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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLdGfCAS YAGROPECUARIAS “CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y FUNCIONAL DE TIROCITOS DE EXPLANTES TIROIDEOS DE RATA SPRAGUE - DAWLEY’ TESIS QUE PRESENTA: PARA OBTENER EL GRADO DE : MAESTRO EN CIENCIAS ÁREA: BIOTÉCNOLOGíA LíNEA DE INVESTIGACIÓN: HERENCIA Y ADAPTACIÓN ANIMAL D IRECTORES : D R . S ERGIO H UGO S A NCHEZ R ODR Í GUEZ D R . J AME M OLINA O CHOA TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO, SEPTIEMBRE DE 1999

QUE PRESENTA: PARA OBTENER EL GRADO DEdigeset.ucol.mx/tesis_posgrado/Pdf/Eduardo Manzanares Acuna... · A Mis Hermanos: Teresa Eugenia, José de Jesús, María Rosaura, Miguel Angel,

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U N I V E R S I D A D DE C O L I M A

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLdGfCASYAGROPECUARIAS

“ C A R A C T E R I Z A C I Ó N M O R F O L Ó G I C A Y F U N C I O N A LD E TIROCITOS D E E X P L A N T E S T I R O I D E O S

D E R A T A S P R A G U E - DAWLEY’

T E S I S

QUE PRESENTA:

PARA OBTENER EL GRADO DE :

MAESTRO EN CIENCIAS

ÁREA:BIOTÉCNOLOGíA

LíNEA DE INVESTIGACIÓN:

HERENCIA Y ADAPTACIÓN ANIMAL

D I R E C T O R E S :

D R . SE R G I O H UGO SA ’ N C H E Z R O D R ÍG U E Z

D R . J A M E M O L I N A O C H O A

TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO, SEPTIEMBRE DE 1999

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Tesis elaborada bajo la dirección de los Doctores:

Dr. Sergio Hugo Sánchez Rodrígue

Dr. Jaime Molina Ocho

Y por el comitC particular de asesores, por los Doctores:

Dr. Javier Farías Lario

Dr. Oscar Rebolledo Domíngue

Dr. Roberto Lezama Gutiérrez

Dr. Rafael Herrera Esparza

Quienes manifestamos que hemos revisado y aceptado el informe final de investigación,mismo que reúne los requisitos académicos para obtener el grado de:

Maestro en Ciencias

Especialidad: Biotecnologia.

Linea de Investigación Herencia y Adaptación Animal.

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Facultad de Ciencias Biológicas y Ag ropecuarias

C. EDUARDO MANZANARES ACUÑAALUMNO DEL POSGRADO DE LA FGBAPRESENTE

En base a los dictámenes emitidos a su tesis titulada“CARACTERIZACI6N MORFOLÓGICA Y FUNCIONAL DE TIROCITOS DEEXPLANTES TIROIDEOS DE RATA SPRAGUE-DAWLEY” por el cuerpoacadémico de la Facultad y el asesor externo, me permito informar a usted, quehabiendo cumplido el documento con los requisitos académicos de forma yfondo, se autoriza la impresión de misma para ser presentada ante un jurado, conel fin de obtener el titulo de “MAESTRO EN CIENCIAS, ÁREABIOTECNOLOGÍA, en la línea de investigación “Herencia y AdaptaciónAnimal”.

Dicho trabajo fue realizado bajo la dirección de los Doctores Sergio HugoSánchez Rodríguez de la Universidad Autónoma de Zacatecas (UAZ) y JaimeMolina Ochoa y los asesores Drs. Roberto Lezama Gutiérrez, Oscar RebolledoDominguez, Javier Farias Larios de la Universidad de Colima y Dr. RafaelHerrera Esparza del Centro de Biología Experimental de la UAZ.

ATENTAMENTE

Tecomán, Col. a 09

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ÍNDICE

Agradecimientos ............................................................................................................ iDedicatorias ................................................................................................................... iiResumen ........................................................................................................................... 1 1 1

Abstract ......................................................................................................................... ivLista de Figuras.. ........................................................................................................... v

I.- INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..~........... 1

II. REVISIÓN DE LITERATURA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*...................................................72.1 Glhdula tiroides ...................................................................................................................................... 72.1.1.2 Fisiologia de las chlas tiroideas .................................................................................................... 1 02.1.2 Hormonas tiroideas TI y T, ................................................................................................................. 102.1.3 Tiroglobulina ........................................................................................................................................ 1 42.2 Hormona estimulante de la tiroides (TSH) .......................................................................................... 152.3 Citoesqueleto.. ......................................................................................................................................... 182.4 Cultivo celular.. ....................................................................................................................................... 20

III. MATERIALES Y MÉTODOS ......... ..*.............................*.....,......................*................. 2 3

3.1 Panorama general ................................................................................................................................... 233.2 Sujetos experimentales ........................................................................................................................... 233.3. Obtención de las cklulas tiroideas ......................................................................................................... 243.3.1 Explante tiroideo.. ................................................................................................................................ 243.3.2 Disociación celular ............................................................................................................................... 243.3.3 Cultivo celular ...................................................................................................................................... 253.4 Determinación de la viabilidad celular.. ............................................................................................... 263.5 Lisis celular ............................................................................................................................................. 263.6 Determinación de proteinas en extractos totales.. ................................................................................ 273.7 Electroforksis (F’AGE-SDS) .................................................................................................................. .273.8 Transferencia de proteinas a membrana de nitrocelulosa .................................................................. 283.9 Bloqueo de la membrana de nitrocelulosa ............................................................................................ 283.10 Inmunodetección .................................................................................................................................. .283.11 Determinación de tiroglobulina .......................................................................................................... .283.12 Inmunoflorescencia indirecta para detectar receptores a TSH, filamentos de Actina ymicrotúbulos ................................................................................................................................................. 293.13 Anhlisis estadlstico.. ............................................................................................................................ .29

IV. RESULTADOS.................................................................................................................. 3 14.1 Viabilidad celular ................................................................................................................................... 3 14.1.1 Concentración de suero fetal de ternera.. .......................................................................................... 324.2 Caracterización morfológica .................................................................................................................. 334.3 Determinación de Tiroglobulina.. ......................................................................................................... .354.4 Expresión de receptores a TSH ............................................................................................................ .36

V. DISCUSIÓN ......*.......,..........,..,...............,...................*....................................................... 4 1

5.1 Tkcnicas de disociación, a partir del explante tiroideo y medición de la viabilidad celular.............4 15.1.1 Condiciones del cultivo ........................................................................................................................ 435.2 Caracterización morfológica .................................................................................................................. 455.3 Caracterización funcional ..................................................................................................................... .475.4 Expresión de los receptores a TSH y componentes del citoesqueleto.. .............................................. .48

VI. CONCLUSIONES ................ .......... .................................... ..*....................*....................... 5 2

VII. LITERATURA CITADA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*...................................................................5 3

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A G R A D E C I M I E N T O S

Al cuerpo de Asesores Internos de la Universidad de Colima: Facultad de Ciencias

Biológicas y Agropecuarias.

Dr. Jaime Molina Ochoa.

Dr. Oscar Rebolledo Domínguez.

Dr. Javier Farías Larios

Dr. Roberto Lezama Gutierrez.

A la Universidad Autónoma de Zacatecas, en especial para el director y asesor de la tesis

respectivamente:

Dr. Sergio Hugo Sánchez Rodríguez.

Dr. Rafael Herrera Esparza.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por su apoyo mediante la beca 121262,

muchas gracias.

A PROMEP, por su apoyo complementario.

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DEDICATORIAS

En memoria de mi abuelo: Don José Manuel Acuna de Santiago.

A mis padres, Teresita del NiAo Jesús Acuña Félix y Lic. J. Jesús Manzanares Jacobo

A Mis Hermanos: Teresa Eugenia, José de Jesús, María Rosaura, Miguel Angel, Sergio,

Ernesto Manuel, Héctor Martín, Gustavo Adolfo, Edmundo y María del Rocío.

A mi esposa Laura Josefina, por su gran apoyo, comprensión e impulso para alcanzar ésta

meta.

A mis hijos: Luis Eduardo, Alejandro y Laura Karina, por su amor y apoyo.

Al Dr. Miguel Arenas Vargas y al Dr. Luis Felipe Bojalil Jaber, por haberme motivado y

mostrarme otra gran faceta del proceso enseñanza-aprendizaje.

A mis amigos, por sus acertados consejos: Héctor René Vega Carrillo, Sergio Hugo

Sánchez Rodríguez, Rómulo Bañuelos Valenzuela, Miguel Angel Salas Luévano, Carlos

Moran Rodríguez y Héctor Alfredo Robles Martínez.

Al Dr. Rafael Herrera Esparza, por sus muy atinados consejos y guía.

A mis compañeros del CREN, por su estímulo y tolerancia.

A mis compañeros de la FCBA.

Para aquellos a los que omití involuntariamente.

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RESUMEN

En el presente trabajo se realizó la estandarización de un modelo biológico in vitro

para llevar a efecto estudios fisiológicos de la glandula tiroides. Se efectuó la digestión

enzimática del explante tiroideo, y se determinó la viabilidad celular. Se utilizaron

diferentes concentraciones de hormonas y 5% de suero fetal de ternera. La caracterización

morfológica de las células tiroideas se realizó comparándolas contra las de la línea célular

FRTLS. La caracterización funcional se determinó por la presencia de tiroglobulina por

RIA, posteriormente las células tiroideas en monocapa se procesaron para IFI y se observó

la expresión de receptores a la TSH y a los componentes del citoesqueleto tubulina y actina.

Se analizó la expresión del receptor contra TSH, en extractos celulares de tirocitos, células

HeLa, hepatocitos, y linfocitos. En la digestión enzimática con tripsina-EDTA y colagenasa

1, se encontró que el rendimiento es igual usando tiempos de digestión de 30 y 60 min; y se

encontró que fue mas eficiente (PcO.05) en comparación con tripsina-verseno. Al medir los

niveles de tiroglobulina, se encontró una elevación importante en la tercera semana de 7.04

ng/mI, en comparación a la cifra basal de 1.47 ng/ml. Los cultivos primarios de tirocitos,

expresaron los receptores a la TSH, y al citoesqueleto de actina y tubulina, mientras que en

las células HeLa (control), se observó dicho fenómeno sólo para tubulina y actina, más no

para el receptor a la TSH. La presencia de los receptores a la TSH en los tirocitos, se

demostró ademas por medio de inmunodetección. Los resultados indican que el método

utilizado, permite la obtención y mantenimiento de cultivos primarios de células tiroideas.

Palabras clave: Cultivo celular, tripsina, colagenasa, tirocitos.

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ABSTRACT

In this research work, the standarization a in vifro biological model, has been

carried out, in order to fi.trther physiological studies in the thyroid gland. Enzimatic

digestion, followed by the ce11 viability determination. Cell culture was performed with

different hormones concentrations and 5% calf serum was used. Morphological

characterization of cultured thyroid cells was compared with the cell line FRTLS.

Functional characterization was performed through the measurements of thyroglobulin by

Radioimmunoassay method. Using indirect immunofluorescence, thyrotropin receptors and

cytoskeleton components were observed, meanwhile actin and tubulin. During the ce11

disgregation with trypsin - EDTA and collagenase was found that the enzimatic digestion,

was more effrcient (PcO.05) than using trypsin-verseno. Yield using tripsyn - EDTA, for

30 and 60 min was statistical similar. Measure of thyroglobulin showed a bigger leve1

during the third week, 7.04 ng/ml, in comparison with basal leve1 of 1.47 @ml. Thyroid

cells in the primary culture, expressed the thyrotropin receptors (TSHr), and the

cytoskeleton componer& as the actin and tubulin, meanwhile in the HeLa cells (control)

only the tubulin and actin were observed. The presente of TSHr was observed by

immunodetection. The method developed here allows us to obtain and maintain primary

thyroid ce11 cultures.

Keywords: Ce11 Culture, Trypsin, Collagenase, Tbyrocytes.

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LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 .-

2 .-

3 .-

4 . -

5 .-

6 .-

7 . -

8 . -

9 .-

lO.-

Porciento de viabilidad obtenida con el método de Rapoport, a las 2 h

(barraly2)yalas3h(barra3y4) ..* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

Datos obtenidos en la viabilidad celular de acuerdo al método de

Ambesi-Impiombato, a tiempos de 30 min (barras 1-4) y 60 min

(barras 5-8) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2

Microfotografia de cultivo de tirocitos después de 21 días, donde se muestra a

las células tiroideas obtenidas en cultivo primario (izquierda) y las células

tiroideas de la línea celular FRTLS (derecha) tomadas con un objetivo 40)3.........33

Microfotografía de los tirocitos obtenidos después de 15 días de cultivo primario

(izquierda) comparando contra la línea celular de tirocitos FRTLS (derecha)

utilizando un objetivo 40X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Microfotografía en donde se muestra la morfología adoptadas por los tirocitos

en cultivo primario obtenida con un objetivo 10X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Comportamiento de la producción de tiroglobulina desde la 1’ a la 5” semana

y donde se observa que la primera barra es la concentración basal del medio de

cultivo, y las 5 siguientes son las cifras determinadas cada semana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Microfotografía de los tirocitos obtenidos después de 15 días de cultivo primario

tomada por contraste de fases (izquierda) y por inmunofluorescencia para la

detección de los receptores a la TSH (derecha) con objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Microfotografia de los tirocitos obtenidos, después de 15 días de cultivo

observados por medio de contraste de fases (izquierda) y por IFI para

detectar a la or-tubulina (derecha) utilizando un objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Microfotografla de los tirocitos obtenidos, después de 15 días de cultivo,

observados por medio de contraste de fases (izquierda) y por IFI para detectar

filamentos de actina (derecha) utilizando el objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Microfotografía de los tirocitos a los 15 días de cultivo, por contraste de fases

(izquierda) y por inmunofluorescencia para detectar filamentos de actina

(derecha) por medio de un objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

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1 l.- Microfotografia de los tirocitos cultivados en cubreobjetos a los 15 días de

cultivo, por contraste de fases (izquierda) y por IFI para detectar

p - tubulina (derecha) por medio de un objetivo 100X. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

12.- Microfotografía de las células HeLa, observadas por contraste de fases

(izquierda) e IFI para detectar filamentos de actina (derecha) tomada con un

objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

13.- Inmunodetección de receptores a TSH, en la que se presentan en primer lugar,

a los extractos de células hepáticas (H), tiroideas (T), células HeLa (He) y

linfocitos respectivamente, se observa la presencia del receptor a TSH en

hepatocitos, tirocitos y linfocitos, pero no en las células HeLa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

vi

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I.- INTRODUCCIÓN

En el presente trabajo, se utilizaron los métodos de Rapoport (1976), y de Ambesi-

Impiombato (1980), para lograr el desarrollo de células en cultivo primario, a partir de

explantes tiroideos de rata Sprague-Dawley, cuyo comportamiento fuera lo mas aproximado a

las de la línea celular FRTLS. En los cultivos celulares, un fenómeno observado, es el de una

respuesta celular completamente anormal, al proceso que ocurre in vivo. La modificación del

medio ambiente in vitre propuesto por Eagle (1955), permitió el desarrollo de las diversas

líneas celulares. Koningsberg, (1963) Mostró que las deficiencias en las técnicas de cultivos

celulares, son perfectibles, ya que muestran limitaciones intrínsecas, que no se han satisfecho,

ademas realizó una revisión de los problemas más frecuentes en el cultivo de tejidos,

tendientes a la diferenciación celular y a las propiedades supracelulares. Ham (1965) y Conn

(1966) reportan la fabricación de medios sintéticos para el cultivo de células de mamíferos.

Sato (1975) propuso agregar suero a los medios de cultivo, con la idea de que éste es una

importante fuente fisiológica por el contenido de hormonas, contribuyendo potencialmente a la

tecnología de cultivos.

La tiroides, es una glándula de secreción interna, considerada la mas grande del

organismo (Wolf et al., 1989). Tiene gran influencia sobre el crecimiento y desarrollo de los

organismos vertebrados. Sintetiza tiroxina o tetraiodotironina (Td), y triiodotironina (TJ), es

controlada por un mecanismo de retroalimentación negativo por la hormona estimulante de la

tiroides (TSH) y ésta a su vez por la hormona liberadora de TSH (TRH) y éstas por el nivel de

hormonas tiroideas (Grossmann et al., 1997).

Los primeros estudios acerca del crecimiento y alteración de la tiroides fueron

realizados por De Vijdler et al., (1979) en modelos animales utilizando la vaca africana y la

cabra danesa. Wollman desarrolló un método para el cultivo de células tumorales de tiroides

en rata Fisher en 1963 (Grollman et al., 1977), posteriormente Knopp et al., (1970) y Burke et

al., (1973) aislaron células tiroideas bovinas y mostraron que la TSH activa la vía de la

adenilatociclasa produciendo incremento del cAMP. Rapoport (1976) cuya aportación al

aislamiento de células en cultivo, fue el utilizar un sistema mecánico y la enzima tripsina para

realizar la digestión de tejidos, por períodos de 2 a 3 horas. Grollman et al., (1977)

encontraron evidencias de la interacción de la TSH con un receptor específico de la

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membrana. Ambesi-Impiombato et al., (1980) desarrollaron una línea de células tiroideas

normales de rata a la que denominaron FRTLS, basada en la clonación de células, adición de

seis hormonas o factores de crecimiento (6H), y una concentración inicialmente baja (0.1 a

0.5%) de suero fetal de ternera.

A través del modelo biológico FRTLS se realizaron estudios con el fin de establecer la

relación entre el crecimiento celular y el cAMP (Valente et al., 1983a), los promotores de

crecimiento (Valente et al., 1983b); estudios sobre las alteraciones de las células irradiadas

utilizando Láser (Andreoni et al., 1983),. Otras líneas de investigación se hicieron sobre los

mecanismos de transporte y síntesis de proteínas (Weiss et al., 1984), mecanismos de control

hormonal en células diferenciadas (Tramontano et al., 1986), propiedades y regulación del

receptor a TSH (Tramontano e Ingbar, 1986), así como sobre la regulación de la membrana

celular por la TSH (Beguinot et al., 1987). Por sus caracteristicas las células FRTLS fueron

consideradas ideales para realizar trabajos investigación, por lo que son comúnmente

utilizadas (Dumont et al., 1992).

Para estudiar el comportamiento de los diferentes modelos biológicos, así como los

mecanismos responsables de las alteraciones de la tiroides. Se han realizado varias

investigaciones, asi se ha estudiado el funcionamiento de la TSH en la transformación de

folículos a monocapas en células tiroideas porcinas (Yap el al., 1986), la exposición de las

células tiroideas a anticuerpos contra los receptores de la TSH, que se presentan en las

enfermedades de Graves y Hashimoto (Madec et al., 1988). Se cultivaron células tiroideas

humanas a las cuales se transfectó con el virus de simio DNA 40, y se les denominaron células

epiteliales tiroideas humanas inmortalizadas, que son factibles para la manipulación genética,

manteniendo sus características tiroideas diferenciadas, y en comparación con otras células,

éstas no requieren suero para su proliferación (Lemoine et al., 1989). Por otro lado, se ha

descrito el transporte de iones y la regulación del volumen folicular tiroideo en células

tiroideas porcinas (Yap et al., 1991).

Para denotar la importancia del citoesqueleto y de las uniones celulares, estructuras y

componentes, que son de primordiales durante el crecimiento y diferenciación celular, se

abordó el estudio de la histoarquitectura folicular y la regulación de los diferentes substratos

de adhesión célula - célula y el balance entre las diferentes fuerzas de unión que actúan en las

2

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células tiroideas (Yap et al., 1992). La activacion del transporte de yodo y la regulación del

volumen folicular ha sido estudiada en respuesta a medios hipotónicos mediada por la

absorción de sodio a través del epitelio (Yap et al., 1993a). La TSH en el sinergismo en

contactos célula - célula y para la adhesión al sustrato, manteniendo los agregados

multicelulares, inhibiendo la expansión celular, pero no la adhesión celular (Yap y Manley,

1993b). Yap y Mamey (1994), encontraron que la TSH inhibe la locomoción intrínseca de las

células tiroideas organizadas como folículos en cultivo primario, y tiene importancia

determinante en la histoarquitectura folicular.

Estos mismos investigadores continuaron con los tipos de adhesión focal, los

microfilamentos de actina y la actividad de la tirosina cinasa, y sugirieron una relación entre la

presencia de la TSH y la formación de los folículos (Yap et al., 1994a), además analizaron

una serie de parámetros mecánicos para los distintos estados de formación y crecimiento de las

células tiroideas (Yap et al., 1994b); también caracterizaron algunas de las moléculas de

adhesión, como la caderina en las uniones célula - célula, y 20-l (Proteína asociada a las

uniones estrechas), y señalaron que la polarización del epitelio tiroideo es crucial en la

formación del lumen folicular, con el agregado celular tridimensional (Yap et al., 1995a).

Encontraron una relación entre los filamentos de actina y la sensibilidad de las uniones a la

citocalasina D, sefialando que las células tiroideas en cultivo y la asociación entre los

filamentos de actina y las uniones celulares difiere, dependiendo de la forma en que se haya

cultivado (Yap et al., 1995~).

La tiroglobulina es una proteína, producida exclusivamente por las células tiroideas. Su

presencia en un cultivo sugiere que las células cultivadas son del tipo tiroideo. La

tiroglobulina es una matriz proteica sobre la cual se sintetizan las hormonas tiroideas (Glinoer,

1997). La producción de tiroglobulina ocupa el 50% de la síntesis proteica de la tiroides. Esta

síntesis forma un grupo de polisornas unidos a la membrana y son dirigidos por un RNA

mensajero @RNA) para el ensamble de las subunidades. Durante su traslado, del retículo

endoplásmico al aparato de Golgi, la tiroglobulina sufre glicosilación, donde un complejo de

azúcar es transferido del fosfato dolicol unido a la membrana y al nitrógeno amina de los

residuos de aspargina. Al salir del sistema Golgi, es incluida en vesículas que se unen a la

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membrana apical de la célula, para su posterior liberación al lumen folicular por exocitosis. La

síntesis y secreción de tiroglobulina son reguladas por la TSH (Glinoer, 1997).

Las hormonas tiroideas circulan unidas a las proteínas plasmáticas, cuya fracción libre

es la parte mas útil de las hormonas tiroideas, ya que mientras permanezcan unidas a su

proteína transportadora no son funcionales. El 70% de la TJ va unida a la globulina

transportadora de la tiroxina (TBG), el 20% a la prealbúmina fijadora de tiroxina (TBPA) y el

10% a la albúmina, mientras que la mayor parte de la T3 se encuentra unida a la TBG. La

fracción libre de las hormonas tiroideas se sitúa en torno al 0.003% de la T4 y al 0.3% de la T3.

La proporción de unión durante el embarazo es mayor, y obedece al estimulo estrogénico. La

vida media de la TBG es aproximadamente de 5 días, y su concentración varía de 10 a 22 mg/l

(Glinoer, 1997).

En el estudio de la disociación del explante tiroideo, se utilizaron las enzimas tripsina y

colagenasa. La tripsina, es una enzima proteasa pancreática con especificidad al sustrato se

basa en cargas positivas de las cadenas de lisina y arginina. La tripsina ha sido aislada de

diferentes fuentes como: el pez perro, alces, ballenas, elefantes marinos, Streptomyces griseus,

perros, cerdos, ratas y humanos, entre otros. La tripsina tiene un peso molecular de 23,800

daltons, produce autólisis limitada de otras formas activas que tienen dos o mas cadenas

- peptídicas unidas por puentes disulfuro, sus formas predominantes son dos cadenas peptídicas

de 01 - tripsina y una de p - tripsina. La tripsina hidroliza específicamente a los péptidos

unidos a los terminales carboxilos de los residuos de lisina y arginina

(httu://www.promega.comítbs/tb5 12/tb5 12.html).

Existen condiciones que se deben de cumplir para que la tripsina sea mas eficiente: La

temperatura debe ser de 37’C, el pH debe ser > 4, estar libre de suero fetal de ternera,

compuestos organofosforados, soya, lima, huevo, plata iónica y calcio. La disociación de las

células, se inicia con el lavado de las monocapas de los cultivos, con una solución con bajas

concentraciones de calcio y magnesio, para remover el suero fetal de ternera, para abatir los

inhibidores de la tripsina. (http://www.worthington-biochem.com/manuaVT/TRY.html).

Otra enzima utilizada para la disociación celular es la colagenasa, cuya función es

degradar las fibrillas nativas helicoidales de colágena. Esta es el mayor componente fibroso

A

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del tejido conectivo extracelular como la piel, tendones musculares, vasos sanguíneos, hueso,

entre otros. La colágena consiste de fibrillas compuestas por agregados de moléculas de

tropocolágena. Cada tropocolágena consiste en 3 helices de cadenas alfa alrededor del eje. La

secuencia de aminoácidos es característica del tejido de origen. Las enzimas atacan

simultáneamente las 3 cadenas y son importantes en el metabolismo del tejido conectivo y son

producidas por las células encargadas de los procesos de remodelación. Bajo condiciones

normales, las enzimas se encuentran unidas a la ct-2-macroglobulina y antiproteasas del

suero. La primera colagenasa fue estudiada de tejido de cola de rana en 1966. Se reporta la

colagenasa de plaquetas en 1974, y la colagenasa en la parte pancreático hepática procedente

del cangrejo violinista. También existe colagenasa en las bacterias, utilizada durante la

invasión del huésped. Esas enzimas difieren de las colagenasas de mamífero. La colagenasa

del Clostridium histolyticum ha sido la mas estudiada, igualmente la procedente del

Achromobacter iophagus, Pseudomonas aeruginosa y la de bacterias marinas

(http://www.worthington-biochem.com/manualKXLS.html).

La disponibilidad de las colagenasas ha permitido el desarrollo de cultivos primarios de

riîrón humano en 1973 y a partir de entonces se dio para el cultivo de múltiples tejidos como

los pancreáticos, hígado, células suprarenales y de tejido graso. Se han descrito cuatro tipos de

colagenasa: el tipo 1 (contiene colagenasa, caseinasa y clostripaína) recomendada para tejido

graso, glándula suprarenal y células hepáticas. El tipo II (contiene gran actividad de

clostripaina) utilizada para corazón, hueso, músculo, tiroides, cartílago y células hepáticas. El

tipo III [contiene baja actividad proteolítica) utilizada en células mamarias y fetales. El tipo IV

(contiene baja actividad triptica) es comúnmente utilizada en islotes y donde la integridad de

los receptores es crucial (http://www.worthington-biochem.com/manualK/CLS.html).

Una vez abordado el origen, morfología y funcionamiento del modelo biológico, se

puede observar la gran diversidad de modelos utilizados y las vías involucradas. Debido a que

las hormonas tiroideas ejercen su acción directamente sobre la función general del organismo,

con el desarrollo de los cultivos primarios de células tiroideas funcionales, utilizadas como

modelo biológico, se puede apoyar a los diferentes trabajos de investigación tendientes al

estudio y comprensión de los factores celulares y moleculares que originan las alteraciones de

la tiroides.

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Basados en la revisión de la literatura se plantea la siguiente pregunta ¿Cómo lograr el

aislamiento y reproducción de las c6lulas tiroideas in vitro? Con el fin de tener un modelo in

vitro, que permita conservar las características morfológicas y funcionales de las células

tiroideas in vivo.

Se considera que con la combinación de enzimas proteolíticas en la disociación celular

y la concentración de suero fetal de ternera, permiten la obtención de tirocitos normales en

cultivos primarios, sin alterar las características funcionales y morfológicas. El objetivo

general de este estudio fue estandarizar una técnica para el cultivo in vitro de tirocitos

morfológica y fisiológicamente diferenciados en cultivos primarios de glándula tiroides de rata

Sprague - Dawley.

Objetivos específicos:

1 .- Aislar las células de explantes de glándula tiroides de rata.

2.- Caracterizar morfológicamente las células tiroideas de los cultivos primarios.

3.- Caracterizar funcionalmente determinando la tiroglobulina.

4.- Determinar sí las células tiroideas obtenidas expresan los receptores de la TSH, y a los

componentes del citoesqueleto actina y tubulina.

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II. REVISIÓN DE LITERATURA

Dado que el propósito del presente trabajo fue generar información para estandarizar

una tecnica para el cultivo in vifro de tirocitos morfológica y fisiológicamente diferenciados,

obtenidos de cultivos primarios de explantes de glándula tiroides de rata. Es fundamental pasar

en revisión todas las características del modelo biológico, por tal motivo se revisan las

características anatómicas, embriológicas, funcionales y de cultivo; así como las diversas

interrelaciones que se suceden.

2.1 Glándula tiroides

La glándula tiroides, produce las hormonas T3 y T4 las cuales tienen influencia

preponderante en el crecimiento, diferenciación y desarrollo de todas las células del organismo

de los vertebrados. La importancia biológica de la glándula tiroides fue reconocida hace

siglos. En el siglo XIX se definió el cretinismo y el mixedema como el resultado de una

disminución de la función tiroidea (Lazar, 1993), desde entonces la Sociedad Clínica de

Londres seÍíaló la importancia de la glándula tiroides en el desarrollo del cerebro

(Oppenheimer, 1997). Harrington (1926) sintetizó la T4. La T3 se obtuvo por desiodinación

periférica de T4 en 1960, siendo ademas la iodotironina mas activa, biológicamente (Roti ef

al., 1993). Enseguida fueron descritos los receptores nucleares a T3 (TRs) (Lazar, 1993).

La glándula tiroides consiste en dos lóbulos situados a los lados de la traquea e

interconectados por el istmo a nivel del 2” o 3er anillo traquéales, inmediatamente por debajo

de la piel y los delgados músculos cutáneos del cuello, usualmente el lóbulo derecho es más

grande que el izquierdo. La dimensión vertical es de 3 a 5 cm. Una tercera parte de los

individuos portan una proyección de tejido que nace en el istmo y se le denomina lóbulo

piramidal. La circulación es importante, con un gasto de 1 ml/min por gramo de tejido

tiroideo, que comparado con otros órganos es muY alta

(<http://www.fhere.org/science/phs/htds/4nf-thdx.html/, 1997; Dumont et al., 1992)

Es muy importante conocer la microestructura del tejido tiroideo, para seleccionar las

enzimas para la disociación y calcular el rendimiento celular. El tejido tiroideo esta compuesto

por tirocitos en un 70%, células endoteliales en un 20% y fibroblastos en un lo%, todo es

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soportado por tejido mesenquimatoso (Dumont et al., 1992). Los folículos de la tiroides

normal son alrededor de 3 millones y varían de 50 a 500 pm de diámetro. Una capa simple de

esas células rodea un lumen que contiene un fluido llamado coloide. Están rodeados por un

extenso plexo capilar. El espacio interfolicular contiene fibras reticulares, una red linfática que

provee canales para la comunicación intraglandular, y fibras nerviosas simpáticas. También

contiene a las células parafoliculares o células C, que producen la calcitonina, cuya acción es

la de regular el metabolismo del calcio (Dumont et al., 1992).

2.1.1. Anatomía comparada y desarrollo

Es fundamental analizar, que otras especies pueden producir prohormonas tiroideas,

como las yodotirosinas y yodotironinas. En la evolución de la función tiroidea, la atención fue

enfocada a los protocordados, como el anfíoxo y sobre el más primitivo de los vertebrados, la

lamprea y el pez brujo (ciclostomas). En los procordados, el yodo puede ser concentrado e

incorporado‘ en yodoproteinas por el endostilo, un órgano situado en la línea media de la

glándula suprafaríngea cuya función es la formación de moco. La larva de la lamprea o

ammocoetes, tiene una estructura como la tiroides, la glándula suprafaríngea, cuyos conductos

son vaciados en la faringe, ésta glándula sintetiza yodoproteínas y son liberadas como

yodotironinas al tracto digestivo, éstas acciones permiten especular que la función inicial de

las yodotironinas fue digestiva (Su et al., 1997).

En los homeotermos como los mamíferos y las aves, las hormonas tiroideas tienen una

íunción común, la de regular el metabolismo, son esenciales en el crecimiento y desarrollo

normal y éste aspecto es similar al desempefiado en la metamorfosis de los anfibios, donde las

hormonas tiroideas envían las sefíales para inducir los cambios morfológicos y funcionales.

Las hormonas tiroideas tienen una función similar en algunas especies de peces y reptiles

(Sing-Yung y Visser, 1994; Su et al., 1997).

2.1.1.1 Embriología

Es primordial el conocer la evolución de la tiroides durante el desarrollo humano,

desde la concepción hasta el nacimiento y en la edad adulta, puesto que los tejidos

embrionarios pueden ser una fuente viable de tejidos. La tiroides es visible durante la tercera

semana de desarrollo, como una evaginación en la faringe ventral, migra hacia abajo y al

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frente de la faringe, y en este descenso se observa como una estructura bilobulada conectada

por el conducto tirogloso. Este conducto posteriormente se reabsorbe, pero si persiste, se

observa en la base de la lengua en el denominado foramen Secar. Durante la séptima semana

se fusiona tejido de la porción ultimobraquial del cuarto arco braquial de donde se originan las

células parafoliculares. Las células epiteliales tiroideas proliferan y se diferencían en folículos.

La capacidad para sintetizar tiroglobulina y formar el coloide, es manifiesta alrededor de la

décima semana; ademas se inicia la capacidad para acumular y organificar yodo. En el

segundo trimestre se pueden detectar cantidades de T4 y de TSH, lo que sugiere que la

actividad de la tiroides esta bajo el control de la hipófisis (Dumont et al., 1992).

Durante la diferenciación fetal, el tejido crece al paralelo del peso corporal y

permanece así hasta la vida adulta. La tiroides fetal pesa 0.2 g, mientras que en el adulto su

peso varía de 16.7 a 28.0 g (Pankow et al., 1985), este crecimiento requiere de 6 a 7 divisiones

celulares. Las células tiroideas humanas se dividen alrededor de 5 veces en la etapa adulta, con

lo que se demuestra que tienen una constante de crecimiento lenta (Su et al., 1997). En el

adulto, la tiroides mantiene su tarntio con un lento crecimiento, pero retiene su capacidad a

crecer por hipertrofia celular y proliferación en respuesta a un estímulo (Dumont et al., 1992).

Por medio de cordocentesis, desde las 12 semanas, se ha observado un incremento de T4, T3,

TSH y Tiroglobulina (tg), que reflejan la madurez del hipotálamo, hipófisis, tiroides e hígado

(Porterfield y Hendrich, 1993).

El tejido tiroideo hipertrofiado extraído quirúrgicamente se puede convertir en fuente

potencial de células tiroideas. El bocio se manifiesta, como un crecimiento de la glandula

tiroides y puede ser debido a agentes bocibgenos, seguido de un incremento progresivo del

peso tiroideo, con mesetas después de 3 meses (hasta 12 veces el volumen original). El primer

signo en los tejidos involucrados es la disminución del espacio luminal de los folículos, del

estroma avascular y un aumento en las células epiteliales y espacios de los vasos sanguíneos

(Dumont et al., 1992). La proliferación de células endoteliales va precedida de los tirocitos, y

la vascularización varía mas que la masa celular folicular con el nivel de estimulación de la

tiroides. El incremento global en el espacio de las células epiteliales es seguido de hipertrofia

(Studer y Derwahl, 1995) y multiplicación celular, todos los tipos de células, proliferan

durante este estadio (Dumont et al., 1992).

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La tiroides es un epitelio de transporte que separa el espacio coloidal del lumen

folicular, del líquido extracelular y la sangre. Las cClu1a.s epiteliales tiroideas median las

formas de transporte vectorial que son necesarios para la función tiroidea normal, en especial

el movimiento transepitelial de yodo, de hormonas tiroideas y de sus precursores. Posee un

sistema bidireccional de transporte de iones, que contribuye al control del tama.iIo de los

folículos tiroideos, determinando el flujo neto de líquidos al lumen folicular (Yap y Stevenson,

1995).

2.1.1.2 Fisiologia de las células tiroideas

Es fundamental el conocer como operan las diferentes vías en la fisiología normal, para

poder detectar las alteraciones, dichos factores son básicos para el crecimiento y

diferenciación de los tirocitos. La unidad funcional de la glándula tiroides es el folículo, que es

una estructura semiesférica compuesta de una capa de células rodeando un espacio llamado

lumen folicular, que secreta una proteína, llamada tiroglobulina. La síntesis de tiroglobulina se

da en el retículo endoplásmico rugoso, continúa en el aparato de Golgi, y concluye hasta pasar

al lumen folicular, con la yodinación de tirosina y el acoplamiento de yodotirosinas para

formar las yodotironinas. El yodo es captado en la célula por difusión y transporte activo

(bomba de Yodo). La per-oxidasa tiroidea, se encuentra localizada en la membrana apical,

oxida el yodo y une la tirosina a la tiroglobulina (Sing-Yung y Visser, 1994). La peroxidasa es

una enzima crucial en la síntesis de hormonas tiroideas, y se incrementa en la enfermedad de

Graves, carcinoma y tumores tiroideos benignos (Massini-Repiso et al., 1994). El mayor

regulador para la secreción de las hormonas tiroideas es la TSH (Guksouma et al., 1998).

2.1.2 Hormonas tiroideas T4 y T3

En los organismos superiores (vertebrados), bajo condiciones normales, la tiroides

metaboliza el yodo y conduce la síntesis de las hormonas tiroideas. El mecanismo tiene lugar

en tres estadios secuenciales: a) transporte activo de yoduro hacia la tiroides, b) oxidación de

yoduro y yodación en forma oxidada de residuos tirosílicos dentro de la tiroglobulina, c)

acoplamiento de yodotirosinas para formar la 3,5,3’,5’ Tetrayodotironina o tiroxina (Th) y

3,5,3’ Triyodotironina (T3). Las hormonas así formadas se unen por enlaces peptídicos a la

tiroglobulina que es el componente más importante del coloide folicular (Sing-Yung y Visser,

1994).

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Harrington en 1926 sintetizó la Ta, qué I en 1960, era considerada la fuente más

importante de TX por desyodinación periférica de la Tq, siendo la yodotironina mas activa

biológicamente. Aproximadamente el 80% de T3 es producida por conversión y el 20%

restante por producción directa de la tiroides en los sujetos normales (Chanoine et al., 1993;

Roti et al., 1993). El 80% de la producción de T3 a partir de la T4 ocurre en órganos perifericos

de los cuales los más importantes son el hígado, riííón, hipófisis y cerebro. En estos órganos el

proceso se lleva a cabo cuando la T4 se desyodina por medio de las enzimas llamadas

desyodinasas. El tipo 1, 1 ,S- desyodinasa (una seleno proteína), el tipo II, 5’- desyodinasa y el

tipo III 5- desyodinasa, encargadas de regir todos los pasos catabólicos en la conversión de Ta

hasta la T2 (Contempré et al., 1991). Las hormonas tiroideas están implicadas en grado

superlativo, en el crecimiento y desarrollo de la mayoría de los tejidos corporales (Galton, et

al., 1983), principalmente del cerebral durante la edad fetal y neonatal (Porterfield y Hendrich,

1993), ejercen su efecto catabólico y anabólico en el metabolismo de lípidos, carbohidratos y

proteínas mediante la interacción con proteínas receptoras específicas localizadas en el núcleo

de todas las células del organismo (Muller y Seitz, 1984a).

La entrada de las tironinas al compartimento celular se da por un proceso activo

conocido como potocitosis, que utiliza vesículas de la membrana celular llamadas caveolas.

Las caveolas se difunden por gradiente al citoplasma celular (Jones et al., 1994). En la célula

ambas hormonas se unen a las proteínas del citosol y al núcleo por medio de receptores que

tienen mayor afinidad para la T3, que para la T4, explicándose en parte el porqué la T3 es la

hormona más activa biológicamente. La interacción de la Ts con los receptores se inicia con

activación de genes y da como resultado cambios en la síntesis de proteínas (Ishii et al., 1982;

Sing-Yung y Visser, 1994).

Existen ademas receptores en la mitocondria, con los que se median cambios en la

cadena respiratoria y sobre la membrana plasmática para regular el transporte de nutrimentos

al interior de las células, proceso que no requiere de síntesis proteica. La mayor vía metabólica

de las hormonas tiroideas es por desiodinación de T4 formando T3 y rT3 (T3 reversa), y T2 a

partir de T3. En virtud de la gran potencia de la T3, la formación a partir de T4 es considerada

como un proceso de activación (Ishii et aZ,. 1982; Sing-Yung y Visser, 1994).

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La desyodinasa tipo 1 se encuentra en el hígado y el riAón (Lee et al., 1993), la T3

formada por ésta enzima es rápidamente liberada a lakrculación y es la mayor fuente de T3 en

el organismo. La desyodinasa tipo II se ubica en el cerebro y la hipófisis (Tang et al., 1994),

cuya actividad se incrementa en hipotiroidismo y este mecanismo opera para conservar los

niveles de T3 en el sistema nervioso central, La desyodinasa tipo III, es la responsable de la

formación de la rT3 y de la T2, su acción es a nivel de sistema nervioso central, placenta y

durante el desarrollo fetal (Ishii et al., 1982; Sing-Yu y Visser, 1994).

En adición a la monodesyodinación, el hígado puede sintetizar conjugados de

yodotironinas con glucuronato y sulfamatos, los conjugados son excretados por la bilis. La

desaminación oxidativa y la descarboxilación de las yodotironinas puede ocurrir en el hígado

y el rifión cuyo metabolito resultante es el ácido tetrayodotiroacético formador de la Tq (Sing-

Yu y Visser, 1994).

Las hormonas tiroideas regulan el metabolismo en los tejidos y la síntesis de muchas

enzimas involucradas en el metabolismo intermedio, generalmente favoreciendo la

movilización y ruptura de los nutrientes como son los ácidos grasos y los azucares. Estimulan

la frecuencia y fuerza de contracción del corazón, actúan sinérgicamente con las

catecolaminas, y la acción más importante es durante el crecimiento y la sobrevivencia de las

especies. Estimula la síntesis y secreción de hormona del crecimiento (GH) (Porterfield y

Hendrich, 1993; Oppenheimer y Schwartz, 1997) y ésta a su vez, el crecimiento celular. La

GH media este efecto regulando la síntesis y secreción de Insulina como factor de crecimiento

1 (IGF-1). Este es un factor de crecimiento p’leiotrópico sintetizado por muchos tejidos para

regular la división celular y la firncibn diferenciada (Wolf et al., 1989).

Los eventos de fosforilación en la célula son indispensables para la activación

transcripcional, vía isoformas del receptor de hormonas tiroideas, ciertas isoformas del

receptor pueden ser fosforiladas in vivo e in vitro (Jones et al., 1994).

2.1.2.1 Metabolismo extratiroideo del yoduro

El yodo es la materia prima para la síntesis de hormonas tiroideas, y sirve como

monitor para evaluar el metabolismo de la glándula tiroides. La tiroglobulina almacenada en la

tiroides contiene yodo suficiente para cubrir las necesidades hormonales temporalmente,

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durante algunas semanas. Alrededor de las tres cuartas partes + yodo se encuentran en forma

de yodotirosinas. Del yodo remanente, un 90% esta en forma de T4, 8 al 9% de Tj, y el resto

como trazas de otras yodotironinas. La secreción de hormonas requiere que la tiroglobulina

sea ingerida por la célula; las vacuolas fagocíticas resultantes se fusionan con los lisosomas

para formar fagolisosomas, en los que la tiroglobulina es digerida por enzimas proteolíticas

liberando aminoácidos yodados. La monoyodotironina (MIT) y diyodotironina (DIT) pueden

desyodinarse completamente por acción de la tirosina deshalogenasa, y el yodo libre resultante

es reciclado. Existe evidencia que la T3 segregada por la tiroides es formada por

desyodinación periferica de Ta. El rango de T4 a T3 es de alrededor de 10: 1 en sujetos

normales (Arvan y Castle, 1998).

La tiroides contiene grandes cantidades de yodo orgánico, la actividad de la bomba de

yodo esta relacionada con la cantidad de yodo inorgánico almacenada y puede mantener

dichas cantidades sin que se provoquen variaciones de la TSH. La proporción del yodo

disponible para la síntesis hormonal varia con la captación de yodo, que usualmente es del

10% y bajo condiciones de deficiencia extrema de yodo la proporción captada puede alcanzar

hasta el 100%. El sistema de transporte, se lleva a cabo en la zona basal de los folículos, es

dependiente del metabolismo oxidativo (puede inhibirse por anoxia, cianuro y otros

inhibidores de la fosforilación oxidativa) y requiere del funcionamiento normal de Na+ - K’-

dependiente de adenosin trifosfato (ATPasa). El yodo difunde al interior por gradiente

electroquímico. El yodo derivado de la dieta, catabolismo periférico de hormonas tiroideas y

yodotironinas por desyodinación constituyen el concentrado inorgánico extratiroideo, que

entra en equilibrio dinámico principalmente en dos órganos, la glándula tiroides y el riñón. La

captación diaria de yodo en sujetos normales es de 150 pg, la disminución del yodo puede

conducir a la insuficiente producción hormonal (Glinoer, 1997).

El yodo utilizado en la síntesis de las hormonas tiroideas es extraído del yoduro

inorgánico que esta en el líquido extracelular (LEC). Este yoduro es parcialmente recuperado

cuando se libera por la desyodinación de las hormonas tiroideas en los tejidos periféricos. Sin

embargo, la dieta es la fuente más importante de yoduro, tanto en su forma inorgánica como

orgánica. El yodo inorgánico se absorbe rápidamente en el tracto gastrointestinal, perdiéndose

muy poco por las heces. Hasta que se unen los compuestos orgánicos (fundamentalmente

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h

tirosina), el yoduro que entra en la tiroides por transporte activo forma parte del yoduro

extracelular, y como tal está en equilibrio con el del compartimento principal de yoduro. La

concentración de yoduro en el LEC normalmente es baja: de 1 a 1.5 pg/lOO ml, el contenido

i:en el torrente circulatorio es aproximadamente de 250 pg, el cual se recambia varias veces

durante el día (Sin@;-Yung y Visser, 1994).

Se pierden pequeiias cantidades de yodo por el aire espirado y a través de la piel. Es

importante considerar el mecanismo de depuración renal de yoduro, ya que puede modificar la

disponibilidad de yoduro. A pesar de que es completamente fíltrable en el glomérulo, la tasa

de depuración de yoduro en un adulto normal es de 30-40 ml/min, y es reabsorbido

fundamentalmente de forma pasiva. Normalmente se eliminan en la orina unos 500 ug de

yodo, casi todo en forma inorgánica. Esta cantidad es inferior a la que se ingiere con los

alimentos, reflejando pérdidas muy bajas del elemento por las otras vías como el tracto

gastrointestinal donde se pierden unos 12 ug, principalmente en forma orgánica (Sing - Yung

y Visser, 1994).

En el déficit familiar de deshalogenasa, se pierden por la orina tirosinas yodadas y la

eliminación fecal de yodo orgánico puede ser muy intensa en ei síndrome de malabsorción

intestinal, también por la acción de ciertos alimentos, como la soya (Rumsey el al., 1997). Se

pueden ademas producir perdidas notables de yodo durante el período de lactancia, de aquí

nació la propuesta de la Organización Mundial de la Salud para aplicar la suplementación de

yodo a mujeres gestantes, y durante el período de lactancia de 200 @día (Glinoer, 1997).

2.1.3 Tiroglobulina

La tiroglobulina es una matriz protéica sobre la cual las hormonas tiroideas son

sintetizadas en la glándula tiroides (Glinoer, 1997). Es una glicoproteína que pesa 660 kD, se

le conocen dos subunidades de 330 kD. La producción de tiroglobulina ocupa el 50% de la

síntesis protéica de la tiroides. Esta síntesis forma un grupo de polisomas unidos a la

membrana y son regidos por un RNA mensajero (mRNA) para el ensamble de las

subunidades, durante su traslado del retículo endoplásmico al aparato de Golgi, la

tiroglobulina sufre glicosilación, donde un complejo de azúcar es transferido del fosfato

dolicol unido a la membrana. El azúcar sufre un proceso multiestado que involucra el

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P

movimiento de glucosa, residuos de manosa y la adición de ácido siálico. Al salir la

tiroglobulina del sistema Golgi, es incluida en vesículas que se unen a la membrana apical de

la célula, para su posterior liberación al lumen folicular por exocitosis (Glinoer, 1997).

Las hormonas tiroideas son transportadas por la TBG por medio de uniones covalentes,

se adhieren a las proteínas plasmáticas, aproximadamente, el 70°/ de la T4 se fija a la

globulina fijadora de la tiroxina (TBG), el 20% a la prealbúmina fijadora de tiroxina (TBPA) y

el 10% a la albumina, mientras que la mayor parte de la T3 se encuentra unida a la TBG. La

vida media de la TBG es alrededor de unos 5 días, su concentración es de 10 a 22 mg/L

(Glinoer, 1997).

2.2 Hormona estimulante de la tiroides (TM-I)

La TSH es una de las señales extracelulares involucradas en el control de la

proliferación y diferenciación de las células tiroideas, tanto in vivo como in vitre. Es

considerada de manera general como el principal elemento controlador del crecimiento

tiroideo in vivo (Dumont et al., 1992). La historia de la TSH viene desde 1920 con el

descubrimiento de su actividad en la glándula hipófisis. En 1970 se determinó la secuencia de

aminoácidos de las subunidades de la TSH. En 1980, se realizó la descripción detallada de la

estructura de carbohidratos y la clonación de la unidad a y /3, facilitó el entendimiento de

algunos mecanismos moleculares de la TSH (Grossman et al., 1997). La TSH es una

glicoproteína de 20 a 30 kDa producida por las tirotropas de la hipófisis anterior. Esa síntesis y

secreción son estimuladas por la TRH e inhibidas por las hormonas tiroideas en un mecanismo

clásico de retroalimentación negativa (Dahl et al., 1994). La TSH controla el mecanismo de

activación del receptor y facilita el acoplamiento de la sefial a la familia de las proteínas G.

Este receptor estimula las diferentes cascadas de regulación como: la vía de la adenilato

ciclasa y la hidrólisis de fosfatidil inositol bifosfato por fosfolipasa C. El cAMP es estimulado

a bajas concentraciones de TSH (0.1 a 1 mU/ml), mientras que la fosfolipasa es de 1 a 10

mUVm1 (Allgeier et al., 1994).

La TSH regula la proliferación y diferenciación funcional de las células tiroideas, como

son la organificación de yodo, la síntesis de tiroglobulina, el metabolismo de las iodoproteínas

y la secreción de hormonas tiroideas (Tramontano e Ingbar, 1986). La TSH es un miembro de

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la familia de glicoproteínas en las que se incluye la hormona folículo estimulante (FSH),

gonadotrofina coriónica (CG) y hormona luteinizante (LH) se encuentran prácticamente en

todas las especies de mamíferos y en pequefios vertebrados. Estructuralmente las hormonas

glicoproteicas son heterodímeros afines, compuestos de una subunidad 01 común conteniendo

una apoproteína central de 92 aminoácidos incluyendo 10 medios residuos de cistina unidos

por puentes disulfuro. Es codificado por un gen localizado en el cromosoma 6 en humanos con

secuencia idéntica de aminoácidos. La subunidad p es distinta y puede estar alineada en 12

formas invariantes de residuos medios de cistina por 6 puentes disulfuro en humanos, y en

secuencia de aminoácidos es idéntica a la de otras especies (Grossman et al., 1997).

Los genes de la subunidad p de hormonas glicoprotéicas, difiere en longitud,

organización estructural y localización cromosómica. La subunidad p es una proteína madura

de 118 residuos de aminoácidos y es localizado en el cromosoma 1. Un importante

componente estructural de esas hormonas es la cantidad de carbohidratos constituyentes entre

el 15 al 35% por oligosacáridos unidos y la subunidad beta (1 en TSH y LH) o (2 en CG y

FSH) (Grossman et al., 1997).

2.2.1 Receptor a TSH

El proceso de reconocimiento y respuesta a estímulos es crítico para el crecimiento y

función de las células. La estimulación del receptor a la TSH, es sin duda la mayor vía de

transducción de sefiales desde la membrana celular, estimulando las vías de señalización

intracelulares. Las vías moleculares involucradas son mediadas por el cAMP y PKC en

respuesta al estímulo aplicado. Las vías de sefialización se dan a través de eventos de

mecanorecepción en la superficie celular, por medio de los receptores transmembranaks

(Wang et al., 1993).

El receptor a TSH, tiene un peso molecular de entre 30 a 200 kD (Misrahi et al., 1990),

y como todos los receptores a glicoproteínas constan de un dominio extracelular (394

aminoácidos), un dominio transmembranal consistente en siete segmentos (268 residuos) y un

dominio carboxilo terminal de aproximadamente 50 residuos. La transducción de señales se

hace a través de la unión a proteínas que unen GTP (proteínas Gs), que a su vez activan las

vías de la adenilatociclasa y fosfolipasa C, induciendo la hidrólisis de los fosfoinosítidos

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(PIP2) y la liberación de Ca* de los reservorios intracelulares, dando como resultado la

activación del cAMP y PKC (Dallas et al., 1994).

La distribución del receptor a la TSH en tejido tiroideo normal, se localiza en la

superficie basolateral de la célula, y se sobreexpresa en la enfermedad de Graves. La TSH al

unirse a su receptor estimula la producción de T3 y T4 (Seetharamaiah et al., 1994), mas aun,

el receptor a la TSH sirve como blanco antigénico, de aquí se desprende que al unir

autoanticuerpos antireceptor causen hipertiroidismo. Igualmente se han encontrado

anticuerpos antireceptor a TSH en la enfermedad de Hashimoto, los cuales inhiben la unión de

la TSH a su receptor (Madec et al., 1988). La enfermedad de Graves (GD) es un trastorno

endocrino caracterizado por hipertiroidismo, bocio y exofkhnos. El hipertiroidismo de la GD

es producido por autoanticuerpos que se unen al receptor a TSH y estimulan la

sobreproducción de hormonas tiroideas (Patibandla et al., 1987).

La clonación molecular y expresión funcional del receptor a TSH han mostrado rápidos

avances para el entendimiento de la estructura y función. Los sitios de unión de anticuerpos

contra receptor a TSH no parecen ser los mismos que para la TSH. Dos de los 6 sitios

potenciales de glicosilación en el dominio extracelular son importantes en la expresión del

receptor funcional. Los puentes disulfuro contribuyen a mantener la estructura tridimensional

del receptor, en la región extracelular la homología de aminoácidos del TSHr entre humanos,

perros y rata es alta (8590%) (Nagayama y Rapoport, 1992).

2.2.3 El Hz02 como regulador de la yodinación y formacibn de hormonas tiroideas

El peróxido de hidrógeno (H202) es muy importante en la organificación, regulación de

la yodinación y formación de hormonas tiroideas, tanto en cultivos celulares, como en cClu1a.s

in vivo (Chen et al., 1993). Para sintetizar hormonas tiroideas, las reacciones de yodinación de

proteínas requiere la presencia de tiroglobulina, peroxidasa tiroidea (TPO) y yodo. El Hz02 es

un aceptador de electrones y un sustrato de TPO en la yodinación de proteínas y en las

reacciones de acoplamiento. El sistema de generación de Hz02 ha sido estudiado

extensivamente en células tiroideas porcinas, de perro y de rata. La TSH estimula la

yodinación y la generación de H202, y media el transporte y organificación de yodo,

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sugiriendo que hay una regulación de la reacción de yodinación en la generación de Hz02 intra

y extratiroidea (Chen ef al., 1993).

2.3 Citoesqueleto

Es muy importante en los cultivos celulares, puesto que son los constituyentes para

generar el huso mitótico durante la división celular, ademas son la estructura rígida y móvil de

las células. Ademas interviene a través de los microtúbulos, como vías para el transporte de

una gran cantidad de productos de exocitosis y endocitosis, y forman las estructuras de

crecimiento y unión de las células constituída por la llamada matriz extracelular. Las células

ejercen sus funciones, sólo después de adquirir una morfología específica, y la función del

citoesqueleto es importante para establecer y mantener ésta forma. Del citoesqueleto dependen

una variedad de procesos celulares como la movilidad celular, migración, transporte

intracelular de partículas, meiosis y mitosis, distribución espacial de los organelos celulares,

respuesta celular a los eventos de la membrana, comunicación intracelular incluyendo la

conducción de sefiales eléctricas, localización del mRNA, síntesis de proteínas, y en el caso de

las hormonas, desde la síntesis, transporte, secreción, degradación y su influencia en las

células blanco. Ademas median los efectos de las hormonas relacionadas con el crecimiento,

transporte transepitelial, esteroidogénesis, funcionamiento tiroideo y paratiroideo, movilidad y

maduración de los oocitos (De Loof eC al., 1996).

El citoesqueleto funciona como sistema de sostén y locomoción de las células, participan

en muchas de las funciones celulares, como el de adoptar una gran variedad de formas,

transportar mc.éculas de manera ordenada, moverse, unirse a un sustrato y dividirse entre

otras funciones (Hitt et al., 1994). Las diversas actividades del citoesqueleto dependen de tres

tipos de proteínas filamentosas que son: filamentos de actina, microtúbulos y filamentos

intermedios. Cada tipo de filamentos esta formado por diferentes subunidades de proteínas: a)

actina, por filamentos de actina, b) microtúbulos; a, p, y y tubulina, c) filamentos intermedios;

las relacionadas con la familia de las proteínas fibrosas tales como la vimentina, proteína glial

fibrilar, laminas celular y citoqueratinas. La actina y tubulina se han conservado durante la

evolución de los eucariotes; sus filamentos protéicos unen una gran variedad de proteínas

accesorias, las cuales hacen posible que los mismos filamentos participen en distintas

funciones, en diferentes regiones de la célula (Yap et al., 1995; Hollembeck et al., 1995).

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Generalmente la diversidad del citoesqueleto es una parte esencial en la diferenciación

durante la embriogénesis. Todas las celulas constitutivas son descendientes de un mismo

cigoto y tienen el mismo genoma, pero los genes se expresan diferentemente, esto permite que

las celulas constituyan y adquieran diferentes morfologías y una gran variedad de funciones

(Schdit y Hall, 1998).

2.3.1 Actina

El citoesqueleto de actina es un compuesto de polímeros altamente dinámico y con una

gran variedad de proteínas asociadas. Las principales funciones del citoesqueleto de actina son

las de mediar la movilidad celular y los cambios en la morfología durante el ciclo celular en

respuesta a estímulos externos, para organizar al citoplasma y generar fuerza mecánica en la

célula. El cambio de morfología y funciones de la actina es regulado por las vías de

sefialización (Schidt y Hall, 1998). La movilidad celular basada en la actina tiene dos eventos

moleculares, la polimetización regulada y los motores moleculares (Cooper y Mitchinson,

1995).

La actina existe en forma monomérica o globular (Actina G) o en forma polimérica o

filamentosa (Actina F). El arreglo de microfilamentos es muy dinámico, capaz de cambiar su

organización y orientación en respuesta a estímulos del receptor. Muchas proteínas forman

complejos con la actina, como con la tropomiosina y la dematina (Hitt y Luna, 1994; Luna y

Hitt, 1992), participa ademas en la sefialización transmembrana, endocitosis y secreción (Luna

y Hitt, 1992).

2.3.2. Microtúbulos (MT)

Son polímeros de tubulina, que se encuentran en todas las células eucarióticas. Durante

la división celular, los arreglos dinámicos de microtúbulos llamados huso mitótico, funcionan

para la segregación y orientación de la fijación de los cromosomas. En células no divididas,

los microtúbulos están en el citoplasma, posicionan el núcleo y los organelos, sirven como un

elemento estructural de cilios y flagelos. Los microtúbulos son polímeros robustos, con una

resistencia intrínseca para retraerse y comprimirse (Desai y Mitchinson, 1997).

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En 1984 un mecanismo llamado inestabilidad dinámica fue propuesto para los MT

basada en un analisis de la longitud de distribución de MT fijos. De acuerdo a éste modelo la

población de microtúbulos exhibe una gran masa en estado fijo, un solo microtúbulo que

nunca se estrecha, pero persiste en estados prolongados de polimerización y despolimerización

que frecuentemente SC interconvierten (Desai y Mitchinson, 1997), y se define la ganancia y

pérdida de subunidades en el mismo extremo (sea polo positivo o negativo) de un MT durante

el crecimiento o acortamiento (Radionov y Borisy, 1997).

2.3.3 Filamentos intermedios

En contraste a los microfilamentos y microtúbulos, cuyos componentes están

evolutivamente conservados y son muy similares en todas las células, los filamentos

intermedios (FI) despliegan una gran diversidad en número, secuencia y abundancia. En los

humanos existen más de 50 diferentes genes de FI, quienes son expresados diferencialmente

en casi todas las células del organismo. Los FI constituyen generalmente el 1% del total de

proteína celular, y en algunas células como en los queratinocitos epidérmicos y neuronas, la

constitución alcanza hasta el 85%. La superfamilia de los FI tienen una estructura común, que

es un dímero compuesto de dos cadenas a helicoidales paralelas (Fuch y Weber, 1994; Fuchs

y Cleveland, 1998). Los filamentos intermedios interactúan con microtúbulos y

microfilamentos, para reforzar el citoesqueleto. Las subunidades de microtilamentos, quizás

actúen como transmisores de seaales de la periferia celular hacia el núcleo (Schdit y Hall,

1998).

2.4 Cultivo celular

Es una de las mejores alternativas para generar un modelo biológico, si bien existen

modelos de tiroides, se ha observado que tienen funciones comunes, y algunos muestran

limitaciones, por lo que no se puede hablar de un modelo perfecto. Para evitar el sacrificio

sistemático y masivo, así como la interferencia de trabajar con el animal in vivo se inició el

cultivo primario de células, en éste caso para el estudio fisiológico y patológico de la glándula

tiroides (Tramontano et al., 1986). Los modelos animales han sido utilizados para estudiar la

influencia de las hormonas tiroideas en el desarrollo de los tejidos de mamíferos, tal es el caso

de las ratas, ovejas, bovinos, primates, porcinos y caninos (Porterfield y Hendrich, 1993).

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El cultivo de tejidos comprende todos aquellos aspectos tendientes a estudiar los

diferentes mecanismos de reproducción celular así como las anomalías que presenta al

dividirse y originar nuevas células. El estudio de la morfología celular la inició Wilson en

1928, al observar las estructuras como arreglos lineales y la polarización de la célula, durante

el desarrollo de la división celular (Desai y Mitchinson, 1997). Los cultivos celulares se

iniciaron a finales de 1940 con Eagle, quién propuso algunos métodos y técnicas para

modificar el medio ambiente celular in vitro, y lograr de esta manera el desarrollo de células

bajo condiciones controladas.

Las células foliculares tiroideas derivadas de tiroides de rata retienen muchas de las

funciones diferenciadas intrínsecas y despliegan una serie de respuestas metabólicas a la TSH

incluyendo el aumento en la actividad de la adenilato ciclasa y la síntesis y secreción de

tiroglobulina, captación de yodo. Este sistema experimental ha mostrado ser un modelo ideal

para estudiar el mecanismo de acción de la TSH en estas células blanco “in vitro”

(Tramontano et al., 1986).

La TSH tiene efecto mitógeno sobre las células derivadas de la glándula tiroides de rata

normal, y permite mantener las características morfológicas y metabólicas diferenciadas,

desarrollo y reproducción in vitre, requieren la presencia continua de 6H como parte esencial

para el crecimiento y la función diferenciada (Tramontano et al., 1986).

El desarrollo de nuevos procedimientos y medios de cultivo, han hecho posible el

desarrollo de algunos tipos de células diferenciadas en cultivo clonado. La dediferenciacibn

emergió como una de las más notables generalizaciones de los estudios in vitre y ocasionó una

gran discusión acerca de la estabilidad del estado diferenciado. Algunos experimentos

muestran que las poblaciones celulares dediferenciadas, re expresa sus características

diferenciadas, bajo condiciones de cultivo adecuadas (Conn, 1966). La mayoría de los cultivos

que han sido adaptados para crecer in vitre y han sido clonados de cklulas mesenquimatosas o

células derivadas de tumores. Recientemente se han incrementado el numero de cultivos

amnióticos debido a que se ha generado una mejor defmición en los requerimientos celulares y

en la disponibilidad de medios de cultivo. Muchas de las células cultivadas, especialmente los

fibroblastos requieren cantidades relativamente elevadas de suero fetal de ternera (SFB) para

su crecimiento (520%). La adición del suero es considerada necesaria para proveer a la célula

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“factores del suero” que son necesarios para que la célula se una al sustrato y se reproduzca

(Coon, 1966; Sato, 1975).

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Panorama general

Los métodos utilizados para el aislamiento de celulas tiroideas de rata Sprague-

Dawley, fueron el obtener el explante de la glándula tiroides, el cual se fragmentó y se sometió

a disociacibn enzimática, una vez aisladas las celulas, se les cuantificó la viabilidad, por la

técnica de azul de tripano y posteriormente fueron sembradas en cajas de cultivo y en botellas

con medio Ham F12 adicionado con 6 hormonas y suero fetal de ternera, bajo condiciones

controladas a una temperatura de 37’C en un ambiente con 95% aire hrímedo y 5% de COZ. El

medio de cultivo fue cambiado cada 4 días y fue recolectado para realizar la determinación de

tiroglobulina por medio de RIA, utilizando al medio nuevo como estándar o nivel basal de Tg.

Se realizó una secuencia fotográfica a partir de la siembra, para observar y caracterizar la

morfología adoptada por las células en cultivo primario y compararlas contra células tiroideas

de la línea celular FRTLS. Asimismo se sembraron celulas sobre cubreobjetos fueron

sembradas y procesadas para inmunofluorescencia para inmunodetectar al receptor de la TSH,

y a los componentes del citoesqueleto de actina y tubulina. Como control, se utilizaron células

HeLa, luego fueron observadas en un microscopio invertido para fluorescencia y se

imprimieron en película fotográfica (Ambesi-Impiombato et al., 1980).

3.2 Sujetos experimentales

Las glándulas tiroides fueron obtenidas de ratas Sprague-Dawley de 24 semanas de

edad, con un peso promedio de 250 g, mantenidas con luz y temperatura controladas (12 hrs

luz/oscuridad a 23 +- 2OC de temperatura), alimento balanceado y agua ad livitum. Las ratas

fueron obtenidas del bioterio del Centro Regional de Estudios Nucleares (CREN), la parte

experimental fue realizada en el Laboratorio de Biología Celular del mismo Centro, en la

Universidad Autónoma de Zacatecas, en Zacatecas, Zac.

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3.3. Obtención de las cdlulas tiroideas

3.3.1 Explante tiroideo

Este paso tuvo como propósito el obtener la glándula tiroides de la rata Sprague-

Dawley, y a partir de éste tejido; aislar las células tiroideas, de acuerdo a la técnica propuesta

por Ambesi-Impiombato et al, (1980).

El proceso se realizó bajo condiciones de esterilidad en una campana de flujo laminar.

Las ratas (Sprague-Dawley) fueron anestesiadas en una cámara conteniendo cloroformo (J. T.

Baker), posteriormente se fijaron y se les realizó lavado de cuello con jabón líquido neutro

(Carboquim), asepsia con jabón quirúrgico (Dermocleen) y antisepsia con benzal (Temer). Se

utilizó un estuche de disecciones (Chrome, USA) para extraer cuidadosamente la glándula

tiroides utilizando, se utilizó un escalpelo No. 21 (Feather Safety) para la incisión de la piel y

otro para la disección de la glándula tiroides. Se siguió el mismo procedimiento para la

obtención de explantes de hígado, rifión, y linfocitos periféricos.

3.3.2 Disociación celular

En éste paso se utilizaron dos procedimientos, el propuesto por Rapoport (1976) y el de

Ambesi-Impiombato el al., (1980).

El primer método utilizado para la obtención del explante y disociación celular fue el

propuesto por Rapoport (1976) consistente en la utilización de un homogenizador de tejidos y

la utilización de tripsina -verseno (0.075%) y colagenasa III, en solución de Hank’s, para la

disociación celular, con digestión de 2 y 3 hr, posteriormente se midió la viabilidad celular y

se sembró las células en botellas y cajas de cultivo, en medio de Ham F12 y 6H y con 0.5% de

suero fetal de ternera.

El segundo procedimiento fue realizado mediante la metodología sugerida por Ambesi-

Impiombato et al., (1980). Se extrajo el explante tiroideo, y se depositó en solución

amortiguadora de fosfatos (PBS) estéril para su lavado primario. Luego se seccionó en

fracciones de aproximadamente de lmm3 utilizando una caja de Petri y una hoja de escalpelo

estéril. Los segmentos de tiroides fueron lavados nuevamente en PBS estéril y se dejaron

sedimentar, se extrajo el PBS. Los segmentos de tiroides se sometieron a digestión enzimática

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en un tubo cónico de polipropileno de 15 ml (Costar 33 18) en solución de Hank’s (Microlab,

Lote 5 Il) adicionada con 20 U/ml de Colagenasa tipo 1 A (Sigma C-2674), tripsina - EDTA

al 0.075% (Gibco, No. Cat. 15400 - 054) y suero de pollo al 2% (Gibco No. Cat. 1600 - 044),

la digestibn fue por 30 minutos, a 37’C en bailo María con agitación (Lab Line), una vez

concluido este paso, se dejó sedimentar por 5 minutos, se extrajo el sobrenadante y se

centrifugó a 1700 rpm (378 g) en una centrífuga clínica (Sorvall TC6).

3.3.3 Cultivo celular

Este paso se efectuó de acuerdo a la propuesta de Ambesi-Impiombato et al., (1980).

El sobrenadante fue eliminado, quedando el paquete celular, el cual se suspendió en medio de

cultivo de Ham F12 (Gibco, No. Cat. L 21700075) adicionado con insulina 10 pg/ml (Lilly),

transferrina 5 l.tg/ml (Sigma T-4382), somatostatina 10 ng/ml (Sigma S-9129), hidrocortisona

10 nM (Sigma H-0396), glicil histidil lisina 10 ng/ml (Sigma G-1887) y TSH 10 mU/ml

(Sigma T-8931) nominados en conjunto 6H, y 5% de suero fetal de ternera (Gibco No. Cat.

26170). 3 ml de la suspensión celular se sembró en 3 cajas de cultivo de 100 X 20 (Costar

3060) conteniendo 8 cubreobjetos (Corning), asi como en una botella de cultivo de 25 cm2

(Costar 3055).

Las cajas y botellas de cultivo conteniendo las células, se colocaron en una incubadora

(Scientific Form) con 95% de humedad y 5% de CO2 a una temperatura de 37°C. Los

fragmentos de tejido remanentes, fueron sometidos a digestión bajo las mismas condiciones

iniciales por otros 30 minutos y las células se obtuvieron bajo las condiciones seiialadas. El

medio de cultivo se cambió cada cuatro días a partir de la siembra inicial.

Para analizar la función del suero fetal de ternera sobre el desarrollo celular, se montó

un experimento utilizando diferentes concentraciones desde 0.0, 0.1, 0.5, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0 y

15.0%, y se observó el desarrollo celular a las 48 horas, utizando un microscopio (Axiovert

25) con el objetivo 40X (Karl Zeiss), consistente en contar el número y tamaño de las colonias

en proceso de crecimiento (Ambesi-Impiombato et al., 1980).

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3.4 Determinación de la viabilidad celular

Una vez aisladas las células, se realizo el recuento celular y la determinación del

porcentaje de viabilidad celular, mediante la técnica de tincibn de exclusión con azul de

tripano (Boyum, 1968). Se utilizó azul de tripano al 4% como colorante supravital. Se

transfirieron 0.5 ml de una solución al 4% (p/v) de azul de trípano en un vial de 1.5 ml (Costar

Cambridge MA.). Se afíadíeron 0.3 ml al PBS pH de 7.2 y 0.2 ml de la suspensión celular

(factor de dilución = 5), mezclando por 15 seg. Se dejó reposar de 5 a 10 mín. Con la solución

formada, se llenaron por capilaridad las cámaras del hematocítómetro (cámara de Neubauer,

Spencer Bright-líne Buffalo N.Y.), cubiertas por un cubreobjeto.

Se contaron todas las células utilizando un microscopio óptico (Carl Zeiss objetivo 4X)

en el cuadrado mílímétrico central y en los cuadrados de cada esquina, llevando cuenta

separada de las células tefíidas y células totales. Cada cuadro del hematocímetro representa un

volumen total de lo4 por rnn?.

Para determinar la concentración de células/ml de la suspensión celular, se realizaron los

cálculos considerando un factor de dilución del 50%, ya que la tincíón se realizó a partes

iguales con la suspensión. El procedimiento fue el siguiente (Sigma. 1999):

Conteo celular: Cada cuadro del hematocímetro con la cubierta en su lugar, representa

un volumen de 0.1 mm3 ó 104/cm3. Ya que 1 cm3 equivale aproximadamente 1 ml, la

subsecuente concentración celular por ml (y el numero total de células) fue determinado

siguiendo los siguientes cálculos:

Células por ml = a la cuenta promedio por cuadrante por el factor de dilución por 1 04.

Células totales = células por ml X el volumen original del cual se tomó la muestra.

Viabilidad celular = Total de células (no teñidas) entre las células totales (teñidas ytetidas) por 100.

no

3.5 Lisis celular

Después de haber sido obtenidas las células tiroideas, el precipitado de células se lavó

con 1 ml de PBS, pH de 7.2 a 4OC, posteriormente se resuspendió dicho precipitado en 150 pl

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de la solución de lisis que contenía: 1% de Tritón X-l OO (Merck West Germany) 140 mM

NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.6 (Gibco BRL Grand Aisland NY ), mas 1 mM de

PMSF. El lisado celular se homogenizó y centrifugó por 10 min a 16,000 g recuperandose

exclusivamente el sobrenadante, que fue transferido a viales etiquetados para congelarse hasta

su procesamiento.

3.6 Determinación de proteínas en extractos totales

Para determinar la cantidad total de proteína de los explantes celulares, se utilizó la

técnica de Bradford (1976), para su posterior caracterización por medio de electroforesis en

geles de poliacrilamida.

3.7 ElectroforCsis (PAGE-SDS)

Se realizó el corrimiento de las proteínas del lisado celular, en geles de poliacrilamida,

de acuerdo a la técnica propuesta por Laemmli (1970). Se ensamblaron los cristales de vidrio

de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se agregó la solución de poliacrilamida al 10%

entre los cristales. El menisco de solución de poliacrilamida llegó aproximadamente a 8 cm

del borde superior, se mantuvo el gel en posición vertical a temperatura ambiente. El gel se

formó (entre 20-30 min), se inclinaron los cristales por su vértice, se lavó el gel de separación

tres ocasiones con agua destilada, y se evitó la presencia de algún residuo.

Se preparo la solución de poliacrilamida para el gel concentrador. Esta solución se

agregó directamente sobre el gel separador polimerizado. Se colocó el peine, apropiado dentro

de la solución cuidando de no producir burbujas. El gel se mantuvo en posición vertical a

temperatura ambiente. El gel concentrador polimerizó en aproximadamente 10 min. Los pozos

se lavaron 3 veces con agua destilada o solución de corrida para eliminar la poliacrilamida no

polimerizada. Los pozos se cargaron con 30 ug de las muestras problema, previamente

tratadas con buffer de muestra, y calentadas a 95OC por 5 min. La corrida electroforética se

llevó a cabo a 1 OO V, a temperatura ambiente y por 80 min de acuerdo a la técnica de 0 ‘Farrel

(1975).

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3.8 Transferencia de proteinas a membrana de nitrocelulosa

Para detectar a los receptores a TSH, y los componentes del citoesqueleto, tubulina y

actina, las proteínas en los geles de poliacrilamida, se transfirieron a una membrana de

nitrocelulosa (Amersham Hybond-C # FWN303C), utilizando la técnica de Towbin et al.,

(1979).

3.9 Bloqueo de la membrana de nitrocelulosa

Para evitar la absorción inespecífíca del anticuerpo en la membrana de nitrocelulosa,

ésta se lavó tres veces con PBS. Después se le agregó solución bloqueadora (3% de leche

descremada Sbelty de Nestlé en PBS) y se dejó en la solución por 12 h (Sharon, 1979;

Olmsted, 198 1).

3.10 Inmunodetección

Las proteínas transferidas a la membrana de nitrocelulosa, se identificaron utilizando

anticuerpos específicos contra los diferentes tipos de proteínas; anti TSHr, tubulina y actina y

un segundo anticuerpo conjugado a peroxidasa (Towbin et al., 1979). Después de bloquear la

membrana de nitrocelulosa con la solución de leche descremada al 3% en PBS durante 12 h,

se lavó tres veces con PBS a 4°C. Posteriormente se incubo por 1 h en solución bloqueadora y

por separado con los anticuerpos anti receptor a TSH, anti actina y ami tubulina

respectivamente, enseguida la membrana de nitrocelulosa fue lavada en forma alternada 5

veces con PBS, y 5 veces con PBS-Twin-20. Después la membrana se incubó 1 h con un

segundo anticuerpo conjugado a peroxidasa, con agitación suave. Pasado el tiempo de

incubación se procedió a lavar de nuevo en la forma anteriormente descrita y por último se

utilizó un reactivo quimioluminiscente (ECL, Amersham Little, Chalfont Buchinghamshire

England), el cual, al reaccionar con la peroxidasa emite luz, misma que fue detectada en una

película fotográfica (Dupont de Neumors, USA).

3.11 Determinación de tiroglobulina

La presencia de tiroglobulina fue detectada por medio de RIA, que es una metodología

con una alta sensibilidad y especificidad (99.5%) para la tiroglobulina (Berson y Yallow,

1956; Larsen et al., 198 1).

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Para medir los niveles de tiroglobulina (secretada por los tirocitos en el medio de

cultivo), fueron utilizados paquetes para radioinmunoanálisis en fase líquida de tiroglobulina

(Diagnostic Products Corporation, DPC Los Angeles, USA). Las muestras fueron corridas por

duplicado, introduciendo estándares altos, medio y bajo para tiroglobulina. Para la validación

de los datos, se utilizó el programa RIAWHO, donado por la Organización Mundial de la

Salud, que provee ademas del cálculo de resultados, los diferentes parámetros de control de

calidad para asegurar la validez de los datos obtenidos (Lamen ef al., 198 1).

3.12 Inmunoflorescencia indirecta para detectar receptores a TM-I, filamentos de Actinay microtúbulos

Para evidenciar los receptores y componentes del citoesqueleto, fueron utilizados

marcadores biológicos fluorescentes. Esta técnica, ha sido utilizada para medir la dinámica de

macromoléculas en las células obtenidas, de acuerdo a la técnica propuesta por Harlow y Lane

(1988). Las células tiroides que crecieron en los cubreobjetos, se fijaron y permeabilizaron

con metano1 absoluto a -20°C, por 20 segundos, el experimento fue realizado por duplicado

con los tirocitos y con células HeLa, como control negativo para receptores a TSH, y positivo

para actina y para microtúbulos: Cada laminilla se permeabilizó con SFB y se agregó 10 pl de

primer anticuerpo anti TSH (dilución 1: 1 OO), anti actina (dilución 1: 1 OO)(A 4700, Clone AC -

40, SIGMA) y anti 01 - tubulina (dilución 1: lOO)(T - 5 168, Clone B - 5 - 1 - 2, SIGMA), l3 -

tubulina ( T - 5293, Clone 2 - 28 - 33, SIGMA). Posteriormente fue agregado un segundo

anticuerpo anti ratón desarrollado en conejo y conjugado con fluoresceína (F - 9137,

SIGMA), una vez concluído éste proceso, los cubreobjetos fueron montados en laminillas y

utilizando aceite de inmersión, y se observaron en un microscopio invertido (Axiovert 25)

equipado con lámpara y filtros para fluorescencia y cámara fotográfica, obteniendo imágenes

por contraste de fases y por fluorescencia.

3.13 Análisis estadistico

Para evaluar el efecto de la digestión con tripsina - EDTA a tiempos de 30 y 60

minutos fue utilizada la prueba de t de Student, partiendo de las siguientes hipótesis;

Hipótesis nula: (Ho) La viabilidad celular para un tiempo de digestión de 30 min del tejido

tiroideo, es igual a la viabilidad celular para un tiempo de digestión de 60 minutos.

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Ho: V30 - Vho = 0, Donde V30 es la viabilidad celular a 30 min , y VIO es la viabilidad

celular a 60 min.

Hipótesis alternativa: (Ha) El tiempo de digestión de 30 min del tejido tiroideo, permite

obtener una viabilidad celular diferente al tiempo de digestión de 60 minutos.

Ha: V3o--Va#O

Para determinar sí la viabilidad de las cClulas expuestas a tripsina - EDTA varía en

función del tiempo de digestión, 30 y 60 min, se realizó la prueba estadística t de Student

(Kokoska y Nevison, 1989; Lyman, 1993). La prueba se realiz& para comparar el efecto

analizando los valores de la desviación estándar de los promedios de la viabilidad.

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En el aislamiento de células del tejido tiroideo de rata, se emplearon 4 diferentes tipos

de enzimas (tripsina-versenokolagenasa tipo III; tripsina-EDTAkolagenasa tipo 1) en dos

grupos experimentales para lograr la disociación tisular (digestión) de las células del tejido

tiroideo. En la Figura 1 se observa el porcentaje de la viabilidad celular, obtenido en cuatro

cultivos empleando las enzimas tripsina-verseno y colagenasa tipo III; con un tiempo de

digestión de 2 y 3 h. Los porcentajes de viabilidad obtenidos fueron 14.23 f 6.15 a 2 h y de

29.99 f 9.06 a las 3 h.

4.1 .Viabilidad celular

IV. RESULTADOS

1 0 0

60

4 60

3 40

s20

0

I 1 2 3 4C U LTIVOS

Figura 1 Porcentaje de viabilidad celular obtenida con el método de Rapoport usando 2

tiempos de digestión.

En la Figura 2 se aprecia que la viabilidad celular fue sensiblemente mayor, al utilizar

las enzimas tripsina-EDTA y colagenasa tipo 1, enzimas recomendadas por Ambesi -

Impiombato et al., (1980) para llevar a cabo la disociación celular con tiempos de digestión

muy cortos en comparación con la técnica propuesta por Rapoport 1976), mostrada en la

Figura 1, lo que permite una menor manipulación y contacto con los agentes proteolíticos.

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1 2 3 4 5 6 7 6CUJlVO6A(3OMN) CUllVCE(6OMN)

Figura 2 Valores obtenidos en la viabilidad celular de acuerdo al método de Ambesi -

Impiombato, a 30 min (barras l-4) y a 60 min (barras 5-8).

Para determinar sí la viabilidad de las células expuestas a tripsina - EDTA varia en

función del tiempo de exposición, 30 y 60 min, se realizó la prueba estadística de t de Student,

para comparar el efecto analizando los valores de la desviacion estándar de los promedios de

la viabilidad. La prueba de t de Student se aplicó bajo la hipótesis de que la viabilidad a 30

min es estadísticamente igual a la viabilidad a 60 min.

Bajo este criterio se acepta Ho, por lo tanto la viabilidad celular no fue

estadísticamente distinta al tiempo de exposición a la enzima.

Como Ttab > Tcal, entonces se puede decir con un 95 % de certeza que la viabilidad 1 no es

diferente de la viabilidad 2.

La utilización de las pruebas estadísticas para comparar; sí la viabilidad celular fue

igual a los 30 y a los 60 min, permitió establecer un efecto similar entre ambos tiempos, por lo

tanto se puede utilizar cualquiera, sin tener diferencias significativas en la viabilidad celular.

4.1.1 Concentración de suero fetal de ternera

Para seleccionar de la cantidad más eficiente de suero fetal de ternera, el experimento

qué se montó con 8 diferentes concentraciones y dio como resultado que del 0.0 al 3.0 % el

rendimiento celular por el desarrollo de colonias fue escaso, en relación con el campo visual

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del microscopio con un áirea menor al 20%, mientras que para el 5% las colonias y densidad

celular fue mayor del 50% del campo visual. A concentraciones mayores, 7.5, 10.0 y 15.0%,

no se observó diferencia visual respecto a la concentración del 5%, razón por la que se

continuó con una concentración al 5%.

4.2 Caracterización morfológica

Los cultivos primarios de tirocitos se caracterizaron morfológicamente comparando su

desarrollo con la línea FRTLS. Los cultivos celulares aislados a partir del tejido tiroideo, se

muestran en las Figuras 3 a 5, como se puede observar, los resultados obtenidos en cuanto a

las formas celulares, tamaiio de los folículos y por el tipo de desarrollo, se puede presumir que

son tirocitos.

Figura 3 Microfotografía de cultivos de tirocitos después de 21 días, donde se

muestran, las células tiroideas obtenidas en cultivo primario (izquierda)

y las células tiroideas de la línea celular FRTLS (derecha), tomadas con

un objetivo 40X.

En la Figura 3 una microfotografia en donde se muestra un cumulo de células tiroideas

obtenidas en cultivo primario (izquierda), el cual guarda la morfología respecto a los tirocitos

de la línea celular FRTLS (derecha), en donde se observan los tirocitos organizados en

ll

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folículos, rodeando unos espacios correspondientes al lumen folicular. En la Figura 4 también

se comparan ambos grupos celulares.

Figura 4 Microfotografia de los tirocitos obtenidos después de 15 días en cultivoprimario (izquierda), comparado contra la línea celular de tirocitosFRTLS (derecha) utilizando un objetivo 40X.

Figura 5 Microfotografía en donde se muestra una de las morfologías adoptadaspor los tirocitos en cultivo primario obtenida con un objetivo 1 OX.

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4.3 Determinación de Tiroglobulina

Para determinar si las células tiroideas en cultivo primario, producen tiroglobulina en

el medio de recambio procedente de los cultivos, se realizó la medición a partir de la semana 1

a la 5, utilizando como control el medio de cultivo, que contenía 1.47 ng/ml de tiroglobulina.

La cuantificación en ng/ml de ésta proteína fue realizada por medio de radioinmunoanálisis

(RIA) (Berson y Yallow, 1956; Larsen, 1981). Los datos obtenidos son mostrados en la Figura

6, en la cual no se aprecia diferencia en la primera semana respecto a la cifra control,

mostrando una elevación importante durante la segunda semana, encontrando una elevación

más importante a la 3” semana, luego el comportamiento se mantuvo a manera de meseta,

durante la cuarta y quinta semanas que fue monitoreada. Lo anterior demuestra que las células

cultivadas son células tiroideas en cultivo primario, ya que es el único tejido que es capaz de

producir tal metabolito.

Figura 6 Comportamiento de la producción de tiroglobulina desde la 1” a la 5” semana, y

en donde se muestra que la primera barra es la concentración basal del medio de

cultivo, y las 5 siguientes son las cifras determinadas cada semana (La

incertidumbre asociada es < 0.05%).

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4.4 Expresión de receptores a TSH

Para demostrar que las células que se obtuvieron de la glándula tiroides fueron tirocitos

y no otras células, a las células que se sembraron sobre cubreobjetos y se procesaron para IFI,

con anticuerpos antireceptor contra TSH. Se encontró que los tirocitos en cultivo primario

expresaron los receptores a la TSH, más no en las células HeLa, como se muestra en la Figura

7. Asi mismo, las cClulas se procesaron por IFI para detectar componentes del citoesqueleto

utilizando anticuerpos contra actina y tubulina, en donde dio positivo para las células

tiroideas como para células HeLa, como se observa en las Figuras 8,9, 10 y ll.

Figura 7 Microfotografia de los tirocitos obtenidos después de 15 días de cultivo

primario, obtenida por contraste de fases (izquierda) y por inmunofluorescencia

para la detección de los receptores a la TSH (derecha) con objetivo 100X.

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Figura 8 Microfotografia de los tirocitos obtenidos, después de 15 días de cultivo,

observados por contraste de fases (izquierda) y por inmunofluorescencia para

detectar la a tubulina (derecha), utilizando un objetivo 100X.

Figura 9 Microfotografía de los tirocitos obtenidos, después de 15 días de cultivo,

observados por medio de contraste de fases (izquierda) Y por

inmunofluorescencia para detectar filamentos de actina (derecha) utilizando un

objetivo 100X.

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Figura 10 Microfotografia de los tirocitos obtenidos a los 15 días de cultivo, observados

por contraste de fases (izquierda) y por inmunofluorescencia para detectar

filamentos de actina (derecha), con el objetivo 100X.

Figura ll Microfotografia de los tirocitos cultivados en cubreobjetos, después de 15 días,

observados por contraste de fases (izquierda) e inmunofluorescencia para p

tubulina (derecha), con el objetivo X 1 OO.

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Figura 12 Microfotografía de las células HeLa, observadas por contraste de fases

(izquierda) e inmunofluorescencia para detectar los filamentos de actina

(derecha), tomada con un objetivo 100X.

Para corroborar por western blot que los tirocitos en cultivos primarios expresaran el

receptor a la TSH, las células en cultivo se lisaron y sus proteínas se caracterizaron en geles de

poliacrilamida, se transfirieron a papel de nitrocelulosa y se procesaron para inmunodetectar el

receptor a la TSH, con un anticuerpo específico. Como control se utilizó lisado de células

HeLa, de hepatocitos y de linfocitos de rata Sprague - Dawley. Se encontró que las células

tiroideas, de hígado y linfocíticas, fueron las únicas en donde se expresó el receptor a la TSH,

mientras que las HeLa no, como se observa en la Figura 13.

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Figura 13 Los extractos de células hepáticas (H), tiroideas (T), células HeLa (He), y

linfocitos (L) respectivamente. Se observa que las células tiroideas, hepáticas y

linfocitos expresan al receptor de la TSH, mientras que las c4ula.s HeLa no

como se observa por IFI.

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V. DISCUSIÓN

El objetivo general de ésta investigación fue estandarizar una técnica para el desarrollo

de tirocitos morfológica y fisiológicamente diferenciados, en cultivos primarios a partir de

glándula tiroides de rata Sprague - Dawley.

Los resultados obtenidos permiten concluir que: a partir de los explantes tiroideos, con

la combinación de enzimas proteolíticas y la concentración de suero fetal de ternera, es

factible la obtención de tirocitos normales en cultivos primarios sin alterar sus características

funcionales y morfológicas.

5.1 Tknicas de disociación, a partir del explante tiroideo y medición de la viabilidadcelular

El primer paso para la obtención del modelo biológico, es el explante de la glándula

tiroides, disociación y aislamiento de los tirocitos y la siembra en un medio de cultivo

específico. Existen pasos cruciales en la optimización de los procedimientos de aislamiento

para un tipo particular de células y es dependiente de una recuperación adecuada teniendo

VUklS características: un manejo enzimático apareado con la viabilidad.

(http://www.worthington-biochem.com/tissueDissociation/cellOpt.html, 1999).

Uno de los aspectos importantes en la obtención de los cultivos primarios, es conocer

el porcentaje de c&las vivas, que serán sembradas luego de su aislamiento, a partir del

explante tiroideo. Esto es con el fin de contrastar su desarrollo en el cultivo específico, con

respecto al numero inicial contabilizado. Esto permitió la estandarización en cuanto a que tipo

de enzimas utilizar, y durante cuanto tiempo se debe de exponer el explante glandular, así

como determinar el rendimiento celular obtenido, que fue de 3.16 X 1 O6 células totales y una

viabilidad celular del 68% en promedio (Ambesi-Impiombato et al., 1980)

Para la disociación del explante tiroideo fueron utilizados dos grupos con dos enzimas

cada uno, el primero comprendió a la tripsina - verseno / colagenasa III, y en el segundo a la

tripsina - EDTA / colagenasa 1. Para el primer grupo se observó un numero total de células,

similar al descrito por Rapoport (1976) 1 X lo5 células por ml, y al aplicarle la prueba de

A l

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exclusión con azul de tripano, se encontró que la viabilidad celular fue de 14.225 f 6.145 a las

2 h, mientras que a las 3 h fue de 29.985 f 9.058.

Esto condujo a buscar alternativas, para mejorar dicha viabilidad, que de manera inicial

se consideró crucial, para la obtención de un rendimiento celular a confluencia, ya que se parte

de que sí se siembra una baja cantidad de células vivas, esto retrazará el tiempo de respuesta

previsto para que alcancen dicha confluencia.

En cambio para el segundo grupo de enzimas, la disociación se realizó durante

perIodos de 30 min (n=4) y 60 min (n=4), encontrándose que a los 30 min, la viabilidad fue de

67.4875 f 6.3517, y del 69.3575 f 5.8705 a los 60 min. Esto es casi similar al promedio

aceptable para la obtención de un cultivo primario reportado por Kolodny (1985) que osciló de

entre el 60 al 70 %, pero es bajo respecto al 90% registrado para el cultivo de hepatocitos por

Lykkesfeldt et al., (1998) y respecto al reportado para las células FRTLS, cuando son

reactivadas que debe ser mayor al 95% según Ambesi-Impiombato et al., (1980).

Para el segundo grupo de enzimas, y para evidenciar sí existe o no alguna ventaja en

cuanto a la obtención de células viables a 30 y 60 min, los datos fueron analizados aplicando

la prueba t de Student, y se encontró, que no existe diferencia estadísticamente significativa,

(pcO.05) y que por lo tanto, se puede disgregar los tejidos por 30 o 60 min, sin variar la

viabilidad celular, con una exactitud del 95%. Esto sugiere que es indistinto utilizar 30 o 60

min para digerir los explantes. Esto se basa en que al aplicar la prueba estadística para los 2

tiempos, tratando de encontrar diferencias, ésta no se pudo demostrar, en ese sentido se

observa que es indistinto la utilización de uno u otros, tiempos, qué servirán como un

parámetro cuando se utilice ésta metodología.

Se encontró en primer lugar que el aislamiento celular total con células vivas, fue

mejor en el segundo grupo de enzimas, ya que existe diferencia entre el método propuesto por

Rapoport (1976), (primer grupo) y el grupo propuesto por Ambesi-Impiombato et al., (1980).

Por otro lado, los autores de los métodos utilizados como base para la operativización

del trabajo (Rapoport, 1976; Ambesi - Impiombato et al., 1980), incluyendo algunos otros que

han obtenido cultivos primarios a partir de explantes, centraron su atención en los

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procedimientos de disociación y aislamiento del modelo biológico, en los medios enzimaticos

y mecánicos como el utilizado por Pourati et al., (1998), o ambos métodos Rapoport (1976),

pero la viabilidad celular, no fue contemplada por ninguno de los autores quienes disefiaron

medios de cultivo, como Ham (1964) y Conn (1965), el que disefió y estandarizó el cultivo de

la línea celular FRTLS, Ambesi-Impiombato et al., (1980), el que comenzó a utilizar las

células tiroideas bovinas utilizando la TSH y un antimicótico, para observar cambios, Knopp

et al., (1970).

En todos los casos anteriormente expuestos la viabilidad celular no fue medida, se

puede argumentar que es un fenómeno estudiado desde principios del siglo, pero según los

autores del manual Worthington, es un factor crucial, cuando se está llevando a cabo un

proceso de estandarización de un cultivo, así como para medir la variación de células viables

durante un experimento. Otros autores han considerado, la estandarización de cultivos

básicamente dirigidos hacia la disociación celular, medios de cultivo y factores de crecimiento

específicos, pero dejan de lado la viabilidad celular, a diferencia de los autores del manual de

Worthington, los parámetros a considerar en cualquier esquema para la estandarización de un

cultivo son la viabilidad celular por un lado y el rendimiento celular. Por lo tanto, no basta tan

solo con disociar un gran numero de células, sino que se debe de buscar un balance entre el

numero de CélUhS disociadas y su viabi l idad (<http://www.worthington-

biochem.com/manual/tissueDissociation/cellOpt.htlm~, 19992

5.1.1 Condiciones del cultivo

Se debe elegir un acondicionador nutritivo general para las células de los mamíferos, y

proporcionar las condiciones metabólicas específicas para un tipo individual de célula.

Estableciendo los requerimientos más favorables para la supervivencia y crecimiento de la

célula, las condiciones de cultivo deben de promover el mantenimiento del estado diferenciado

(Koningsberg, 1963).

La función del medio condicionado general de Eagle y Piez (1955), fue constituído por

30 aminoácidos y 8 vitaminas como elementos esenciales para las diferentes células de

mamífero, pero se deben adicionar algunas otras sustancias para lograr las condiciones

específicas de un cultivo en especial. Este es el caso de las células tiroideas, que aparte del

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medio específico Ham F 12 (modificado de Conn), se requieren además 6 hormonas o factores

de crecimiento específicos para su desarrollo, los cuales son esenciales para la proliferación de

los tirocitos aislados (Ambesi-Impiombato et al., 1980).

Los factores de crecimiento específicos, en el caso de las células tiroideas son la

insulina, transferrina, somatostatina, glicil histidil lisina y TSH, y substituye la hidrocortisona

por cortisol (Smelderly et al., 1993), mientras que otros utilizan los considerados como

mínimos, la insulina, transferrina y TSH (Dere et al., 1985). Se estableció el experimento

conforme lo recomendado por Ambesi - Impiombato et al., (1980), en el cual se inició con

una serie de ensayos tendientes a estandarizar las concentraciones de los diferentes factores de

crecimiento hormonal, y se observó que no hubo el desarrollo celular esperado, por lo anterior

se considera que la fuente de error no depende de la concentración de las 6H, posiblemente

influyeron factores como la disociación enzimática y la resiembra semanal, o la actividad

específica de las hormonas utilizadas.

Asi mismo en la preparación del medio de cultivo, se realizó una modificación en la

concentración de suero fetal de ternera, para lo cual se instaló un experimento utilizando

diferentes concentraciones que fueron desde 0, 0.1, 0.5, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0 y 15.0 %, y la

concentración en donde se observó un mejor crecimiento fue al 5%, misma que es utilizada

por Ambesi - Impiombato et aZ.,( 1980) para la línea celular FRTLS, mas no para la siembra de

tejidos nativos, cuya propuesta es a una concentración de 0.1 a 0.5 %, para evitar la

proliferación de los fibroblastos sobre los tirocitos.

En este experimento con la modificación de suero fetal de ternera a diferentes

concentraciones, no se observó el desarrollo de los fibroblastos, probablemente a que los

factores de crecimiento específico para los tirocitos, interfieren con el desarrollo de los

fibroblastos, privilegiando exclusivamente la proliferación de los tirocitos.

En cambio hay autores quienes no utilizan ni suero, ni hormonas, como en el cultivo de

células epiteliales de pulmón (Nielsen et al., 1997), o células transfectadas de tiroides humana

(Lemoine, 1989), ya que no logran ventaja adicional con su uso.

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Algunos explantes obtenidos quirúrgicamente en humanos con enfermedad de Graves,

fueron digeridos con colagenasa IV y dispasa, a 32’C por 30 min, el medio utilizado fue el

Ham F12 y el RPM1 1640 (1: l), el suero fetal varió de 0 al lo%, en donde se observó gran

reactividad a la bTSH a bajas concentraciones entre 1 al 2 %, perdiéndose ésta respuesta entre

3 aI 10% (MacNeil el al., 1994; Sato el al., 1995).

5.2 Caracterización morfolhgica

Los cultivos celulares tiroideos en cultivo primario, obtenidos in vitro, pueden permitir

su utilización como un modelo biológico que facilite, evidenciar algunos mecanismos

celulares y moleculares, en el desarrollo de las diferentes enfermedades tiroideas, desde las

simples disfunciones endocrinas, como en el hipotiroidismo e hipertiroidismo, hasta la

investigación de los factores precipitantes de neoplascias y algunas enfermedades

autoinmunes, que ya no solo afectan el proceso de secreción hormonal, sino que pueden tener

efectos devastadores en otros ámbitos no tiroideos. Para la caracterización morfológica de los

tirocitos obtenidos, se realizó la comparación entre éstas células de cultivo primario,

contrastándolas contra los tirocitos de la línea celular FRTLS (Figuras 4 y 5) respectivamente.

Se puede evidenciar cuan importante es la morfología asumida por las células tiroideas,

de tal manera que Yap y Manley (1984), consideran como la base anatómica y funcional a la

histoarquitectura folicular de la tiroides. La organización de las células epiteliales tiroideas en

formas quisticas, conteniendo coloide en el lumen permite la síntesis, procesamiento y

secreción de hormonas tiroideas. Esos eventos morfogenéticos son coordinados por procesos

como la adhesión celular, el tráfico intracelular, ensamble de uniones especializadas y la

regulación de los movimientos celulares morfogenéticos (Yap et al., 1992). La morfogénesis

folicular tiroidea es alterada en enfermedades endócrinas como la tiroiditis de Hashimoto y

neoplasia de la tiroides, cuya característica es la alteración de la histoarquitectura folicular

(Yap et al., 1987).

Por otro lado cuando se siembran células a alta densidad en presencia de TSH, las

células tiroideas se adhieren unas a otras. La influencia morfogenética de la TSH es mediada

por la proteína cinasa A, vía cAMP, y lo identifican como el principal determinante de la

morfología folicular tiroidea in vitro. La TSH regula la adhesión de células tiroideas, la

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organización del citoesqueleto e inhiben la locomotilidad celular. Los patrones de las celulas

tiroideas en cultivo, no son fijos, ya que pueden disociarse y migrar convirtiendo los folículos

en monocapas (Yap y Manley, 1994; Yap et al., 1997).

Para asumir una funcionalidad y morfología adecuadas, es importante que la célula esté

polarizada. La polaridad celular (asimetría) es extensamente distribuida y altamente

conservada en los diferentes tipos celulares, desde procariotes hasta los grandes eucariotes. En

organismos multicelulares es mas conspicuo, pero no esta restringido a neuronas y células

epiteliales. La membrana plasmática esta organizada en dos dominios, el apical y el

basolateral. Esta función inherente a las células epiteliales es acomptiada de funciones mas

especializadas incluyendo la absorción y la secreción (Salas et al., 1997).

La morfología de los folículos tiroideos tiene un comportamiento similar en las

diferentes especies de vertebrados, como en células de rata (Ambesi-Impiombato et al., 1980),

en células humanas transfectadas (Lemoine, 1989), células de cerdo (Yap et al., 1997), células

bovinas y caninas (Depoortere et al., 1998), entre otros modelos biológicos de células tiroideas

utilizados.

La organogénesis y el remodelado de tejido requieren no solo la proliferación y

diferenciación extensiva de los tejidos, sino también de la eliminación selectiva de células

indeseables. Las hormonas tiroideas son esenciales durante el desarrollo de los humanos, ya

que regulan directamente la transcripción genética a través de los receptores a hormonas

tiroideas, como son los factores de transcripción nuclear. Muchos de los genes son regulados

por la T3, han sido aislados y caracterizados, confiriéndoles a las células tiroideas una función

importante dentro de los mecanismos de apoptosis (muerte celular programada) en especial en

ésta especie, pero que a futuro se pueden extender las investigaciones a otras especies (Su et

al., 1997).

Uno de los fenómenos observados durante el desarrollo de los folículos tiroideos fue la

generación de estructuras extracelulares, con morfología aproximadamente hexagonal,

nominada matriz extracelular (ECM). La interacción de células con las proteínas de ECM,

afecta muchos aspectos del comportamiento y regulación de los procesos biológicos,

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incluyendo la morfología celular, migración, diferenciación, transformación y crecimiento

(Vitale ef al., 1997).

La comparación gráfica-gráfica permite cotejar las similitudes morfológicas entre las

células obtenidas de glarrdula tiroides de rata y las de línea celular FRTLS. No se observó

diferencia en cuanto a distribución y tarnaiio de los tirocitos, en la formación de folículos y de

los espacios interfoliculares. Cabe mencionar que las células de línea FRTLS, no se

desarrollaron adecuadamente bajo las condiciones proporcionadas por la patente, por lo que no

se pudieron obtener patrones de cúmulos mayores a las aproximadamente circulares,

mostradas en las Figuras 4 y 5.

5.3 Caracterización funcional

La tiroglobulina es uno de los marcadores específicos que se expresa en las células

tiroideas, y es una glicoproteína yodada en la cual se sintetizan las hormonas tiroideas

(Fontana, 1982). Este proceso de yodación de hormonas tiroideas se lleva a cabo en la

membrana apical de las células epiteliales de la tiroides (Lemansky, 1998).

La tiroglobulina, es el precursor de las hormonas tiroideas T4 y T3, deriva de las

células epiteliales tiroideas. La tiroglobulina es almacenada en el lumen del folículo tiroideo y

su transporte a la circulación, es a través de transporte vesicular transepitelial (trancitosis). La

depuración de la tiroglobulina de la circulación ocurre en el hígado, por endocitosis en las

células de Kupffer. La intemalización de la tiroglobulina es acompañada por la liberación

proteolítica de las hormonas tiroideas, de sus moléculas precursoras. El significado biológico

de esta liberación extratiroidea de hormonas por los macrófagos, quizás consista en

interacciones parácrinas con los hepatocitos (Brix, 1998).

La tiroglobulina se detectó, por medio de RIA, desde la 1” a la 5” semana, y se utilizó

como control estandar o cifra basal, la determinada en el medio de cultivo (1.47 ng/ml) a

utilizar para el recambio, encontrando que la tiroglobulina mostró una elevación incipiente

durante la primera semana (1.88 ng/ml), se observó una mayor elevación en la segunda

semana (4.96 ng/ml), alcanzando el umbral a la tercera semana (7.04 ngml). Durante la cuarta

(6.71 ng/ml) y la quinta semanas (6.80 ng/ml), el comportamiento observado fue a manera de

meseta. La medición por medio de RIA mostró una sensibilidad para tiroglobulina del 99.5%,

A- l

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aunque las cifras obtenidas, son bajas en relación a las reportadas por Fontana et al., (1982)

que fue desde una producción de 60 a 80 pg/ml hasta 20 ng/ml, encontrando que en el cultivo

de tirocitos, la liberación de tiroglobulina, al medio de cultivo es de 30 pg/ml, y ésta respuesta

es directamente proporcional al numero de células (Fontana et al., 1982). En el experimento

no fue posible medir la densidad celular in sifu, debido a no contar con la infraestructura para

tal fin.

Existe evidencia de que algunas hormonas polipeptídicas son degradadas en los

órganos blanco, y sugiere que la inactivación local, quizás funcione como un importante

mecanismo de regulación celular, así como de inactivación de la señal hormonal (DeRubetis et

al., 1975).

Se han reportado secreción y formas anormales de tiroglobulina, como lo mencionó

Medeiros-Neto et al., (1996), donde identificaron una alteración en el retículo endoplásmico,

con inducción de una proteína chaperona y deficiencia de tiroglobulina. Abramowicz et al.,

(1997) describieron la presencia de una tiroglobulina mutante estructuralmente y la

propusieron como un factor potencial para la presencia de hipotiroidismo congénito, cuyos

efectos intra y extraútero, son muy importantes, dentro. del esquema de evolución, que

relaciona al hipotiroidismo con el retraso mental.

5.4 Expresión de los receptores a TSH y componentes del citoesqueleto

La presencia de receptores y componentes del citoesqueleto fue determinada de dos

formas, la primera fue el procesamiento por medio de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y la

segunda por Western Blot.

La importancia de la inmunofluorescencia indirecta, se encuentra dentro de las técnicas

para evidenciar estructuras utilizando marcadores biológicos fluorescentes. Los biosensores

protéicos fluorescentes, están involucrados en la citoquímica y espectroscopia fluorescente, y

han sido utilizadas para medir la dinámica de macromoléculas, metabolitos, iones, y para

explorar las bases moleculares de las funciones vitales, en los campos de la química orgánica,

bioquímica y biología celular y molecular, incorporándolas en diversas células, tejidos y

órganos. Se han desarrollado ademas dispositivos como son los paquetes de cómputo, e

instrumentación para el procesamiento digital de las imágenes obtenidas, como la

AQ

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cristalografia por rayos “X” y la resonancia magnética nuclear, que acoplado a un modelo

molecular que permite definir la relación entre la estructura y función de proteínas “in vitre”

(Giuliano et al., 1995).

La tendencia acerca de los receptores a TSH y de los receptores nucleares para

hormonas tiroideas, es estudiar las vías de acción y expresión de los componentes de ambos

receptores en la termogénesis, lipogénesis y maduración cerebral (Wilkstrom et al., 1998),

específicamente en el desarrollo del sistema auditivo, funciones cocleares y en el órgano de

Corti (Rusch et al., 1998) y en la alteración de la expresión del receptor a hormonas tiroideas y

de otros receptores nucleares, que provocan resistencia a hormonas tiroideas (Weiss el al.,

1999). Igualmente la atención se enfoca hacia los factores de crecimiento que actúan en la

organogénesis y que pueden causar agenesia de glándulas endócrinas y exocrinas, rifion,

pulmón, estructuras cutáneas, anormalidades craneofaciales y del esqueleto humano,

provocado por una mutación en el factor de crecimiento de los fibroblastos (Celli et al., 1999).

Los tirocitos obtenidos en cultivo primario, y procesados para IFI, así como los

resultados obtenidos, por medio de las estructuras y receptor expresados, pueden permitir que

sea factible su utilización para evidenciar las estructuras celulares antes mencionadas, lo

expuesto en los resultados es tan solo una parte de la verificación funcional, y su potencial

para facilitar su utilización combinando variables que serán exploradas a futuro.

En algunas disciplinas, los sistemas in vitre, no son bien vistos como una alternativa de

reemplazo, pero son una norma para los estudios en el ámbito celular y molecular. En muchos

casos el reemplazo es relativo, porque requiere de células y tejidos frescos. Aun así, los

animales utilizados son económicamente mejores, puesto que de un sólo animal se obtienen

tejidos y sirven para realizar numerosos cultivos. El material humano puede en algunas

ocasiones ser utilizado, pero es muy difícil de obtener, guardar y distribuir. Algún tejido

humano puede estar disponible después del explante quirúrgico. La placenta humana ha sido

utilizada como fuente para algunos tipos de tejidos para investigación, ya que contiene algunas

estructuras con células nerviosas para estudios neurológicos. El utilizar tejidos humanos tiene

el riesgo de contener virus peligrosos como el SIDA y la hepatitis, que requieren mayores

precauciones.

A 9

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En trabajos de investigación la utilización de cultivos celulares es más económica, que

con la utilización de un animal completo

<http://hayato.med.osaka.ac.ip/index/g;uide/inform/renulation/standard.html>, las células

diferenciadas en cultivo proveen de una herramienta muy útil para estudiar los mecanismos de

acción de hormonas y otros factores que influyen en el crecimiento y metabolismo celular

(Tramontano eC al., 1986).

Trabajos a futuro van encaminados a cómo la TSH interacciona con su receptor. Pero

más importante para la perspectiva clínica es definir los epítopes de las células B y células T

sobre el receptor a TSH que son reconocidas por el sistema inmunológico. Esta información

facilita el desarrollo para una aproximación inmunológica para controlar la enfermedad de

Graves e hipertiroidismo, y quizás ofrezca un evidenciar los mecanismos acerca de la

destrucción de la glándula tiroides y el consecuente hipotiroidismo (Nagayama et al., 1992).

A pesar de los avances en el cultivo celular, es pequeño el número de células epiteliales

diferenciadas en cultivo. Las células obtenidas en dichos cultivos se han empleado no sólo

para el diagnóstico citológico de enfermedades de tipo metabólico y hereditario, sino también

en deficiencias bioquímicas para plantear o resolver problemas de investigación, que

actualmente demandan soluciones a los diferentes problemas que afectan a la salud humana,

soluciones que se han de encontrar utilizando los diversos métodos existentes para lograrlo

(Ambesi-Impiombato et al., 1980).

Aún se ignoran muchas de las vías que son utilizadas en polimerización dinámica de

los microtúbulos, y se pueden remarcar en algunos aspectos. A muchos niveles fundamentales

la polimerización dinámica permite la rápida reorganización del citoesqueleto. La hidrólisis de

NTP es el potencial para poder realizar el trabajo mecánico, (estos mecanismos son

pobremente entendidos). Existe evidencia que la polimerización de actina produce trabajo

mecánico y fuerza en las células (Inoue y Salmon, 1995) y que la atención en su distribución

es crucial para la función celular tiroidea, ya que este se encuentra asociado con el receptor de

la TSH.

Los resultados, muestran que la estandarización del modelo biológico propuesto

inicialmente como alternativa a la línea celular FRTLS, sirve como punto de partida para

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proseguir la investigación en el ámbito celular y transpolarlo a las diferentes anormalidades

que sufren las células tiroideas in vivo como son el estudio de la alteración de los productos

característicos que endocita o exocita la célula tiroidea normal, como es la produccibn de

tiroglobulina, el estudio de los segundos mensajeros, las vías de activación, y alteraciones en

la bomba de yodo, entre otros (Martínez-Galán et al., 1997).

Es un hecho que los avances logrados en éste trabajo pueden proporcionar un buen

modelo biológico que permita la relativamente fácil obtención y reproducción de células

tiroideas en cultivo primario, y que sus características tanto fisiológicas como metabólicas

sean de utilidad para investigar algunas funciones normales complementarias y las

alteraciones que afectan dicho funcionamiento de la glándula tiroides. Los resultados

conseguidos a la fecha impulsan la continuación para lograr superar los objetivos que a futuro

se tienen contemplados tomando como punto de partida el presente trabajo. Tanto el objetivo

principal como cada uno de los particulares propuestos, fueron realizados en su totalidad, pero

queda la inquietud para continuar en ésta línea de investigación, dado que cada día la

incidencia de enfermedades tiroideas es mayor y las alternativas de solución muy escasas.

Cl

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VI. CONCLUSIONES

l.- La técnica propuesta para la obtención de los tirocitos de rata Sprague-Dawley, ha sidoestandarizada.

2.- Se obtuvieron cultivos de tirocitos cuya morfología fué similar a la línea celular FRTLS.

3.- Los cultivos tiroideos son morfológica y funcionalmente similares a las células in vivo, ya

que éstas células expresan el receptor a la TSH y producen tiroglobulina. Asimismo, al utilizar

anticuerpos contra citoesqueleto se observa una distribución de manera normal.

4.- Lo anterior, provee una herramienta importante para poder estudiar in vitro, la distribución

y función del receptor de la TSH y el citoesqueleto, como alteraciones como son el hipo e

hipertiroidismo.

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