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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
TÍTULO DEL TRABAJO:
POSIBLE INHIBICION DEL COMPLEJO NS3-NS2B DEL VIRUS DE
DENGUE POR PEPTIDOS IN SILICO.
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO BIOTECNOLÓGO
PRESENTA:
YERSIN ADENAUR CELAYA TREJO
(NOMBRE DE ALUMNO O ALUMNOS)
México, D. F. A 25 de Febrero de 2015
DIRECTOR INTERNO: Nombre y Firma Paola B. Zárate Segura
DIRECTOR EXTERNO: Nombre y Firma Fernando G. Bastida González
DIRECTOR EXTERNO: Nombre y Firma
______________________________
(Sólo si procede)
2
Contenido 1 Introducción ....................................................................................................................... 5
1.1 Estructura y clasificación .......................................................................................... 5
1.2 Patogenia ..................................................................................................................... 6
1.3 Clico viral ..................................................................................................................... 7
2 Antecedentes ................................................................................................................... 11
3 Justificación ..................................................................................................................... 11
4Objetivos............................................................................................................................ 11
4.1 Objetivo general........................................................................................................ 11
4.2 Objetivos específicos. .............................................................................................. 11
5 Metodología...................................................................................................................... 12
5.1 Modelado por homología ......................................................................................... 12
5.2 Docking de ligandos y sustratos ............................................................................ 12
5.3 Análisis de las interacciones .................................................................................. 13
6 Resultados y análisis ...................................................................................................... 13
7 Conclusiones ................................................................................................................... 16
8 References........................................................................................................................ 16
3
Autorización de uso de obra
Instituto Politécnico Nacional
Presente
Bajo protesta de decir verdad el que suscribe Yersin Adenaur Celaya Trejo,
manifiesto ser autor (a) y titular de los derechos morales y patrimoniales de la obra
titulada Posible inhibición del complejo NSB2-NS3 del virus del dengue tipo2 por
péptidos in silico, en adelante "La Tesis" y de la cual se adjunta copia, por lo que por
medio del presente y con fundamento en el artículo 27 fracción 11 , inciso b) de la Ley Federal del Derecho de Autor, otorgo a el Instituto Politécnico Nacional, en adelante El
IPN, autorización no exclusiva para comunicar y exhibir públicamente total o
parcialmente en medios digitales para su difusión con fines académicos y de
investigación "La Tesis" por un periodo de 5 años contado a partir de la fecha de la
presente autorización, dicho periodo se renovará automáticamente en caso de no dar
aviso expreso a "El IPN" de su terminación.
En virtud de lo anterior, "El IPN" deberá reconocer en todo momento mi calidad de
autor de "La Tesis".
Adicionalmente, y en mi calidad de autor y titular de los derechos morales y
patrimoniales de "La Tesis", manifiesto que la misma es original y que la presente autorización no contraviene ninguna otorgada por el suscrito respecto de "La Tesis",
por lo que deslindo de toda responsabilidad a El IPN en caso de que el contenido de
"La Tesis" o la autorización concedida afecte o viole derechos autorales, industriales, secretos industriales, convenios o contratos de confidencialidad o en general cualquier
derecho de propiedad intelectual de terceros y asumo las consecuencias legales y
económicas de cualquier demanda o reclamación que puedan derivarse del caso.
México, D. F. 25 de Febrero de 2015.
Atentamente
______________________________
4
POSIBLE INHIBICION DE LA UNION DEL COMPLEJO NS3-NS2B DEL VIRUS DEL DENGUE TIPO 2 POR
PEPTIDOS IN SILICO Celaya Trejo Yersin, Fernando Bastida-González b,c, Paola B. Zárate-Segura a,b
a UPIBI-National Polytechnic Institute, Bioprocess Departament, Av Acueducto s/n PoBox 07340, b ESM-National Polytechnic Institute, Lab. Biol Mol., Salvador Dìaz Miron, Plan de Sn Luis s/n PoBox 11340.
c ISEM-Instituto de Salud del Estado de México E-mail: [email protected]
Key words: Inhibición, NS3-NS2B, Modelado.
Introduction.
El virus del dengue (DENV) pertenece a la familia Flaviviridae del genero Flavivirus, con 4 serotipos (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4), es el agente
causante de la fiebre del dengue, el dengue hemorrágico y síndrome de shock tóxico (1). El genoma del dengue es una cadena de ARN de sentido
positivo de 3390pb, éste codifica 3 proteínas estructurales C, E, pr-M y siete proteínas no estructurales NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5. La proteína NS3 es la responsable del
procesamiento de la poliproteina en sitios específicos(3) esto por el dominio proteasa de NS3 que necesita del cofactor NS2B para su actividad (bucle
hidrofilico), El dominio NS3Pro actúa hidrolizando los complejos NS2A/NS2B, NS2B/NS3, NS3/NS4A y NS4B/NS5 del polipéptido y generando el ambiente
lipídico alrededor del R.E. (2), por lo anterior en el presente trabajo se realizó el diseño de péptidos que bloqueen la interacción entre NS3 y NS2B.
Methods. Las secuencias de las proteínas virales NS3 (DENV1-
DENV4) Y NS2B (DENV1-DENV4) fueron descargados de la base de datos del GeneBank NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Las proteínas NS3 y NS2B fueron analizadas por separado utilizando el software MEGA 5.2 y JALVIEW, para localizar regiones conservadas y variables dentro
de las proteínas, y obtener una secuencia consenso. Se utilizaron las secuencias consenso para realizar un
BLAST (http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y encontrar los cristales de estas proteínas que tuvieran un porcentaje elevado de identidad con las secuencias, para su uso como templete. Se Utilizo el servidos
SWISS-MODEL para generar los modelos de las proteínas.
Se obtuvieron modelos de la proteína NS3 y NS2B para el serotipo 2 del virus, se analizaron en el servidos SAVES (http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/) y se
compararon con los templetes utilizados en el software CHIMERA 1.8.2. (Fig. 1), Se realizó un doking de las proteínas en el servidor CLUSPRO y se comprobó la
interacción de las proteínas en el sitio activo (Fig 2), y
se obtuvo el péptido que efectúe un posible bloqueo de la unión de las proteínas virales mediante el servidor ELLIPRO (Fig 3).
Results.
(A) B) Fig.1. Modelo de la Proteina NS3 generado en el
servidos SWISS- MODEL(A), Modelo de la proteína NS2B generado en servidor SWISS-MODEL (B)
Conclusions. Se obtuvieron los modelos de las proteinas NS3 y NS2B. Se comprobó la interacción de la NS2B en el sitio
activo del dominio proteasa de NS3. Se deseno un péptido con posible inhibición de la unión del complejo NS3-NS2B.
References. 1.Gubler DJ (1998) Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev 11:480–496.
2.Heaton NS, Perera R, Berger KL, Khadka S, Lacount DJ, Kuhn RJ,et al. Dengue virus nonstructural protein 3 redistributes fatty acidsynthase to sites of viral
replication and increases cellular fatty acid synthesis.Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A .
3.Rushika Perera and Richard J Kuhn. Structural proteomics of dengue virus. Current Opinion in Microbiology 2008, 11:369–377.
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1 Introducción
1.1 Estructura y clasificación
El virus del dengue es un microorganismo perteneciente a la familia de Flaviviridae del
genero Flavivirus, esta conformado por cuatro serotipos denominados DENV1 al DENV4,
es el agente causante de la fiebre del dengue, el dengue hemorrágico y síndrome de
shock tóxico (1).
El genoma del dengue es una molécula de ARN de sentido positivo. Sin embargo, la
forma replicativa de ARN del dengue no es una molécula lineal única, sino más bien, un
genoma cíclico o dimerizada. Esta organización ARN genómico es especialmente
competente para la replicación, lleva muchas estructuras secundaria y terciaria altamente
ordenadas que garanticen una adecuada regulación de la síntesis de ARN dengue
El genoma del virus consta de 3 proteínas estructurales C, E, pr-M y siete proteínas no
estructurales NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5.
Figura 1. Genoma del virus del dengue (Modificado de )
6
Proteína de la capside C, pesa aproximadamente 11 Kda.
Proteína de envoltura E, pesa aproximadamente 50 Kda.
Proteína precursora de membrana, pr-M, pesa aproximadamente 26 Kda.
Proteína no estructural NS1, pesa aproximadamente 46 Kda.
Proteína no estructural NS2A, pesa aproximadamente 22 Kda.
Proteína no estructural NS2B, pesa aproximadamente 14 Kda.
Proteína no estructural NS3, pesa aproximadamente 70 Kda.
Proteína no estructural NS4A, pesa aproximadamente 16 Kda.
Proteína no estructural NS4B, pesa aproximadamente 27 Kda.
Proteína no estructural NS5, pesa aproximadamente 105 Kda.
1.2 Patogenia
El modo por el que el dengue provoca una severa alteración del estado general del
hospedero se basa en:
1. Daño vascular originado por la invasión directa de las células endoteliales por el virus o
por la acción del complemento y citosinas, así como por el depósito de complejos
inmunes.
2. Desregulación de la cascada de la coagulación caracterizada por la presencia de
trombocitopenia, función plaquetaria anormal, desajustes en la producción hepática de
factores de coagulación y la presencia de coagulación intra vascular diseminada.
3. Desajuste inmunológico que provoca la inhibición de la respuesta inmunitaria
permitiendo así una replicación viral descontrolada (asociación directa a linfocitos T y
macrófagos).
4. Daño celular directo en determinados órganos debido bien a la acción del virus o a la
respuesta inflamatoria del huésped.
7
1.3 Clico viral
El virus utiliza la proteína E para lograr el acercamiento a la célula, la proteína E
interactúa con proteínas de la membrana celular que median la unión y la endocitosis del
virus, El dominio III de la proteína E interactúa con proteoglucanos como el heparán
sulfato, entre otras moléculas.
Cuando la nucleocápside es liberada en el citoplasma, el virus inicia la traducción y
replicación del RNA, este se traduce en un polipéptido completo, el cual es procesado en
el retículo endoplásmico por proteasas celulares y la actividad de NS3pro, liberando las 3
proteínas estructurales (C, E y prM), y las siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A,
NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) las cuales se encargan de la replicación y ensamblaje
viral (ciclo y replicación). Las secuencias de señal dentro de la poliproteina envían a NS1
y los ectodominios de prM y E al lumen del RE, mientras que las proteínas C, NS3 y NS5
se localizan en el citoplasma. NS2A, NS2B y NS4A, NS4B siguen siendo
predominantemente como proteínas transmembrana (dengue Proteomics).
Fig.2.Ciclo viral de replicación del virus del dengue.
El proceso de ensamblaje comienza con la formación de la nucleocápside debido a la
interacción del ARN genómico y la proteína C, sobre esta estructura luego se asocian las
proteínas prM/M y E, que deben estar inmersas en la membrana del RE. Posteriormente,
suceden dos etapas de maduración de la partícula viral. Primero se organizan de forma
8
heterodimérica las proteínas prM/M y E, en donde la primera recubre a la segunda; este
recubrimiento le confiere un aspecto rugoso a la superficie del virus.
En el segundo paso, esta partícula inmadura transita desde el retículo endoplásmico
hasta el aparato de Golgi, donde se inicia la segunda etapa de maduración. En esta última
etapa, los cambios de conformación y de rotación de la proteína E generan homotrímeros
antiparalelos de la misma, lo que le da una apariencia lisa a la superficie del virus.
Por último, un nuevo procesamiento proteolítico sobre la proteína prM/M por la proteasa
furina, libera el péptido pr y la proteína M. Esta nueva modificación estabiliza los
homotrímeros de E y mantiene unido al péptido pr. Finalmente, cuando el virus es
liberado, el pH neutro induce el desprendimiento del péptido pr y la proteína E adquiere la
conformación final. (ciclo viral)
Fig.3.Esquema de los cambios rotacionales y de conformación de las proteínas prM, M y E en virus
inmaduros
El procesamiento de esta poliproteina es un proceso fundamental que debe ocurrir antes
de la replicación del ARN viral pueda proceder. Esta tarea se lleva a cabo por medio de
señales de host que residen en el lumen del ER y la proteína NS3 viral y su cofactor,
NS2B que residen en el citoplasma (dengue proteomics 22 23) liberando las 3 proteínas
estructurales (C, E y prM), y las siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3,
NS4A, NS4B, NS5) las cuales se encargan de la replicación y ensamblaje viral (8). Las
secuencias de señal dentro de la poliproteina envían a NS1 y los ectodominios de prM y E
al lumen del RE, mientras que las proteínas C, NS3 y NS5 se localizan en el citoplasma.
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NS2A, NS2B y NS4A, NS4B siguen siendo predominantemente como proteínas
transmembrana (3).
La actividad de la proteasa es críticamente dependiente de la presencia de su cofactor,
NS2B (loop hidrofóbico) que se conserva entre los flavivirus (6,7), se ha observado que la
ausencia de NS2B tiene efectos negativos tanto en la estabilidad y la actividad catalítica
de NS3pro (21), él cofactor contribuye con un β-plegada (residuos 51-57 en DENV) en el
barril-β de la N-terminal de NS3.
El cofactor NS2B contienen tres regiones asociadas a la membrana, juega un papel
importante para la formación de la estructura general de la proteasa, esta conformación
permite la posibilidad de que el loop este expuesto.
Fig.4. Conformación de NS2B-NS3
Este loop, que se conserva entre los flavivirus, puede jugar un papel análogo al de la
hélice hidrofóbica del N-terminal de la proteasa del VHC (20). El hecho de que NS2B
podría formar una estructura "tipo cinturón" que envuelve el dominio de proteasa para
formar el sitio activo (12).
Los residuos de Arg78-Leu87 formar un loop (cadenas 4 y 5), que interactúa con el bucle
de E1b-F1 y de ese modo vincula NS2B al barril de la N-terminal de NS3pro. Este pliegue
se estabiliza mediante la formación de enlaces de hidrógeno entre NS2B y NS3pro
10
(cadenas 2 y 3)( Fig. ). En particular, la integración de los residuos 78-87 de NS2B en el
complejo de proteasa-cofactor afecta a la formación del sitio activo. Debido NS2B se
pliega debajo de la b-loop E2b-F2 (22).
Fig.5. Cadenas del dominio proteasa de NS3
Esta estructura sugiere que la NS3 es una molécula extendida con el dominio de proteasa
orientado espacialmente en la parte superior de los subdominios I y II de la helicasa. Esta
geometría coloca el sitio activo de la proteasa cerca de dominios transmembrana que
deben ser procesados dentro de la poli proteína (3). La proteína NS3 incluye los residuos
del 49-66 de la NS2B que se han ligado a la N-terminal de longitud completa de NS3
mediante un enlazador Gly-Ser. Mientras la región central de NS2B (residuos 67-80)
interactúa con la proteasa, flanqueando las regiones hidrofóbicas de NS2B para anclar el
complejo NS2B-NS3 en la membrana del RE (5).
NS3 es estructuralmente dinámico y puede requerir una conformación extendida para su
función. Tal conformación de NS3 podría explicar la capacidad de la proteasa NS3-NS2B
para funcionar en sitios no fácilmente accesibles a ella (3)
Obtener un péptido para realizar un posible bloqueo de la unión del complejo NS3-NS2B
del virus de dengue tipo 2
11
2 Antecedentes
Cristalizaron la proteína NS3 en la cual encontraron un fragmento de la proteína NS2B
asociada al dominio proteasa. Expresaron una construcción que contiene los residuos 49-
66 de NS2B en una forma soluble, lo que indica que la parte N-terminal de NS2B es
suficiente para estabilizar la enzima.
NS3 es estructuralmente dinámico y puede requerir una conformación extendida para su
función.
3 Justificación
El complejo NS3-NS2B forma un papel importante en el procesamiento de la poliproteina
para poder iniciar la transcripción y replicación del RNA viral, en estudios resientes se ha
descubierto que la proteína NS2B juega un papel importante en la actividad del dominio
proteasa de NS3.
En la actualidad no existe una vacuna eficiente, así como un tratamiento específico contra
el virus de dengue, lo cual hace que el estudio de posibles vacunas y tratamientos nuevos
sea se suma importancia para combatir este virus.
Por lo anterior es importante realizar un tratamiento para contrarrestar la infección de
forma específica, irrumpiendo con la replicación viral.
4Objetivos
4.1 Objetivo general.
Modelar las proteínas NS2B y NS3 del virus del dengue para generar péptidos in
silico
4.2 Objetivos específicos.
Realizar los alineamientos de las secuencias de las proteínas NS2B y NS3.
Determinar las estructuras tridimensionales de las proteínas NS3 y NS2B a través
del modelado computacional por homología.
Comparar los modelos obtenidos por diferentes software y servidores y elegir los
mejores de acuerdo a calidad obtenida.
12
5 Metodología.
5.1 Modelado por homología
Se utilizó la herramienta BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para la búsqueda de
homólogos de la versión no redundante de la base de datos públicos actuales del NCBI
(Centro Nacional de Información Biotecnológica, por sus siglas en ingles), secuencias de
la proteína NS3 del virus de dengue del tipo 2 y de la proteína NS2B del virus de dengue
del tipo 2.
Para cada proteína y su correspondiente secuencia fueron introducidas en el servidor
RCSB PDB, para elegir los templetes que compartan una mayor identidad con las
secuencias. Un modelado por homología fue llevado a cabo por SWISS-MODEL
utilizando como estructuras de referencia las de las proteínas NS3, NS2B como templates
(Protein Data Bank, entradas 2VBC y 2FOM, respectivamente). En el modo automático de
SWISS-MODEL se introdujeron las secuencias de aminoácidos de cada proteína. Los
alineamientos target-template los realizó en el servidor y debido a la alta similitud entre
ellas no se llevaron a cabo refinamientos manuales a los alineamientos.
Los parámetros energéticos y estereoquímicos de los modelos 3D en principio fueron
evaluados con los reportes de análisis o funciones de puntuación del software. SWISS-
MODEL se tomaron en cuenta los valores de la puntuación “C-score” y el parámetro de
calidad (12). Los modelos fueron evaluados posteriormente en el servidor SAVES, de
donde se obtuvieron las pruebas de calidad de Ramachandran y ERRAT.
5.2 Docking de ligandos y sustratos
Para llevar cabo los docking proteína-proteína y proteína-ligando se utilizo el servidor
CLUSPRO, con las especificaciones automáticas del servidor. Para la visualización de las
estructuras tridimensionales y el análisis de residuos, así como la visualizac ión de la
superposición de las proteínas para su posterior análisis, se utilizaron los programas VMD
(14) y Chimera (11)
13
5.3 Análisis de las interacciones
El resultado obtenido de cada docking para cada enzima se sometió al servidor PDBsum
(13). Para una mejor visualización de los resultados y el análisis de las interacciones
también se utilizó el programa Chimera (11).
Fig.6.Diagrama de la Metodología del modelado de proteínas in silico
6 Resultados y análisis
Para la predicción de estructuras 3D de las proteínas, invariablemente primero se requiere
el uso de algún método de alineamiento de secuencias que permita identificar relaciones
estadísticamente significantes entre las secuencias consenso y uno o más posibles
templates (15). En general, el promedio de la precisión de los modelos por homología es
función de la similitud entre las secuencias consenso-template (16), las secuencias
consenso de las proteínas target fueron ingresadas y comparadas con la ayuda de la
herramienta BLAST en la base de datos no redundante de secuencias de proteínas.
Se obtuvieron modelos de la proteína NS3 y NS2B (figura 1y 2) para el serotipo 2 del
virus.
14
Fig.7.Modelo del la proteína NS3 del virus del dengue Fig.8. Modelo de la proteína NS2B del virus de dengue
El gráfico de Ramachandran es probablemente el determinante más poderoso de la
calidad de una proteína (17, 18) por eso es importante validar los modelos.
Para validar la calidad de los modelos obtenidos de Swiss-Model y descartar posibles
errores, los modelos obtenidos fueron evaluados por el servidor SAVES, los resultados de
Ramachandran plot mostraron 82,2 % de residuos en regiones favorables para NS3 y
92,5% de los residuos en las regiones favorables para NS2B, los resultados de ERRAT
mostró set score: 75.904 para NS3 y un set score: 100 para NS2B.
15
Fig.9. Resultados del programa Ramachandran plot Fig.10. Resultados del programa Ramachandran plot
16
7 Conclusiones
Se obtuvieron los modelos en 3D de las proteínas NS3 y NS2B.
Se verifico la calidad de los modelos mediante el servidor SAVES.
El grafico de Ramachandran plot mostraron 82,2 % de residuos en regiones favorables
para NS3 y 92,5% de los residuos en las regiones favorables para NS2B, los resultados
de ERRAT mostró set score: 75.904 para NS3 y un set score: 100 para NS2B.
8 References
1. Gubler DJ (1998) Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev 11:480–
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