http://chemistry.armstrong.edu/nivens/chem3801/SizeExclusionChromatography.htm

a cromatografía de exclusión por tamaño (filtración en gel Chromatography)

Para obtener más información, consulte: Capítulo 4 en Garett y Grisham oSwitzer y Garrity, Experimental Bioquímica, 3ª ed WH Freeman and Co. 1999Fondo:SEC es una técnica analítica preparativa, no destructivo que permite la separación de las moléculas por su tamaño.   Esto es especialmente útil en la purificación de proteínas, porque si bien puede haber muchas proteínas en una muestra, sus pesos moleculares pueden variar ampliamente.   Esto permite separar una mezcla de proteínas en base a esta distribución de tamaño amplia.   También proporciona un procedimiento simple para la eliminación de sal (desalación) a partir de una muestra de proteína.  Moléculas más pequeñas que el límite de exclusión del material de gel se quedan atrapados en las perlas de gel.   Los de peso molecular mayor que no será atrapado pero fluirá a través del gel.   Las moléculas más grandes son retrasados sólo por su forma y su facilidad de pasar por las perlas.   De este modo, las moléculas más grandes eluyen primero, mientras que las moléculas más pequeñas se mantienen más tiempo en el interior de los granos y eluyen pasado.

Gel de selección es muy importante.   Los geles se hacen típicamente de dextrano (Sephadex), agarosa (Sepharose) o poliacrilamida (Bio-Gel).   Algunos geles, tales como Spehadex G-10, retienen sólo las moléculas de 0-700 daltons, mientras que otros, tales como Sephadex G-200 retienen moléculas de 5000-600000 daltons.  Además de la separación de una mezcla de proteínas basado en el tamaño, cromatografía de filtración en gel también permite estimar el peso molecular de una proteína globular desconocido.   En primer lugar, la columna debe ser calibrado.   Para calibrar la columna, se mide el "volumen vacío" V o de la columna, es decir, el volumen de líquido recogido desde el minuto que la muestra se aplica a la columna hasta que una molécula no retenida se eluyó de la columna

(típicamente un gran, teñidos azúcar tal como azul de dextrano con un peso molecular de 2x10 6 daltons).   Esto representa el volumen de esa molécula no retenida experimentó en sus viajes a través de la columna.   Cada molécula experimentará este volumen, ya sea retenido o no.   Este valor debe medirse cada vez que una columna de SEC se prepara y se usa porque es única para cada columna (basado en la densidad de empaquetamiento, composición de gel, longitud, etc.).  En segundo lugar, una serie de proteínas estándar de peso molecular conocido se aplica a la columna y el volumen al que se registra cada proteína se eluye estándar.   Esto le da V r, el volumen de elución.  Una parcela de peso molecular de la proteína V vs. r / V o da una curva de calibración para la columna.   Esto lleva tiempo y los datos para la curva de calibración es única para solamente esa columna. Sin embargo, esta es la manera más precisa para obtener los datos de su columna de SEC.Con el fin de comparar los datos entre las columnas, se utiliza un volumen de elución relativo.   Recordemos que K d, la constante de distribución se describe cómo se distribuye la proteína entre las dos fases: 

En SEC, esta relación se puede expresar como una relación de tiempos de retención o volúmenes de retención (ver su libro de análisis cuantitativo, capítulo sobre métodos cromatográficos para las derivaciones).

Donde V r es el volumen de retención de la proteína, o V es el volumen vacío y V s es el volumen de la fase estacionaria.   El volumen de la fase estacionaria es difícil de calcular con precisión desde las partículas de gel varían en tamaño y volumen en cada lote y la columna.   En lugar de ello, la constante de distribución media se utiliza:

donde V t es el volumen máximo de retención experimentado por una molécula pequeña tal como un ácido amino tinte etiquetado.   Esta es una aproximación del volumen de la fase estacionaria en la columna.   Valores de K avg se han determinado por un número de geles y por un número de proteínas.   Esto permite comparar valores de K avg a través de diferentes columnas y diferentes experimentos.  Uno también puede gráfico log MW vs. K d para obtener una estimación del peso molecular de una proteína.   Recuerde, esto no es tan preciso como hacer una calibración de la columna completa.   Hay que tener cuidado en

la interpretación de estos resultados.   SEC separaciones están influenciadas por la forma proteínas, así como la fuerza iónica.En este experimento, se determinará el volumen vacío (V o) y el volumen total (V t) de su columna de SEC.   A continuación, ejecutar una curva de calibración de la columna de la SEC por la separación de una mezcla de tres proteínas patrón de pesos moleculares conocidos.   A partir de su volumen de elución podrá determinar su K promedio.   Por último, tendrá que ejecutar una muestra de proteína desconocida y determinar su K peso promedio y molecular.¿Cómo sabemos que cuando una proteína se eluye de la columna?En el caso de azul de dextrano y el colorante marcado de aminoácidos (cualquier aminoácido DNP), las moléculas son de color azul o amarillo, respectivamente, y uno puede verlos eluyen de la columna visualmente.   Sin embargo, la mayoría de las proteínas no presentan un color visual (proteínas que contienen los hemos, como -c citocromo o mioglobina será rojo).   En su lugar, que absorben a 280 nm con un coeficiente de extinción que se relaciona con el número de aminoácidos aromáticos en la proteína (recordar sus tres aminoácidos aromáticos?).   Como recoja fracciones, tendrá que supervisar cada fracción en el UV-VIS a 280 nm.   A continuación, debe trazar Abs. vs. volumen para determinar dónde se eluyen las proteínas, sobre la base de un aumento en la absorbancia a 280 nm.Procedimiento: Día 1

1.)     Va a preparar su columna la semana antes del comienzo del laboratorio como el gel necesita tiempo para asentarse.

2.)     Obtener el gel SEC (G-100) de su instructor.   Es ya estará empapando en 0,05 M pH 7 tampón Tris-HCl con 0,1 M NaCl.   Esto permite que los granos se hinchen a su tamaño completo antes de verter.

3.)     Obtener una columna de su instructor y el enchufe de la parte inferior con lana de vidrio.  

4.)     Cierre la llave de paso.   Agitar el gel en el erlenmeyer y se vierte por una varilla de vidrio.   Es MUY MUY MUY importante que no queden burbujas de aire atrapadas en su ser la columna (¿por qué?).   Si usted tiene una burbuja de aire, coloque parafina en la parte superior de la columna, eliminar la columna del soporte.   Invierta la columna varias veces para redispersar el gel y luego permitir a reasentar.   Si la burbuja de aire está en la parte superior de la columna, usted puede ser capaz de eliminar con su varilla de vidrio.

5.)     Vierta la columna de al menos 30-40 cm de altura.6.)     Abra la llave de paso y permitir que el tampón para tirar por la columna

hasta justo por encima del nivel del gel.7.)     Cierre la llave de paso. Cubra la parte superior con parrafilm y coloque

en el refrigerador hasta la semana siguiente.Determinación del volumen de hueco (V o) y el volumen total (V t). Dia 2

1.)     Retire la columna de la nevera y fijarlo al soporte en una abrazadera bureta.

2.)     Obtener 250  L de cada uno de azul de dextrano y ácido DNP-amino en tampón fosfato.

3.)     Mezclar las dos muestras para dar un volumen total de 0,5 ml.4.)     No deje que el DRY RUN COLUMNA.   Asegúrese de que el nivel de la

memoria intermedia en la parte superior de la columna es muy cerca del nivel superior del gel.   Si no, drenar el tampón hasta que alcanza la parte superior del gel.

5.)     Utilizando una pipeta Pasteur de largo, añadir la muestra de 0,5 ml a la parte superior del gel con la llave de paso cerrada.   No molestar el gel en la parte superior de la columna.

6.)     Coloque un cilindro graduado debajo de la llave de paso.   Abra la llave de paso y dejar que la muestra se mueva en la columna.   Cierre la llave de paso.  

7.)     Aplicar 1 ml de tampón a la parte superior de la columna.8.)     Escurrir en el cilindro graduado.9.)     Añadir 5-10 ml de tampón a la parte superior de la columna y de drenaje

en el cilindro graduado.  10.) Continuar la recogida de volumen en un cilindro graduado hasta que la

primera aparición del color azul (de azul de dextrano) se ve para eluir de la columna.   Anote este volumen total con la mayor precisión posible (V o).

11.) Recoge todo el azul de dextrano en el cilindro graduado.   Recuerde que debe mantener el llenado del búfer en la parte superior de la columna con cuidado-no molestar el nivel de la columna)

12.) Después de todo el azul de dextrano es pasado, registrar el volumen total en este punto.

13.) En un nuevo cilindro graduado, recoger volumen desde el momento en que el azul de dextrano se detiene hasta que el ácido DNP-amino amarilla eluye.   Anote este volumen.   Escurrir la columna hasta que se haya eliminado todo dextrano amarilla.   V t es el volumen total recaudado (azul dextrano más ácido-DNP amino).

14.) Cierre la llave de paso.Normas (Obtención V r 's y K d' s):1.)     Obtener una mezcla de dos estándares de proteína.   Anote el nombre de

las normas y su peso molecular.   (mioglobina en 16.500 y albúmina de suero bovino al 67 000)

2.)     Su orden de elución será de mayor a menor.   Las proteínas fueron elegidos para tratar de cubrir el rango de exclusión por tamaño del gel que estamos utilizando.

3.)     Aplicar 1 ml de la norma a la parte superior de la columna, de nuevo, teniendo cuidado de no alterar demasiado la parte superior de la columna.  

4.)     Permita que la muestra migre a la columna mediante la apertura de la llave de paso.   El volumen de elución se puede recoger en un cilindro graduado hasta hasta 1 ml antes de la V o determinado en la Parte 1.

5.)     Añadir 1 ml de tampón y recoger el eluido.6.)     Añadir 5.10 ml a la vez a la parte superior de la columna, teniendo

cuidado de que no se seque!7.)     Recoger el eluido en 1 ml marcó tubos de ensayo a partir del 1 ml antes

de la V o.  8.)     Continuar recogiendo fracciones hasta que reacciona V t.

9.)     Analice sus fracciones en el UV-VIS.   Asegúrese de ejecutar un espacio en blanco de la memoria intermedia a 280 nm.  

Ejecutar la proteína desconocida:Análisis:1.)       Absorbancia vs. volumen y determinar el volumen donde cada una de

las tres proteínas estándar eluyó.   Terreno absorbancia vs. volumen para la proteína desconocida para determinar dónde los eluye desconocidos.

2.)     Trazar MW vs. V r / V o para cada proteína (si lo desea, también puede gráfico dextrano azul y aminoácidos DNP).   Ajustar a una línea lineal en Excel y obtener la ecuación de la recta.

3.)     Calcular K promedio y trazar ingrese MW vs. promedio de K para las muestras de proteínas.   Ajustar a una línea lineal.

4.)     Use las ecuaciones de cada parcela para determinar el peso molecular de lo desconocido.

https://www.msu.edu/course/lbs/159h/Chromatography04.pdfMateriales1,5 ml tubos de microcentrífuga (alrededor de 12)microcentrífuga bastidor de tubo de ensayotubos de ensayo para recoger el volumen vacío y ensayos de amilasa ejecutarP1000 y consejos

P50-200 y consejossoporte anillo y abrazaderaramo de hielocolumna Sephacryl-100 preenvasadostampón de columna20 mM de fosfato de potasio, pH 7,0, EDTA 1 mM, 1 mM b mercapto-etanol-100 ml una amilasa-cóctel / normas. (tenga esto en hielo hasta su uso)a-amilasa y normas cóctel: 0,1 mg / ml de vitamina B-12, 0,1 mg / mlcitocromo C, 0,1 mg / ml de azul de dextrano en Tris HCl 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8yodo ácida0.2% (w / v) de almidónTampón fosfato 200 mM, pH 7,0Procedimiento1. Uno de los miembros de cada equipo tendrá que conseguir hielo.2. Número sus tubos de microcentrífuga 1 a 12 y los puso en un estante. Estos serán pararecogida de sus fracciones de la columna.3. Retire con cuidado la tapa superior de la columna; asegúrese de no perturbar el lecho de gel.Colocar la columna en una abrazadera a continuación, comprobar que 1) la columna es vertical, y 2) la pruebabastidor de tubo libremente se puede mover en la columna de tal manera que los tubos pueden coger los goteos(eluyente) de la columna.4. Retire la tapa inferior y deje que el tampón fluya a través de la columna en un vaso de precipitadoshasta que la superficie del líquido es de aproximadamente 1 cm por encima del lecho de gel. Vuelva a colocar la tapa inferior para detenerel flujo de la memoria intermedia.

Nunca deje que el menisco toca la parte superior del lecho de resina! Es muy importante que lacolumna no se le permite llegar a ser seco, contaminado con bolsas de aire o perturbado como esteinterrumpirá la migración a través del gel.Cargando y ejecución de la columna:5. Muy lenta y suavemente puso la punta de su pipetteman través del tampón de columna ycargar cuidadosamente 100 ml (toda la muestra) de a-amilasa / cóctel de serie en la parte superior de lalecho de gel con cuidado de no perturbar el lecho de gel.6. Coloque un tubo de ensayo en la columna y brevemente quitar la tapa inferior sólo el tiemposuficiente para iniciar la migración de la muestra (es decir, justo hasta que la muestra tiene completamenteentrado en la columna). Vuelva a colocar el tapón inferior.7. muy lentamente y suavemente añadir 3 ml de tampón de columna a la columna. Esto se hace mejorañadiendo lentamente la memoria intermedia (un ml a la vez con su pipetteman) a lo largo del lado dela columna justo en la parte superior del menisco. Ahora, retire la tapa inferior y permitir que elcolumna para "correr". Continuar para recoger el eluyente en el tubo de ensayo. Usted comenzará a ver el colornormas separan. Use un pedazo de papel blanco como fondo para ayudar a determinarel color del eluyente gotas.El colorante azul de dextrano no entra en las perlas de gel (es decir, se excluye). Se utiliza paramedir el volumen vacío de la columna (V0), Que es el volumen del eluyente recogidodesde el principio de la carrera hasta que el azul de dextrano comienza a eluir. Guarde este vacíoeluir y luego medir y registrar su volumen.9. Como los eluye dextrano azul, empezar a recoger las fracciones de aproximadamente 200 m l envolumen (alrededor de 5 gotas) en los tubos de microcentrífuga.Junto con la a-amilasa y azul de dextrano, el cóctel contiene el siguiente peso molecular

normas:Hemoglobina68.000 Daltons (D), marrónGFP26900 D emite fluorescencia verde bajo luz UV.El citocromo C 12,400 D, marrón / óxido,La vitamina B-121350 D, rosa.10. Una vez que el B-12 La vitamina ha eluido, puede dejar de recoger 200 ml fracciones. Usarsu pipetteman para medir con precisión el volumen de sus fracciones y registrar losvolúmenes.11. Continuar para ejecutar la columna hasta que el tampón de la columna es de aproximadamente 1 cm por encima del lecho de gel.Vuelva a colocar la tapa inferior y suavemente rematar su columna con 3 ml de tampón de columna comolo hizo anteriormente. Reemplazar suavemente la tapa superior con el fin de no perturbar el lecho de gel. Etiquetar elcolumna con un signo de la utilización de su Sharpie para que podamos saber que se ha utilizado y retornoa la parte delantera del laboratorio.12. Utilice su pipetteman para medir el volumen de cada fracción y luego calcular lavolumen acumulativo (es decir, volumen de huecos (V0) Más el volumen de elución (Ve)) para cada fracción.Más tarde se le trazar el peso molecular registro vs. volumen de elución después de que el volumen de huecoseluye (es decir, el volumen en el que la proteína "viene off" de la columna después de que el azul de dextranoha comenzado a salir de la columna). Es decir, el volumen acumulado de todas las fraccionesdesde el principio del dextrano azul a través de la fracción que contiene el particular,marcador de peso molecular.Usted tendrá que examinar los tubos de fracciones más de la caja de luz UV para determinar quéfracción (s) contiene la GFP. Las otras normas deben ser visibles bajo luz normal.Ensayo para la a-amilasa actividad

Etiquetar un tubo de ensayo de vidrio vacía para cada fracción, también tendrá un tubo inicial ("I"Tubo o control negativo) y un tubo de control positivo ("+").Añadir 500 ml de 200 mM de tampón de fosfato (pH 7,0) a cada tubo.Añadir 500 ml de 0,2% w / v de almidón a cada tubo.

Página 8Repite lo siguiente para cada fracción de la columna. Cada grupo se proporcionará con tampónque contiene amilasa como un control positivo y tampón solo como control negativo.Añadir 50 ml de la fracción que está probando a uno de los tubos de ensayo.Añadir 50 ml de agua al tubo (control negativo) "I"Añadir 50 ml de tampón que contiene amilasa de al tubo "+" (control positivo)Incubar los tubos durante cinco minutosAñadir 500 ml de yodo ácida a cada tubo.Determinar las fracciones que contiene amilasa-visuales. No hay necesidad de utilizarespectrofotómetro (a menos que quiera). ¿Los tubos que contiene amilasa-ser oscuro o¿azul claro?Graba todos los datos en su cuaderno de prácticas, y el gráfico del volumen de elución (Ve) vs.peso molecular de los estándares. Grafique sus datos primero en papel cuadriculado regularesy luego en semi-log papel cuadriculado. A continuación, utilice los gráficos para determinar lapeso molecular de la amilasa. Buena suerteLimpiarEnjuague su cristalería:Tubos de ensayo: ensayos de almidón se puede verter por el desagüe. Retire todas las etiquetas de latubos de ensayo de vidrio. Utilice EtOH en un Kimwipe para eliminar las marcas Sharpie. Para lavar, llenar eltubo hasta la mitad con agua del grifo, agitar y verter un par de veces. Luego enjuagueel tubo de la misma manera con agua destilada dos veces. En este punto, el tubo debeestar libre de color, polvo, etc. Si no es así, consulte a su TA. Devolver los tubos boca abajopara drenar y secar en los bastidores en su estación.

Vasos: Pour eluyente por el desagüe en las campanas de extracción. Enjuague con agua de la llave dos vecesy agua destilada dos veces.Tubos de microcentrífuga, guantes: Coloque en un bote de basura. No son residuos de riesgo biológico.Todo lo demás: dejar a su estación

https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/1/a8656bul.pdf

Descripción del ProductoCromatografía de filtración en gel es un método establecidopara la determinación del tamaño y la masa molecular deproteínas. El fraccionamiento se basa en la difusión demoléculas en los poros de la resina. Proteínas más grandes hacenNo entrar en los poros de la resina con la misma facilidad, pero pasara través del volumen de líquido de la columna más rápidamente queproteínas más pequeñas. Estas moléculas de proteínas eluyen dela columna en orden decreciente de masa molecular.La determinación de la masa molecular de las proteínas desconocidasse hace mediante la comparación de la relación de Ve/ Vopara la proteínaen cuestión a la Ve/ Vode los estándares de proteína de conocidamasa molecular (Ve es el volumen de elución y Vo es el volumen vacío). La Vode una columna dada se basa en lavolumen de efluente requiere para la elución de un granmolécula tal como azul de dextrano (masa molecular de~ 2000 kDa, Número de catálogo D4772). Trazado de lalogaritmos de las masas moleculares conocidas de proteínanormas frente a su respectiva Ve/ Vo valoresproduce una curva de calibración lineal.Ve/ Voes esencialmente independiente del tamaño de la columna yconcentración de proteína, pero puede ser la temperaturadependiente para algunas proteínas. No es fiable molecularmasas se pueden obtener si la proteína forma un complejocon el gel, contiene una gran cantidad de hidratos de carbono,agregados a los complejos más grandes, o disocia ensubunidades en las condiciones utilizadas.1El molecularmasa de una proteína impura puede determinarse usandoeste procedimiento si una prueba de detección específica está disponible parala proteína El procedimiento para determinar las masas moleculares utilizandocromatografía de filtración en gel como se describe en este boletínes una modificación de los métodos publicados.1,2La proteína

normas en este kit pueden ser adecuados para su uso en otrasistemas cromatográficos incluyendo HPLC, aunquealgunos sistemas tampón parecen alterar los volúmenes de eluciónde albúmina (Número de catálogo A8531) y carbónicoanhidrasa (número de catálogo C7025). Las proteínas enel Kit de MWGF200 tienen una gama de masas moleculares12,4 a 200 kDa.ReactivosAproximadoMasa molecular•Citocromo c de corazón de caballo,Número de catálogo C7150, 10 mg / vial12,4 kDa•Anhidrasa carbónica de bovinoeritrocitos, Número de catálogoC7025, 15 mg / vial29 kDa•Albúmina, suero bovino, CatálogoNúmero A8531, 50 mg / vial(Contiene  0,3% ditiotreitol)66 kDa•La alcohol deshidrogenasa de levadura,Número de catálogo A8656, 25 mg / vial150 kDa•β-amilasa de la patata dulce,Número de catálogo A8781, 15 mgproteína / vial (Contiene  15% de NaCl,4% de glucosa, 1% y ditiotreitol)200 kDa•Blue Dextran, Número de catálogoD4772, 50 mg / vial2000 kDaPrecauciones y Descargo de responsabilidadEste producto es para I + D sólo uso, no para las drogas,hogar, u otros usos. Por favor, consultar el material

Hoja de datos de seguridad para obtener información sobre los peligrosy las prácticas de manejo segurolmacenamiento / EstabilidadAlmacene el kit a -20  C.ProcedimientoEl uso de MWGF200 Para Cromatografía de filtración en gelSe recomienda usar - 1. Buffer y Resina50 mM Tris-HCl, pH 7,5, con KCl 100 mM como eltampón de equilibrado con 90 cm  cmSephacryl®S-200-HR (número de catálogo S200HR)columna a 2-8  C. Para obtener información sobre la resinapreparación, relleno de la columna, y el equilibriopóngase en contacto con el Servicio Técnico.2. Volumen Void (Vo) Determinación - Se disuelve el azuldextrano en tampón de equilibrio que contiene 5%glicerol a una concentración de 2 mg / ml. Estaconcentración de azul de dextrano dará una A280 de ~ 1,0 en la fracción pico. El glicerol se añade aaumentar la densidad de la solución, pero su uso esopcional.El volumen de muestra recomendado es de menos del 2%del volumen total de lecho de gel. Aplicar con cuidado el azulmuestra de dextrano a la columna (evitar molestar a lagel de superficie de la cama) para determinar Voy para comprobar relleno de la columna. Inmediatamente después de aplicar elmuestra, comienza la recogida de fracciones de 0,5 a 1,5% deel volumen total lecho de gel. La velocidad de flujo debe ser~ 7% del volumen de columna por hora. Sesgo delbanda de azul de dextrano representa un fallo en la columna,aunque algunos tailing es normal. El pico que llevaindica el volumen vacío. Determinar espectrometríafotométricamente el volumen de elución de azul dextrano(Vo para la columna) a 280 nm o 610 nm pormidiendo el volumen de efluente recogido de lapunto de aplicación de ejemplo para el centro de lapico de efluentes.Notas: Mezcla de dextrano azul con las normas del kit oproteínas de la muestra, no se recomienda ya que muchosproteínas se unen a azul dextrano.Preparar estándares de proteínas y fresca azul dextrano.3

Ocasionalmente puede aparecer un poco de proteína agregada en el volumen vacío.. La elución de volumen (Ve) Determinación de ProteínaNormas - Disolver patrones de proteínas individualesen tampón de equilibrio que contenía 5% de glicerol (VerMesa 1). Si, después de la reconstitución, cualquiera de la proteínasoluciones contienen material insoluble luego filtrado delsolución de proteína a través de un filtro de 0,45 o 0,2  m. lospérdida de proteína a partir de esta filtración es insignificante. Para90  x 1,6 cm columna, la aplicación de 2,0 ml demuestras individuales en el recomendadoconcentración (Tabla 1) da una A280de  1 en elfracción pico.Mesa 1RecomendadoConcentraciónAlbúmina, A853110 mg / mlAlcohol deshidrogenasa, A86565 mg / mlβ-amilasa, A87814 mg / mlAnhidrasa carbónica, C70253 mg / mlEl citocromo c, C71502 mg / mlLas siguientes proteínas pueden ser mixta y de ejecuciónjuntos en las columnas:El citocromo c y Anhidrasa carbónica y alcoholdeshidrogenasaAplicar estándares de proteína a la columna usando elmismo volumen de la muestra y la tasa de flujo tal como se utiliza para lamuestra de dextrano azul. La elución de la normalas proteínas pueden ser seguidos por lecturas de absorbanciaa 280 nm. Determinar la Vepara la proteínanormas midiendo el volumen de los efluentes

recogido desde el punto de aplicación de la muestra a lacentro del pico de efluente4. Curva Estándar - Parcela masa molecular vs. Ve/ VoPara cada respectivo estándar de la proteína en papel semilogarítmico(véase la Figura 1

5. La elución de volumen (Ve) Determinación de una desconocidaProteína - Aplicar la muestra desconocida a la columnaa una concentración apropiada usando el mismo volumen de la muestra, tamaño de la fracción, y el caudal como se usa para el azul de dextrano y los estándares de proteína.Determinar la Ve a lo desconocido con el mismométodos aplicados a las normas. Calcular la Ve/ Vopor lo desconocido y determinar su molecularmasa de la curva estándar

http://faculty.ksu.edu.sa/77632/Documents/Calibration gel filtration for student.pdf

rocedimiento1) Selección de columna de filtración en gelSeleccionar una columna con un intervalo de fraccionamiento de modo que la esperadapeso molecular de la muestra cae aproximadamente en el centrodel rango para esa columna. Superdex 200 se puede utilizar para unaaproximación preliminar, rápida de peso molecular de la muestra.Una longitud de lecho de 30 a 60 cm es suficiente para la mayoría de las determinaciones.2) La equilibración de la columnaSi la columna se ha almacenado en 20% de etanol, se lava la columna primerocon 2 volúmenes de columna de agua destilada. Equilibrar la columna con2 volúmenes de columna de tampón. Un tampón con un pH de 6-8 y un iónicaSe sugiere fuerza ≥ 0,15 M. Un tampón de fosfato típico es 50 mMen NaCl 0,15 M, pH 7,2.3) Elección de las proteínas del kit de calibraciónIncluya proteínas kit de calibración de un peso molecular más alto yde un peso molecular menor que el de la muestra. Las proteínaslistado en la Tabla 4 se pueden mezclar para dar picos resueltos.Tabla 4. mezclas de proteínas adecuados para picos resueltos.Para la calibración deMezcle unaMix bC MixSuperdex 200F + C + CA + RConcejal + O + R + abrilSuperdex 75C + CA + R + abrilO + R + abrilSuperose 6T + Concejal + CA + abrilF + O + RSuperose 12F + O + RConcejal + CA + abrilSephacryl 300T + Concejal + CAF + O + R + abril

Sephacryl 200Concejal + CA + R + abrilC + CA + RO + CA + RSephacryl 100Concejal + CA + R + abrilC + CA + RO + CA + RAbr - La aprotinina, R - ribonucleasa A, CA - anhidrasa carbónica,O - ovoalbúmina, C - conalbúmina, Concejal - aldolasa, F - ferritina,T - tiroglobulina

Página 11114) preparación de proteína individualLe recomendamos que las proteínas se disuelven en altaconcentración (20 mg / ml) y se diluyó con tampón antes de su uso.Disolver el contenido del vial en un tampón con un pH de 6-8 yuna fuerza iónica de 0,15 M ≥ (por ejemplo, fosfato 50 mM, NaCl 0,15 M,pH 7,2). La ferritina y la aldolasa se suministran mezclados con sacarosa omanitol para mantener la estabilidad y ayudar a su solubilidad. Para éstosdos proteínas, es particularmente importante para disolver el contenido completodel vial para obtener una solución homogénea. Es recomendadoque la anhidrasa carbónica se disuelve en agua destilada para evitar laformación de agregados durante la congelación y descongelación.5) la preparación de la mezcla de proteínasDiluir la combinación apropiada de proteínas en el kit de calibraciónamortiguador. Para obtener picos con alturas similares a 280 nm, utilice elconcentraciones en la Tabla 5. Se han calculado las concentracionescon un volumen aplicado asumido de 0,5% de la columna geométricavolumen (Vc). Ver apéndice para una explicación detallada de cómopreparar una muestra típica mezcla de proteínas.Nota: Si la precipitación de las proteínas se produce al mezclar nosrecomendar breve centrifugación para clarificar la mezcla de proteínas antesaplicarlo a la columna.4) preparación de proteína individualLe recomendamos que las proteínas se disuelven en altaconcentración (20 mg / ml) y se diluyó con tampón antes de su uso.Disolver el contenido del vial en un tampón con un pH de 6-8 y

una fuerza iónica de 0,15 M ≥ (por ejemplo, fosfato 50 mM, NaCl 0,15 M,pH 7,2). La ferritina y la aldolasa se suministran mezclados con sacarosa omanitol para mantener la estabilidad y ayudar a su solubilidad. Para éstosdos proteínas, es particularmente importante para disolver el contenido completodel vial para obtener una solución homogénea. Es recomendadoque la anhidrasa carbónica se disuelve en agua destilada para evitar laformación de agregados durante la congelación y descongelación.5) la preparación de la mezcla de proteínasDiluir la combinación apropiada de proteínas en el kit de calibraciónamortiguador. Para obtener picos con alturas similares a 280 nm, utilice elconcentraciones en la Tabla 5. Se han calculado las concentracionescon un volumen aplicado asumido de 0,5% de la columna geométricavolumen (Vc). Ver apéndice para una explicación detallada de cómopreparar una muestra típica mezcla de proteínas.Nota: Si la precipitación de las proteínas se produce al mezclar nosrecomendar breve centrifugación para clarificar la mezcla de proteínas antesaplicarlo a la columnaTabla 5. sugerido concentraciones de proteína para la producción de picos dealtura similar.BotiquínProteínaProteínaconcentraciónBPMLa aprotinina3 mg / mlBPMRibonucleasa A3 mg / mlBPMAnhidrasa carbónica3 mg / mlBPM, HMWOvoalbúmina4 mg / mlBPM, HMWConalbúmina3 mg / mlHMW

Aldolasa *4 mg / mlHMWFerritina *0,3 mg / mlHMWLa tiroglobulina5 mg / ml* Nota: Estas proteínas se suministran mezclados con sacarosa o manitolpara mantener la estabilidad.6) Tamaño del volumen de la muestraAplicar las proteínas del kit de calibración de la columna. Para obtener una buena resolución,el tamaño de la muestra no debe exceder de 2% de la columna geométricavolumen, Vc.(Vc= R2× π × l donde r es el radio y l es la longitud de la columna).7) Determinación del volumen de elución (Ve)A partir de la curva de UV, determinar los volúmenes de elución (Ve) para elProteínas del kit de calibración de la medición del volumen del eluyente desdeel punto de inyección para el centro de la pico de elución, véase la figura 1.8) Determinación del volumen de huecos (Vo)El volumen de elución de Blue Dextran 2.000 es igual a la columnavolumen vacío (Vo). Prepare una solución fresca de azul dextrano 2000(1,0 mg / ml) en el tampón. La velocidad de solubilización del azulDextran 2000 puede aumentarse calentando el tampón a 50 ° C antesla adición de azul de dextrano 2.000.

Aplicar una muestra a la columna (tamaño de la muestra, 0,5% de la geométricavolumen de la columna) para determinar el volumen de huecos (Vo). La elución de Blue Dextran se puede monitorizar convenientemente a longitudes de onda de 254, 280 o 620 nm.Se recomienda encarecidamente que el dextrano azul 2000 se ejecuta solo,sin mezclar con el kit de calibración o proteínas de la muestra, como la fracciónde azul dextrano es amplio y puede solapar los picos de proteínas. Siemprecalcular el volumen vacío desde el primer pico eluido de azul

Columna:HiLoad 16/60 Superdex 200 pgVolumen de la columna geométrica (VC): 120 mlVolumen de la muestra:500 lAmortiguador:

Fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2Caudal:1 ml / minSistema:ÄKTAexplorer ™ 10Detección 280 nm

9) Preparación de curva de calibraciónCalcular la KAVvalores de las proteínas del kit de calibración utilizando elecuación:donde Vo= Columna volumen vacío, Ve= Volumen de elución, y Vc=volumen de la columna geométrica.Preparar una curva de calibración de KAVfrente a log peso molecular o bienen papel semilogarítmico o con un programa de cálculo. Deberíaserá posible ajustar una curva a los puntos de datos, ver Figuras 2 a 10.10) Determinación del peso molecularAplicar la muestra desconocida (volumen 0.1 a 2% de Vc) Y determinarel volumen de elución (Ve) Del compuesto de interés. Ajuste elconcentración de la muestra teniendo en cuenta que una muestrade 0,5% de Vcse diluye 5 a 15 veces durante la carrera.Calcular el correspondiente KAVpara el componente de interés ydeterminar su peso molecular a partir de la curva de calibración preparadautilizando las proteínas del kit de calibración.

Tenga en cuenta que las determinaciones de peso molecular utilizando el molecularlos pesos de las glicoproteínas, lipoproteínas, proteínas no globulares, ootros polímeros pueden no correlacionarse bien con las curvas de calibraciónestablecido para las proteínas globulares de las proteínas del kit de calibración. portales compuestos, la información útil se pueden obtener mediante la relaciónsus datos de volumen de elución a un parámetro de tamaño molecular, tales comoRadio de Stokes (RSt), En lugar de valores de peso molecular. Parcelasde √-log (KAV) Vs RStse han utilizado con éxito para determinar laRadio de Stokes de las proteínas y de nuestras proteínas del kit de calibración pueden serutilizado para estas parcelas tambiénLa preparación de la mezcla de proteínas para la calibraciónHiLoad Superdex 200 pg 26/60Volumen de la columna geométrica (Vc) = 320 mlVolumen de la muestra recomendado = 1,6 ml (0,5% Vc)Preparación de "Mezclar una" en la Tabla 4 (ferritina, conalbúmina, carbónicoAnhidrasa y Ribonucelase A) para Superdex 200Prepare cada proteína individual como se describe en la sección 5.4 a unconcentración de 20 mg / ml.Las concentraciones de proteínas recomendadas para las diferentes proteínasen una mezcla son de acuerdo a la Tabla 5:Ferritina: 0,3 mg / mlConalbúmina: 3 mg / mlAnhidrasa carbónica: 3 mg / mlRibonucleasa A: 3 mg / mlPara preparar una mezcla de proteína de 2 ml, hacer los siguientes cálculos:Calcular el volumen (X) de cada proteína necesaria desde el 20 mg / mlsolución con el fin de conseguir la concentración de proteína deseada

Ferritina:20 mg / ml * X ml = 2 ml * 0,3 mg / mlX = 0,03 mlTodas las demás proteínas:20 mg / ml * X ml = 2 ml * 3 mg / mlX = 0,3 mlFinalmente la mezcla 0,03 ml de ferritina, 0,3 ml conalbúmina, 0,3 ml carbónicaAnhidrasa y 0,3 ml Ribonucelase y diluir con 1,07 ml de tampón deconseguir volumen 2 ml final.Inyectar 1,6 ml de la mezcla de proteína en la columna.

Página 23239. Producto informaciónKits de filtración en gel de calibraciónCódigo no.De bajo peso molecular28-4038-41De alto peso molecular28-4038-42Productos relacionadosCantidadCódigo no.Superdex 75 10/300 GL117-5174-01Superdex 75 5/150 GL128-9205-04Superdex 75 PC 3.2 / 30117-0771-01Superdex 200 10/300 GL117-5175-01Superdex 200 5/150 GL128-9065-61Superdex 200 PC 3.2 / 30117-1089-01

HiLoad 16/60 Superdex 75 pg117-1068-01HiLoad 26/60 Superdex 75 pg117-1070-01HiLoad 16/60 Superdex 200 pg117-1069-01HiLoad 26/60 Superdex 200 pg117-1071-01Superose 12 10/300 GL117-5173-01Superose 12 PC 3.2 / 30117-0674-01Superose 6 10/300 GL117-5172-01Superose 6 PC 3.2 / 30117-0673-01HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR117-1165-01HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR117-1194-01HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR117-1166-01HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR117-1195-01HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR117-1167-01HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR1

17-1196-01Precisión Holder Columna117-1455-01Referencias bibliográficasGuía de selección:Columnas de gel de filtración y medios18-1124-19Manual:Gel filtración - Principios y Métodos18-1022-18

Proteína La purificación por cromatografía de filtración en gelCopy Right © 2001 / Instituto de Molecular Development LLC

INTRODUCCIÓN

Cromatografía de filtración en gel separa las proteínas con el fin de grandes a pequeñas moléculas. Mezclas de proteínas se aplicaron a una filtración en gel (GF) columna que contiene una matriz cromatográfica de tamaño de poro definido. Las proteínas se eluyeron con un tampón acuoso, recogidos como fracciones cromatográficas individuales, y se analizaron por separado. La filtración en gel se puede utilizar para separar las proteínas en base a diferencias en su tamaño molecular, o para desalar proteínas (es decir, eliminan los contaminantes de bajo peso molecular tales como sales, aminoácidos y péptidos, etc.). Una separación de las diversas proteínas en una muestra de las diferencias resultados en sus capacidades para entrar en los poros. En general, las proteínas grandes no van a entrar en los poros de gel y eluirán rápidamente de la columna en el volumen vacío. Proteínas más pequeñas varias veces entrar y salir de los poros del gel y por lo tanto, permanecer más tiempo en la columna. Por lo tanto, las proteínas se eluyen en orden decreciente de tamaño molecular.

http://www.molecularinfo.com/MTM/G/G3/G3-1/G3-1-1.html

MATERIALES Y SOLUCIONES

Comercialmente disponible de filtración en gel (GF) Matrix Gel

Tipo GelIntervalo de fraccionamiento

(peso molecular)Sephadex G-10 <700

Sephadex G-25 1.000-5.000

Bio-Gel P-60 3,000-60,000

Sephadex G-75 3,000-70,000

Sephadex G-100 4,000-100,000

Bio-Gel P-100 5.000-100.000

Sephadex G-200 5,000-250,000

Bio-Gel P-200 30,000-200,000

Sephacryl S-300 10,000-1,500,000

Sepharose 2B 70,000-40,000,000

Filtración en gel (GF) Buffer Tampón Tris-HCl, tampón de fosfato de sodio, y el tampón de acetato de sodio en diferentes valores de pH son los más utilizados. Se recomienda una fuerza iónica de al menos 0,05 M para reducir las interacciones no específicas entre las proteínas se separaron y la matriz cromatográfica.

Filtración en gel (GF) La columna de cromatografía

Extensión Columna nivel de carpintero o Gel Embalse

Bomba peristáltica

Detector UV

Colector de fracciones

PROCEDIMIENTOS

Hinchazón del gel

1. Oleaje del GF (filtración en gel) matriz de gel en un tampón GF apropiado.

Permitir a hincharse por completo.

2. Después de permitir que el gel se asiente, aspirar o decantar las partículas de gel finas que no se han asentado en el lecho de gel.

3. Resuspender el gel sedimentado en un volumen igual de tampón de GF para formar una suspensión espesa, se vierte la suspensión en un matraz de filtración, desgasifique el gel con el fin de eliminar el aire atrapado.

4. El volumen de tampón de la hinchazón y el tiempo de hinchamiento requerida para un determinado gel depende del tipo de gel. El gel seco se añadió gradualmente a la memoria intermedia, mientras se agita suavemente la suspensión con una varilla de vidrio. Nota: No remover con un agitador magnético, ya que se pulverizan las perlas de gel.

5. Suspender el gel en el doble del volumen del lecho aproximada (es decir, los mililitros de gel hinchado). Los geles pueden estar hinchados rápidamente por calentamiento de la suspensión a 90 ° C durante 5 horas, usando un baño de agua para controlar la temperatura. Hinchazón a temperatura ambiente puede ser considerablemente más lento, especialmente para las grandes geles de poro.

6. Si una matriz de gel GF se compra prehinchada, se debe lavar con exceso de tampón en un embudo Buchner para eliminar agentes antimicrobianos contenidos en el tampón de almacenamiento.Resuspender el gel asentado en tampón GF, desgasificar la suspensión.

Llenado de la columna

7. Montar la columna vertical sobre un soporte de laboratorio. Un nivel de carpintero debe utilizarse para determinar que la columna es vertical.

8. Usando una jeringa, inyecte tampón GF en el tubo salida de la columna hasta

que la columna vacía se llena con tampón para justo encima de la pantalla de soporte de lecho. Deje la jeringa en su lugar para bloquear el extremo de la tubería de salida.

(Este procedimiento elimina el aire atrapado de debajo de la pantalla de ayuda.)

9. Verter un volumen apropiado de la suspensión de gel con el fin de llenar completamente la columna a la altura de lecho de la columna requerida. La suspensión de gel debe ser vertida sobre una varilla de vidrio cuyo extremo toca la pared de la columna interior. Esto dará lugar a un buen flujo de la suspensión de gel sin turbulencia y la introducción de aire innecesario.

10. Dado que el volumen de la suspensión generalmente excede el volumen de lecho de la columna deseada, es conveniente utilizar una extensión de depósito o columna de gel para mantener el exceso de suspensión.

11. Después de que la columna se llena hasta la altura del lecho deseada, pipetear cuidadosamente una capa de 1 cm de tampón sobre la parte superior del gel. Después de llenar por completo el tubo de entrada y al final ajustada con tampón, conecte el final apropiado para la columna.

Embalaje y lavar la columna

12. Antes de retirar la jeringa del tubo de salida, ajuste el depósito tampón para proporcionar una presión de funcionamiento apropiado o usar una bomba peristáltica para controlar la velocidad de flujo.

Para geles no rígidos (por ejemplo, Sephadex G-75, G-100 y G-200 o Sepharose), presiones de trabajo no deben exceder de los límites definidos por el fabricante.

Para gel rígido (por ejemplo, Sephadex G-10 a G-50 o Sephacryl), el embalaje puede llevarse a cabo a velocidades de flujo más altas usando una bomba peristáltica.

13. Retire la jeringa del tubo de salida de la columna e iniciar el flujo. Lavar la columna con 2 a 3 volúmenes de lecho de tampón con el fin de empacar la cama y para equilibrar la columna con tampón. Un caudal ligeramente superior se puede utilizar para el embalaje que pueda ser utilizado para la separación cromatográfica.

14. Cierre el tubo de salida. Inspeccionar el lecho empaquetado, iluminando por detrás por una linterna para detectar grietas o aire atrapado en el lecho de la columna.

La determinación de la Columna volumen de hueco

15. Cierre el tubo de salida y retire la mayor parte de la memoria intermedia de sobre el lecho de la columna por aspiración. Abra el tubo de salida y deje que el tampón restante penetre en el gel, pero tenga cuidado de no dejar que el centro del gel se seque. Cierre el tubo de salida.

16. El uso de una pipeta pasteur, aplicar una muestra de proteína (0.2 a 0.5 mg / ml), cuyo peso molecular es conocido por ser mayor que el volumen de huecos de la matriz GF que se utiliza para la separación, en un volumen de tampón igual a 1 % del volumen total del lecho de la columna es en capas en la parte superior del gel.

17. Abrir el tubo de salida de la columna y dejar que la muestra penetre en la cama.

18. Lavar la muestra restante de la pared de la columna mediante la aplicación de pequeñas cantidades de tampón a partir de una pipeta Pasteur.

19. Después de aplicar la muestra, pipeta cuidadosamente una capa de 1 cm de tampón sobre la parte superior del gel, y después de llenar por completo el tubo de entrada y final apropiado con tampón, conecte el extremo apropiado a la columna.

20. Permitir la elución de proceder a una presión hidrostática apropiado o tasa de flujo.

21. Recoger el efluente de la columna utilizando un colector de fracciones automático. Es conveniente para recoger las fracciones que contienen cada uno 100 un volumen equivalente a aproximadamente el 1% del volumen total del lecho.

22. Medir el A280 de cada fracción. Calcular el volumen vacío multiplicando el volumen recogido en las fracciones individuales por número de troquel de la fracción que contiene la proteína de absorción de UV máxima. El volumen vacío debe ser de aproximadamente 1/3 del volumen total del lecho.

Disolución y aplicación de la muestra

23. Disolver la muestra que contiene una mezcla de proteínas en el tampón utilizado en la columna de filtración en gel. Para conseguir la máxima resolución, el volumen de la muestra debe ser de 1-5% del volumen de lecho de la columna.

24. Con el fin de optimizar la forma del pico cromatográfico, es necesario que la viscosidad de la solución de muestra no sea mayor del doble que la del tampón de elución.

Recopilación de las fracciones de la columna

25. Medir la A 280 de las fracciones cromatográficas individuales o el efluente de la columna con el fin de detectar las proteínas. Las proteínas que contienen tirosina y triptófano residuos absorben a 280 nm.

NOTAS

La resolución de dos bandas de proteínas durante la filtración en gel está relacionado con la raíz cuadrada de la longitud de la columna, tamaño de partículas de gel, velocidad de flujo de tampón, y el rango de fraccionamiento de gel. A la separación de proteínas se lleva a cabo mejor en una columna larga (por ejemplo,> 50 cm) con un diámetro interno entre 1 y 2,5 cm.

Para la mayoría de las separaciones de proteínas, bien de tamaño de partículas se deben usar, ya que tanto la resolución cromatográfica y el caudal se mantendrá alto. Por mismas separaciones de proteínas a gran escala, se recomiendan las partículas de tamaño medio. Para la resolución más alta, la velocidad de flujo lineal debe mantenerse entre 2 y 10 cm / hora. La tasa de flujo de la columna correspondiente en ml / hora se puede calcular multiplicando velocidad de flujo lineal por el área de la sección transversal de la columna (2 cm).

La elección de una matriz de filtración en gel depende del tamaño molecular de la proteína de ser purificado, así como los tamaños moleculares de los contaminantes. Es importante que el tamaño molecular de la proteína está separada se encuentran dentro de la mitad del intervalo de fraccionamiento de la matriz de la columna usada para la separación.

La fuerza iónica de los tampones utilizados para la filtración en gel debería ser 0,05 M o mayor, y el pH de la memoria intermedia no deben exceder el rango de pH operativo prescrito por el fabricante para una matriz cromatográfica.

La proteína debe ser soluble en el tampón elegido. Si es necesario, la proteína se puede disolver en tampones que contienen agentes caotrópicos (por ejemplo, 6 M de guanidina-HCl y 8 M urea),

disolventes orgánicos a bajas concentraciones, y detergentes, y la separación puede llevarse a cabo en tales tampones si el gel elegido matriz es estable bajo estas condiciones.

Proteína Peso molecular estándar.

Proteína Peso molecular

El citocromo c 11700

La mioglobina 16800

Tripsinógeno 24000

Anhidrasa carbónica 29000

Ovoalbúmina 45000

Hemoglobina 64500

Albúmina de suero bovino 66000

Transferrina 74000

Inmunoglobulina G 158000

El fibrinógeno 341000

La ferritina 470000

La tiroglobulina 670000

INFORMACIÓN KIT

REFERENCIAS

Andrews, P. 1970. Estimación del tamaño molecular y pesos moleculares de compuestos biológicos mediante filtración en gel. En los métodos de análisis bioquímico (Glikc, D., ed.). Vol. 18, pp.1-53.Interscience, Nueva York.

Fischer, L. 1980. Gel-filtración cromatografía. Elsevier, Amsterdam.

Porath. J. y Flodin, P. 1959. Gel de filtración: Un método para la desalinización y la separación de grupo. Naturaleza 183: 1657/59.

Por favor envíe sus comentarios sobre este protocolo para"editor@MolecularInfo.com".

http://www.chem.iitkgp.ernet.in/faculty/SDG/Protein isolation chromatography.pdf

TÉCNICAS EXPERIMENTALES

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE BAJA PRESIÓN

06/21/2006

Antes de que una proteína u otra macromolécula biológica pueden ser estudiados

rigurosamente de una base estructural y funcional, que debe ser purificada. Los

problemas que pueden surgir durante la purificación de proteínas se vuelven claros

cuando se considera que una sola proteína tiene que ser purificado a partir de una

mezcla de hasta 10.000 proteínas, cada uno de los cuales se componen de los

mismos aminoácidos constituyentes. Las proteínas difieren en tamaño (cuántos

aminoácidos), la carga (la cantidad de carga positiva y negativamente

aminoácidos), y en secuencia y la presencia de sitios de unión específicos en las

proteínas. Cualquier técnica que se podría utilizar para purificar la proteína debe

basarse en estas diferencias inherentes. Tres principales técnicas de cromatografía

de columna utilizados para las proteínas separadas (u otras macromoléculas) se

discuten a continuación.

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

1. Separación sobre la base de la cromatografía de filtración en

gel tamaño-:

Las proteínas de diferentes tamaños se separan en una columna en la que la fase

estacionaria es una agarosa o acrilamida grano polimerizado, que contienen poros

de diversos tamaños.Una proteína más pequeña en la fase móvil (solución acuosa

tamponada) puede entrar en los poros en el cordón, mientras que una proteína

más grande no puede, debido a la restricción de tamaño. El resultado es que una

fracción mayor del volumen total de la columna está disponible para la proteína

más pequeña, que por lo tanto pasa un tiempo más largo en la columna y se eluye

por el disolvente móvil después de la proteína más grande. La forma de la proteína

(no sólo su tamaño) también determina si la proteína entrará en los poros. Se

utilizó esta técnica para separar colorante encapsulado en liposomas de colorante

libre en la práctica 1.

Vamos a considerar con mayor profundidad la teoría de la cromatografía de

filtración en gel. Varios diferentes volúmenes de columna se pueden definir como

se muestra a continuación.

Si tenemos en cuenta la masa de las perlas para ofrecer una cantidad

insignificante del volumen de la perla, el volumen real en el cordón de solución

atrapado y representa la fase de "estacionaria". El volumen alrededor de la cuenta

se llama el volumen vacío, V o. También, Vi = V t - V o.

Un soluto eluye de la columna en un pico ancho. Si el volumen de la muestra

aplicada a la columna es muy pequeño en comparación con V t, el volumen en el

que un soluto se eluye, V e, se considera que es el centro del pico de elución. Esto

es cierto cuando la muestra V << V e.

Si ver el cromatografía tiene una partición de soluto entre las fases móvil y

estacionaria, podríamos estar interesados en qué fracción de la fase estacionaria,

V i, un soluto podría repartirse en. Tal relación estaría dada por:

K = (V e -V o) / V t -V o)

donde V o -V t (= Vinside) representa el 100% de la fase estacionaria, donde K es

un coeficiente de distribución. Consideremos dos casos:

1. Una muy grande de soluto en comparación con el tamaño de poro: En este

caso V e -V o = 0 puesto que V e sería igual a V o. (El soluto no vería cualquiera

de los V i.) En este caso, K = 0. El soluto sería eluir en el volumen vacío de la

columna ya que no puede particionar en cualquiera de el volumen dentro de

las perlas. Todos los solutos de peso molecular mayor que o igual que el

soluto más pequeño que no puede entrar en las perlas de gel hará todo

eluyen en el volumen vacío. Por lo tanto solutos mayor que este tamaño

mínimo será co-eluyen de la columna y no se pueden separar. V o es

habitualmente de aproximadamente 30-40% de la V t.

2. Una muy pequeña soluto en comparación con el tamaño de poro. En este

caso V e -V o = V t -. V o, ya que V e sería igual a V t (El soluto vería todo el

disolvente) En este caso, K = 1.Similar al anterior, todos los solutos de MW

igual o menor que el más grande de soluto que puede particionar en todo el

volumen dentro de un grano de co-eluyen a un volumen de cerca de V t.

Por lo tanto K es un coeficiente de partición, que varía de 0 - 1, y representa la

fracción del V i en la que un soluto podría partición. Esta K no es exactamente un

coeficiente de partición, sin embargo, ya que el volumen real de la matriz de gel se

supone que es cero por encima. El siguiente gráfico muestra típica e V como una

fracción de V t para solutos de diferente tamaño (eje x es V e / V t).

Tamaño y forma relaciones:

K depende del tamaño y la forma del soluto. El tamaño y la forma de un objeto

determina es propiedades de flujo en un fluido. Resistencia de rozamiento (una

fuerza que tiene la dirección opuesta a la velocidad, otra cantidad vectorial, puede

demostrarse que es proporcional a la velocidad.

F  a v o F f = - fv

donde f es el coeficiente de fricción, que depende de la forma. Es evidente que,

cuanto más grande sea el objeto, más resistencia por fricción al movimiento. Para

una esfera se puede demostrar que:

f = 6  R s

 h es la viscosidad (medida de la resistencia al flujo de un líquido - agua tiene

una baja viscosidad, arce real jarabe una alta viscosidad), y (radio de Stokes) R s es

el radio de la esfera hidratado (cuanto mayor R s, cuanto mayor sea el coeficiente

de fricción, mayor será el F f que resiste el movimiento). Para un objeto de forma

irregular, el radio de Stokes es el radio de una esfera que tiene el mismo

coeficiente de fricción que el objeto. Por lo tanto el R s para una molécula de

proteína que no era de forma esférica sería mucho mayor que el R s para otra

molécula de proteína de peso molecular idéntico que era esférica. De ahí la V e y el

valor de K para un soluto en una columna de filtración en gel mejor estarían

relacionadas con el radio de Stokes, ya que los valores de I s tiene en cuenta tanto

el tamaño y forma.

Se puede demostrar que:

Rs  erf -1 (1-K) o Rs = A + B erf -1 (1-K)

¿Cómo sería una parcela de Rs vs erf -1 (1-K) parece?

Para las proteínas globulares, también se puede demostrar que

K = log -A (MW) + B o mayor rigor

'Log R + B' K = -A

log log Rs  MW de la proteína, y que, más prácticamente,

una parcela de log MW vs K o Ve es lineal con una pendiente negativa.

Por lo tanto la filtración en gel se puede utilizar para determinar el MW de un

desconocido proteínas globulares esféricas () cuando se compara con una curva

estándar generada utilizarse otras proteínas globulares de MW conocida. En la

práctica 1 nos separamos tinte liposomas-encapsulados de colorante libre. Esa

separación fue trivial ya que era equivalente en difícil separar los elefantes de los

mosquitos. Es mucho más difícil a las proteínas separadas de tamaño similar, un

problema a menudo se enfrentan en el laboratorio.

animación de filtración en gel Cromatografía de GE Healthcare

animación de filtración en gel La cromatografía de Voet   2

2. Separación sobre la base de cargo- intercambio iónico y

cromatografía de cromatoenfoque:

La resina de cromatografía en este tipo de cromatografía se componen de una,

acrilamida, resina de celulosa o agarosa o perla que está derivatizado para

contener unidos covalentemente grupos cargados positiva o negativamente. Las

proteínas en la fase móvil se unen a través de interacciones electrostáticas con el

grupo cargado en la columna. En una mezcla de proteínas, las proteínas cargadas

positivamente se unen a una resina que contiene grupos cargados negativamente,

como el grupo carboximetilo, CM (-OCH 2 COO -) o de sulfopropilo, SP, (-

OCH 2 CH2 CH 2 SO 3 -), mientras las proteínas cargadas negativamente pasarán a

través de la columna. Las proteínas cargadas positivamente se pueden eluir de la

columna con una fase móvil que contiene o bien un gradiente de concentración

creciente de sal o una sola concentración de sal más alta (elución isocrática). La

proteína más carga positiva se eluye pasado, a la mayor concentración de sal. Del

mismo modo, las proteínas cargadas negativamente se unirán a una resina que

contiene grupos cargados positivamente, como el grupo dietilaminoetilo, DEAE (-

OCH 2 CH 2 NH (C 2 H 5) 2 +) o un grupo amino cuaternario de etilo, QAE, y se puede

separar de una manera análoga. En cromatoenfoque, la fase móvil contiene un

gradiente de pH, y las proteínas unidas se eluyen cuando el pH alcanza el punto de

la proteína, en la que las proteínas no tienen carga neta isoeléctrico. En este

laboratorio, utilizará QAE y SP Sephadex intercambiadores de iones.

animación de la cromatografía de intercambio iónico de GE

Healthcare

animación de la cromatografía de intercambio iónico de Voet   2

3. Separación sobre la base de sitios de unión específicos en la

cromatografía de afinidad a proteínas:

En esta técnica, la resina de cromatografía está derivatizado con un grupo que se

unirá a un sitio específico en una determinada proteína de interés. Puede ser un

grupo que se une al sitio activo de una enzima (por ejemplo, benzamidina-agarosa

que se utiliza para la purificación de la tripsina) o un anticuerpo que reconoce una

secuencia específica de aminoácidos en una proteína. Por ejemplo, un anticuerpo

se puede hacer para un péptido específico de la albúmina, el anticuerpo unido

covalentemente a agarosa, y la columna de anticuerpo-agarosa entonces utilizarse

para purificar la albúmina específicamente. Esta es una técnica de gran alcance, ya

que los anticuerpos teóricamente se pueden hacer que se unirá selectivamente a

cualquier proteína dada. Sabiendo sólo la secuencia de ADN de una proteína que

nunca ha sido aislado previamente, el siguiente esquema se podría utilizar para

purificar la proteína desconocida. La secuencia de aminoácidos de la proteína

desconocida se puede derivar de la secuencia de ADN. Un péptido amino ácido 10

a 12 a partir de que la proteína se puede sintetizar en el laboratorio, y un

anticuerpo generado contra el péptido. El anticuerpo se unirá más probable que la

proteína desconocida, así como al péptido, y por lo tanto se podría utilizar para

purificar la proteína.

animación de la cromatografía de afinidad de GE Healthcare

4. Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)

animación de la cromatografía de interacción hidrofóbica de GE

Healthcare

5. Cromatografía de Fase Inversa

cromatografía en fase inversa de GE Healthcare

6. TLC

animación

http://nptel.ac.in/courses/102103047/23