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Índice
Introducción
I. Indol1. Géneros bacterianos que identifica2. Fundamento bioquímico3. Características generales4. Interpretación5. Controles de calidad
II. Rojo de Metilo1. Géneros bacterianos que identifica2. Fundamento bioquímico3. Características generales4. Interpretación5. Controles de calidad
III. Voges -Proskauer1. Géneros bacterianos que identifica2. Fundamento bioquímico3. Características generales4. Interpretación5. Controles de calidad
IV. Citrato1. Géneros bacterianos que identifica2. Fundamento bioquímico3. Características generales4. Interpretación5. Controles de calidad
V. Conclusión
VI. Bibliografía
Pruebas bioquímicas
Consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Sirven de gran apoyo a la hora de diagnosticar infecciones por bacterias.
IMVIC
El IMVIC se compone de cuatro pruebas:
Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato.
PRUEBA PRINCIPIOI. La prueba del Indol Estudia la capacidad de degradar el
triptófano con producción de Indol y metabolitos indólicos
II. Rojo de MetiloEstudia la fermentación ácido mixta con producción de ácidos estables en el tiempo.
III. Voges ProskauerEstudia la fermentación butanodiólica con formación de un metabolito intermediario neutro.
IV. CitratoEstudia la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono.
I. PRUEBA DE INDOL
PRINCIPIO
Para determinar la capacidad de un microorganismo para separar el indol a partir del triptófano.
OBJETIVO
Ayuda a diferenciación entre géneros
1. Separación de Escherichia coli (+) de los miembros de los géneros Klebsiella (variables, por lo común negativos; V-), Enterobacter (V-), Hafnia (-), Serratia (V-) y una especie de Pantoea, P. agglomerans (-).
Ayuda en la diferenciación de especies junto con otras pruebas bioquímicas.
1. Paenibacillus alvei (+) de otras especies de Bacillus (por lo general -).
2. Escherichia coli (+), E. hermanii (+) y E. fergusonii (+) de E. vulneris (-) y E. blattae (-).
3. Citrobacter freundii (-) de C. koseri (+) y de C. amalonaticus y del biogrupo 1.
4. Klebsiella oxytoca (+) y K. ornithinolytica (+) de otras especies de Klebsiella (V-)
5. Proteous vulgaris (+), P. inconstans (+) de otras especies de Proteus (-)
6. Pasteurella dagmatis (+), P. dagmatis sbesp. Septica (V+) Pasteurella multocida (+), P. multocida subesp. gallicida (+) y P. multocida subesp. multocida (+), P. pneumotropica (+) de P. haemolytica (-) y de Actinobacillus ureae (-)
7. Paenibacillus alvei (+) de las especies aisladas con mayor frecuencia P. macerans (-) y P. polymgxa (-).
8. Peptostreptococcus asaccharolyticus (+) y P. indolicus (+) de otras especies de Peptostreptococcus (-) que pueden causar infecciones humanas.
9. Propionibacterium acnes (+) de las especies de Propionibacterium (-) aisladas con mayor frecuencia.
10.Prueba de indol en mancha
11.Junto con otras pruebas (ureasa y ornitina) subdivide Haemophilus influenzae a Haemophilus parainfluenzae en biotipos.
12.Junto con la sialidasa, alfa- y beta-glucosidasas y alfa-fructosidasa, diferencia entre los aerobios con pigmento negro.
FUNDAMENTO
El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indólicos principales: escatol (metil indol) y ácido indolacético (IAA, indolacetato). Las diversas enzimas intracelulares involucradas se denominan colectivamente “triptofanasa”.
La triptofanasa cataliza la reacción de desaminación atacando la molécula de triptófano sólo en su cadena lateral y dejando el anillo aromático intacto como indo.
La desaminación y la hidrólisis tienen lugar con el agregado de una molécula de agua en presencia de la triptofanasa y de la conenzima fosfato de piridoxal.
II. PRUEBA DE ROJO DE METILO
PRINCIPIO.
Probar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables los productos finales ácidos a partir de la fermentación de la glucosa y para vencer la capacidad buffer del sistema.
Ésta prueba cuantitativa para la producción de ácido (determinación de pH); algunos microorganismos producen más ácidos que otros.
Los resultados de rojo de metilo son características valiosas para la identificación de especies de bacterias que producen ácidos fuertes a partir de glucosa.
OBJETIVO.
Ayudan a la diferenciación entre géneros o la diferenciación de especies dentro de un género de la familia Enterobacteriaceae.
1. Escherichia coli (MR+) de Enterobacter aerogenes (MR-) y Enterobacter cloacae (MR-).
2. Especies de Yersinia (V, variable, por lo común +) de otros bacilos gramnegativos no entéricos (MR-).
3. Diferenciar Edwardsiella ictaluri (MR-) de E. hoshinae (MR+) y E. tarda del biogrupo 1 (MR+)
4. Diferenciar Leminorella richardii (MR-) de L. grimontii (MR+).
5. Diferenciar Klebsiella oxytoca y K. pneumoniae subesp. Pneumoniae (ambas V, por lo común MR-) y K. terrigena (V) de otras especies o subespecies de Klebsiella. (MR+)
Budvicia aquatica (MR+) de otros miembros de familia Enterobacteriaceae con resultados KIA/TSI Ácido/Ácido, HS2.
Otros microorganismos que son rojo de metilo positivos.
Aerococcus urinae
Todas las especies Shigella
Ewingella americana
Especies Kluyvera
Lecrercia adecarboxylata
Especies Citrobacter, Buttiauxella agrestis
Las pruebas de rojo de metilo y Voges-Proskauer identifican:
o Aeromonas hydrophila
o Aeromonas salmonicida
subesp.masoucida
o Aeromonas veronni
o Especies de Listeria
o Vibrio metschnikovii
FUNDAMENTO.
La prueba de rojo de metilo (MR) es una prueba cuantitativa basada en el uso de un indicado de pH, el rojo de metilo, para determinar la concentración del ion Hidrógeno, cuando un microorganismo fermenta glucosa. La concentración del ion Hidrógeno depende de la relación de gases (CO2 y H2), lo que a su vez es un índice de las diferentes vías metabólicas de la glucosa exhibidas por los diversos microorganismos. Los diferentes patrones de fermentación se deben a las variaciones en las enzimas relacionadas con el metabolismo del ácido piruvico en el organismo.
Reacción global del metabolismo de:
E.coli
2Glucosa + H2O 2 Ácido láctico + ácido acético + etanol + 2 CO2 + 2 H2
(Ácido fórmico H2 + CO2)
Klebsiella-Enterobacter
Glucosa + ½ O 2,3-butanodiol + H2O + 2 CO2
(Acetoìna 2,3-butanodiol)
La validez de la prueba de RM depende de un tiempo de incubación suficiente como para permitir que se produzca la diferencia en el metabolismo de
la glucosa. Los organismos en estudio se incubarán por lo menos 2 días a 35-37°C, lo que permite que todos los organismos con baja proporción gaseosa(MR+) muestren su limite en la concentración de iones H limitante, mientras que todos los que tienen relaciones altas de gas (MR-) mostraran una concentración del ion H más baja.
MEDIO DE CULTIVO UTILIZADO.
Medio de Clark y Lubs
Fórmula
Polipeptona o peptona de carne tamponada
O digerido pancreático de caseína
Y digerido péptico de tejidos animales
Glucosa (dextrosa)
Buffer fosfato dipotásico (K2HPO4)
Agua desionizada
MÈTODO DE PREPARACIÒN.
1) Pesar la cantidad exacta como indica el rótulo. Los productos de las diferentes compañías pueden presentar leves variaciones.2) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada.3) Calentar con suavidad la solución.4) Fraccionar alrededor de 5ml por tubo(26x125mm)
Método de esterilización: autoclave, 121°C, 15lb, 15min.
Enfriar antes de usar y refrigerar para la conservación (4-10°C); vencimiento, a las 6-8 semanas.
Inoculación.
Incubación.
• MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD
A. MR-positivo (+)/VP negativo(-): Escherichia coli ATCC 25922
B. MR-negativo (-)/VP positivo(+): Enterobacter aerogenes ATCC 13048
III. PRUEBA DE VOGES- PROSKAUER
La prueba de Voges-Proskauer (VP) se basa en la detección de acetoína, un producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. La glucosa es metabolizada a ácido pirúvico, las bacterias pueden seguir muchos caminos metabólicos; la producción de acetoína es una de las vías metabólicas de la degradación de la glucosa en las bacterias. La prueba de Voges-Proskauer para la acetoína se utiliza sobre todo para separa Escherichia coli de los grupos KlebsiellaEnterobacter,aunque otros miembros de la familia Enterobacteriaceae pueden producir un resultado positivo de VP.
En esta prueba se determina la vía de fermentación del butanodiol descrita anteriormente en la prueba rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol o acetoína es un
producto intermediario en la producción de butanodiol esta se forma por la descarboxilación de dos moléculas de ácido purúvico, tanto la acetoína como el 2,3-butanodiol son productos neutros en la fermentación de la glucosa. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo este se revela en presencia de α-naftol dando un color rojo-fucsia.
Reactivos empleados:
Reactivos VP de Barrit
Añadir 0.6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.
Reactivos VP de Coblentz
Añadir 0.2ml de alfa naftolal 5% en etanol al 95%, creatina al 0.3% en KOH al 40%.
VP positivo (+) color rosado-rojo en la superficie del medio (acetoína presente)
Enterobacter cloacae ATCC 13047
VP negativo (-) color amarillo en la superficie del medio, puede formarse un color cobrizo pero es un resultado negativo.
Escherichia coli ATCC 11775
CONCLUSIÓN
Las pruebas IMViC son suma importancia dentro de la búsqueda de un agente patógeno causal, es decir
y comparten una característica importante, éstas identifican enterobacterias en su mayoría. De acuerdo a sus vías metabólicas, las cuales pueden ser aerobias o anaerobias.
Cada una denota su fundamento.
La prueba de Indol
Degradación de Triptófano con producción de Indol.
Rojo de Metilo.
Acidificación del medio.
Voges Proskauer
Fermentación butanodiólica con formación de un metabolito intermediario neutro.
Citrato
Como única fuente de carbono
BIBLIOGRAFÍA