiti determinar el pKa, y por medio de este, el punto isoelctrico del aminocido lisina y acido glutmico. El conocer el comportamiento cido-base de los aminocidos es de vital importancia para realizar este procedimiento.

El pH en el que precipitan las protenas se denomina punto isoelctrico (pI), ya que se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de 0 y la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada ya que la partculas se agregan produciendo una menor solubilidad.

Mediante la titulacin con cido clorhdrico logramos alcanzar el punto isoelctrico de la casena donde es menos solubles, en base a esa menor solubilidad, la casena se precipita y se puede aislar, que en la experiencia el pl fue en un pH de 4.8, en este punto la casena se separa del resto de los componentes de la muestra de leche formando un precipitado. Se utiliza alcohol

para el lavado posterior del precipitado de la protena obtenida, debido a que la casena es insoluble en l alcohol y adems el alcohol remueve la grasa de la leche, eliminando las impurezas del que pueda contener la muestra de casena.

BIBLIOGRAFIA

Antonio Pea, Bioqumica, editorial Limusa (2004), 157 pag.

Qumica Orgnica: Estructura y Reactividad, Volumen 2, Seyhan Ege, pg. 1201-1202

Brown, T. LcMay, H. Bursten, B. Murphy, 2009; Qumica La Ciencia Central, decimotercera edicin. Pearson Educacin

Punto isoelctrico, publicado por Dapne (11,2011), recuperado el 15 de abril de 2014 en http://biokimik2011.blogspot.com/2011/09/separacion-y-cuantificacion-de.html CUESTIONARIO

1. Por qu no se alcanza el pH 1 con HCl 0.1M en las soluciones en las que se prepararon de aminocidos?

Las protenas son buenos amortiguadores por que los aminocidos que lo constituyen se comportan como cidos dbiles .El gasto realizado con HCl al titular se deduce que mientras ms estabilizada y estructurada esta la protena mayor cantidad de volumen se requiere para lograr varia el pH de la solucin cumpliendo as la propiedad amortiguadora que poseen las protenas. En cambio cuando se desnaturaliza la protena el gasto de HCl es mucho menor debido a que no alcanza mantener el pH constante. Como la concentracin de cido clorhdrico es de 0.1M, no se logra alcanzar un pH 1 debido a la estabilidad de los aminocidos y a la baja concentracin del cido clorhdrico.

2. Compare los puntos isoelctricos de la glicina y los pptidos glicil-glicina y glicil-glicil-glicina? Que concluye sobre estos resultados:

Glicina

= . + .

= .

La glicina es un aminocido no esencial, lo que significa que tiene igual cantidades de grupo amino como cido, al formar enlaces glicina-glicina, se forma una macromolcula por perdida de agua y su valor de pI no se altera bruscamente debido a que es el aminocido ms pequeo y neutro

3. Porque las molculas con grupos ionizables se hacen menos solubles en el punto isoelctrico?

Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese pH. Las molculas se hacen menos solubles en el punto isoelctrico debido a que el punto isoelctrico representa el equilibrio de las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de cero y la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada ya que las partculas se agregan.

4. En la precipitacin de la casena, qu pasara si se aade muy rpido el cido y si se alcanza un pH ms bajo de 4.8. Qu se debe hacer en este caso?

Si se le aade cido muy rpido y se alcanza un pH ms bajo de 4.8, la casena se vuelve nuevamente soluble en este medio y desaparecera el precipitado. En este caso se deben aadir una solucin de pH bsico para compensar la disminucin de pH o tambin se le aade ms leche para disminuir la solucin cida.

5. Por qu es necesario lavar la casena precipitada con alcohol (etanol 95%) y ter? La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los disolvente orgnicos intercambian con el interior hidrofbico de la protena, y desorganizan la estructura terciaria provocando su desnaturalizacin y precipitacin.