QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS …tesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/4100/1/DETERMINAC... · 2018-08-16 · moléculas formadas de la combinación de bencimidazol

0

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

DETERMINACIÓN DE LA POSIBLE ACTIVIDAD

NEMATICIDA DE CINCO NUEVOS COMPUESTOS HÍBRIDOS DEL BENCIMIDAZOL Y LA NITAZOXANIDA

T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS P R E S E N T A

BIOL. BLANCA EUNICE GONZÁLEZ GÓMEZ

DIRECTORES: DR. BENJAMÍN NOGUEDA TORRES

M. EN I.B.B. JORGE LUIS DE LA ROSA ARANA

México, D.F., 2009

0

1

El presente trabajo fue realizado bajo la dirección de:

Dr. Benjamín Nogueda Torres, en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del

Instituto Politécnico Nacional, adscrito al laboratorio de Helmintología del

Departamento de Parasitología.

M. en I.B.B. Jorge Luis de la Rosa Arana, en el Instituto de Diagnóstico y

Referencia Epidemiológicos de la Secretaria de Salud, adscrito al Laboratorio de

Helmintos Tisulares del Departamento de Parasitología.

0

AGRADECIMIENTOS En este espacio quiero agradecer profundamente a mis directores de tesis:

Dr. Benjamín Nogueda Torres

M. en I.B.B. Jorge Luis de la Rosa Arana

Por su valioso apoyo, asesoría y dirección en la realización del presente trabajo

Agradeciendo especialmente a mi comité tutorial:

Dra. María Estela Meléndez Camargo

Dra. María Elena Campos Aldrete

Dra. Amalia Monroy Ostria

Dra. Gloria de la Luz León Ávila

Dr. Alejandro Tovar Soto

Por su apoyo en la revisión y corrección del presente trabajo

Agradecimiento especial al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

(CONACyT), por haber financiado la realización de este postgrado, mediante la

beca otorgada No. 205158

0

Quiero agradecer profundamente a mi familia, por su gran apoyo que me ha

brindado en la realización de este importante paso que di en mi vida profesional

Muchas gracias mamá e Iván por apoyarme incondicionalmente, los ama Blanca

Quisiera agradecer enormemente a mis amigos y compañeros de la ENCB, así

como del INDRE, por compartir, convivir y apoyarme en estos formativos años

Agradecimiento especial a mis amigos y compañeros de la USB, por su apoyo

brindado para salir adelante con mi formación académica

Aquello que guardes en tu corazón determinará el transcurrir de tu vida

ÍNDICE GENERAL

i

|ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL……………………………………………………………………………………..............................i

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS.…………………………………………………………………………….………...iii

ABREVIATURAS……………………………………………………………………………………………………….....iv

RESUMEN…………………………………………………………………………………………………….…...............v

ABSTRACT..........................................................................................................................................................vi

1. INTRODUCCIÓN.…………...…………………………………………………………………………………............1

2. ANTECEDENTES……………………………………………………………………………………………………….3

2.1. El Modelo experimental………………………………………………………………………………………………3

2.1.1. Toxocara canis………………………………………………………………………………................................3

2.1.1.1. Taxonomía y morfología…………………………………………………………………................................3

2.1.1.2. Ciclo biológico…………………………………………………………………………………………...............5

2.1.1.3. Manifestaciones clínicas y sintomatología…………………………………………………………………….6

2.1.1.4. Diagnóstico……………………………………………………………………………………………….............8

2.1.1.5. Tratamiento…………………………………………………………………………………………....................9

2.1.1.6. Distribución geográfica y epidemiología……………………………………………………………………….9

2.1.1.7. Profilaxis…………………………………………………………………………………….............................10

2.1.2. Trichinella spiralis…………………………………………………………………………………………………11

2.1.2.1. Taxonomía y morfología……………………………………………………………………………................11

2.1.2.2. Ciclo biológico…………………………………………………………………………………….....................13

2.1.2.3. Manifestaciones clínicas y sintomatología…………………………………………………….....................14

2.1.2.4. Diagnóstico……………………………………………………………………………………………..............15

2.1.2.5. Tratamiento……………………………………………………………………………………………..............16

2.1.2.6. Distribución geográfica y epidemiología………………………………………………................................16

2.1.2.7. Profilaxis…………………………………………………………………………………..……………………..18

2.2. Inmunología contra helmintos……………………………………………………………………………………..18

2.3. Fármacos antiparasitarios………………………………………………………………………………………….19

2.3.1. Antihelmínticos………………………………………………………………………………………………….....19

2.3.1.1. Bencimidazoles………………………………………………………………………………………………….20

2.3.1.2. Nitazoxanida………………………………………………………………………………..............................22

2.3.1.3. Compuestos híbridos…………………………………………………………………………….....................24

3. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………………………………...................28

4. HIPÓTESIS………………………………………………………………………………………..............................28

5. OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………..................29

5.1.Objetivo general………………………………………………………………………………................................29

5.2. Objetivos particulares…………………………………………………………………………………...................29

6. DIAGRAMA DE FLUJO DEL DESARROLLO EXPERIMENTAL………………………………………..……….30

7. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………………….........................31

7.1. Evaluación in vitro de los compuestos híbridos sobre J2 de T. canis, LM y GA de T. spiralis……………..31

7.1.1. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de la fase Juvenil 2 (J2) de Toxocara canis…….……..31

ÍNDICE GENERAL

ii

7.1.2. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de larvas musculares (LM) de Trichinella spiralis….....34

7.1.3. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de gusanos adultos (GA) de Trichinella spiralis……...36

7.1.4. Determinación in vitro de la actividad nematicida de los compuestos híbridos…………………………….38

7.1.5. Efecto de los compuestos sobre el índice de capacidad reproductiva en LM de T. spiralis……..........…39

7.1.6. Efecto de los compuestos sobre el índice de larviposición de adultos hembras de T. spiralis………..…41

7.1.7. Análisis estadístico………………………………………………………………………………………………..41

8. RESULTADOS………………………………………………………..……………………………………………….42

9. DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………………………..…..59

10. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………….66

11. PERSPECTIVAS……………………………………………………………………………………………..……...67

12. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………………..………..68

APÉNDICE……….………………………………………………..……………………………………………………...79

I. Soluciones y reactivos……………………………………………………………….………………………………...79

II. Resultados anexos sobre el porcentaje de reducción de LM y el RCI……………………………………….….81

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS

iii

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS

Ilustración Descripción Página

Tabla 1 Clasificación taxonómica de Toxocara spp. 4

Figura 1 Morfología de la parte anterior de Toxocara canis 5

Figura 2 Ciclo biológico de Toxocara canis 6

Figura 3 Áreas del cuerpo donde se aloja larva migrans 8

Tabla 2 Clasificación taxonómica de Trichinella spp. 12

Figura 4 Morfología de Trichinella spiralis 13

Figura 5 Ciclo biológico de Trichinella spiralis 14

Figura 6 LM en célula nodriza y edema periorbital 15

Figura 7 Distribución de la triquinelosis en la república mexicana 17

Figura 8 Fórmula general del bencimidazol 22

Figura 9 Fórmula general de la nitazoxanida 24

Figura 10 Hibridación molecular 25

Figura 11 Compuestos madre 26

Tabla 3 Composición de los compuestos híbridos a evaluar 26

Figura 12 Compuestos híbridos resultantes 27

Figura 13

Colección de Toxocara canis del intestino de un canino, Adultos de T. canis, Extracción del útero de hembras de T. canis y Embrionación de huevos

32

Figura 14 Eclosión de los J2, Microembudos tipo Baermann y J2 de Toxocara canis liberadas

34

Figura 15

Infección con Trichinella spiralis, Carcasa, Molienda, Digestión enzimática, Embudos de sedimentación, Trichinella spiralis liberadas de la célula nodriza y Mantenimiento de Trichinella spiralis

36

Figura 16

Disección de intestino delgado del ratón experimentalmente infectado, Incubación para obtención de gusanos adultos de Trichinella spiralis y Gusanos adultos de Trichinella spiralis

37

Figura 17 Placa de cultivo con helmintos y compuestos experimentales 39

Figura 18 Efecto de los compuestos sobre J2 de T. canis, tratados con

0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL

44

Figura 19 Micrografía de J2 de Toxocara canis viable y no viable 45

Figura 20 Efecto de los compuestos sobre LM de T. spiralis, tratadas

con 0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL

48

Figura 21 Micrografía de LM de Trichinella spiralis viable y no viable 49

Figura 22 Índice de capacidad reproductiva de las LM con tratamiento

a 0.1, 1, 10 y 100 g/mL

51

Figura 23 Efecto de los compuestos sobre GA de T. spiralis, tratados

con 0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL

54

Figura 24 Micrografía de GA de Trichinella spiralis viable y no viable 55

Figura 25 Índice de larviposición de los GA hembras con tratamiento a

0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL

57

Figura 26 Micrografías de LRN de Trichinella spiralis 58

ABREVIATURAS

iv

ABREVIATURAS ABZ Albendazol CPMIV 1-metil-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-1H-bencimidazol-5-carboxamida DMSO Dimetil sulfóxido dpi Días postinfección GA Gusano adulto IL Índice de larviposición

J2 Fase juvenil 2 LM Larva muscular LRN Larva recién nacida MEM Medio esencial mínimo NTZ Nitazoxanida PBS Solución salina amortiguadora de fosfatos RCI Índice de capacidad reproductiva SAG61 N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-2-(tiol)-1H-bencimidazol-5-carboxamida

Tx Tratamiento VMAS60 N-(5-Nitro-1,3-tiazol-2-il)-2-(triflurometil-1H-bencimidazol-5

-carboxamida

VMAS62 N-(5-Nitro-1,3-tiazol-2-(metilsulfuro)-1H-bencimidazol-5-carboxamida VMAS74 1-metil-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-2-(metilsulfuro)- bencimidazol-5

-carboxamida

RESUMEN

v

RESUMEN

Toxocara canis y Trichinella spiralis son dos nematodos que comúnmente se nombran como

“helmintos tisulares”, puesto que sus larvas pueden invadir los tejidos musculares y el sistema

nervioso central. El hombre es accidentalmente un anfitrión en ambas enfermedades parasitarias.

En el primer caso, el principal hospedador de T. canis es el perro y la transmisión al ser humano se

da por el consumo accidental de los huevos embrionados que desarrollan una larva migratoria (J2),

la cual causa el síndrome de larva migrans visceral o ocular. En el segundo caso, el principal

hospedador de T. spiralis es el cerdo; el consumo de carne mal cocida que contiene las larvas

musculares (LM) infecta al hombre, y por lo tanto le causan un síndrome febril. Ambas zoonosis

presentan distribución mundial. El tratamiento de elección es la quimioterapia basada en la

administración de antihelmínticos de amplia gama, como los derivados del bencimidazol (BNZ),

(albendazol (ABZ)) o la nitazoxanida (NTZ). Así, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto

antihelmíntico de cinco nuevos derivados de la unión del BNZ y de la NTZ utilizando T. canis y T.

spiralis como modelos de helmintiosis experimental. En primer lugar la inhibición de la motilidad de

J2 (T. canis) y LM y gusanos adultos (T. spiralis) fue evaluada in vitro agregando el compuesto a

diversas concentraciones. La fecundidad del gusano adulto femenino de T. spiralis también fue

evaluada in vitro. Finalmente el efecto sobre la capacidad infectiva de las larvas de T. spiralis fue

registrado a través del índice de capacidad reproductiva; las larvas fueron incubadas con el

compuesto experimental por un tiempo, después fueron utilizadas para infectar ratones CD1 y al

cabo de cuatro semanas las LM fueron recuperadas y el RCI calculado. Las cinco nuevas

moléculas formadas de la combinación de bencimidazol y la parte activa de la nitazoxanida son

VMAS60, VMAS62, VMAS74, CPMIV y SAG61, las cuales fueron evaluadas a concentraciones

logarítmicas de 100 a 0.01 g/mL con tiempos de exposición a partir de 2, 6 y 12 horas. Se

colocaron veinte gusanos por pozo de placas de microcultivo. La motilidad fue evaluada a través de

la técnica de motilidad relativa (RM). Nuestros resultados mostraron que la motilidad no fue

afectada por los compuestos nuevos; la NTZ redujo en su totalidad la motilidad J2 y la viabilidad en

el 80 % después de las 2 horas de exposición en 100 g/mL. Asimismo la NTZ en T. spiralis

reduce la motilidad hasta el 30 % desde las 2 horas de exposición a concentración de10 g/mL. La

larviposición realizada por el gusano femenino de T. spiralis se redujo un 95 % con los compuestos

VMAS60 y VMAS62, resultados similares se obtuvieron con el ABZ y la NTZ. La capacidad

infectiva de T. spiralis, se redujo significativamente con los compuestos VMAS60 (el 95 %) y

VMAS62 (el 98 %), asimismo resultados similares se obtuvieron con el ABZ (el 99 %) y la NTZ (el

98 %) desde las 2 horas de exposición con una concentración de 100 g/mL. Los resultados

sugieren que los compuestos híbridos no tienen efecto sobre la motilidad de las larvas del T. canis

y de T. spiralis, pero si inhibe a larviposición de los gusanos femeninos de T. spiralis y el RCI.

ABSTRACT

vi

ABSTRACT

Toxocara canis and Trichinella spiralis are two nematodes that commonly are named “tissular

helminthes”, since their larvae can invade the muscular tissues and the nervous central system.

The man is an accidentally host in both parasitic diseases. In the first case, the main host of T.

canis is the dog and transmission to human are by consumption of embrionated eggs that develop

in a migrant larva (J2) that causes the visceral or the ocular larva migrans syndrome. In the second

case, the main host of T. spiralis is the pig; man is infected by the consumption of undercooked

meat containing the muscular larvae (ML) causing a febrile syndrome. Both zoonosis are of world-

wide distribution. The treatment of election is the chemotherapy by administration of wide spectrum

anthelmintics, as the benzimidazole (BNZ) (albendazole (ABZ)) or the nitazoxanide (NTZ). Thus,

the aim of this job was to determine the anthelmintic effect of five new derivatives of the union of

BNZ and the NTZ using the T. canis and T. spiralis as models of experimental helminthiosis. In the

first instance, inhibition of J2 (T. canis) and ML y adults worms (T. spiralis) motility was evaluated

in vitro by adding the drug in different concentrations. Fecundity of female adult worm of T. spiralis

was also evaluated in vitro. Finally the effect on the infective capacity of T. spiralis larvae was

recorded by the reproductive capacity index; larvae was incubated with the experimental drug by a

time, then used to infect CD1 mice and after four weeks, ML was recovered and the RCI calculated.

The five new molecules formed by the combination of benzimidazole and the active part of the

nitazoxanide are VMAS60, VMAS62, VMAS74, CPMIV and SAG61 and were evaluated in

logarithmic concentrations of 100 to 0.01 g/mL with exposure times from 2, 6 and 12 hours.

Twenty worms by well were placed in plates of microculture. Mobility was evaluated by means of

the relative motility (RM) technique. Our results showed the mobility was not affected by the new

compounds; the NTZ reduced totality the J2 motility and the viability in 80 % since the 2 hours of

exposition at 100 g/mL. As far for T. spiralis, the NTZ reduces the motility to 30 % since the 2

hours of exposition at 10 g/mL. Larviposition of T. spiralis female worm was reduced in 95 % by

the VMAS60 and VMAS62 compounds at 24 hours of exposition and 100 g/Ml. Similar results

were obtained with the ABZ and the NTZ. The infective capacity of T. spiralis was reduced with the

use of VMAS60 (95 %) and VMAS62 (98 %), similar results were obtained with the ABZ (99 %) and

the NTZ (98 %) when were used since 2 hours of exposition at 100 g/mL. These results suggest

that the hybrid compounds have not effect on the motility of T. canis and T. spiralis larvae but inhibit

the larviposition of female T. spiralis worms and reduce the RCI.

INTRODUCCIÓN

1

1. INTRODUCCIÓN

El parasitismo es una asociación biológica entre dos organismos de especies

distintas (parásito y hospedador), en donde el parásito vive a expensas de su

hospedador adquiriendo de este vivienda y nutrientes de la sangre, tejidos o

contenido del tubo digestivo. Para adaptarse a la vida parasitaria, los parásitos

han desarrollado órganos de fijación, simplificación anatómica y funcional, así

como hiperactividad de órganos subsistentes como los sexuales (Gállego-

Berenguer, 1997).

Las geohelmintiosis son el conjunto de parasitosis helmínticas en las que los

huevos de los helmintos parásitos son expulsados con las heces, los cuales aún

no presentan embrión y para que este pueda desarrollarse y ser infectante

necesita permanecer en suelo húmedo un promedio de 7 a 14 días (Gállego-

Berenguer, 1997).

En México las geohelmintiosis más comunes son causadas por los siguientes

nemátodos: Ascaris lumbricoides (Linnaeus, 1758), Trichuris trichiura (Linnaeus,

1771), Enterobius vermicularis (Linnaeus, 1758), Ancylostoma duodenale (Dubini

1843) y Necator americanus (Dubini 1843), y aunque también se incluye Toxocara

spp. (Wilder, 1950), debido a su ciclo de vida que éste presenta en el ser humano

se le asigna en el grupo de los helmintos tisulares (Flisser et al., 2008).

Las helmintiosis tisulares son un conjunto de padecimientos ocasionados por

nematodos que invaden los tejidos de su hospedador del cual se benefician

absorbiendo de ellos nutrientes, entre las principales helmintiosis tisulares que

afectan al hombre se encuentran la triquinelosis, la cisticercosis, la fasciolosis, la

equinococosis, la oncocercosis y la toxocariosis (Lamothe-Argumedo y García-

Prieto, 1988).

INTRODUCCIÓN

2

Las estrategias de prevención y control de las helmintiosis han sido diversas y

cambiantes, especialmente en lo que se refiere al “blanco” de las acciones. Debido

a que aún no se cuenta con vacunas, la principal estrategia es la administración

de fármacos antiparasitarios (Belkind-Valdovinos et al., 2004). Entre los fármacos

antiparasitarios cabe destacar a los derivados bencimidazólicos, los cuales son

utilizados como tratamiento de amplio espectro para toda clase de helmintiosis;

asimismo, los nitrotiazoles como la nitazoxanida han sido evaluados

principalmente contra protozoarios, aunque en estudios recientes como los de

Dávila-Gutiérrez y colaboradores (2002) y los de Díaz y colaboradores (2003), han

demostrado su eficacia contra helmintiosis intestinales en humanos. En el trabajo

recientemente publicado por Rodríguez-Morales y colaboradores en 2008

demostraron la eficacia de la nitazoxanida en ratones infectados

experimentalmente con Toxocara canis.

Con respecto a los bencimidazoles utilizados contra Trichinella spiralis (Paget,

1835), son muchos los trabajos que han reportado su efectividad in vivo, en los

que se utilizan modelos murinos inclusive en perros y gatos (Douglas et al., 1993).

En el estudio realizado por Bolas-Fernández y colaboradores en el 2004,

demuestran una actividad importante nematicida contra T. spiralis del ricobendazol

(metabolito activo del albendazol o sulfóxido de albendazol). Con la nitazoxanida,

Fonseca-Salamanca y colaboradores (2003), mostraron que en modelo murino in

vivo, la tizoxanida vuelve inactivas a los gusanos preadultos de T. spiralis. Aunque

in vivo se ha demostrado que con el tratamiento antihelmíntico la carga parasitaria

se disminuye significativamente, ésta no se elimina totalmente y los parásitos que

sobreviven, no pierden su capacidad infectiva (De-la-Rosa et al., 2007). Por lo que

nuestro grupo de trabajo consideró pertinente evaluar compuestos híbridos

formados de la molécula del bencimidazol y la nitazoxanida, considerando que si

se unen estas dos moléculas se tendrá un espectro con acción más amplia y con

mayor efectividad contra Toxocara canis y Trichinella spiralis, empleados como

modelos experimentales.

ANTECEDENTES

3

2. ANTECEDENTES

2.1. El Modelo Experimental

2.1.1. Toxocara canis

Wilder en 1950 describió por vez primera la infección con Toxocara en el ser

humano, identificando una larva de una especie de nematodo desconocido en un

granuloma retinal de un niño; Beaver y colaboradores en 1952 (revisado en

Despommier, 2003) reportaron un caso similar en un grupo de pacientes que

presentaban eosinofilia y enfermedad multisistémica, describiendo así las

características de la larva migrans visceral (LMV). Mediante el análisis

histopatológico de biopsias clasificaron correctamente a los agentes etiológicos de

este padecimiento: Toxocara canis y Toxocara cati (Despommier, 2003).

2.1.1.1. Taxonomía y morfología

La diferenciación de las especies del género Toxocara se basa en las

características morfométricas que han sido descritas por Schacher (1957).

Toxocara es un gusano dioico, en el cual se pueden observar tres regiones, una

anterior donde se encuentra la boca y el anillo nervioso, una media donde se

observa el intestino y una posterior donde se localizan las gónadas y la cloaca. En

la parte anterior se encuentra un par de aletas cefálicas, que le dan las

características diagnósticas del género (Figura 1) y en la boca se observa la

presencia de tres labios bien desarrollados; el extremo posterior del macho

termina arqueado y se observa en él la papila caudal. La diferencia de tamaño

entre machos (10 cm) y hembras (18 cm) es notoria. Otras características

diagnósticas del género son la ornamentación de la cutícula y las espículas

desiguales.

El tamaño aproximado de los huevos es de 80 m y se describen de la siguiente

manera: presentan tres capas que son de color café claro, su cascarón de origen

ANTECEDENTES

4

proteico presenta hendiduras llamadas fosetas y recién que son ovopositados los

embriones son inmaduros (Levine, 1968).

La Clasificación taxonómica de Toxocara spp. se encuentra descrita en la tabla1 y

es una adaptación de la descrita por Bischoff y colaboradores (2003) y De-la-Fé-

Rodríguez y colaboradores (2006).

Tabla No. 1. Clasificación taxonómica de Toxocara spp. (Bischoff et al., 2003; De-

la-Fe-Rodríguez et al., 2006.

Reino: Animalia

Subreino: Eumetazoa

Dominio: Eukaryota

Rama: Protostomia

Grado: Bilateria

Infrareino: Ecdysozoa

Superphylum: Aschelmintes

Phylium: Nemathelmintes

Clase: Cecermentea

Subclase: Rhabditia

Orden: Ascaridida

Suborden: Ascaridina

Superfamília: Ascaridoidea

Família: Toxocaridae

Género: Toxocara

Espécie: T. canis T. lyncis T. vajrasthirae T. paradoxura

T. cati o T. mystax T. alienata T. warreni T. vincenti

T. malaysiensis T. mackerrasae T. canarisi T. indica

T. tanuki T. pteropodis T. genettae T. elephantis

T. vitulorum T pearcei T. apodemi T. manzadiensis

T. cynonycterides T. suricattae T. Sprenti T. hippopotami

ANTECEDENTES

5

Figura 1. Morfología de la parte anterior de Toxocara canis. En el panel A se observa la

parte anterior del gusano adulto con las aletas cefálicas (flecha), mientras que en el panel

B es un acercamiento de la boca donde se observan los labios (Fuente: College of

Veterinary Medicine, University of Georgia, 2007).

2.1.1.2. Ciclo biológico

El ciclo de vida de Toxocara canis comienza con la ingesta (geofagia, común en

niños) de huevos embrionados que contienen la fase juvenil 2 (J2) y estos se

encuentran en el suelo, ya que los perros depositan sus deyecciones ahí.

Posterior a la ingestión de los huevos, los J2 eclosionan en el estómago y se

dirigen al intestino delgado, ahí penetran la pared intestinal, entran en circulación y

migran (término conocido como larva migrans) a todos los órganos a través de los

vasos sanguíneos. En cachorros menores a dos meses de edad, los J2 atraviesan

los alvéolos pulmonares, ascienden a la faringe en donde son deglutidos para

pasar al esófago y de ahí migrar al intestino delgado, donde crecen y maduran

hacia el estado adulto. Los adultos se desarrollan entre los 60 y 90 días post

infección. Los gusanos hembras producen huevos no embrionados y son

eliminados a través de las deyecciones; la embriogénesis ocurre entre los 9 y 15

días a temperaturas de 25 a 30 ºC o en 35 días a temperaturas de 16 ºC (Figura 2)

(Magnaval et al., 2001; Despommier, 2003; CFSPH-IOWA UNIVERSITY, 2005;

Tolan y Laufer, 2007).

A B

ANTECEDENTES

6

Únicamente los cachorros de canes son los hospedadores definitivos de este

helminto, sin embargo el hombre y otros animales solo son hospedadores

paraténicos. La infección por Toxocara canis en caninos también se adquiere por

vía transplacentaria, ya que los J2 migran a través de la placenta (Tolan y Laufer,

2007).

Figura 2. Ciclo biológico de Toxocara canis (Fuente: Cordero del Campillo, 2001).

2.1.1.3. Manifestaciones clínicas y sintomatología

Las manifestaciones clínicas y la sintomatología en el ser humano dependerá del

grado del daño del órgano que haya sido invadido, como hígado, pulmones,

sistema nervioso central (SNC) y ojos, por lo que la enfermedad se conoce como

larva migrans visceral (LMV) o larva migrans ocular (LMO). Asimismo la carga

parasitaria y la edad del hospedador son factores importantes para determinar la

gravedad de la enfermedad (Del-Valle-Guardis et al., 2002; Despommier, 2003).

ANTECEDENTES

7

Los signos y síntomas ocasionados por la LMV son: distensión abdominal, falta de

apetito, inquietud, dificultad para respirar, fiebre, hepatomegalia y necrosis del

hígado, esplenomegalia, tos, broncoespasmos, manifestaciones asmáticas,

miocarditis, nefritis y daño al SNC que puede provocar síntomas

neuropsiquiatricos y encefalopatías (Figura 3), este tipo de infección ocurre en

promedio en la población infantil menor de cinco años. Los datos generados en el

Instituto de Diagnóstico y Referencias Epidemiológicos (InDRE) (De-la-Rosa et al.,

2004) indican una prevalencia de anticuerpos moderadamente alta en personas en

edad productiva (48.1%). También se presenta leucocitosis y eosinofilia.

Además larva migrans estimula la formación de hipergammaglobulinemias e

isohemoglutininas, también puede haber presencia de granulomas secundarios

(Despommier, 2003; Magnaval et al., 2001; Ruíz-Espinosa, 2007; Tolan y Laufer,

2007).

Las manifestaciones clínicas ocasionadas por la LMO principalmente son:

retinoblastoma, visión unilateral en ocasiones acompañada por estrabismo, por

otro lado la invasión en la retina provoca la formación de un granuloma el cual

ocasiona uveitis, endoftalmitis difusa, papilitis, corioretinitis y heteropia. Evidencias

epidemiológicas demuestran que cuando se presentan manifestaciones oculares

no hay manifestaciones sistémicas y viceversa (Magnaval et al., 2001;

Despommier, 2003; Tolan y Laufer, 2007).

ANTECEDENTES

8

Figura 3. Áreas de cuerpo humano en donde se aloja larva migrans (Modificado de

Kelsey, 2002).

2.1.1.4. Diagnóstico

El diagnóstico para la toxocariosis se establece sobre bases clínicas como la

triada: eosinofilia-hepatomegalia-hiperglobulinemia y el síndrome de Löeffler. Los

ensayos inmunológicos como los de inmunoprecipitación y el ELISA en los cuales

se emplean antígenos secretados y recombinates de la fase juvenil 2, muestran

una sensibilidad del 78 % y especificidad del 92 %, demostrando muy buenos

resultados; también se realiza radiología y biopsias de órganos afectados, aunque

la sensibilidad del método no es muy confiable (Canese et al., 2001; Magnaval et

al., 2001; Despommier, 2003; De-la-Rosa et al., 2004).

ANTECEDENTES

9

2.1.1.5. Tratamiento

Para el tratamiento de la toxocariosis la OMS ha recomendado la administración

oral de dietilcarbamacina (DEC), en la cual se ha observado que mata los J2 y

detiene la enfermedad, su dosis se inicia con 1 a 3 mg/kg 2 veces al día hasta

llegar a 3 mg/Kg 2 veces al día, sin embargo debido a las reacciones adversas

que este fármaco ocasiona se ha suspendido su administración. Actualmente y de

manera eficaz se utiliza el albendazol (ABZ) como antihelmíntico de primera línea

(400 mg una vez al día por 5 días), aunque el mebendazol ha sido utilizado como

antihelmíntico secundario, empleando una dosis de 200 a 400 mg divididos

durante 21 días (Despommier, 2003; Chira et al., 2005). Aunque el tiabendazol

(3000 mg dos veces al día por 5 días) y el febendazol (7.5 mg/kg, 25 mg/kg o 50

mg/kg según sea el caso) se han utilizado como fármacos alternos para el

tratamiento (De-la-Fe-Rodríguez et al., 2006).

El grado de eficacia para el tratamiento LMV y LVO es dietilcarbamacina (DEC) >

tiabendazol (TBZ) > albendazol (ABZ) = febendazol FBZ = mebendazol (MBZ),

aunque el DEC como se mencionó antes, no es aceptado por los pacientes debido

a sus reacciones adversas (De-la-Fe- Rodríguez et al., 2006).

2.1.1.6. Distribución geográfica y epidemiología

Epidemiológicamente la toxocariosis es una zoonosis cosmopolita y se encuentra

asociada a perros y gatos, es conocida como una parasitosis doméstica, los

cachorros pueden infectarse a través de la lactancia y en los seres humanos

principalmente los niños, la zoonosis está asociada al “síndrome de pica”, al ingerir

huevos encontrados en la tierra o la arena (cajas de arena). Los parques

recreativos de áreas urbanas y suburbanas son un sitio apropiado para encontrar

huevos de Toxocara spp., debido a que comúnmente es frecuentado por

paseantes y sus mascotas (Despommier, 2003). Los cachorros caninos menores

a seis meses de edad son más afectados que los adultos. Comúnmente un canino

ANTECEDENTES

10

se muestra enfermo cuando presenta síntomas como vómito y diarrea, lo que

atribuye a que pueda tener toxocariosis, sin embargo estos síntomas son tan

comunes que se pueden confundir con una gastroenteritis pasajera. Aunque en

infecciones masivas los cachorros presentan el vientre abultado, lo que facilita un

diagnóstico más especifico a toxocariosis. (Warren y Mahmoud, 1979).

En México no se ha encontrado alta incidencia en la población de caninos

callejeros y por lo tanto la prevalencia es escasa, y aunque se conozca su poder

biótico, en zonas urbanas cada vez es menos frecuente encontrar caninos

infectados, este factor se debe a las campañas de desparasitación (Ruíz-

Espinoza, 2007).

La prevalencia mundial demuestra que el 10% de parques recreativos estudiados

presentan huevos de Toxocara spp. La seroprevalencia de población adulta sana

es de 8.3% y en un estudio de niños asmáticos se encontró que el 28 % de ellos,

resultaron positivos a antígenos de Toxocara canis (Ghiani, 2001). Un ejemplo

citado recientemente por el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos

(InDRE-SSA) en México es el que se observó que en una población abierta de 77

pacientes adultos solo el 2.60 % presentó anticuerpos contra Toxocara ( Jiménez-

Balderas et al., 2008). Y en una población de 302 individuos adultos con signos

complatibles a toxocariosis (eosinofilia, problemas respiratorios o problemas

visuales) se detectaron anticuerpos en el 10.9 % (De-la-Rosa et al., 2004).

2.1.1.7. Profilaxis

La profilaxis empleada principalmente para evitar la infección por T. canis, es

básicamente la higiene personal, higiene de mascotas, asimismo la

desparasitación frecuente de estas últimas y evitar la defecación al aire libre de

canes (Magnaval et al., 2001).

ANTECEDENTES

11

2.1.2. Trichinella spiralis

La triquinelosis es una zoonosis de origen alimentario frecuente en poblaciones en

donde se consume carne de cerdo cruda o insuficientemente cocida (Martínez-

Barbosa et al., 2001). El agente etiológico de la triquinelosis es el nematodo

Trichinella spiralis. El ciclo de vida monoxeno se lleva a cabo en un sólo

hospedador, donde se establece en el músculo esquelético e induce alteraciones

en la estructura celular que incrementan su propia sobrevivencia (Gállego-

Berenguer, 1997).

2.1.2.1. Taxonomía y morfología

La diferenciación de las especies del género Trichinella spp., se basa en las

características morfométricas como el extremo anterior delgado, boca carente de

papilas, faringe con esticocitos, papilas laterales en los machos, la ornamentación

de la cutícula, larvas musculares encapsuladas (Figura 4) y en estudios basados

en pruebas enzimáticas y genéticas (Schmidt y Roberts, 1977).

La clasificación taxonómica de Trichinella spp., se encuentra descrita en la tabla 2

y es una adaptación de la descrita por Bischoff y colaboradores en 2003.

ANTECEDENTES

12

Tabla No. 2. Clasificación taxonómica de Trichinella spp. (Birchoff et al., 2003).

Reino: Animalia

Subreino: Eumetazoa

Dominio: Eukaryota

Rama: Protostomia

Grado: Bilateria

Infrareino: Ecdysozoa

Superphylum: Aschelmintes

Phyllum: Nemathelmintes

Clase: Adenoforea

Subclase: Enoplia

Orden: Enoplida

Suborden: Trichinellina

Superfamília: Trichuroidea

Família: Trichinelloidea

Género: Trichinella

Especie: T. nativa T. pseudospiralis T. britovi

T. spiralis A T. papuae B T6 C

T. murrelli T. zimbabwensis T9

T. nelsoni D

T8

El grupo A se caracteriza por tener una distribución mundial y que presenta

cápsula, el grupo B se caracteriza por que no presenta cápsula además de que su

distribución es mundial, el grupo C se distribuye únicamente en zonas templadas y

el grupo D se distribuye únicamente en zonas cálidas, asimismo los grupos C y D

se presentan en hospedadores específicos.

ANTECEDENTES

13

Figura 4. Morfología de T. spiralis: diferencia de sexos, arreglo de espículas y LM

enquistada. (Fuente: Rodríguez-Uribe, 2003).

2.1.2.2. Ciclo biológico

El ciclo de vida de Trichinella se constituye por dos fases: enteral y parenteral

(Figura 5). En la fase enteral el nematodo adulto dioico se encuentra en el

intestino delgado a nivel de duodeno y yeyuno, la cópula se lleva a cabo a los

cinco días post infección en las paredes de la mucosa y en la luz intestinal, la

hembra libera entre 500 a 1500 larvas recién nacidas (LRN o J1), a partir del

décimo día post infección éstas penetran la mucosa intestinal se dirigen hacia los

vasos sanguíneos y linfáticos hasta entrar a la circulación sistémica invadiendo

múltiples tejidos y encapsulándose únicamente en el músculo estriado en donde

se desarrolla la fase infectiva J2 o larva muscular (LM). En un periodo de 2 a 3

semanas, comenzando así su ciclo de vida parenteral (Despommier, 1983).

El parásito induce en las células musculares modificaciones, iniciando así la

formación de una estructura conocida como “célula nodriza”, la cual es una

Espículas en machos

LRN

Hembra

LM

Macho

ANTECEDENTES

14

asociación entre la larva infectiva y el miocito, a esta nueva entidad se le nombra

como complejo “célula nodriza-larva infectiva” (Despommier et al., 1991).

Figura 5. Ciclo biológico de Trichinella spiralis. (Fuente: Rodríguez-Uribe, 2003).

2.1.2.3. Manifestaciones clínicas y sintomatología

El padecimiento triquinelosis se divide principalmente en tres periodos críticos:

incubación, migración y encapsulamiento (Olsen, 1974). Incubación,

posteriormente del 1ro al 5to día post ingestión se presenta un cuadro

gastroentérico que es comúnmente confundido con gastroenteritis (Kilgore et al.,

1988). Migración, a los 15 días post infección ocurre la migración de las larvas J1

al músculo esquelético y se manifiesta por: dolor muscular durante la respiración,

la conversación, el movimiento ocular o durante el masticado, edema

peripalpebral, agrandamiento de los ganglios linfánticos y se puede presentar

ANTECEDENTES

15

fiebre intermitente. Encapsulamiento: a partir de los 35 a 40 días post infección, la

larva se establece en el músculo esquelético (Figura 6 A) y se caracteriza por

mialgias, artralgias, edema (Figura 6 B) y fiebre (Biagi, 1985).

Figura 6. LM de T. spiralis en la célula nodriza (Foto Ramírez-Melgar) (panel A), Fuente:

InDRE-SSA, 2000 y Edema periorbital (panel B). (Fuente: Medical-Chemical Corporation,

2001).

2.1.2.4. Diagnóstico

Son varias las técnicas para el diagnóstico de la triquinelosis, dichas técnicas se

clasifican en tres importantes tipos:

1. Diagnóstico parasitoscopico que incluye técnicas como triquinoscopía y

digestión enzimática para recuperar larvas musculares (Despommier et al., 1974).

2. Diagnóstico inmunológico que incluye pruebas intradérmicas, fijación del

complemento, hemaglutinación indirecta, floculación de bentonita,

inmunoflorescencia indirecta (IFI), contrainmunoelectroforesis, inmunoensayo

enzimatico (ELISA), difusión en gel-ELISA (DIG-ELISA) e

inmunoelectrotransferencia (IET) o Western Blot. (Gómez-Priego et al., 2000;

Tinoco-Velázquez et al., 2002).

A B

ANTECEDENTES

16

3. Diagnótico molecular que incluye pruebas como reacción en cadena de la

polimerasa (PCR por sus siglas en Inglés) y Southern blot (De-la-Rosa y Gómez-

Priego, 2000).

2.1.2.5. Tratamiento

Para el tratamiento se utilizan los bencimidazoles, más específicamente el

albendazol, aunque el mebendazol se administra como segunda opción, la dosis

de ambos fármacos se administra con 400 mg 3 veces al día seguido de 500 mg 3

veces al día durante 3 días, aunque se ha sugerido que la dosis indicada para

administración vía oral de cualquiera de estos dos derivados es de 50 mg/kg

durante 5 días consecutivos (Thomson-PLM, 2007).

Actualmente se administra el albendazol (específico para LM) y su dosis

terapéutica es de 400 mg/día durante 3 días seguido de 800 mg/día durante 15

días ó de 800 mg/día en dosis divididas, durante 6 días. Asimismo para el

tratamiento sintomático se utiliza analgésicos, antipiréticos y corticosteriodes

(McCracken, 1978; Thomson-PLM, 2007; Correa et al., 2006 revisado en Flisser y

Pérez-Tamayo, 2006).

Sin embargo, según en el artículo publicado por De-la-Rosa y colaboradores en el

2007, al administrar un tratamiento subóptimo (20 mg/kg/día) se presenta alta taza

de reducción de gusanos adultos y LM (73% y 90% respectivamente). Lo que

indica que los helmintos sobrevivientes posiblemente hayan desarrollado algún

tipo de resistencia.

2.1.2.6. Distribución geográfica y epidemiología

La triquinelosis presenta amplia distribución mundial. Es frecuente en América,

(aunque no en México (frecuencia < 5%)) y en algunos países de Europa, poco

frecuente en África y Asia y raramente se encuentra en Oceanía (Gállego-

Berenguer, 1997; De-la-Rosa et al., 1998).

ANTECEDENTES

17

Este padecimiento ha sido estudiado en México desde finales del siglo XIX, en

1862 se descubrió en la ciudad de México que el agente etiológico se encontraba

en carne porcina, y no fue hasta 1891 que se diagnóstico el parásito en cadáveres

de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México

(Mazzotti revisado en Tay-Zavala et al., 2004). Otros estudios reportados en varios

estados de nuestro país han demostrado la presencia de T. spiralis en ratas

(Rattus norvergicus, Berkenhout, 1769), gatos (Felis catus, Schreber 1775) y

perros (Canis familiaris, Linnaeus 1758). Asimismo se han clasificado como de

alta, mediana y baja prevalencia en diferentes estados de la república mexicana

(Ortega-Pierres et al., 1996), (Figura 7).

Figura 7. Distribución de la triquinelosis en la República Mexicana (numerados). Estados

con alta prevalencia (negro): Distrito Federal, Durango, Estado de México y Zacatecas;

estados con mediana prevalencia (café): Chihuahua, Jalisco y Michoacán; Estados con

baja prevalencia (blanco): Aguascalientes, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Nuevo León,

Querétaro, Sonora y Veracruz. (Fuente: Ortega-Pirres y colaboradores, 1996).

En México se han presentado numerosos brotes epidémicos de esta zoonosis, sin

embargo es considerado como un problema económico más que de salud pública,

debido a pérdidas ganaderas y a que el diagnóstico no se realiza con frecuencia

ANTECEDENTES

18

en humanos y por lo tanto son pocos los datos reportados por el Sistema Nacional

de Vigilancia Epidemiológica (Martínez-Barbosa et al., 2000).

2.1.2.7. Profixalis

Como profilaxis para la triquinelosis se cita principalmente consumir carne de

cerdo bien cocida o frita, someter a la congelación prolongada (–20ºC) lo que

causa la muerte de las larvas (estas medidas también se aplican a otro tipo de

carne de consumo humano). Mejorar las inspecciones sanitarias en rastros y

mercados, realizar encuestas, establecer diagnósticos epidemiológicos metódicos,

limitar y establecer mejores cercos sanitarios (Gállego-Berenguer, 1997; NOM-

194-SSA2-2004).

2.2. Inmunología contra Helmintos

Los helmintos parásitos presentan mayor tamaño, tienen estructuras y ciclos de

vida más complejos, por lo que esto hace que presenten mayor número de

antígenos y mayor especificidad por cada etapa de desarrollo del parásito

(Takahashi, 1997).

Los helmintos parásitos inducen una expansión de los linfocitos Th2, dicha

respuesta incluye aumento de concentración de IgE totales, IgG, eosinofilia y

mastocitosis, esta respuesta es inmunitariamente protectora y además se

encuentran citocinas que previenen la patología de algunas parasitosis. Esta

cuestión tiene interés debido a que IgG4 puede bloquear los mecanismos

mediados por IgE aunque ambos isotipos están promovidos por el mismo tipo de

citocinas Th2 (Caballero-Soto, 1998).

Los mecanismos de evasión presentados por los nematodos son los siguientes,

muda de componentes de la superficie de la cutícula, enzimas antioxidantes,

ANTECEDENTES

19

resituación de los tejidos, imitación molecular, camuflaje con moléculas del

hospedador e inmunomodulación (Caballero-Soto, 1998).

La identificación de antígenos que determinan tales respuestas es útil

principalmente para una doble actividad: desarrollar inmunodiagnósticos

provechosos y comprender las bases de la protección inmunitaria, incluso la

proteómica con su consecuente caracterización de antígenos, lo que ayudará a

proponer antígenos como candidatos para vacunas en acción con adyuvantes

(Takahashi, 1997).

2.3. Fármacos antiparasitarios

Los fármacos antiparasitários presentan actividad limitada y en ocasiones

específica contra diversas especies de parásitos, ya sea helmintos o protozoarios.

Los fármacos antiparasitarios en general reúnen las siguientes características:

presentan básicamente carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno, los anillos

aromáticos son muy comunes, sus grupos substituyentes con frecuencia son

metilos y aminos. Los principales mecanismos de acción de los antiparasitarios

son: inhibidores de la síntesis de cofactores, inhibidores de la síntesis de ácidos

nucleicos, inhibidores de la síntesis de proteínas, inhibidores de la síntesis de la

membrana, inhibidores de la función microtubular, inhibidores del metabolismo

energético e inhibidores de la función neuromuscular (específicamente para

artrópodos) (Köhler, 2001; Aparicio et al., 2003).

2.3.1. Antihelmínticos

Los antihelmínticos representan el principal método para el control de

nematodiosis, existen varios tipos, aunque los más importantes son las

avermectinas, bencimidazoles y agonistas nicotínicos. Los fármacos disponibles

comercialmente son: imidazoles, tetrahidropirimidinas, bencimidazoles,

salicilanilidas y avermectinas (Köhler, 2001; Márquez-Lara, 2003).

ANTECEDENTES

20

En muchas ocasiones el descubrimiento de nuevos compuestos químicos para el

control de helmintiosis, han hecho que estos organismos evadan su mecanismo

de acción, por lo que este fenómeno es conocido como resistencia, la cual es

definida como la capacidad que tiene una fracción de la población para tolerar

dosis tóxicas letales, lo que atribuye como característica importante la herencia a

su progene de esta resistencia (Köhler, 2001; Márquez-Lara, 2003).

2.3.1.1. Bencimidazoles

Debido al descubrimiento del tiabendazol en 1961 como potente antiparasitario

sobre helmintos entéricos, se obtuvieron los bencimidazoles (Figura 8) como

antihelmínticos de amplio espectro tanto de importancia clínica y veterinaria

(Craig, 1993; Tracy y Webster, 1996).

Son cientos los derivados que se han probado, como principales ejemplos se

citan: flubendazol, triclabendazol, parbendazol, febendazol, oxfendazol,

oxibendazol, proflubendazol, cianida-bencimidazol y selenio-bencimidazol pero

cabe destacar que los compuestos con mayor utilidad terapéutica son aquellos

que presentan modificaciones en las posiciones 2 y 5 o ambas del anillo del

bencimidazol, los cuales son el mebendazol (MBZ), albendazol (ABZ) y el

tiabendazol (TBZ) ya que los otros se han utilizado en menor escala (Karunakaran

y Denham, 1980; Gómez-Barrio et al., 1986; Latif y Surin, 1993; Tracy y Webster,

1996; De-Silva et al., 1997).

Mucho se cuestiona sobre la eficacia de los derivados del bencimidazol como el

tiabendazol para combatir la etapa muscular de las larvas de T. spiralis,

investigaciones como las de Rodríguez-Caabeiro y colaboradoes (1978) y de Hess

y colaboradores (1986) señalan que otro derivado del bencimidazol (el

mebendazol) elimina más del 80 % de larvas musculares en ratones tratados

después de 4 a 15 días post infección.

ANTECEDENTES

21

Estos derivados del bencimidazol presentan gran actividad antihelmíntica, aunque

su acción no depende de la concentración que alcanza a nivel sistémico, sus

productos son altamente eficaces contra diferentes especies de geohelmintos y

helmintos tisulares, ya sea en infecciones únicas o mixtas. Estos bencimidazoles

presentan actividad tanto en fases adultas como fases larvarias, asimismo

destruyen huevos de tricocéfalos y ascáridos (Tracy y Webster, 1996; De-Silva et

al., 1997).

Los bencimidazoles ocasionan muchos cambios bioquímicos en los nemátodos

sensibles a ellos, tales son como inhibición del fumarato reductasa de

mitocondrias, que es vital para la producción de energía, disminución del

transporte de la glucosa y desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, pero su

principal mecanismo de acción es inhibir la polimerización de microtúbulos al

unirse a -tubulina (Tracy y Webster, 1996; De-Silva et al., 1997; Köhler, 2001;

Márquez-Lara, 2003).

Los bencimidazoles poseen hidrosolubilidad limitada y las pequeñas diferencias de

solubilidad de los derivados ocasionan un efecto mayor de absorción. El

albendazol por ejemplo, fue utilizado por primera vez en 1977 como vermífugo en

ovejas y en el año de 1983 fue aprobado para humanos. Actualmente es el

antihelmíntico más utilizado para combatir la etapa muscular de T. spiralis y J2 de

T. canis, su absorción es variable e irregular y no se detecta en el plasma porque

es metabolizado rápidamente en el hígado formando sulfóxido de albendazol

(ABZ-SO), este metabolito presenta una potente actividad antihelmíntica. Este

importante metabolito alcanza concentraciones máximas de 300 ng/mL, se liga un

70 % a las proteínas plasmáticas, su vida media en el plasma es de 8 a 9 horas y

se distribuye adecuadamente en los tejidos. La formación del ABZ-SO es

catalizada por la flavida monooxigenasa microsómica y en menor magnitud por

algunas formas del citocromo P450, asimismo el ABZ-SO es oxidado para generar

el metabolito de sulfato el cual es inactivo, los metabolitos son excretados por la

orina (Tracy y Webster, 1996; De-Silva et al., 1997).

ANTECEDENTES

22

Se han realizado estudios con respecto a la utilización de nuevos productos

derivados del albendazol como N-metoxycarbonil-N’-((2-nitro-4-propiltio)-fenil1)

tiourea y N-metoxycarbonil-N’-((2-nitro-5-propiltio)-fenil1) tiourea, concluyendo que

no son muy efectivos en la reducción de fase muscular de T. spiralis (menos del

40%) (Yépez-Mulia et al., 1999).

Figura 8. Fórmula general del bencimidazol, con su amina terciaria en la posición 1.

(Fuente: Ruíz-Espinoza, 2007).

2.3.1.2. Nitazoxanida

La nitazoxanida (2-acetiloxi-N-(5-nitro-2-tiazol) benzamida (Figura 9), es un nuevo

compuesto de nitrotiazol benzamida eficaz para el tratamiento de parasitosis

intestinales ya sea por protozoarios y helmintos, fue sintetizada y descrita por

primera vez en 1976 por Rossignol y Cavier e inicialmente su uso fue

exclusivamente veterinario como antihelmíntico contra nematodos y cestodos

intestinales así como para tremátodos del hígado (Fox y Saravolatz, 2005).

En humanos este fármaco ha sido reportado como eficaz contra diversos

protozooarios parásitos como Giardia lamblia (Kunstler, 1882), Entamoeba

histolytica (Schaudinn, 1903) Trichomonas vaginalis (Donné, 1836) entre otros,

asimismo se reporta eficacia en nematodos como Ascaris lumbricoides (Linnaeus

1758) y Trichuris trichura (Linnaeus, 1771) y en platelmintos como Taenia saginata

(Goeze 1782), Hymenolepis nana (Blachard, 1891) y Fasciola hepatica (Linnaeus,

NH

N

ANTECEDENTES

23

1751), aunque también presenta buenos efectos antibacteriales (Fox y Saravolatz,

2005).

Estudios in vitro han demostrado buena actividad contra platelmintos como

Echinococcus spp. y F. hepatica. Sobre nemátodos como Ascaris spp., han

presentado efectos nematicidas arriba de un 70 % y en tricocéfalos arriba del

80 %, sin embargo Díaz y colaboradores reportaron una efectividad del 100 %

contra estos nemátodos y posteriormente Fonseca y colaboradores (2000)

demostraron que 1 g/kg in vitro no presenta actividad contra la fase de preadultos

de T. spiralis (Dávila et al., 2002; Díaz et al., 2003; Fonseca et al., 2003; Fox y

Saravolatz, 2005).

La farmacocinética de la nitazoxanida demuestra que en sangre es rápidamente

hidrolisada por las esterasas plasmáticas en tizoxanida (desacetil-nitazoxanida), el

cual es un metabolito activo. Seguida de una administración oral la tizoxanida

alcanza su concentración máxima en plasma entre 1 a 4 horas, su

biodisponibilidad es mejor si se administra el fármaco con alimentos (Laboratorios

Romark, 2005).

La tizoxanida se une casi un 100 % a las proteínas plasmáticas y su vida media de

eliminación por vía renal es de 7.5 horas, su máxima concentración plasmática es

de 1 g/mL. Su mecanismo de acción se basa en inhibir la polimerización de la

tubulina. La tizoxanida es conjugada por glucuronidación para ser excretada. Otros

metabolitos menores que se han encontrado en orina son ácido salicilúrico, sulfato

de tizoxanida, y trazas de hidroxil-tizoxanida y en heces el salicilato (Fox y

Saravolatz, 2005; Laboratorios Romark, 2005).

ANTECEDENTES

24

Figura 9. Fórmula general de la nitazoxanida con su parte activa nitrotia. (Fuente:

Laboratorios Romark, 2005).

2.3.1.3. Compuestos Híbridos

A su fórmula original de algunos fármacos se les hace modificaciones en sus

diferentes grupos funcionales para disminuir o aumentar su actividad, asimismo se

puede dar origen a moléculas híbridas (Figura 10), las cuales son formadas por

algunas de las agrupaciones de los compuestos originales (asociación molecular).

La asociación de partes distintas o mixtas por formación de enlace covalente en

dicho proceso se denomina hibridación molecular (Korolkovas, 1974).

ANTECEDENTES

25

Figura 10. Hibridación molecular: Se tomó la parte activa de la nitazoxanida y la molécula

del bencimidazol, además se realizó una modificación en la posición 2 para aumentar su

actividad

En el presente trabajo se utilizarán una serie de nuevos compuestos híbridos de la

molécula original del benzimidazol y la nitaxozanida para evaluar su eficacia sobre

larva muscular y nematodo adulto de T. spiralis y el juvenil 2 de T. canis, así como

la larviposición de GA en T. spiralis. Asimismo conocer su efecto que pueda tener

la parte farmacofórica de las moléculas originales.

Se buscarán mejores perspectivas terapéuticas, así como baja toxicidad, buena

eficacia y bajo costo como han demostrado los bencimidazoles originales y la

nitazoxanida.

El grupo de investigación consideró que si se unen en una sola molécula la

estructura del bencimidazol junto con la parte activa de la nitazoxanida, se

generará un compuesto antihelmíntico de mayor espectro y eficacia.

Para la síntesis de estas moléculas se calculó el Clog P, el cual indica la

permeabilidad que tiene una molécula para atravesar una membrana biológica. Se

estima que una molécula debe presentar un valor entre 0 y 2. Por otro lado la

solubilidad acuosa debe ser mayor a 100 g/mL para que no presente problemas

Nitazoxanida con la

nitrotia

Bencimidazol

Compuesto Híbrido

ANTECEDENTES

26

de disolución, sobre todo cuando los compuestos se administran por vía oral

(Ruíz-Espinosa, 2007).

En el presente trabajo de tesis se llevará a cabo la evaluación de la actividad

nematicida de cinco híbridos formados del bencimidazol con el 5-nitro-2-tiazol de

la nitazoxanida (Figuras 11 y 12), previamente sintetizados, los cuales se

representan en la tabla 3.

N

N

R1

R2

R3

R4

Figura 11. Compuesto madre: molécula del bencimidazol en donde se muestran las

posiciones a los cuales se les unen moléculas activas de otros compuestos, halógenos,

azufre o metilos. (Fuente: Ruíz-espinoza, 2007).

Tabla No. 3. Composición de los compuestos híbridos a evaluar

Clave

Posiciones en la molécula del Bencimidazol Peso

Molecular

Clog P R5 R6 R1 R2

VMAS60 Nitrotia* H H CF3 357.268 2.82

VMAS62 Nitrotia* H H SCH3 335.362 2.90

VMAS74 Nitrotia* H CH3 SCH3 349.388 3.02

CPMIV Nitrotia* H CH3 H 303.297 1.86

SAG61 Nitrotia* H H SH 321.331 2.90

R5

R1

R2

R6

ANTECEDENTES

27

* Nitrotia

MOLÉCULAS HÍBRIDAS FORMADAS

VMAS60 VMAS62 VMAS74

NCH3

NC

O

NH

S

N

NO2

SH

NH

NC

O

NH

S

N

NO2

CPMIV SAG61

Figura 12. Compuestos híbridos como resultado de la unión del bencimidazol y la

nitazoxanida, en los cuales se les unió en la posición 5 la nitrotia y en las posiciones 1 y 2

se le realizaron modificaciones uniendo nitrógeno, azufre, metilos y fluor.

N-(5-Nitro-1,3-tiazol-2-il)-2- (triflurometil-1H-bencimidazol

-5-carboxamida

N-(5-Nitro-1,3-tiazol-2-(metilsulfuro)-1H-bencimidazol-

5-carboxamida

1-Metil-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-2-(metilsulfuro)-bencimidazol-5-

carboxamida

1-Metil-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-1H-1H-bencimidazol-5-

carboxamida

N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-2- (tiol)-1H-bencimidazol-5-

carboxamida

SCH3

NCH3

NCNH

S

N

NO2

O

SCH3

NH

NC

O

NH

S

N

NO2

CF3

NH

NC

O

NH

S

N

NO2

JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS

28

3. JUSTIFICACIÓN

La nitazoxanida y compuestos derivados del bencimidazol, como el albendazol y el

mebendazol, han demostrado actividad antihelmíntica. De acuerdo a la bibliografía

el más efectivo para tratar las nematodiosis es el albendazol, mientras que la

nitazoxanida es un fármaco alterno para la eliminación de parasitosis intestinales.

Ambos compuestos no eliminan el 100 % de las formas parasitarias, ya sea por la

baja biodisponibilidad de los fármacos y/o la resistencia antihelmíntica descrita

recientemente que sus metabolitos han seleccionado. En la literatura no se

describen estudios sobre la efectividad de la nitazoxanida en nematodiosis

tisulares. Por las razones anteriormente expuestas, en el presente trabajo se

evaluará la posible actividad nematicida de cinco nuevos compuestos híbridos de

la fórmula original del bencimidazol y la nitazoxanida sobre diferentes etapas de

desarrollo de T. spiralis y larva migrans de T. canis.

4. HIPÓTESIS

El albendazol y la nitazoxanida de manera independiente presentan una

importante actividad nematicida. Si utilizamos compuestos híbridos de la fórmula

original de ambas moléculas su acción se potencializará, entonces se esperaría

una actividad nematicida similar o esta aumentaría por el efecto sinérgico.

OBJETIVOS

29

5. OBJETIVOS

5.1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad nematicida en Toxocara canis y Trichinella spiralis de cinco

nuevos compuestos híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida, denominados

como: VMAS60, VMAS62, VMAS74, SAG62 y CPMIV.

5.2. OBJETIVOS PARTICULARES

1. Evaluar in vitro el efecto parasiticida de los compuestos híbridos sobre la

motilidad del estadío juvenil 2 de T. canis y la larva muscular de T. spiralis.

2. Evaluar in vivo el efecto de los compuestos híbridos sobre la infectividad de la

larva muscular de T. spiralis a través del índice de capacidad reproductiva.

3. Evaluar in vitro el efecto parasiticida y/o inhibidor de la fecundidad de los

compuestos híbridos sobre el adulto de T. spiralis.

DIAGRAMA DE FLUJO

30

6. DIAGRAMA DE FLUJO DEL DESARRROLLO EXPERIMENTAL

Estandarización de las técnicas para obtención de los helmintos

Trichinella spiralis Toxocara canis Propagación y mantenimiento en Embrionación, eclosión y mantenimiento medio de cultivo de LM y GA en medio de cultivo de J2

Tratamiento de los cinco compuestos híbridos del bencimidazol y la nitaxozanida a

concentraciones logarítmicas de 0.01 a 100 g/mL Periodo de Incubación de 2 y 6 horas

Someter 20 nemátodos de cada especie por concentración

Evaluar la motilidad en los parásitos del experimento de acuerdo al método realizado por Kiuchi y colaboradores en 1987

5 corridas por 5 replicas cada una Viabilidad Índice de capacidad reproductiva Índice de larviposición Cristal violeta al 1 % en LM de T. spiralis en GA de T. spiralis J2 de T. canis LM de T. spiralis GA de T. spiralis

Registro de Resultados

Análisis y discusión de Resultados

MATERIALES Y MÉTODOS

31

7. MATERIALES Y MÉTODOS

7.1. Evaluación in vitro de los compuestos híbridos del bencimidazol y la

nitaxozanida (VMAS60, VMAS62, VMAS74, SAG61 y CPMIV) sobre la

motilidad de los modelos experimentales J2 de Toxocara canis, LM de

Trichinella spiralis y GA de Trichinella spiralis

7.1.1. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de la fase juvenil 2 (J2)

de Toxocara canis

Para la obtención de los nematodos adultos de Toxocara canis sólo se emplearon

perros que fueron sacrificados en los centros antirrábicos del Estado de México

(Ecatepec) y en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán de la UNAM, de los

cuales fueron extraídos los parásitos.

1. Se obtuvieron especimenes hembras de T. canis a partir de necropsias de

cachorros caninos mayores a 5 semanas de nacidos, infectados naturalmente. Se

diseccionó el intestino delgado de los cachorros y se colectaron los nematodos

adultos (Figura 13 A).

2. Los adultos hembras de T canis se lavaron con solución salina y sobre una

charola de disección se separó la parte media del pseudoceloma del nematodo

para extraerle el útero. Los ejemplares machos se descartaron (Figura 13 B y C).

3. El útero se lavó con PBS 1X y se colocó en una solución de formol al 1 %

disuelto en PBS 1X. Posteriormente se seccionó para liberar la mayor cantidad de

huevos. Los huevos inmaduros se colocaron en una solución de formol al 1 % a

temperatura ambiente y se incubaron durante 4 semanas.

4. Posteriormente al periodo de incubación, se observó que los huevos ya

presentaban el estadío juvenil 2 (estadío infectivo de la enfermedad toxocariosis)

(Figura 13 D). Los diferentes rendimientos de embrionación (obtenidos en


32

porcentaje) hasta J2 de T. canis de los tres lotes adquiridos (cada uno consistente

en aproximadamente 2500 huevos) se obtuvieron a 30 ± 10 %, 40 ± 10 % y

70 ± 10 % y pueden ser atribuibles a los mecanismos que se siguieron en el

sacrificio de los cachorros.

5. Los huevos embrionados se lavaron varias veces con solución salina 0.8 % por

centrifugación y resuspensión alternadas. Posterior al último lavado el botón

resultante se resuspendió en una solución de hipoclorito de sodio al 1 % y se agitó

manualmente durante 20 minutos (De-Savigny, 1975).

6. Transcurrido este tiempo y en condiciones estériles, los huevos de T. canis se

lavaron 4 veces con solución salina al 0.8 % estéril por centrifugación y

resuspensión alternadas. Posteriormente se lavaron 4 veces con medio de cultivo

(MEM + glucosa) estéril por centrifugación y resuspensión alternadas.

Figura 13. Colección de T. canis del intestino de un canino (panel A), Adultos de T. canis

en solución salina (panel B), Extracción del útero de hembras de T. canis (panel C) y

Embrionación en huevos de T. canis, se observa la presencia de la fase juvenil 2 de

izquierda a derecha (400X) (panel D).

B A C

D


33

7. El cuarto lavado no se desecho si no se resuspendió junto con el botón de

huevos y se colocó en agitación magnética durante una hora en condición estéril.

Este procedimiento se realizó para acelerar el proceso de eclosión de los J2 de T.

canis. Se observó que los J2 se liberaron del cascarón (Figura 14 A y B).

8. Para separar los J2 del cascarón se utilizaron microembudos tipo Baermann, los

cuales consistieron en una pipeta tipo Pasteur de vidrio a la cual se le adiciona un

trozo de algodón y esta se colocó dentro de un tubo de vidrio de 1.6 cm x 12.5 cm

con tapón de rosca, dicho sistema se esterilizó en autoclave (Adams y Kayes,

1979) (Figura 14 C).

9. Antes de la separación en condición estéril, se adicionó MEM + glucosa dentro

del tubo hasta cubrir el algodón, después se le agregó lentamente la suspensión

de huevos utilizando una pipeta tipo Pasteur (1 mL por tubo).

10. El cultivo se incubó en estufa bacteriológica a 37ºC y en cámara de CO2

durante 24 horas.

11. Posterior al cultivo, con mucho cuidado se retiró la pipeta tipo Pasteur y se

recuperaron los J2 del fondo del tubo. Estos se guardaron en un tubo estéril con

medio de cultivo a 37ºC hasta su evaluación con los compuestos (Figura 14 D).


34

Figura 14. Eclosión de los J2 (400X y 100X) (panel A y B), Microembudos tipo Baermann

(Panel C) y J2 de Toxocara canis, liberadas en medio de cultivo (100X) (panel D).

7.1.2. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de larvas musculares

(LM) de Trichinella spiralis

1. Se obtuvo la cepa MSUS/México/92/CM-92 de Trichinella spiralis de un modelo

murino y se propagó en ratas cepa Wistar machos y edad adulto joven (250-300 g)

a la dosis oral infectiva de 28 LM por gramo de peso por rata (se utiliza una

micropipeta de 100 L para administrar solamente 100 L de solución con las LM)

(Figura 15 A) (De-la Rosa y Correa, 1996).

2. Al cabo de 40 días post infección (dpi) se le realizó la necropsia a una rata y se

obtuvo el diafragma, lengua, músculo esquelético y maceteros, asimismo se

extrajeron las vísceras, la cabeza y la piel, los cuales fueron desechados.

A B

C D


35

3. Se partió la carcasa junto con los huesos en pedazos pequeños y se molieron, a

esta molienda se le agregó pepsina (0.1 g por cada gramo de peso), agua y HCl a

37.9% (0.1 mL por cada gramo de peso) y se procedió a digerir a 37ºC durante 3

horas (Figura 15 B, C y D).

4. Se sedimentó el producto de la digestión para que las LM por gravedad

formaran un botón de color rosado en el fondo de la copa de sedimentación, este

se recuperó y se lavó varias veces con PBS 1X hasta que estuviera libre de

detritus (Figura 15 E y F).

5. Transcurrido este tiempo y en condiciones estériles las LM de T. spiralis se

lavaron 4 veces con PBS 1X estéril por centrifugación y resuspensión alternadas.

Posteriormente se lavaron 4 veces con medio de cultivo (MEM + glucosa) estéril

por centrifugación y resuspensión alternadas.

6. Se colocaron las LM en un tubo cerrado con MEM + glucosa estéril a

temperatura ambiente hasta su evaluación con los compuestos (no más de 48

horas) (Figura 15 G).


36

Figura 15. Infección de T. spiralis por vía oral en modelo murino (panel A), Carcasa

(panel B), Molienda (panel C), Digestión enzimática a 37°C (panel D), Embudos de

sedimentación (panel E), T. spiralis liberadas de la célula nodriza, 10X (panel F) y

mantenimiento de T. spiralis en medio de cultivo (panel G).

7.1.3. Obtención y mantenimiento en medio de cultivo de gusanos adultos

(GA) de Trichinella spiralis

1. De la cepa propagada, se obtuvieron LM de T. spiralis a los 45 días post

infección y se infectaron ratones cepa CD1 o ratas cepa Wistar, ambos machos

adultos jóvenes (250-300 g) a la dosis infectiva de 28 LM por gramo de peso por

ratón.

2. Los gusanos adultos se obtuvieron a partir de la disección del intestino delgado

del murino a los 7 días post infección (Dennis y Despommier, 1970). En este

método se sacrificó al murino por dislocación cervical, ya que el éter mata a los

adultos de T. spiralis (Figura 16 A).

E

C B

D

A

F

G


37

3. Se realizó un corte longitudinal al intestino, se colocó en una rejilla sumergida

en una solución de PBS 1X a 37ºC y se incubó durante 2 horas (Figura 16 B).

4. Pasado este periodo los gusanos adultos machos y hembras se recuperaron de

la solución mediante centrifugación a 3500 rpm y se lavaron varias veces con PBS

1X, hasta que estuvieran libres de detritus (Figura 16 C).

5. Transcurrido este tiempo y en condiciones estériles los GA de T. spiralis se

lavaron 4 veces con PBS 1X estéril por centrifugación y resuspensión alternadas.

Posteriormente se lavaron 4 veces con medio de cultivo (MEM + glucosa) estéril

por centrifugación y resuspensión alternadas. Se prosiguió a evaluar el efecto

nematicida de los compuestos experimentales.

Figura 16. Disección del intestino delgado del murino experimentalmente infectado (panel

A), Incubación para la obtención de los gusanos adultos (panel B) y Gusanos adultos de

T. spiralis recuperados (100X), se observa la hembra (a) y el macho (b).

A B

b

b

a

C


38

7.1.4. Determinación in vitro de la actividad nematicida de los compuestos

híbridos el bencimidazol y la nitazoxanida

1. Se evaluó in vitro la posible actividad nematicida de cinco nuevos compuestos

híbridos del bencimidazol y nitazoxanida (clave VMAS60, VMAS62, VMAS74,

CPMIV y SAG61) sobre la motilidad y viabilidad los J2 de Toxocara canis, las LM

de T. spiralis y los GA de T. spiralis, de igual manera se evaluó el albendazol

(como derivado del bencimidazol mas común en el tratamiento de la toxocariosis y

triquinelosis) y la nitazoxanida (fármaco alterno utilizado contra helmintiosis

tisulares).

2. Se obtuvieron los compuestos experimentales y los dos antihelmínticos

comerciales para aplicar éstos últimos como controles positivos, los cuales se

estandarizaron (se realizaron diluciones logarítmicas) de acuerdo a la

biodisponibilidad del albendazol y de la nitazoxanida (concentración máxima

plasmática / tiempo) señalada por los laboratorios GlaxoSmithKline® y Romark®.

Como testigos negativos se utilizó el medio de cultivo sin compuestos a evaluar y

dimetil sulfóxido (DMSO).

3. Sobre una placa de cultivo estéril de 96 pozos se colocó una serie de

concentraciones logarítmicas de 100 g/mL a 0.01 g/mL de los compuestos

problema, se utilizó como disolvente DMSO, el cual al evaluar los fármacos este

no debió ser mayor a 2.5 %.

4. En cada pozo de la placa de cultivo se colocó un volumen de 100 L con una

suspensión de 20 gusanos fase juvenil 2 o 20 larvas musculares o gusanos

adultos (T. canis y T. spiralis respectivamente).

5. Cada placa de cultivo se dejo en incubación por periodos de 2, 6 y 12 horas a

37ºC, se utilizaron estos rangos considerando el tiempo máximo de la

concentración plasmática del albendazol y la nitazoxanida, asimismo la vida media


39

de ambos fármacos (Figura 17) (Tracy y Webster, 1996; Laboratorios Romark,

2005)

6. El siguiente criterio se empleó para evaluar la motilidad a los J2, las LM y los

GA después de haberse sometido al tratamiento, asignando una escala de mayor

a menor de acuerdo a lo reportado por Kiuchi y colaboradores en 1987:

Movimiento del todo el cuerpo: 3

Movimiento de la mitad del cuerpo: 2

Motilidad de una parte del cuerpo ó LM de T. spiralis enrollada: 1

Muerto: 0

7. La viabilidad se observó tiñendo los helmintos con el colorante vital cristal

violeta al 1 %, siguiendo el criterio de que si se teñían en su totalidad éstos

encontraban muertos.

Figura 17. Placa de cultivo con helmintos y compuestos experimentales.

7.1.5. Efecto de los compuestos híbridos sobre el Índice de la capacidad

reproductiva o capacidad infectante (RCI por sus siglas en inglés) en LM de

Trichinella spiralis

1. Se evaluó el Índice de capacidad reproductiva de cinco nuevos compuestos

híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida (clave VMAS60 VMAS62, VMAS74,

SAG61 y CPMIV) sobre la fase LM de Trichinella spiralis.


40

2. Para realizar este experimento se colocaron sobre una placa de cultivo de 24

pozos una serie de concentraciones logarítmicas de 100 g/mL a 0.1 g/mL de los

compuestos problema y los testigos. Se consideró la biodisponibilidad máxima del

albendazol de 0.250 a 0.300 g/mL y la nitazoxanida de 1 g/mL (Tracy y Webster,

1996; Laboratorios Romark, 2005).

3. En cada pozo de la placa de cultivo se colocó un volumen de 500 L con una

suspensión de 600 larvas musculares (LM).

4. La placa se dejó en incubación durante 2 y 6 horas a 37ºC, se utilizó este rango

considerando el tiempo máximo de la concentración plasmática del albendazol y la

nitazoxanida (Tracy y Webster, 1996; Laboratorios Romark, 2005).

5. Posteriormente a esos periodos de incubación, se recuperaron las LM y se

lavaron tres veces con PBS 1X para eliminarles el exceso de los compuestos. In

vivo las LM se utilizaron para infectar a ratones cepa CD1 agrupados de acuerdo a

cada compuesto experimental y a cada dosis de tratamiento. De manera que por

cada compuesto experimental (n = 9) y cada tratamiento (n = 4) fueron 5

repeticiones, aunado a que los experimentos se hicieron con 2 y 6 horas de

incubación.

6. El Índice de capacidad reproductiva o capacidad infectante se calculó de

acuerdo a la fórmula:

No. de LM recuperadas por ratón

RCI =

No. de LM administradas por ratón


41

7.1.6. Efecto de los compuestos híbridos sobre el índice de larviposición de

adultos hembras de Trichinella spiralis

1. Los gusanos adultos posterior a la exposición con los compuestos, se incubaron

a 37ºC durante 24 horas para que las hembras larvipusieran, en este periodo se

obtiene un máximo de larvas recién nacidas (LRN) liberadas.

2. Pasado las 24 horas se realizó el conteo de LRN y de gusanos adultos hembras

3. El Índice de larviposición se calculó mediante la fórmula:

No. de Larvas recién nacidas IL =

No. de Gusanos adultos hembras

7.1.7. Análisis estadístico

1. Se realizó análisis porcentual de la escala de motilidad, índice de capacidad

infectante e Índice de larviposición (Daniels, 1992).

2. Se realizó un análisis de varianza monofactorial, para encontrar semejanzas y

diferencias entre los grupos experimentales y las escalas de motilidad con ayuda

de el Sofware Excel(R) 2003.

RESULTADOS

42

8. RESULTADOS

8.1. Efecto in vitro de los compuestos híbridos del bencimidazol y la

nitaxozanida sobre la motilidad del segundo estadío juvenil (J2) de Toxocara

canis.

Los datos de todos los grupos de tratamiento fueron analizados por la prueba de

varianza monofactorial (ANOVA). Asimismo se analizó la interacción entre el

efecto nematicida y tratamiento.

El criterio para evaluar la motilidad fue implementado de acuerdo a lo reportado

por Kiuchi y colaboradores en 1987, de tal manera que la escala se muestra en

cuatro diferentes colores, representándose así: escala 3, movimiento de todo el

cuerpo y de color negro, escala 2, movimiento de la mitad del cuerpo y de color

azul rey, escala 1, movimiento de una parte del cuerpo y de color azul claro y

escala 0, muerta y de color blanco.

La figura No. 18 muestra la escasa actividad nematicida de los compuestos

híbridos sobre los juveniles 2 de T. canis (promedio de la motilidad relativa) y

testigos. A una concentración de 100 g/mL la nitazoxanida registró alta

mortalidad a las 2 horas postratamiento, mostrando una diferencia significativa (p

= 0.0001) con relación al control negativo (DMSO) y los demás compuestos. A las

6 horas la actividad nematicida fue más notoria, aproximadamente la motilidad del

No. 1 aumentó un 10 % (p = 0.034).

El albendazol presentó menor actividad nematicida (motilidad No. 0) y disminución

de la motilidad vigorosa (No. 1) en comparación con la nitazoxanida. A todos los

tiempos registrados, la actividad de los compuestos híbridos fue menor o

semejante a la originada por el albendazol, no se registró diferencia significativa

en la disminución de la motilidad (p > 0.05).

RESULTADOS

43

La nitazoxanida presentó mayor mortalidad a dosis de 10 g/mL en el periodo de 2

y 6 horas postratamiento en comparación con el testigo negativo DMSO, sin

embargo estas diferencias no fueron tan marcadas en las lecturas de las 12 horas

y por lo tanto éstas no fueron significativas (p > 0.05) con la actividad de los

compuestos híbridos.

A las 12 horas de tratamiento el efecto de los compuestos híbridos sobre la

motilidad y viabilidad no fue posible determinarlo, ya que el control sin compuestos

mostró que las condiciones ambientales afectaron a los J2, por lo tanto los

resultados a las 12 horas presentan gran heterogeneidad en los grupos testigos,

por lo que los datos no fueron considerados para el análisis de resultados.

Se muestran los resultados obtenidos con: VMAS60 (1), VMAS62 (2), VMAS74

(3), CPMIV (4), SAG61 (5), NTZ (6), ABZ (7), DMSO (8) y Sin tratamiento (9).

RESULTADOS

44

Figura 18. Efecto de los compuestos híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida así como

los testigos sobre juveniles 2 de T. canis, tratados con una concentración de 0.01, 0.1, 1,

10 y 100 g/mL, medida a través de la motilidad (promedio de la motilidad relativa).

Lectura a las 2, 6 y 12 horas.

0.01 g/ml

2 Horas 6 Horas 12 Horas Horas

10 g/ml

0.1 g/ml

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

100 g/ml

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Compuestos y testigos

1 g/ml

3 1

2 0

RESULTADOS

45

8.2. Viabilidad de juveniles 2 de Toxocara canis

Para observar la viabilidad de los J2 se utilizó el colorante vital cristal violeta al

1 %, el cual no tiñó a los J2 cuando éstos estaban viables. En general la prueba

coincide con número registrado de ejemplares vivos y muertos (Figura 19).

Figura 19. Micrografías de J2 viable (panel A) y J2 no viable, completamente teñida

(panel B) a 400 X.


nitaxozanida sobre la motilidad de la larva muscular (LM) de Trichinella

spiralis (LM)

A partir de los modelos murinos infectados experimentalmente con T. spiralis se

obtuvo un número considerable de LM (por cada 7000 LM como dosis de infección

se logró una recuperación de 100,000 LM a los 40 días post infección).

Los datos de los grupos de cada tratamiento fueron analizados por la prueba de

varianza monofactorial (ANOVA). Asimismo se analizó la interacción entre el

efecto nematicida y tratamiento.

A B

RESULTADOS

46

El criterio para evaluar de la motilidad fue implementado de acuerdo a lo reportado






La figura No. 20 muestra la actividad nematicida sobre ejemplares LM de T.

spiralis tratados con los compuestos híbridos (promedio de la motilidad relativa) y

testigos. A dosis de 100 g/mL ninguno de los compuestos activos presentó

actividad nematicida semejante a la nitazoxanida y al albendazol después de las 2

horas de incubación. Aunque disminuyó la motilidad relativa de T. spiralis durante

el tiempo de exposición a los compuestos experimentales, ninguno de ellos

presentó actividad nematicida a las 6 horas.

La nitazoxanida a 100 g/mL disminuyó la motilidad en LM a partir de las 2 horas

postratamiento (p = 0.007 (Motilidad No. 3), p = 0.525 (Motilidad No. 2), p = 0.014

(motilidad No. 1), valores con diferencia significativa al compararla con el DMSO, y

los grupos experimentales. Asimismo la nitazoxanida utilizada a 10 g/mL,

presentó una diferencia significativa a las 6 horas postratamiento (0.029 (motilidad

No. 3), 0.671 (motilidad No. 2), 0.766 (motilidad No. 1)) en comparación con el

DMSO y los grupos experimentales.

Después del tratamiento con 1 g/mL, 0.1 g/mL y 0.01 g/mL, se observó una

actividad nematicida nula sobre los ejemplares LM de T.spiralis tratados con los

compuestos híbridos.

Aunque disminuyó la motilidad relativa de T. spiralis durante el tiempo de

exposición a los compuestos experimentales, ninguno de de ellos presentó

actividad nematicida a las 12 horas. En general todos los compuestos

experimentales y testigos mostraron un patrón similar, el análisis estadístico

RESULTADOS

47

corroboró que no hay diferencia significativa entre los grupos experimentales y

controles (p > 0.05).



RESULTADOS

48


los testigos sobre larvas musculares de T. spiralis, tratadas con una concentración de

0.01, 0.1, 1, 10 y 100 g/mL, medida a través de la motilidad (promedio de la motilidad

relativa). Lectura a las 2, 6 y 12 horas.

1 g/ml

0.1 g/ml

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0.01 g/ml

10 g/ml

100 g/ml

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Compuestos y Testigos


3 1

2 0

RESULTADOS

49

8.4. Viabilidad de larvas musculares de Trichinella spiralis

En la figura 21 se observa la viabilidad de las LM, se utilizó el colorante vital cristal

violeta al 1 %, el cual indicó si una LM fue viable o no, observando LM sin teñir y

completamente enrollada (viable) o teñida en su totalidad y además adquirieron

forma de garfio (no viable).

Figura 21. Micrografías de Trichinella spiralis. LM viable (enrollada) a 1000 X y LM no

viable (forma de garfio y completamente teñida) a 400 X (panel A y B respectivamente).

8.5. Efecto de los compuestos híbridos del bencimidazol y la nitaxozanida

sobre el índice de capacidad reproductiva de Trichinella spiralis (LM).

El índice de capacidad reproductiva (RCI) o índice de capacidad infectante fue

calculado mediante la fórmula correspondiente al número de LM recuperadas

entre el número de larvas administradas (n = 120). Los datos de todos los grupos

de tratamiento fueron analizados por la prueba de varianza monofactorial ANOVA.

Asimismo se analizó la interacción entre el efecto nematicida y tratamiento.

El análisis de datos con ANOVA muestran diferencias significativas al utilizar los

compuestos y testigos a una concentración de 100 g/mL y 10 g/mL en un

periodo de tratamiento de 2 y 6 horas, sin embargo ya no se presenta diferencia

A B

RESULTADOS

50

significativa a las concentraciones de 1 y 0.1 g/mL, en un periodo de 2 y 6 horas

post tratamiento.

La figura No. 22 muestra el índice de capacidad reproductiva (RCI) de ejemplares

LM de T. spiralis tratados con los compuestos experimentales (promedio de RCI ±

DS) y testigos. La lectura se realizó a las 2 y 6 horas. Se presentaron valores con

diferencia significativa (p = 0.0003 y p = 0.0012) a partir de las 2 horas, en la

reducción del RCI al tratar LM con los compuestos VMAS60 (el 95 %), VMAS62

(el 98 %), albendazol (el 99 %) y nitazoxanida (el 98 %) a una concentración de

100 g/mL, los cuales se compararon con el DMSO (47 %).

Los valores estadísticos del índice de capacidad reproductiva de las LM de T.

spiralis tratadas con una concentración de 10 g/mL, mostraron diferencia

significativa (p < 0.05) en la reducción del RCI al utilizar el compuesto VMAS60 y

los fármacos testigos de referencia albendazol y nitazoxanida.

Después del tratamiento con 1 g/mL y 0.1 g/mL con los compuestos

experimentales, el RCI de las LM de T. spiralis, demostró que los valores

estadísticos no tuvieron diferencia significativa (p > 0.05) en la reducción de carga

parasitaria, comparándolos con el DMSO.



RESULTADOS

51

Figura 22. Índice de capacidad reproductiva de las LM tratadas con los compuestos

híbridos del bencimidazol y la nitazoxanida (promedio de RCI en los compuestos

experimentales) a una dosis de 0.1, 1, 10, 100 g/mL. La lectura se llevó a cabo a las 2

horas y a las 6 horas.

1 g/ml

10 g/ml

0.1 g/ml

100 g/ml

2 Horas 6 Horas

0

40

80

0

40

80

0

40

80

0

40

80

0

45

90

0

45

90

0

50

100

0

50

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9


RESULTADOS

52


nitaxozanida sobre la motilidad del estado adulto de Trichinella spiralis

A partir de modelos murinos infectados experimentalmente con T. spiralis se

obtuvo un número considerable de gusanos adultos (por cada 7000 LM como

dosis de infección se logró una recuperación de 700 GA a los 6 días post

infección, extraídos del intestino delgado).

Para realizar éste experimento, los datos de todos los grupos de tratamiento

fueron analizados por la prueba de varianza monofactorial (ANOVA). Asimismo se

analizó la interacción entre el efecto nematicida y tratamiento.

El criterio para evaluar de la motilidad fue implementado de acuerdo a lo reportado






En la figura No. 23 se muestran los resultados obtenidos posterior al tratamiento

con de los compuestos híbridos, en los cuales se observó escasa actividad

nematicida (promedio de la motilidad relativa) y testigos, sobre GA de Trichinella

spiralis. Con una dosis de 100 µg/mL, todos los compuestos presentaron un patrón

similar, aunque se ve una reducción de motilidad No. 2. con el albendazol a las 6

horas postratamiento, por lo que el 100% de los GA presentó una motilidad No. 1,

obteniendo así un valor estadístico significativo (p = 0.004) en relación a los

demás compuestos experimentales y el DMSO.

Al tratar con los compuestos híbridos a concentraciones de 10 g/mL, 1 g/mL,

0.1 g/mL y 0.01 g/mL se observa la escasa actividad nematicida sobre los GA

de T. spiralis. Todos los compuestos presentaron un patrón similar, por lo que no

RESULTADOS

53

se presenta diferencia significativa entre los grupos experimentales y testigos

(p > 0.05).

A las 12 horas de tratamiento el efecto de los compuestos sobre la motilidad y

viabilidad no fue posible determinarlo, ya que los controles sin fármacos mostraron

que las condiciones del ambiente afectaron a los GA. Por lo tanto los resultados

no fueron considerados en el análisis.



RESULTADOS

54


los testigos sobre gusanos adultos de T. spiralis, tratados con una concentración de 0.01,

0.1, 1, 10 y 100 g/mL, medida a través de la motilidad (promedio de la motilidad relativa).

Lectura a las 2, 6 y 12 horas.


100 g/ml

10 g/ml

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 g/ml

0.1 g/ml

0.01 g/ml


3 1

2 0

RESULTADOS

55

8.7. Viabilidad en adultos de Trichinella spiralis

Para observar la viabilidad del estado GA se utilizó el colorante vital cristal violeta

al 1 %, el cual no tiñó a los GA viables. En general, la prueba coincide con el

número registrado de ejemplares vivos y muertos (Figura 24).

Figura 24. Micrografía de Trichinella spiralis: Gusano adulto viable y no viable

(completamente teñido) a 400 X (panel A y B respectivamente).

8.8. Efecto in vitro de cinco compuestos híbridos del bencimidazol y la

nitaxozanida sobre la índice de larviposición (IL) de Trichinella spiralis

(gusanos adultos)

Para el análisis de datos, el índice de larviposición (IL) fue calculado mediante la

fórmula correspondiente al número de larvas recién nacidas (LRN) recuperadas

entre el número de gusanos adultos hembras. Se realizó la lectura a las 24 horas

postratamiento, después de evaluar la motilidad de los gusanos adultos. Este

tiempo fue considerado para tener el máximo de LRN y poder de esta manera

realizar el conteo con más exactitud. Los datos de todos los grupos de tratamiento

fueron analizados por la prueba de varianza monofactorial ANOVA.

A B

RESULTADOS

56

En la figura No. 25 se presenta el índice de larviposición (IL) de ejemplares GA

hembras de T. spiralis tratados. En el eje de las ordenadas se representan los

compuestos y testigos y en el eje de las abscisas se representa el índice de

larviposición.

A la concentración de 100 g/mL (Promedio de IL ± DS) y testigos, se presentó un

valor significativo (p = 0.0002), en la reducción del IL (95 %) al utilizar los

compuestos VMAS60, VMAS62 y los fármacos de referencia, en comparación con

el DMSO.

El índice de larviposición (IL) de ejemplares LM de T. spiralis tratados con los

compuestos híbridos a las concentraciones de 10 g/mL, 1 g/mL, 0.1 g/mL y

0.01 g/mL, con un periodo de incubación de 24 horas, no presentó diferencia

significativa (p > 0.05), por lo que se estableció que únicamente hubo efecto sobre

el índice de larviposición al utilizar una concentración de 100 g/mL.

RESULTADOS

57

0

40

80

VMAS60

VMAS62

VMAS74

SAG61

CPM

IVNTZ

ALB

DM

SO

SIN T

x

Índ

ice d

e larv

ipo

sic

ión

0

50

100

VMAS60

VMAS62

VMAS74

SAG61

CPM

IVNTZ

ALB

DM

SO

SIN T

x

Índ

ice d

e larv

ipo

sic

ión

100 g/ml

0.01 g/ml

0.1 g/ml1 g/ml

10 g/ml

Figura 25. Índice de larviposición (Promedio de IL) de los GA hembras tratadas con los

compuestos experimentales a la concentración de 100, 10, 1, 0.1 y 0.01 g/mL.

RESULTADOS

58

En la figura No. 26 se muestran larvas recién nacidas, después de 24 horas de

incubación postratamiento, las micrografías no registran daños aparentes con el

aumento utilizado (400 X).

Figura 26. Micrografías de LRN de Trichinella spiralis, las flechas señalan las LRN. No se

observaron alteraciones (400X).

DISCUSIÓN

59

9. DISCUSIÓN

Los estudios que se han realizado in vitro con helmintos, donde se ha demostrado

la actividad nematicida de algunos compuestos químicos, aún no han utilizado

compuestos híbridos de moléculas líderes en la industria farmacéutica, las cuales

se administran para la eliminación de parasitosis, tales como los carbamatos

derivados del bencimidazol (albendazol, mebendazol, etc.) y el nitrotiazol

benzamida (Holt, et al., 1981; Laboratorios Romark, 2005).

En el presente trabajo se observó que la nitazoxanida presenta in vitro 2 veces

más actividad nematicida en comparación al albendazol, dicho resultado puede

ser de interés ya que hasta donde se conoce no está descrita su actividad sobre

este parásito. A los tiempos y concentraciones valorados, los cinco derivados

evaluados (VMAS60, VMAS62, VMAS74, SAG61 y CPMIV) no presentaron

actividad nematicida sobre la fase J2 de T. canis, semejante a la que origina los

fármacos de referencia. La actividad nematicida de la molécula nitazoxanida se

registró a partir de las 2 horas postratamiento (diferencia significativa (p = 0.0001)

en comparación con los controles), con una concentración de 100 g/mL y se

mantuvo a las 6 horas de incubación, en donde ya no hubo incremento de

mortandad (Figura 18). La lectura a las 12 horas presentó problemas ya que los

controles mostraron que los J2 son afectados de manera importante por las

condiciones de mantenimiento, por lo que no se consideró este resultado.

Observamos también que a concentraciones menores (1 g/mL, 0.1 g/mL y 0.01

g/mL) esta actividad no es diferente a los demás compuestos, simplemente

disminuyó con el tiempo. Las lecturas más importantes son a las 2 y 6 horas

postratamiento, ya que la nitazoxanida se mantiene en circulación sanguínea de 2

a 6 horas tras la administración oral de una sola dosis de 500 mg (Laboratorios

Romark, 2005).

El testigo positivo albendazol presentó poca actividad nematicida a las dosis y

tiempos evaluados, sin embargo ésta no fue significativa con respecto a los

DISCUSIÓN

60

controles sin fármaco (p > 0.05). El tiempo de lectura a las 2 horas es un tiempo

importante, ya que el albendazol alcanza en este periodo su concentración

máxima plasmática tras la administración oral y permanece hasta las 8 horas. Sin

embargo éste fármaco no presentó actividad nematicida de interés.

La disminución de la motilidad que originó el albendazol al estadío juvenil de T.

canis concide con el estudio reportado previamente con Satou y colaboradores en

el 2005, quienes muestran que el albendazol disminuye la motilidad en casi un

40% a una concentración de 0.1 mg/mL, aunque la dosis fue diferente y se evaluó

in vivo. En su trabajo utilizaron como compuestos experimentales alcaloides -

carbolinos (n = 17), de los cuales 12 presentaron actividad nematicida, destacando

así que al utilizar los compuestos 1, 2, 9, 11, 16 y 17 (marcados así por los

autores), disminuyeron la motilidad menos del 20 % sobre J2, asimismo el

tiabendazol presentó casi el 50 % de disminución de la motilidad. Únicamente

fueron realizados trabajos in vivo donde se probaron moléculas recién

sintetizadas, como el estudio realizado por Holt y colaboradores en 1981, quienes

demostraron que los carbamatos derivados del bencimidazol tales como

mebendazol, oxfebendazol, albendazol y febendazol así como piperazina y

dietilcarbamacina presentaron baja actividad nematicida in vivo en ratones

(cerebro), sin embargo fue alta en músculo esquelético. Delgado y colaboradores

en 1989, mostraron la reducción en la motilidad de J2 en cerebro de ratón

posterior al tratamiento con albendazol con 9 y 3 mg cada 24 y 48 horas durante 8

días, Otro estudio que podemos citar es el realizado por Hrckova y colaboradores

en el 2001, quienes demostraron que el albendazol presenta gran actividad

nematicia en cerebro de ratones (92.2 % de J2 muertas).

Las moléculas híbridas utilizadas para este experimento no presentaron actividad

nematicida, ni acción alguna sobre la motilidad de las larvas musculares de

Trichinella spiralis. El fármaco de referencia nitazoxanida evaluado a dosis de 100

g/mL no presentó actividad nematicida como en el caso de T. canis, solamente

disminuyó la motilidad. Asimismo no se obtuvo actividad nematicida a la

DISCUSIÓN

61

concentración 10 µg/mL, únicamente la nitazoxanida presentó un valor significativo

de disminución de la motilidad a las 6 horas. Con respecto a las concentraciones

1 g/mL, 0.1 g/mL y 0.01 g/mL, su patrón de comportamiento fue similar entre

todos los compuestos, no habiendo así ninguna actividad parasiticida.

Al igual como en Toxocara canis, los trabajos publicados referentes a la actividad

nematicida in vitro sobre LM de T. spiralis, no demuestran la utilización de

compuestos híbridos y las referencias sobre el efecto nematicida in vivo en T.

spiralis, tampoco han publicado el uso de compuestos híbridos de moléculas

líderes, si embargo se han registrado buenos efectos antihelmínticos contra T.

spiralis. Gómez-Barrio y colaboradores en 1986, demostraron que el albendazol

en modelos in vivo de ratones a dosis única de 100 mg/kg reduce un 56 % las LM.

López-García y colaboradores en 1997, mostraron la reducción de larvas

enquistadas en modelo in vivo, utilizando albendazol con una dosis de 50 mg/kg,

obtuvieron una reducción de 33.6 % y con 100 mg/kg, la carga parasitaria se

redujo a 94.7 %; con el ricobendazol (metabolito sulfóxido de albendazol) a dosis

de 50 mg/kg, la reducción fue a 23.2 % y con una dosis de 100 mg/kg la carga

parasitaria se redujo a 65.5%. Yépez-Mulia y colaboradores en 1999 publicaron

que el porcentaje de reducción de larvas musculares con el albendazol en ratón a

una dosis de 25 mg/kg fue de 37 %.

Nuestros resultados pueden ser atribuibles a que el mayor tamaño de las

moléculas de los compuestos híbridos, impida el paso a través del intestino del

nematodo y llegar a su blanco que son los microtúbulos de ß-tubulina en músculo

longitudinal, situación que es compatible cuando comparamos el peso molecular

(PM) del híbrido más pequeño (303,3 g), mientras que el albendazol sólo es de

265.3 g. Sin embargo no es la misma situación cuando comparamos la

nitazoxanida, que tiene un peso molecular de 307.3 g, la cual es más grande que

la molécula híbrida. Otra circunstancia que no apoya, es la suposición de que las

moléculas de alto peso molecular presenten menos actividad parasiticida, como en

el caso de la ivermectina (PM 875.10 g), molécula con más actividad nematicida

DISCUSIÓN

62

que el albendazol. Otra posibilidad es que las partes híbridas de las moléculas que

se seleccionaron no sean las responsables de la actividad nematicida, por ejemplo

en el presente estudio demostramos mayor actividad de la nitazoxanida que el

albendazol, por lo que la molécula híbrida podría llevar más componentes de la

nitazoxanida.

En cuanto a la capacidad infectante de LM de Trichinella spiralis medido a través

del índice de capacidad reproductiva, se observó que las moléculas VMAS60 y

VMAS62 redujeron más del 50% (p = 0.0003) la recuperación de LM en

comparación con el DMSO, casi igualándose a los testigos positivos albendazol y

nitazoxanida, con una concentración de 100 g/mL a partir de las 2 horas de

incubación. Este trabajo coincide con los estudios publicados por Fonseca-

Salamanca y colaboradores (2003), quienes mostraron la actividad nematicida de

la nitazoxanida contra T. spiralis in vivo, indicando que ésta con una

administración de 1g/kg en ratón inactiva completamente la etapa preadulta y

comparándola con el mebendazol el cual se administra con 10 mg/kg, disminuye la

carga parasitaria de LM un 83 %. Asimismo es importante resaltar que en nuestro

experimento el farmaco nitazoxanida disminuye un 100% la carga parasitaria

después de una exposición de 6 horas, presentando así un valor significativo de

p = 0.001. Éste dato coincide con lo reportado por De-la-Rosa y colaboradores en

2007, que muestran una reducción del 73 % al 90 % de LM, en ratones tratados

con albendazol y mebendazol, aunque los ratones fueron infectados in vivo. El

DMSO a la concentración de 100 g/mL sin compuesto redujo casi un 47 % la

recuperación de LM, este resultado probablemente se deba a su toxicidad que

normalmente presenta.

Es crítico señalar que el RCI evaluado después de exponer las LM a 10 g/mL, 1

g/mL y 0.1 g/mL no fue bajo, ya que se obtuvo una carga parasitaria dentro de

los valores normales al infectar con 120 LM previamente tratadas (recuperación de

LM superior a 60 LM por cada LM inoculada). Al analizar estos resultados, nuestro

grupo de investigación observó que al exponer los helmintos por 2 y 6 horas a

DISCUSIÓN

63

altas concentraciones (100 g/mL) se presentó un efecto en cuanto a la capacidad

reproductiva de los nemátodos, este resultado posiblemente se debió a que su

sistema reproductor fue blanco de acción de los compuestos o bien las LRN no

alcanzan una madurez apropiada.

Las diferencias que se presentaron en la disminución de la capacidad infectante

de las LM de T. spiralis tratadas, puede atribuirse a que los compuestos que

presentaron cierta actividad como el VMAS60 y VMAS 62, no están sustituidos en

la posición 1 del anillo bencimidazol, mientras que VMAS74 y CPMIV presentan un

metilo. Entre los compuestos sin sustitución en la posición 1, como la molécula

SAG61, su actividad menor se le atribuye a las diferencias en hidrofobicidad que

genera el grupo tiol en la posición 2. Además también de las propiedades

electroatrayentes del grupo trifluorometilo (VMAS60) y del metilsulfóxido

metabolito generado de la posible biotransformación del metilsulfuro (VMAS62).

Los trabajos publicados referentes a la reducción y RCI de LM T. spiralis se

mencionan a continuación, sin embargo estos fueron realizados in vivo y no in vitro

exponiendo las LM a diferentes concentraciones durante una cinética, y

posteriormente inoculadas a modelos murinos como se realizó en este trabajo.

Entre ellos está el trabajo publicado por Rodríguez-Caabeiro y colaboradores en

1978, quienes mostraron el poder de infestabilidad de LM recuperadas posterior

de los tres días de tratamiento con 30 y 50 mg/kg de mebendazol, demostrando

que el 6 % de estas LM desarrollan el estado adulto y que sólo el 7 % y 2 %

(respectivamente) alcanzan a enquistarse en músculo. Chávez-Ruvalcaba y

colaboradores en 2003, utilizaron el modelo murino (ratas) in vivo, a las que se les

administró albendazol a 200 mg/kg como dosis única y con una infección de 500 y

1000 LM demostraron que se obtiene un RCI de 25.5 y 395 respectivamente. Al

utilizar la nitazoxanida a una dosis de 7.5 mg /kg/12 horas, por 3 días y con una

infección de 500 y 1000 LM, los mismo autores obtuvieron un RCI de 437.5 y 750

respectivamente, no mostrando así eficacia nematicida.

DISCUSIÓN

64

Al exponer el estado adulto de Trichinella spiralis a los compuestos hibridos con

tratamiento de 100 g/mL, 10 g/mL, 1 g/mL, 0.1 g/mL y 0.01 g/mL, se observó

que éstos no presentaron alguna actividad nematicida. Al igual que en los otros

casos, dichas moléculas no fueron absorbidas suficientemente de forma

adecuada. En estos datos se observó un patrón de comportamiento similar entre

ellos durante la cinética de tratamiento (de 2 a 6 horas). Lo único que se pudo

percibir fue que el fármaco de referencia albendazol presentó un valor significativo

(p = 0.004) con respecto al incremento de la motilidad No.1 (100%) al utilizar la

dosis de 100 g/mL con 6 horas de exposición. Este fenómeno posiblemente se

debió al factor tiempo, porque los gusanos adultos no estuvieron en condiciones

ambientales que requieren al 100 %, ya que aunque en condiciones naturales se

encuentran en el intestino delgado y por lo tanto son aerobios facultativos

probablemente intervinieron otros factores como la temperatura y falta de

nutrientes al realizar la cinética empleada (lectura de 2, 6 y 12 horas).

Entre las publicaciones que han demostrado eficacia nematicida contra gusanos

adultos de T. spiralis destacan el trabajo presentado por Sujatha y colaboradores

en 1976, quienes mostraron que al utilizar mebendazol, éste redujo un 94 % y el

fenbendazol redujo un 99.2 % de gusanos adultos en ratones a las 7 horas.

McCracken en 1978, tuvo un 100 % de eficacia contra gusanos adultos al utilizar

mebendazol y albendazol a dosis de 50 mg/kg.

Cuando se expusieron los gusanos adultos de Trichinella spiralis a las

concentraciones establecidas durante 24 horas, posterior a este periodo se

recuperó el índice de larviposición (IL), el cual fue relativamente bajo (menor al

estandar de 60 LRN por gusano hembra), sin embargo al utilizar los compuestos

experimentales y los testigos a una concentración de 100 µg/mL, se mostró que la

larviposición de hembras adultas tratadas con los compuestos VMAS60, VMAS62,

albendazol y nitazoxanida fue menor a 4 LRN, es decir se recuperó 4 LRN por

cada hembra. Este resultado obtuvo un valor con gran diferencia significativa (p =

0.0002), entre estos compuestos. El conteo de LRN se realizó posterior a las 24

DISCUSIÓN

65

horas, debido a que se pudo recuperar el máximo de larvas recién nacidas, ya

que las hembras adultas continuamente están larviponiendo en un lapso

prolongado.

Se sugiere que en las hembras tratadas con los compuestos VMAS60, VMAS62,

albendazol y nitazoxanida, posiblemente la larviposición se inhibió debido a que

los compuestos tuvieron como blanco el útero (inhibición de la tubulina y por lo

tanto hay parálisis de los músculos) de las hembras. Un trabajo similar fue el

presentado por De-la-Rosa y colaboradores (2007), quienes obtuvieron un

porcentaje de 100 % en reducción de LRN in vivo al utilizar albendazol y

mebendazol, con una dosis administrada de 20 mg/kg una vez recuperados los

gusanos adultos. El trabajo publicado por Yépez-Mulia y colaboradores en 1999

demostraron que los gusanos adultos hembras presentan una reducción en su

taza de fecundidad del 87% y 82% al administrar el albendazol (25 mg/kg y 50

mg/kg de dosis respectivamente) y al administrar los profármacos del albendazol

N-metoxycarbonil-N'-[(2-nitro-4-propiltio)-fenil] tiourea (componente No. 2) y N-

metoxycarbonil-N'-[(2-nitro-5-propyltio)-fenil] tiourea (componente No. 3) con las

mismas dosis, demostraron que el compuesto No. 2 reduce la fecundidad un 45%

y 88% respectivamente y el compuesto No. 3 reduce la fecundidad un 88 y 85%

respectivamente.

CONCLUSIONES

66

10. CONCLUSIONES

1. Los compuestos híbridos (VMAS60, VMAS62, VMAS74, CPMIV y SAG61) no

presentaron actividad parasiticida ni parasitostática in vitro sobre el estadío J2 de

T canis y LM de T. spiralis.

2. El fármaco de referencia nitazoxanida presentó actividad antihelmíntica a partir

de concentraciones de 10 µg/mL sobre J2 de T. canis y parasitostática sobre la LM

de T. spiralis.

3. El fármaco de referencia nitazoxanida tiene una mejor actividad nematicida (2

veces más) que el albendazol en el modelo in vitro sobre el estadio J2 de

Toxocara canis a dosis de 100 µg/mL.

4. Los compuestos VMAS60 y VMAS62 a concentración de 100 g/mL y un tiempo

de exposición de 2 y 6 horas, afectaron la capacidad reproductiva de la LM de T.

spiralis, sin superar a la actividad observada en el albendazol y nitazoxanida.

5. El índice de larviposición solamente se redujo cuando los gusanos adultos

fueron expuestos a una concentración de 100 g/mL de las moléculas híbridas

VMAS60 y VMAS62, actividad semejante a los fármacos de referencia albendazol

y nitazoxanida.

6. Los resultados in vivo de la actividad del albendazol y la nitazoxanida mostraron

que a pesar de no haber muerte o disminución importante de la motilidad de las

larvas musculares de T. spiralis si existió alteración en sus mecanismos de

infectividad y larviposición.

PERSPECTIVAS

67

11. PERSPECTIVAS

El diseño de nuevos compuestos puede ser útil para combatir las parasitosis, sin

embargo debido a que el tratamiento subóptimo es una constante en los

tratamientos masivos e individuales, conlleva a que siempre haya parásitos en la

naturaleza. Asimismo nuestros experimentos fueron realizados in vitro, lo que

atribuye a pensar que una mejor propuesta de utilizar estas nuevas moléculas, es

mediante el uso de modelos experimentales in vivo, para que intervengan factores

metabólicos del hospedador (como la absorción, biotransformación, etc.) éste

último paso es importante para que los compuestos se oxiden, reduzcan o se

hidrolicen y así tengan una mejor actividad nematicida.

BIBLIOGRAFÍA

68

12. BIBLIOGRAFíA

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APÉNDICE

79

APÉNDICE

I. Soluciones y reactivos (De-la-Rosa, 2005)

1. Solución amortiguadora de fosfatos (PB) 10X

- NaH2PO4.H2O.................................................2.62 g

- Na2HPO4 (anhidro)..........................................11.50 g

- Aforar con H2O................................................1000 ml

2. Solución amortiguadora de fosfatos (PBS pH 7.2)

- PB 10X……………………………………………100 ml

- NaCl………………………………………………8.75 g

- Aaforar con H2O…………………………...........900 ml

3. PBS estéril + antibióticos

- PBS estéril……………………………………….100 ml

- Mezcla de antibióticos (1X)…………………….1 ml

4. Solución salina fisiológica

- NaCl……………………………………………….87.5 g

- Aforar con H2O…………………………………...1000 ml

Filtrar con membrana de 0.22 micrómetros

5. Preparación de Glucosa al 1 %

- Glucosa grado biología molecular………………..1 g

- Aforar con H2O destilada………………………….100 ml

Filtrar con membrana de 0.22 micrómetros

6. Medio RPMI 1650 ó DMEM

- MEM…………………........................…………106 g

- H2O……………………………………………….800 ml

APÉNDICE

80

- Hepes………………………………………………2 g

- NaHCO3……………………………………………2 g

Mezclar y ajustar el pH entre 6.8-6.9.

Aforar a 1000 ml

Filtrar com membrana de 0.22 micrómetros

7. Médio de cultivo + antibióticos

MEM (preparado)……………………………………99 ml

Mezcla de antibióticos (1X)………………………….1 ml

8. Preparación de los compuestos

- Se pesaron 5 mg de cada compuesto sólido (VMAS60, VMAS62, VMAS74,

SAG61, CPMIV, albendazol y nitazoxanida) y se disolvieron en DMSO obteniendo

una concentración final de 5 mg/mL

APÉNDICE

81

II. Resultados anexos sobre el porcentaje de reducción de LM y el RCI

Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 100 g/mL durante 2 horas de exposición.

Moléculas y Testigos RCI + DS Reducción (%)

VMAS 60 5 ± 1.9 95

VMAS 62 2 ± 1.2 98

VMAS 74 68 ± 2 32

SAG 61 70 ± 1.6 30

CPM IV 69 ± 2.6 31

Nitazoxanida 2 ± 1.1 98

Albendazol 1 ± 0.8 99

DMSO 53 ± 3.3 47

Sin Tratamiento 72 ± 1.6 28



VMAS 60 6 ± 3 94

VMAS 62 3 ± 1 97

VMAS 74 65 ± 3 35

SAG 61 59 ± 6 41

CPM IV 39 ± 24 61

Nitazoxanida 0 ± 0 100

Albendazol 2 ± 3 98

DMSO 27 ± 7 73

Sin Tratamiento 65 ± 1 35

APÉNDICE

82



VMAS 60 32 ± 3 68

VMAS 62 72 ± 6 28

VMAS 74 73 ± 0. 27

SAG 61 74 ± 4 26

CPM IV 73 ± 3 27



DMSO 77 ± 2 23

Sin Tx 77 ± 4 23



VMAS 60 22 ± 2 78

VMAS 62 66 ± 3 34

VMAS 74 65 ± 7 35

SAG 61 68 ± 2 32

CPM IV 64 ± 1 36



DMSO 57 ± 4 43

Sin Tx 72 ± 1 28

APÉNDICE

83



VMAS 60 74 ± 2 26

VMAS 62 73 ± 2 27

VMAS 74 83 ± 3 17

SAG 61 87 ± 2 13

CPM IV 72 ± 2 28



DMSO 79 ± 4 21

Sin Tx 84 ± 3 16



VMAS 60 73 ± 1.5 27

VMAS 62 71 ± 2 29

VMAS 74 85 ± 3 15

SAG 61 89 ± 2 11

CPM IV 71 ± 3 29



DMSO 77 ± 4 23

Sin Tx 81 ± 2.5 19

APÉNDICE

84

Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 0.1 g/mL durante 2 horas de exposición.


VMAS 60 80 ± 3.6 20

VMAS 62 94 ± 4.6 6

VMAS 74 92 ± 8.5 8

SAG 61 93 ± 7.4 7

CPM IV 84 ± 5.5 16

Nitazoxanida 67 ± 7.1 33

Albendazol 73 ± 1.3 27

DMSO 88 ± 8.8 12

Sin Tx 78 ± 1.7 22

Porcentaje de la reducción de LM y RCI utilizando los compuestos a 0.1 g/mL durante 6 horas de exposición.


VMAS 60 79 ± 4 21

VMAS 62 91 ± 5 9

VMAS 74 94 ± 4 6

SAG 61 90 ± 8 10

CPM IV 89 ± 8 11



DMSO 88 ± 6 12

Sin Tx 87 ± 9 13

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QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS …tesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/4100/1/DETERMINAC... · 2018-08-16 · moléculas formadas de la combinación de bencimidazol