Química Analítica y Premio Nobel

LECCIÓN INAUGURALCURSO 2004/2005

UNIVERSIDAD DE ALICANTE23 de septiembre de 2004

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Química Analítica y Premio Nobel

A mi familiaA la memoria de mis padres

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Guillermo López Cueto

tradición mantenida en la Univer-sidad de Alicante, al igual que, creo,en todas las universidades españo-

las, incluir, como parte del solemne acto deapertura oficial del curso académico, una lec-ción inaugural, impartida por uno de sus pro-fesores, responsabilidad que, en esta aperturadel curso 2004-2005, ha recaído en mi perso-na. Estimo a este respecto conveniente, en se-guimiento de algo que ha devenido también,si no en tradición, sí al menos en costumbre,recordar que la designación del profesor a quiense encomienda esta tarea se efectúa en esta uni-versidad atendiendo a un criterio de rotaciónde sus Facultades y Escuelas, y de antigüedaddentro del centro, siendo, por tanto el azar, yno los méritos académicos de quien les habla,la causa de mi presencia ante ustedes.

La elección del tema sobre el que habríade versar esta lección no ha sido decisión to-mada a la ligera. En universidades de ranciatradición, la lección inaugural de curso —entiempos denominada oración inaugural, enatención a su naturaleza exclusivamente oral,más tarde acompañada de su edición impre-sa— solía ser con frecuencia de carácterexhortativo, como, al parecer, gustaba de lla-marla Unamuno, y tenía como principales, ycasi únicos, destinatarios a los estudiantes quese aprestaban a iniciar un nuevo curso. Unalección de estas características iría encamina-da, como señalaba el profesor Lamberto deEchevarría en la que él mismo pronunciara en1977 en la Universidad de Salamanca, “a can-tar las excelencias de la Sabiduría y del trabajointelectual, y a animar a profesores y alumnosen orden a las tareas del nuevo curso”. En otrasocasiones se optaba por un tema rigurosamen-te científico, una lección “expuesta con la bre-

Química Analítica y Premio NobelUn perfil de su historia común

GUILLERMO LÓPEZ CUETOCatedrático de Química Analítica

Universidad de Alicante

vedad que la cortedad del tiempo y la hetero-geneidad del auditorio exigían” [1].

El tema por mí elegido es mucho máspróximo a la segunda de las opciones. No obs-tante, tampoco he creído que un tema de miespecialidad con un contenido propio, porejemplo, de las asignaturas de licenciatura odoctorado, pudiese mantener el interés másque, a lo sumo, de los colegas de químicaanalítica u otras materias científicas afines. Trasestas consideraciones, mi pretensión para estalección no ha sido otra que llevar a cabo unaincursión, sustentada más en datos biográficosy hechos curiosos que en áridas disquisicionescientíficas, a través del desarrollo que han ex-perimentado algunas técnicas analíticas, prin-cipalmente durante el ya pasado siglo XX. Ladiversidad de las técnicas que configuran lametodología actual de la química analítica haceimprescindible seleccionar aquéllas sobre lasque esta lección ha de tratar. He querido llevara cabo esta selección con un criterio objetivo,como me ha parecido que es la atención quelos avances en la metodología analítica hanmerecido por parte de la comunidad científicainternacional, y que se ha materializado en laconcesión del galardón más prestigiado uni-versalmente desde el año 1901, como sin dudaes el premio Nobel, a algunos de los científi-cos que han contribuido a la creación de prin-cipios y métodos en la disciplina de cuya ense-ñanza me ocupo.

En la relación de descubrimientos cien-tíficos distinguidos por el premio Nobel dequímica no son frecuentes las contribucionescientíficas específicas en química analítica. Unade las razones se encuentra en que muchos delos métodos y técnicas analíticas y de separa-

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ción han sido desarrollados dentro de proyec-tos y programas de investigación en camposdiversos de la ciencia, como química inorgánica,química orgánica, bioquímica o fisiología.

El primer científico distinguido con elpremio Nobel de química por un trabajo espe-cífico en el campo del análisis químico(microanálisis orgánico) fue Fritz Pregl (quien,curiosamente, no era químico, sino médico),en 1923. Por aquel entonces publicaba JaroslavHeyrovsky (un químico físico) sus primeros tra-bajos sobre polarografía, por lo que sería tam-bién galardonado con el premio Nobel bas-tantes años después, en 1959. Unos años an-tes, en 1952, los bioquímicos Archer J. P.Martin y Richard L. M. Synge habían recibidoconjuntamente el premio Nobel de química porel descubrimiento o invención de lacromatografía de partición.

Además de los anteriormente referidos,habría que citar otros científicos que, aunqueno desarrollaron su trabajo con fines analíti-cos, fueron distinguidos con el premio Nobelde química por contribuciones a la ciencia quehan supuesto avances sustanciales en el desa-rrollo de la teoría o la práctica de la químicaanalítica. Tal sucede, por ejemplo, con SvanteArrhenius, químico sueco a quien fue conce-dido el premio Nobel de química en 1903 “enreconocimiento de los extraordinarios serviciosprestados al avance de la química a través de suteoría de la disociación electrolítica”, contri-bución que, junto con la del alemán WilhelmOstwald en relación con los principios funda-mentales del equilibrio químico, por la quemereció el premio Nobel de química en 1909,constituyen las bases teóricas de la química delas disoluciones, presente como es sabido enuna gran variedad de técnicas de análisis quí-mico y de separación. El primer científico nor-teamericano que mereció la distinción del pre-mio Nobel fue Theodor William Richards, en1914, y lo fue en reconocimiento a sus resul-tados en la determinación de las masas atómi-cas de numerosos elementos químicos, lo queconstituyó el primen paso para el descubrimien-to de los isótopos. Los trabajos de Richards sebasaron en el empleo sistemático de métodosclásicos de análisis químico. Una técnica quese aplica desde hace décadas con fines analíti-

cos, pero que en sus inicios fue desarrolladacomo medio para llevar a cabo trabajos de in-vestigación en otros campos, es laespectrometría de masas, que se basa en lamedida precisa de la relación masa/carga delos iones formados en un gas. El primer apara-to para llevar a cabo este tipo de medidas fueideado, diseñado y construido por FrancisAston (Gran Bretaña) en 1919. Aston deno-minó espectrógrafo de masas a este instrumen-to, y lo utilizó para determinar las masas ató-micas de los elementos con mayor precisiónde la que hasta entonces se había conseguido,lo que le permitió descubrir un gran númerode isótopos, por lo que recibió el premio Nobelde química en 1922. En 1926, TheodorSvedberg (Suecia) fue distinguido con el pre-mio Nobel de química por sus estudios en laquímica de los coloides. Para conseguir la pre-cipitación de las partículas coloidales, Svedbergtuvo que construir una ultracentrífuga, dise-ñada por él mismo, cuyos primeros modelospodían trabajar por encima de las 30 000 rota-ciones por minuto (velocidad que producía unaaceleración varios miles de veces superior a lade la gravedad), siendo considerado por ello elpionero de la técnica de la ultracentrifugación,de reconocida utilidad en la separación demacromoléculas y numerosas sustancias de in-terés bioquímico. En 1925 Svedberg habíaadmitido como ayudante de investigación aljoven químico, también sueco, Arne WilhelmKaurin Tiselius, cuyo interés se centró en laseparación de proteínas mediante el uso de uncampo eléctrico, técnica denominadaelectroforesis, y que estaba basada en una ideaque, aunque propuesta a finales del siglo XIX,no había conducido hasta entonces a resulta-dos relevantes. Los resultados obtenidos porTiselius le merecieron el premio Nobel de quí-mica en 1948, y la consideración de padre dela electroforesis, técnica que ha experimenta-do un auténtico renacimiento en las últimasdos décadas con el desarrollo de la denomina-da electroforesis capilar.

Centraré, no obstante, el contenido deesta lección en las tres técnicas específicamenteanalíticas a cuyo desarrollo colaboraron losprimeros científicos que he citado: microanálisiselemental orgánico, cromatografía y análisispolarográfico.

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1. Microanálisiselemental orgánico

Ya en el siglo XVII se sabía que las sus-tancias orgánicas contenían carbono e hidró-geno, dado que la combustión de aquéllas pro-ducía dióxido de carbono y vapor de agua.Además de los citados elementos, la mayoríade las sustancias orgánicas contienen oxígeno,muchas de ellas nitrógeno y, con menor fre-cuencia, azufre, fósforo y otros elementos.Consecuentemente, el proceso de analizar uncompuesto orgánico desconocido se inicia conla determinación de su contenido en los ele-mentos citados —análisis elemental— comoprimer paso para el establecimiento de su fór-mula empírica. En 1923 se concede el premioNobel de química a Fritz Pregl “por su inven-ción del método de microanálisis de las sus-tancias orgánicas”, según figura textualmenteen el acta de la Real Academia Sueca de lasCiencias. Estrictamente hablando, Pregl noinventó los métodos químicos de análisis ele-mental orgánico, sino que adaptó métodos yaentonces utilizados a una escala de trabajo delorden de 100 veces más pequeña, lo que lepermitió partir de muestras de unos pocosmiligramos.

Para comprender la evolución del análi-sis elemental y su situación cuando Pregl co-mienza sus trabajos, a principios del siglo XX,conviene remontarse a los últimos años del si-glo XVIII, en los que el gran químico francésAntoine Laurent Lavoisier, nacido en París en1743, intentaba analizar cuantitativamente lassustancias orgánicas mediante la determinaciónde su contenido en carbono e hidrógeno.Lavoisier describió los procedimientos emplea-dos en su libro Traité elementaire de chimie[2], publicado en 1789, y para cuya prepara-ción encontró en su esposa una activa colabo-radora (fue Mme. Lavoisier quien dibujó cui-dadosamente los complicados montajes expe-rimentales que lo ilustran). A diferencia de losexperimentos de análisis de sustancias orgáni-cas que se habían realizado hasta entonces, cuyaetapa inicial era la destilación de la muestra, elmétodo de Lavoisier se iniciaba con su com-bustión, bien en presencia de aire o de oxíge-no, o bien en presencia de clorato potásico u

óxidos metálicos como sustancias suministra-doras de oxígeno, para medir a continuaciónlas cantidades de dióxido de carbono y de aguaproducidas en la combustión. Aunque los re-sultados obtenidos por Lavoisier fueron satis-factorios sólo en una pequeña parte, sus con-tribuciones constituyen, ciertamente, las basesquímicas del análisis orgánico, cuya metodo-logía habría de desarrollarse a lo largo del si-glo XIX, desgraciadamente ya sin el concursodel propio Lavoisier. El rigor del pensamientocientífico de Lavoisier, y la superioridad inte-lectual demostrada en cierta polémica que sedesarrolló en el seno de la Academia Francesade las Ciencias despertaron recelos en algunosacadémicos que habían alcanzado cierto po-der en la recién iniciada Revolución francesa,entre los que se hallaba el radical Marat. A ins-tancias de éste, Lavoisier fue despojado de loscargos políticos y académicos que ocupaba y,cuatro años más tarde, detenido, juzgado, con-denado y ejecutado en mayo de 1794, a la edadde 50 años. No resulta fácil decidir qué pro-duce más indignación en el pensamiento cien-tífico posterior a Lavoisier, si el hecho de ha-ber truncado brutalmente la vida del científicoen su plenitud creadora, o el desprecio con elque, tras su detención, fue tratada su obra cien-tífica: cuando alguien quiso interceder ante eltribunal que lo juzgó, señalando que el acusa-do no era un contrarrevolucionario sino uncientífico, el juez Coffinhals respondió con latristemente célebre frase: “La República nonecesita sabios”. El matemático Lagrange, con-temporáneo de Lavoisier, diría ante este dra-mático desenlace: “Ha bastado un instante parahacer caer su cabeza, mientras que, tal vez, cienaños no serán suficientes para reproducir otrasemejante”.

Tras Lavoisier, los también francesesBerthollet [3], Gay-Lussac y Thénard [4] di-señaron diferentes dispositivos para el análisiselemental de sustancias orgánicas, basados tam-bién en la combustión de la muestra. Pero fueJöns Jacob Berzelius (1779-1848), médico yquímico sueco, quien introdujo las modifica-ciones más sustanciales en los métodos de aná-lisis elemental: mejoró la eficacia de la com-bustión llevándola a cabo en un tubo horizon-tal (Lavoisier empleaba una campana de vidrio,mientras que Berthollet y Gay-Lussac y

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Thénard usaban un tubo en posición vertical)y simplificó notablemente los procedimientosde medida del agua y del dióxido de carbonoproducidos en la combustión [5] , consiguien-do con todo ello resultados mucho más exac-tos que los que proporcionaban los métodosprecedentes.

A pesar de todo, los métodos de Berzeliusfueron criticados con cierta aspereza por su con-temporáneo Liebig, quien los consideró extre-madamente lentos. Justus Liebig (1803-1873)fue un químico alemán cuya actividad destacóprincipalmente en la química orgánica, pero tam-bién en el análisis químico, la agroquímica y laquímica alimentaria. Aun siendo un científicoprestigioso en su tiempo, sus ingresos profesio-nales no eran muy sustanciosos, por lo que du-rante la mayor parte de su vida pasó apuros eco-nómicos, lo que le causaba depresiones y brus-cos cambios de humor. Llegó incluso a pensaren el suicidio, como consta en la corresponden-cia que mantuvo con sus colegas Berzelius yWöller. Este último atribuía las crisis anímicasde Liebig a lo que en su particular argot deno-minaba hysteria chemicorum (lo que hoy tal vezsería diagnosticable como ansiedad o stress). Enla búsqueda de fuentes de ingresos adicionales,Liebig montó, inicialmente sin éxito, algunaspequeñas industrias en el campo alimentario,hasta que encontró aplicación práctica a una ideapropia que había sugerido en alguno de sus es-critos: la posibilidad de obtener extractos decarne que permitieran su conservación. En ciertaocasión llegó a su conocimiento la existencia deexcedentes de vacuno en la Pampa argentina(donde, al parecer, por entonces se apreciabamás la piel que la propia carne), y pronto en-contró socios para financiar su proyecto, cuyosresultados fueron excelentes. De hecho, la fa-bricación y comercialización de extractos decarne con su propio nombre permanece hastanuestros días. Es muy probable que, a nivel po-pular, el nombre de Liebig sea más conocidopor la sopa “de sobre” que por sus contribucio-nes a la química orgánica o al análisis químico...

Volviendo al campo del análisis elemen-tal, la principal contribución de Liebig fue eldiseño, en 1831, de un aparato para llevar acabo la combustión de las muestras [6] quemejoraba el sistema de calentamiento de

Berzelius. Asimismo introdujo la determina-ción del dióxido de carbono mediante pesada,previa retención del gas en hidróxido potásico,en sustitución de la medida del volumen degas como hasta entonces se había hecho.

La determinación del contenido de ni-trógeno en sustancias orgánicas no se consi-guió con resultados satisfactorios hasta queDumas mejoró, en 1831, un complicado y te-dioso método que había propuesto Liebig. JeanBaptiste André Dumas (1800-1884) fue pri-mero aprendiz de farmacia en el sur de Fran-cia, estudió química en Ginebra y, tras pasarpor la Escuela Politécnica de París como ayu-dante de Química, llegó a ser nombrado pro-fesor de la Universidad de La Sorbona. Dumases considerado por muchos químicos orgáni-cos el fundador de esta rama de la química.Destacó por su escrupuloso trabajo de labora-torio y por la exactitud de los resultados queobtenía en sus experimentos. Intelectual y po-lifacético, Dumas destacó también en la políti-ca (fue ministro de Agricultura y Comercio yalcalde de París), reconociéndosele a su muer-te, con un funeral de estado, los servicios quehabía prestado a su país.

La determinación de nitrógeno en com-puestos orgánicos por el método de Dumas sebasa en la reducción de los óxidos de nitróge-no formados en la combustión de las mues-tras, haciéndolos pasar por un tubo contenien-do cobre metálico a elevada temperatura, paramedir después volumétricamente el gas nitró-geno producto de dicha reducción [7]. Estemétodo ha experimentado pocos cambios des-de que fue propuesto, pero resultaba tedioso aotros químicos que intentaron aplicarlo.

Como alternativa a la determinación delnitrógeno orgánico por combustión de lamuestra, y tras algunos intentos fallidos, el da-nés Johan Gustav Christoffer ThorsagerKjeldahl (1849-1900) publicó en 1883 unmétodo basado en la conversión del nitrógenoen amoniaco por vía húmeda (digestión conácido sulfúrico concentrado), seguida de des-tilación del amoniaco y su determinaciónvolumétrica [8]. Aunque el método de Kjeldahlno es aplicable a muchos compuestos orgáni-cos nitrogenados debido a la conversión in-

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completa del nitrógeno en amoniaco, condu-ce, no obstante, a resultados exactos cuandose aplica a muestras que contienen nitrógenoproteínico.

El primer método para la determinaciónde azufre en sustancias orgánicas fue propues-to en 1830 por los franceses Henry y Plisson[9], quienes transformaban dicho elemento endióxido de azufre mediante tratamiento concorriente de oxígeno en presencia de óxido dehierro y arena de cuarzo. Cuatro años despuésaparecen casi simultáneamente dos publicacio-nes, una del propio Henry [10] y otra del ale-mán Zeise [11], en las que, siguiendo trata-mientos distintos, se transforma el azufre ensulfato para su posterior determinacióngravimétrica, siendo éstas, esencialmente, lasbases del método que se sigue actualmente parala microdeterminación de azufre orgánico.

Entre 1860 y 1870, el químico alemánGeorg Ludwig Carius (1829-1875) desarrollaun método que permite determinar azufre yhalógenos en sustancias orgánicas, basado enla conversión de dichos elementos en sulfato yhaluros, respectivamente, mediante un trata-miento común: tratamiento con ácido nítricoen presencia de cloruro de bario y nitrato deplata, como paso previo a las correspondientesdeterminaciones gravimétricas [12-14].

Coincidiendo con el desarrollo de labioquímica y la fisiología, los químicos orgá-nicos de finales del siglo XIX y principios delXX comenzaron a interesarse por la químicade los seres vivos, animales y vegetales, y de lassustancias de esta procedencia. El aislamientoy purificación de las sustancias orgánicas pre-sentes en los productos naturales requería cos-tosos y elaborados procedimientos, por lo queno resultaba fácil disponer de cantidades demuestra suficientes para proceder a su análisiselemental mediante los métodos al uso (entre0.2 y 2 gramos). Resultaba, por tanto, necesa-rio reducir drásticamente la escala de trabajopara poder analizar cantidades de muestra quehabrían de ser unas cien veces más bajas. Hubodos hechos que posibilitaron esta reducción:por una parte, la construcción de balanzas degran sensibilidad (microbalanzas) y, por otra,la adaptación de los métodos de análisis ele-

mental a la nueva escala de trabajo, lo que seconoce con el nombre de microanálisis.

La primera microbalanza fue diseñadaen 1903 por el químico-físico alemán WaltherHermann Nernst (1864-1941), más conoci-do en el ámbito científico por sus trabajos entermoquímica y termodinámica química, porlos que le fue concedido el premio Nobel dequímica en 1920. La microbalanza de Nernst,basada en la torsión de una fina fibra de cuar-zo, presentaba una extremada sensibilidad, perosu capacidad o carga estaba limitada a unoscuantos centigramos [15], lo que le restabautilidad en análisis químico. Unos años mástarde, en 1911, Wilhelm Kuhlmann constru-yó en Hamburgo una microbalanza destinadaal trabajo con metales preciosos que alcanzabauna sensibilidad de 0.01 a 0.02 mg. Lamicrobalanza de Kuhlmann desempeñaría unpapel crucial en el desarrollo del microanálisisllevado a cabo por Pregl en Austria.

La microquímica y su faceta analítica, elmicroanálisis, se inician a principios del sigloXX en las dos universidades de la ciudad aus-tríaca de Graz. La Universidad Técnica de Grazes la más moderna —había sido fundada en1811— y en ella Friedrich Emich (1860-1940),que ejerció como profesor durante varias dé-cadas, contribuyó decisivamente al desarrollode las técnicas microquímicas, y particularmen-te al microanálisis inorgánico. Así, Emich, encolaboración con Donau, había desarrolladoen 1909 el primer método de microdeter-minación de halógenos [16]. Aunque Emiches considerado uno de los pioneros de lamicroquímica, el término microanálisis va uni-do indisolublemente al nombre de Fritz Pregl(Figura 1) y a la antigua y afamada Universi-dad de Graz, cuya fundación, en 1585, habíasido impulsada por los jesuitas, y que había te-nido en sus aulas a científicos de enorme pres-tigio (Johannes Kepler había enseñado en ellasmatemáticas y retórica antes de trasladarse aPraga, en 1600, por motivos religiosos).

Pregl había nacido en 1869 en Laibach(la actual Ljubliana), entonces bajo el domi-nio del imperio austro-húngaro. Estudió me-dicina en la universidad de Graz, consiguien-do tras su graduación una plaza docente en el

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Instituto de Fisiología de la misma universi-dad, donde pronto fue conocido por su ex-traordinaria destreza e ingenio en el trabajo delaboratorio. Tras dos breves estancias en 1903en Alemania, donde trabajó primero en la uni-versidad de Leipzig con Wilhelm Ostwald, pre-mio Nobel de química en 1909, y después enla universidad de Berlín con Emil HermannFischer, quien también había sido distinguidocon dicho galardón en 1902, el interés cientí-fico de Pregl empezó a desplazarse desde lamedicina clínica hacia la fisiología, labioquímica y el análisis químico. De regreso aGraz, es contratado por el Instituto de Quími-ca Médica en 1905, y nombrado médicoforense en 1907, puestos que desempeña has-ta 1910.

Durante estos cinco años en Graz escuando Pregl concibe la metodología delmicroanálisis, como consecuencia de sus pro-pias necesidades en el trabajo de investigaciónque por entonces desarrollaba, centrado en elanálisis de las proteínas extraídas de la bilis yde la orina. El problema con que se enfrentabaera que los métodos tradicionales de análisiselemental para carbono, hidrógeno y nitróge-no (debidos a Liebig y a Dumas) requeríancantidades de muestra muy superiores a las quePregl podía aislar a partir de los fluidos fisioló-gicos. No sin cierta dosis de ironía, el propioPregl describiría sus reflexiones al respecto enel discurso que pronunció en la Academia Sueca

de las Ciencias el 12 de diciembre de 1923 enel acto de recepción del premio Nobel de quí-mica que le había sido concedido [17]:

“... durante el tiempo en el que estuveinvestigando una sustancia que podíaobtenerse sólo en cantidades extraordina-riamente pequeñas, me vi obligado a de-cidir entre procesar toneladas de materialo buscar nuevos métodos que me permi-tieran alcanzar resultados analíticos correc-tos usando cantidades mucho más peque-ñas. Decidí que ésta última sería la formade actuar. El plan más obvio fue aplicarreducciones a todas y cada una de las co-sas, es decir, mover el punto decimal unoo dos lugares a la izquierda, no sólo enrelación a la cantidad de sustancia, sinotambién en relación a todos los aparatosimplicados, cantidades de reactivos, etc.”

En 1910, Pregl se traslada a la universi-dad de Innsbruck, donde ha sido nombradoprofesor de Química Médica, siendo allí don-de, durante tres años, inicia el desarrollo expe-rimental de los métodos de microanálisis quehabía proyectado en la universidad de Graz.Se interesa por la microbalanza de Kuhlmanny consigue la colaboración de éste para queperfeccione el diseño de la misma siguiendosus propias sugerencias, tendentes a alcanzarunas mejores prestaciones en el trabajomicroanalítico. De esta forma, Pregl consiguedisponer de una microbalanza que unía a unacapacidad de hasta 20 g una exactitud de 0.001mg [18]. En 1913 Pregl regresa a la universi-dad de Graz, también como profesor de quí-mica médica, donde continúa cuatro años máscon su trabajo experimental, trabajo que llevaa cabo prácticamente solo, con suma dedica-ción, habilidad e ingenio. Salvo una comuni-cación sobre su método de microanálisis decarbono, hidrógeno y nitrógeno [19], Preglno publica los resultados parciales de su inves-tigación. Como un perfeccionista incorregible,prefiere mejorar paciente, sistemática y minu-ciosamente sus métodos hasta que consideraque pueden darse a conocer en su conjunto, loque hace en 1917 con la publicación de su li-bro Die quantitative Mikroanalyse (Elmicroanálisis cuantitativo) [20], del que se hanhecho siete ediciones en alemán (la última enViena, en 1958), y que ha sido traducido tam-bién al francés, inglés y ruso.

Figura 1. Fritz Pregl (1869-1930).

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El método de Pregl se basa esencialmen-te en el procedimiento de Liebig para la deter-minación de carbono e hidrógeno, el de Dumaspara le determinación de nitrógeno y el deCarius para la determinación de azufre yhalógenos, incluyendo asimismo procedimien-tos para la determinación de algunos gruposfuncionales, como carboxilo, metoxi ymetilimida. La adaptación llevada a cabo porPregl de estos procedimientos a la escalamicroanalítica no fue, en contra de los quepudiera parecer, algo trivial: debido a la reduc-ción de la escala de trabajo aparecían erroresconsiderables que habían pasado inadvertidosen la escala macroanalítica, y cuya solución re-quirió grandes dosis de inventiva (Figura 2).Así, las interferencias a las que daba lugar lapresencia de nitrógeno, azufre o halógenos enla microdeterminación de carbono e hidróge-no fueron eliminadas mediante lo que deno-minó relleno universal del tubo de combustión,cuya función era, en palabras del propio Pregl,“retener todo lo que no fuese dióxido de car-bono o vapor de agua”. Dicho relleno consis-tía en óxido de cobre, cromato de plomo, pla-ta metálica y dióxido de plomo, mezcla queaseguraba la retención de los gases de carácterácido causantes de los errores en la determina-ción del carbono. También en la microdeter-minación de carbono e hidrógeno, Pregl ad-virtió la aparición circunstancial de errores porexceso, observando después que aquéllos sólose producían cuando los tubos de caucho queutilizaba para la conducción del oxígeno em-pleado en la combustión eran nuevos, pero no

cuando habían sido objeto de un uso conti-nuado. Pregl sospechó que el caucho nuevodesprendía sustancias volátiles hidrocarbonadasque eran arrastradas por el oxígeno, por lo quedecidió aplicar un tratamiento prolongado conoxígeno a los tubos antes de su uso, con locual conseguía un envejecimiento artificial delcaucho y, con ello, la desaparición de los erro-res. Uno de los ejemplos más evidentes de lamagnificación que se produce en algunos erro-res al trabajar en la escala microanalítica lo cons-tituye la medida del volumen de nitrógeno enla microdeterminación de dicho elemento porel procedimiento de Dumas: el volumen de ladelgadísima película de disolución que recubrelas paredes del recipiente de medida del gas essuficiente para producir errores considerablesque, sin embargo, pasan por completo desaper-cibidos en la escala macroanalítica. En el ya ci-tado discurso pronunciado en el acto de re-cepción del premio Nobel de química [17],Pregl describió con convicción éstos y otrosproblemas que se había encontrado a lo largode sus investigaciones, así como la solución quehabía hallado a cada uno*.

Figura 2. Aparato de combustión de Pregl.

* La reducción de escala que aplicaba Pregl a sus experi-mentos por un factor de 100, afectaba a las masas y alos volúmenes, pero no a las superficies, que habríande resultar reducidas sólo por un factor de 10, comopuede deducirse mediante consideraciones geométricaselementales. Como consecuencia de esto, cualquiererror asociado a fenómenos de superficie debería demanifestarse, en términos relativos, en una proporción10 veces mayor trabajando en la escala microanalíticaque haciéndolo en la escala macroanalítica.

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Aun hoy, después de transcurridos casinoventa años, se sigue reconociendo la extraor-dinaria valía del trabajo de Pregl: laoptimización de los métodos empleados, eldiseño y construcción de los aparatos de com-bustión y medida, el montaje de los equipos,todo ello fue obra de su ingenio y esfuerzopersonal. Aunque, como se señaló anterior-mente, Pregl no invento la química del análisisorgánico, la reducción de la escala de trabajoque fue capaz de conseguir sin merma de exac-titud en los resultados habría sido sencillamenteimposible sin las cualidades y recursos de unverdadero inventor: mente imaginativa, destre-za en el trabajo de laboratorio y grandes dosisde paciencia.

Pregl fue un científico cuyo trabajo fuereconocido por sus coetáneos: en 1914 la Aca-demia Imperial de la Ciencia de Viena le con-cede el premio Lieben de química; en 1920 laUniversidad de Göttingen le nombra doctorhonorario; en 1921 es elegido miembro co-rrespondiente de la Academia de las Cienciasde Viena y, finalmente, en 1923 la AcademiaSueca de las Ciencias le otorga el premio Nobelde química.

La dedicación de Pregl al trabajo cientí-fico fue absoluta; hombre más bien solitario,no llegó a casarse, y había conseguido ahorrarun sustancioso capital que cedió en 1930, pocoantes de su muerte, a la Academia de las Cien-cias de Viena con la finalidad de crear un fon-do con el que se premiase cada año a un cien-tífico austríaco distinguido por sus trabajos enmicroquímica. Pregl murió ese mismo año, ala edad de 61 años. Desde 1931, y hasta laactualidad, la Academia otorga el premio FritzPregl.

Muchos de los químicos austríacos dis-tinguidos con el premio Fritz Pregl han alcan-zado renombre fuera de sus fronteras, tantoen el campo del microanálisis como en otrosde la química analítica. Tal es el caso de FritzFeigl, que obtuvo el premio en su primera edi-ción (1931), y cuya técnica de ensayos a la gotapara la identificación de sustancias inorgánicasy orgánicas [21,22] se conoce y utiliza univer-salmente, o el de Anton Benedetti-Pichler, pre-mio Pregl en 1933, quien, terminada la guerra

europea, había sido discípulo de Emich y delpropio Pregl en Graz, y que puede considerar-se el introductor de la microquímica en Esta-dos Unidos. Benedetti-Pichler se trasladó en1929 a la Universidad de Nueva York, en laque organizó el laboratorio de microanálisis,disciplina que enseñó primero en la universi-dad y después en el Queens College, hasta1964. En 1935 fue uno de los fundadores dela inicialmente denominada New York-New Jer-sey Section of the Microchemical Society, que seconvirtió en 1963 en la American Micro-chemical Society. Entre los químicos analíticosactuales que han sido distinguidos con el pre-mio Fritz Pregl se encuentran Robert Kellner(Universidad Técnica de Viena), premiado en1977, y Hans Malissa (Universidad deSalzburgo), que lo fue en 1965 y 1992.

Después de la publicación de la obra dePregl han sido numerosos los investigadoresque han trabajado en la mejora de sus méto-dos, principalmente en la eficacia del procesode combustión. En 1943 Belcher y Spooner,primero en Sheffield y después en Birmingham(Gran Bretaña) introducen en la microdeter-minación de carbono e hidrógeno una modifi-cación a la que denominan empty-tube (tubovacío) o de combustión rápida [23], caracteri-zado por la ausencia de relleno, un mayor flu-jo de oxígeno y una temperatura de trabajo de800ºC, lo que resulta en un tiempo de com-bustión cuatro veces más corto que el del mé-todo clásico de Pregl. Belcher e Ingram utili-zan más adelante un diseño similar para lamicrodeterminación de azufre y halógenos[24]. Una alternativa sustancialmente diferen-te a los anteriores métodos de combustión fuedesarrollada en 1955 por Schöniger en Graz(Austria), y consiste básicamente en llenar deoxigeno un matraz tipo erlenmeyer, que ya con-tiene la muestra y una disolución de hidróxidopotásico y peróxido de hidrógeno, y taparloherméticamente después de iniciar la combus-tión [25]. Este método, conocido con la de-nominación de oxygen-flask (matraz de oxíge-no) se ha aplicado también a la determinaciónde carbono e hidrógeno, y ha sido objeto pos-teriormente de numerosas modificaciones.

Un componente de las sustancias orgá-nicas que no podía ser determinado por el

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método de Pregl es el oxígeno. En 1939, elalemán Zimmermann desarrolló un procedi-miento para la microdeterminación de oxíge-no basado en la pirolisis de la muestra en pre-sencia de un gran exceso de carbono emplean-do platino como catalizador, condiciones enlas que el oxígeno es transformadocuantitativamente en monóxido de carbono[26]. A lo largo del siglo XX la determinaciónde oxígeno en sustancias orgánicas puras o ensus mezclas se ha hecho más y más necesariaen muchos procesos de la industria y la tecno-logía químicas. Así sucede, por ejemplo, en elcontrol del grado de transformación en ciertasreacciones de polimerización o de condensa-ción, o el control de calidad de los modernoscombustibles desde que, hace unos años, elplomo tetraetilo que se empleaba comoantidetonante hubo de ser sustituido por com-puestos orgánicos oxigenados. Aunque se hanpropuesto diferentes modificaciones al méto-do de Zimmermann, en esencia es dicho mé-todo el que aplica en la actualidad.

En los años sesenta los métodos demicroanálisis elemental comienzan a mostraruna clara tendencia a la simplificación y laautomatización, introduciéndose la cromato-grafía de gases como forma de separación de

los gases procedentes de la combustión, y lasmedidas de conductividad térmica como alter-nativa a la determinación gravimétrica de losmismos. Pronto aparecen los primerosanalizadores automáticos comerciales:Coleman Instruments Inc. (1961-1962), F &M Scientific Corp. (1963), Fisher Scientific Co.(1963) y Technicon Instruments (1963), a losque se incorporarán después AmericanInstruments Co. y Perkin Elmer Corp. (1965),y Hewlett Packard (1970). El procesado dedatos mediante acoplamiento del ordenador alanalizador elemental tiene lugar en la décadade los ochenta.

A pesar de los vertiginosos cambios quese han producido en la metodología delmicroanálisis elemental en los últimos treintao cuarenta años, sobre todo con la generaliza-ción del uso de los analizadores automáticos,el proceso de mineralización continúa basadoesencialmente en el tubo de combustión delmétodo clásico de Pregl. Las modificacionesmás sustanciales se han producido en las eta-pas de separación y cuantificación de los gases.En algunos analizadores automáticos la sepa-ración de lleva a cabo, tal como se hace en elmétodo clásico de Pregl, mediante absorciónsecuencial de los gases (Figura 3), mientras que

Figura 3. Esquema de un analizador elemental automático con separación secuencial de los gases.

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en otros se ha incorporado una columna decromatografía de gases, con lo que la separa-ción tiene lugar de forma continua (Figura 4).Por lo que se refiere a la cuantificación de losgases, la medida gravimétrica (absoluta) delmétodo clásico ha sido reemplazada por me-didas diferenciales de conductividad térmica,siendo ésta la forma de detección que suelenllevar incorporada ambos tipos de analizadores.

En 1952, los británicos Martin y Syngereciben el premio Nobel de química “por suinvención de la cromatografía de partición”.Aunque la contribución de Martin y Synge fueesencial para comprender las bases teóricas dela cromatografía, por aquel entonces dicha téc-nica distaba mucho de ser una novedad. Esnecesario remontarse a los primeros años delsiglo XX para encontrar por primera vez el tér-mino cromatografía, introducido por el botá-nico ruso Mijail Tsvet* en sus primeras publi-caciones. Se pueden hallar referencias a algu-nos experimentos bastante anteriores que po-drían considerarse precursores de lacromatografía, como los del médico alemánFriedrich Runge, publicados entre 1834 y1850, en los que describe la formación de ani-llos concéntricos coloreados al depositar unagota de disolución sobre un trozo de papel defiltro [27-30], o los de Christian FriedrichSchönbein y Friedrich Goppelsröder, profeso-res de química de la Universidad de Basilea,quienes, entre 1861 y 1878 desarrollaron loque denominaron análisis capilar empleandotiras de papel de filtro para la separación denumerosas sustancias orgánicas [31,32]. En elprimer Congreso Internacional del Petróleo, ce-lebrado en París en 1900, el norteamericanoDay presenta los resultados obtenidos en laseparación de fracciones del petróleo emplean-do un lecho de arcilla de batán [33,34]. Losestudios de Day se desarrollaban en EstadosUnidos en los mismos años en que Tsvet estu-diaba en Polonia la separación de los pigmentoscoloreados contenidos en extractos de plan-tas, muy probablemente sin que ninguno deestos científicos tuviese noticia de los trabajosrealizados por el otro. No parece que Day con-tinuase con sus investigaciones en este campo,por lo que actualmente se reconoce a Tsvetcomo el único y auténtico padre de la croma-tografía.

Figura 4. Esquema de un analizador elemental automáticocon separación continua de los gases mediante una columna

cromatográfica.

2. CromatografíaCuando de trata de analizar química-

mente muestras complejas, pocas veces puedellevarse a cabo la determinación individual desus componentes directamente en la muestra.Lo habitual es que sea necesario aplicar una ovarias etapas previas de separación para evitarinterferencias entre unos componentes y otrosque puedan dar lugar a la aparición de erroresen los resultados. La cromatografía es una téc-nica de separación, sin duda alguna la más ver-sátil y eficaz de las que dispone el químico, yestá basada en las diferencias de movilidad delos componentes de una mezcla (denomina-dos solutos) como consecuencia de las fuerzasrelativas que se establecen entre cada uno delos solutos y dos fases no miscibles, denomi-nadas fase móvil y fase estacionaria.

* Se han encontrado referencias bibliográficas con lasgrafías Tswett, Tsvett y Tsvet. Se ha optado por utili-zar esta última por ser la transcripción más sencilla delalfabeto cirílico al latino, y porque es también la quesuele aparecer en textos escritos originariamente enruso.

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Mijail Semenovich Tsvet (Figura 5), depadre ruso y madre italiana, nació en 1872 enun hotel de Asti, al norte de Italia, durante unlargo viaje que sus padres hubieron por ello deinterrumpir en dicha ciudad. La madre deMijail fallece poco tiempo después, y su padre,un alto funcionario del gobierno del Zar, de-cide enviarlo a Suiza para que reciba una edu-cación adecuada. Tsvet estudia primero enLausana y luego se traslada a Ginebra, en cuyauniversidad estudia Química, Física y Botáni-ca, para doctorarse en esta última disciplina en1896, con una tesis titulada Investigaciones so-bre la fisiología de las células. Contribución alconocimiento del protoplasma, membranasplasmáticas y cloroplastos [35], trabajo que fueconsiderado de especial relevancia, debido, se-gún expresara textualmente uno de los com-ponentes del tribunal “a la complejidad de sumateria y a la forma en que ha sido desarrolla-do por su autor”.

A los 24 años Tsvet abandona Suiza y,tras algunas breves estancias en centros de in-vestigación en Italia, regresa a su país con lailusión de optar a un puesto de profesor en launiversidad para proseguir sus estudios sobrefisiología vegetal. Pronto advierte las dificulta-des casi insalvables que va a encontrar. La polí-tica académica de la Rusia de finales del sigloXIX era rígida en extremo, y exigía a un aspi-

rante a profesor universitario haber obtenidolos grados de magister (licenciado) y doctoren una universidad rusa, sin que se contempla-se posibilidad alguna de aplicar convalidaciones:el flamante título de Ph. D. en Botánica expe-dido por la Universidad de Ginebra, en Rusiaera papel mojado. Para subsistir, Tsvet aceptaen 1897 un contrato temporal en un laborato-rio de biología de San Petersburgo. Allí, supe-rando las dificultades idiomáticas —su lenguamaterna era el francés y su educación, occiden-tal— prepara una nueva memoria de licencia-tura, que presentará en 1901, no sin antes su-perar, en 1899, los exámenes de botánica yquímica en la Universidad de Kazan. La pre-sentación de la tesis de licenciatura, que dedi-ca a la memoria de su padre, fallecido un añoantes, le confiere el grado de magister, lo quele permite aceptar un puesto de ayudante en laUniversidad de Varsovia (por entonces, el GranDucado de Polonia formaba parte del ImperioRuso). Este trabajo estaba mal remunerado, ycarecía de complementos de financiación parala investigación, por lo que Tsvet tuvo que re-currir a impartir clases en una escuela secun-daria para poder costearla.

Superando sus dificultades económicas,Tsvet fue capaz de desarrollar en Varsovia unfructífero trabajo de investigación en el queestableció las bases de lo que más tarde deno-minaría cromatografía de adsorción, y que lemereció una distinción por la Sociedad Ale-mana de Botánica, de la que fue elegido miem-bro en 1902, y en cuya revista Beritche derDeutschen Botanischen Gesellschaft publicó bue-na parte de sus trabajos. En 1903, en una re-unión de la Sociedad de Científicos Naturalesde Varsovia, Tsvet presentó una comunicaciónpreliminar con el título Sobre una nueva cate-goría de fenómenos de adsorción y sus aplicacio-nes en análisis biológico, en la que se describíapor primera vez el método cromatográfico,aunque sería en 1906 cuando el mismo Tsvetpropone el término cromatografía en dos pu-blicaciones en la revista de la Sociedad Alema-na de Botánica [36,37]. En estos dos artículosTsvet incluía un diagrama con el montaje ex-perimental utilizado y describía el procedimien-to que había seguido (Figura 6): depositabaun extracto de hojas verdes en éter de petróleoen la parte superior de una delgada columna

Figura 5. Mijail Semenovich Tsvet (1872-1919).

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de vidrio rellena de carbonato cálcico y, a con-tinuación, hacía pasar a través de la columnaéter de petróleo. Los pigmentos que compo-nían el extracto (diferentes formas de clorofi-la, xantofila y caroteno) avanzaban a lo largode la columna con velocidades diferentes, de-pendiendo de la fuerza con que eran adsorbidospor el relleno de carbonato cálcico. El resulta-do era espectacular, y consistía en el estableci-miento de varias franjas de distintos colores alo largo de la columna que se podían distin-guir con toda nitidez, lo que el propio autordescribía de esta forma:

“...los diferentes componentes de la mez-cla de pigmentos se distribuyeron el lacolumna de carbonato cálcico como losrayos luminosos en un espectro, lo quepermite su análisis cualitativo y cuantita-tivo. La preparación obtenida como re-sultado de este experimento se ha deno-minado cromatograma, y el método,cromatográfico...”

“Los fenómenos de adsorción descritosno son, por supuesto, característicos sola-mente de los pigmentos de la clorofila;obviamente, varios compuestos químicos,sean coloreados o incoloros, pueden tam-bién separarse mediante este método.”

Tras contraer matrimonio en 1907 conHelena Trusiewicz, que trabajaba en la Biblio-teca de la Universidad de Varsovia, Tsvet pudosatisfacer, un año después, su anhelo de ejer-cer como profesor universitario: fue nombra-do profesor de Botánica y Microbiología en elInstituto Politécnico de Varsovia. En 1910 pre-sentó su (segunda) tesis doctoral, esta vez enla Universidad de Varsovia, trabajo que, al igualque había sucedido catorce años antes con latesis presentada en la Universidad de Ginebra,mereció elogiosos comentarios por parte deltribunal calificador, y que publicó ese mismoaño en forma de monografía, escrita en ruso,con el título Cromofilas en el mundo vegetal y

animal [38]. En 1911 se leconcedió el Gran Premio de laAcademia de las Ciencias deSan Petersburgo, lo que le su-pondría, al fin, prestigio en loscírculos científicos rusos y...una gratificación económica demil rublos.

Desafortunadamente, laera de bonanza científica, so-cial y económica de Tsvet noiba a ser muy duradera: en1912 su salud empieza a dete-riorarse, lo que afecta a su rit-mo de trabajo. Dos años des-pués estalla la guerra europea,y en 1915 las tropas alemanasllegan a Varsovia, lo que obli-

ga a Tsvet a abandonar la ciudad, trasladándo-se a Moscú con todos sus libros y archivos. En-fermo ya de tuberculosis, estos acontecimien-tos aceleran su deterioro físico, del que tratade recuperarse trasladándose una temporadaal Cáucaso. En 1917 es propuesto para ocuparuna cátedra en la Universidad de Tartu(Estonia) pero, unos meses más tarde, ante laproximidad del ejército alemán, la propia uni-versidad como institución decide trasladar susede a Voronezh, donde es refundada comoUniversidad de Voronezh, de cuyo primer

Frente a alguna especulación más bienpintoresca (la palabra tsvet en ruso significacolor), no parece que deba albergarse duda al-guna de que lo que movió a Tsvet a denomi-nar a su técnica cromatografía (del griegochroma, color y graphos, escritura) fue el he-cho de que las sustancias por él separadas po-dían ser visualizadas debido a sus diferentescolores. Pero esto era una mera circunstancia,y el propio Tsvet así lo advertía en el mismoartículo:

Figura 6. Aparato de Tsvet para separaciones cromatográficas.

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claustro de profesores, debido a estas circuns-tancias, formó parte Mijail Tsvet. La GranGuerra terminó ese mismo año, pero Tsvetestaba ya muy enfermo: la tuberculosis se lehabía declarado abiertamente, y causaba su fa-llecimiento en el verano de 1919, a los 47 añosde edad. Pasados los años, parece como si eldestino no permitiera que las tribulaciones deTsvet cesaran siquiera con su muerte: durantela segunda guerra mundial, el cementerio delmonasterio Alekseev, donde reposaban sus res-tos, fue destruido por los bombardeos, y des-de entonces su tumba nunca pudo ser hallada.

Pese a su más bien corta vida, Tsvet fueun investigador prolífico. Entre 1894 y 1919publicó más de 70 artículos científicos y la ci-tada monografía en la que explicaba el méto-do cromatográfico [38]. Pero el hecho de queésta estuviese escrita en ruso y nunca fuera tra-ducida a otros idiomas, dificultó sin duda ladifusión de su obra científica y retrasósustancialmente el desarrollo de la técnicacromatográfica.

Tsvet se consideraba un botánico, y asíera considerado también por los científicoscoetáneos. Su interés científico siempre estuvoenfocado hacia los pigmentos de las plantas,pero el concepto que tenía de la metodologíade la investigación le hacía apartarse frecuen-temente del empirismo de las meras descrip-ciones para buscar explicaciones teóricas a losresultados que obtenía. Hoy Tsvet sería consi-derado un bioquímico o un biofísico, o tal vezambas cosas. En sus trabajos se pueden encon-trar no solamente los brillantes resultados desus investigaciones, sino también ideas y re-flexiones sumamente valiosas para el futurodesarrollo de la cromatografía. En sus artícu-los se advierte un especial interés por las carac-terísticas de la fase móvil empleada en sus se-paraciones. Así, subrayaba que se puede con-seguir una mayor eficacia empleando como fasemóvil no un único disolvente, sino varios, biende forma sucesiva (lo que muchos años des-pués se llamaría elución en etapas) o bien enforma de mezcla de composición variable (loque constituye una clarísima predicción de latécnica que actualmente se conoce comoelución en gradiente). También reclamaba laatención sobre el tamaño de grano de las par-

tículas del material adsorbente que rellena lacolumna, haciendo ver el efecto positivo queel uso de partículas de grano muy fino teníasobre la eficacia de las separaciones, debido ala atenuación de los fenómenos de difusiónresponsables del ensanchamiento de las ban-das, lo que actualmente constituye una de lasbases de la cromatografía de líquidos de altaresolución (HPLC), que no comenzaría a serdesarrollada hasta casi cincuenta años después.

Como suele suceder con los hombres deciencia imaginativos y rupturistas, el quehacercientífico de Tsvet fue controvertido, y suscitópolémicas que él nunca rehuyó. En 1905, du-rante su estancia en Varsovia, aparecieron unaspublicaciones de Hans Molisch, profesor deBotánica de la Universidad de Praga, sobre lospigmentos extraídos de las algas. Tsvet com-probó que los resultados de Molisch diferíannotablemente de los suyos propios, aún inédi-tos, por lo que publicó una carta en la mismarevista que había recogido las publicaciones deaquél, en la que mostraba las diferencias ad-vertidas en los resultados, aunque no descri-bió la metodología que había empleado. Estoprovocó la protesta de Molisch, a quien se unióF.G. Kohl, autor de un libro sobre carotenos.La respuesta de Tsvet no se hizo esperar, y sematerializó en la publicación de los dos artícu-los ya referidos en la revista de la Sociedad Ale-mana de Botánica, la más prestigiosa de la es-pecialidad, y en los que describía el métodoempleado y usaba la palabra cromatografía porprimera vez para denominarlo [36, 37]. Lascríticas de Molisch y Kohl fueron retomadasen 1907 por Leon Marchlewski, profesor en laUniversidad de Cracovia, ciudad polaca que porentonces se hallaba bajo el dominio del impe-rio austro-húngaro. A las diferencias de índoleacadémica que Marchlewski mantenía conTsvet (a quien tachaba de arrogante, segúndecía, “por pretender cambiar la química de laclorofila con la ayuda de un simple experimen-to de filtración”) se sumaban otras de índolepolítica más difíciles de solventar (paraMarchlewski, nacionalista polaco, Tsvet era uninvasor ruso en la Varsovia ocupada). Otro in-vestigador contemporáneo de Tsvet manifies-tamente crítico con los trabajos de éste, fueRichard Willstätter, profesor del Instituto Po-litécnico de Zürich y tal vez el químico orgá-

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nico alemán más prestigiado de su tiempo.Willstätter trabajaba también en pigmentosvegetales, principalmente clorofilas, por lo quese interesó por los trabajos de Tsvet. Como lamonografía de éste sólo había sido publicadaen ruso, en 1913 encargó particularmente unatraducción alemana de la misma para mejorestudiarla. Las discrepancias se centrarían endos suposiciones de Willstätter: por una parte,que la cromatografía no podía ser una técnicaútil con fines preparativos y, por otra, que lassustancias sufrirían necesariamente alteracionesquímicas durante el proceso de separación.Ninguna de estas dos suposiciones era cierta,como demostró Tsvet y, según parece, el pro-pio Willstätter reconoció más tarde. Tras in-corporar la cromatografía, como método pre-parativo, a sus propias herramientas de traba-jo, Willstätter obtuvo en 1915 el premio Nobelde química por sus investigaciones sobre lasclorofilas, siendo así el primero de los más deveinte científicos que han accedido al citadogalardón por descubrimientos para cuya con-secución se han valido de las técnicascromatográficas.

Debido, por una parte, a que los traba-jos de Tsvet no fueron del todo comprendidospor los bioquímicos y químicos orgánicos dela época, principalmente alemanes, y, por otra,al hecho de que su monografía nunca fue tra-ducida del ruso a otras lenguas, el métodocromatográfico fue muy escasamente utiliza-do por sus contemporáneos, con lo que cayóen un olvido del que no saldría hasta la décadade los años treinta. El inicio de este renaci-miento tuvo lugar en 1922, gracias a un traba-jo relativamente modesto del químico norte-americano Leroy Sheldon Palmer (1887-1944). Palmer había estudiado en la Universi-dad de Missouri, en el estado de Columbia y,tras un inicio en la investigación en el campode la ingeniería química, ingresó como cola-borador en el Instituto de Investigaciones Lác-teas de la universidad de Missouri, para trasla-darse en 1919 a la Universidad de Minnesota,donde permaneció hasta su muerte en 1944.Durante su estancia en la Universidad deMissouri, Palmer trabajó en el estudio de lospigmentos de la grasa de la leche, sobre lo quepublicó, en 1914, varios artículos, en el pri-mero de los cuales [39] empleó la técnica

cromatográfica de Tsvet, de la que tenía cier-tos conocimientos a través de alguno de losartículos de Tsvet escritos en alemán o en fran-cés que habían llegado a su poder. En 1922Palmer publicó una monografía sobre loscarotenoides y otros pigmentos [40], en la quedescribe algunos de los trabajos de Tsvet y latécnica cromatográfica. Esta monografía fueeditada por la American Chemical Society, na-turalmente en inglés, y fue por eso el medio através del cual la cromatografía empezó a serconocida por químicos de todo el mundo.

Uno de los primeros químicos europeosque tuvieron acceso a la monografía de Palmerera el austríaco Edgar Lederer (1908-1988).Lederer había estudiado química en la Univer-sidad de Viena, donde presentó en 1930 sutesis doctoral sobre los alcaloides del indol, trasde lo cual se incorporó al equipo de RichardKuhn (1900-1967), en el Instituto de Investi-gaciones Médicas de la Universidad deHeidelberg (Figura 7). Se daba la circunstan-cia de que Kuhn se había incorporado recien-temente como profesor a dicha universidad,procedente del Instituto Politécnico de Zürich,donde había sido discípulo de Willstätter quien,como antes se ha señalado, se había distingui-do como uno de los más furibundos críticosde Tsvet, y conservaba en su poder la traduc-ción alemana de la monografía de éste.Willstätter cedió esta traducción a Kuhn, quienla llevó consigo a la universidad de Heidelberg.Allí Kuhn trabajó sobre los pigmentos presen-tes en la yema de huevo, pero no utilizó lacromatografía hasta que Lederer se integró ensu equipo de trabajo. Cuando Kuhn le encar-ga que investigue la posibilidad de que la luteínade la yema de huevo sea una mezcla de xantinay xantofila, Lederer le comunica su intenciónde aplicar el método cromatográfico, que co-nocía superficialmente a través de la monogra-fía de Palmer, por lo que Kuhn le facilitó latraducción alemana de la monografía de Tsvet.De esta forma, Lederer pudo acceder a las de-talladas descripciones contenidas en el libro, yaplicar la técnica cromatográfica a sus estudiossobre la luteína. El resultado que obtuvo con-firmaba las sospechas de Kuhn: a partir de unamuestra de luteína de huevo se separaron dosbandas cromatográficas que contenían, respec-tivamente, zeaxantina y xantofila [41]. A par-

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tir de entonces, tanto Lederer como otros co-laboradores de Kuhn continuaron empleandola cromatografía, tanto a escala analítica en laseparación de carotenos [42,43], como a esca-la preparativa [44].

años después, el impulso necesario para que lacromatografía llegase a los laboratorios norte-americanos: uno de los autores de esta mono-grafía, el húngaro Laszlo Zechmeister (1889-1972), emigró en 1940 a los Estados Unidos,donde fue contratado como profesor en el Ins-tituto de Tecnología de California, y desde allíinfluyó para que la segunda edición alemanade su libro fuese traducida al inglés y editadaen 1941 [46]. La edición en lengua inglesa al-canzó una rápida difusión, no sólo en EstadosUnidos, sino también en Europa.

La cromatografía, tal como era entendi-da a principios de la década de los cuarenta,era un proceso basado en la adsorción (reten-ción de las sustancias en la superficie de unsólido) y la separación de las mismas con ayu-da de un líquido. En 1941, los británicosMartin y Synge publican el primer artículo so-bre una nueva técnica cromatográfica: lacromatografía de partición proceso basado enla distribución de las sustancias entre dos lí-quidos en los que se absorben o disuelven enun grado que depende de sus propiedades [47].Este artículo no solamente abría nuevos hori-zontes a la cromatografía, sino que contenía lateoría de la separación cromatográfica y pos-tulaba la posibilidad de aplicar la técnica a laseparación de gases, lo que, 11 años después,constituiría la cromatografía gas-líquido.

Figura 7. Richard Kuhn (1900-1967) yEdgar Lederer (1908-1988).

Los trabajos de Kuhn y Lederer, publi-cados en 1931, fueron el detonante para quelas técnicas cromatográficas empezasen a serutilizadas en Europa de forma generalizada: sehabía producido el renacimiento de lacromatografía, 25 años después de los prime-ros artículos de Tsvet y 12 años después de sumuerte. No deja de ser curioso que la traduc-ción alemana del libro de Tsvet encargada ex-presamente por Willstätter para criticar el mé-todo cromatográfico sirviera, 18 años más tar-de, para propiciar su renacimiento. En 1938,la Academia Sueca de las Ciencias otorgó elpremio Nobel de química a Richard Kuhn porsus estudios sobre los carotenoides y las vita-minas. Sin embargo, el gobierno alemán, enpoder de los nazis, nunca le concedió el per-miso para acudir a Estocolmo. Kuhn recibió elpremio en 1945, cuando finalizó la segundaguerra mundial.

En la década de los treinta lacromatografía ya se empleaba habitualmenteen Europa, pero no en Estados Unidos, don-de la bibliografía en alemán dificultaba su di-fusión. No obstante, la publicación en 1937de la primera monografía sobre esta técnica[45] después de la que había publicado el pro-pio Tsvet, de la que se hicieron dos edicionesalemanas en Viena y Berlín, supondría, cuatro

Figura 8. Archer J.P. Martin (1910-2002) yRichard L.M. Synge (1914-1994).

Archer John Porter Martin (1910-2002)nació en Londres y estudió en la Universidadde Cambridge, donde se graduó en bioquímicaen 1932 y se doctoró en 1936. En 1938 se

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trasladó a Leeds, donde fue contratado por uncentro de investigación sobre la lana, la WoolIndustries Research Association. RichardLaurence Millington Synge (1914-1994) na-ció en Liverpool y estudió física, química, fi-siología y bioquímica también en la universi-dad de Cambridge, obteniendo el doctoradoen 1941. En 1939 Synge había realizado untrabajo de investigación en la Wool IndustriesResearch Association en Leeds, donde, juntocon Martin, comenzaría a trabajar en la sepa-ración de los aminoácidos presentes en las pro-teínas de la lana. Martin había adquirido enCambridge cierta experiencia en separacionesmediante extracción a contracorriente, y se sen-tía fuertemente atraído por esta técnica, intro-ducida unos años antes por Lyman C. Craig.La extracción a contracorriente es una técnicade fundamento teórico muy claro, pero cuyapuesta en práctica requiere un complicado apa-rato constituido por un elevado número detubos mediante los cuales se van desplazandodos líquidos inmiscibles, en sentido contrario,y de forma secuencial.

En 1940, ya en Leeds, y con Synge comocolaborador (Figura 8), Martin propuso a ésteestudiar la separación de aminoácidos median-te extracción a contracorriente. Synge consi-deró que el benceno y el agua serían disolventesadecuados para ello, y construyó un aparatode 40 elementos para llevar a cabo los experi-mentos. La separación resultó satisfactoria, peroel aparato dio muchos problemas y requeríauna atención continua, por lo que Martin pasóun tiempo diseñando nuevos modelos, quedespués mostraba a Synge, quien, según pala-bras del propio Martin, terminó cansado deescuchar sus propuestas. Entonces Martin tra-tó de poner en práctica una idea que habíaconcebido tiempo atrás: la posibilidad de lle-var a cabo una separación a contracorriente deforma continua, no secuencial, para lo cual te-nía que conseguir desplazar los dos líquidosen sentidos opuestos simultáneamente, comosi resbalasen uno sobre el otro. Naturalmente,esta forma de operar permitiría prescindir dela complicada máquina de tubos, pero su puestaen práctica no parecía fácil. Aún así, Martin ySynge prepararon una columna empaquetadacon fibras paralelas de algodón y lana de formaque, poniendo agua en un extremo del tubo y

cloroformo en el otro, se produjese un flujode corrientes paralelas y en sentido contrariode uno y otro disolvente. Los resultados, sinembargo, no fueron los deseados. En busca denuevas soluciones, Martin decidió que no eranecesario que los dos líquidos se movieran, sinoque bastaría con que lo hiciera uno de ellos,siempre que se consiguiera fijar el otro conve-nientemente, por ejemplo reteniéndolo en lasuperficie de un sólido. En los primeros expe-rimentos que llevaron a cabo con éxito, el lí-quido que habría de mantenerse inmóvil, o faseestacionaria (agua) se fijaba sobre gel de sílice,y esto constituía el relleno de la columnacromatográfica. En la parte superior de la co-lumna se depositaba la mezcla de sustancias quese quería separar (aminoácidos acetilados), yfinalmente se hacía pasar a través de la colum-na un líquido inmiscible con el agua, o fasemóvil (cloroformo con algo de etanol), quearrastraba los componentes de la mezcla a ve-locidades distintas, consiguiéndose de esa for-ma su separación. Como los aminoácidos sonincoloros, encontraron una forma de visualizaro revelar las bandas impregnando previamenteel relleno de sílice con disolución de un indica-dor ácido-base (anaranjado de metilo), con loque el resultado fue la formación de vistosas ban-das de color rojo sobre un fondo anaranjado.

Después de presentar sus primeros re-sultados en una reunión de la BiochemicalSociety británica en junio de 1941, a finales deese mismo año publicaron el artículo A newform of chromatogram employing two liquidphases [47], que presentaba primero la teoríade la cromatografía de partición y después laseparación de aminoácidos contenidos en lasproteínas. Así nacía la cromatografía de parti-ción o cromatografía líquido-líquido, como losautores la denominaron inicialmente. Martiny Synge recibieron en 1952 el premio Nobelde química por la invención de la cromatografíade partición. El trabajo de Martin y Syngemereció el siguiente comentario en la presti-giosa revista científica Nature [48]:

“Los métodos desarrollados por Martiny Synge son probablemente únicos envirtud de su sencillez y elegancia de con-cepción y ejecución, y también por elextenso alcance de su aplicación. Es pro-bable que su invención sea considerada

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por las futuras generaciones como unade las más importantes piedras angularesen el desarrollo de las ciencias químicas”.

Martin y Synge, a quienes se unierondespués A.H. Gordon y R. Consden, conti-nuaron con el estudio de la separación de otrosaminoácidos, cambiando el soporte de sílicepor otro de celulosa, para lo cual emplearontrozos de papel de filtro (celulosa casi pura),primero en forma semicircular y después deforma lineal, cortando tiras de dicho material,que podían considerarse como delgadas colum-nas cromatográficas. Como fase móvil para laseparación de valina y leucina emplearonbutanol, que avanzaba por capilaridad a lo lar-go de la tira de papel. El revelado lo llevaban acabo con ninhidrina, reactivo que forma conlos aminoácidos compuestos fuertemente co-loreados, lo que permitía localizar la posiciónalcanzada después de la separación. La técnicafue denominada cromatografía sobre papel. Paraseparar un mayor número de aminoácidos re-currieron al empleo de un trozo de papel defiltro cuadrado en lugar de una tira y, despuésde la primera separación, repitieron la opera-ción tras cambiar de disolvente y girar el papelun ángulo de 90 grados, de forma que el avan-ce de las nuevas manchas se producía en direc-ción perpendicular a la de las primeras, por loque llamaron a esta modalidad cromatografíabidimensional sobre papel. En 1943 Synge sehabía trasladado al Lister Institute of PreventiveMedicine en Londres, debido a lo cual su par-ticipación en este trabajo se redujo a su etapainicial, y los nuevos resultados fueron publica-dos por Consden, Gordon y Martin [49].

Aunque el equilibrio de intercambioiónico ya se había usado en 1938 por T.I.Taylor y H.C. Urey como base para la separa-ción de isótopos de litio y potasio [50], elmétodo era complicado, pues hubieron deemplear para ello columnas de unos tres centí-metros de diámetro y más de treinta metros delongitud, empaquetadas con zeolita comointercambiador iónico natural. La cromato-grafía de intercambio iónico sólo comenzaríaa emplearse de forma generalizada cuando fuefactible disponer de resinas cambiadoras sinté-ticas, a principios de la década de los cuarenta,y se pudo demostrar su eficacia como método

de separación durante el desarrollo, en plenaSegunda Guerra Mundial, del gigantesco ymultidisciplinar proyecto Manhattan, cuyoobjetivo central, como después se supo, era lafabricación de la bomba atómica. El empleode la cromatografía de intercambio iónico den-tro de dicho proyecto Manhattan estuvo a car-go de Glenn Theodore Seaborg (1912-1999),quien, junto con Edwin Mattison Mac Millan(1907-1991), aisló los 64 kilos de plutonionecesarios para construir la bomba que el 9 deagosto de 1945 sería arrojada sobre la ciudadjaponesa de Nagasaki. Por obvias razones deseguridad, el gobierno de los Estados Unidosno permitió que ni la metodología ni los resul-tados alcanzados en la separación de los ele-mentos transuránidos fuesen dados a conocerhasta después de finalizada la guerra. Seaborgcontinuó después de la guerra sus investiga-ciones en la separación de elementostransuránidos, descubriendo los elementos denúmero atómico entre 94 (plutonio) y 102(nobelio), que, junto con el 103 (laurencio),descubierto en 1961, completaban la segundaserie de transición. (Se ha dicho de Seaborgque ha sido, después de Mendeleev, el científi-co que más ha hecho por la tabla periódica delos elementos). Seaborg y Mac Millan recibie-ron el premio Nobel de Química en 1951 porsus descubrimientos en la química de los ele-mentos transuránidos. A principios de la déca-da de los 70 se desarrolló una nueva modali-dad de cromatografía de intercambio iónico:la cromatografía de iones, basada también en eluso de una columna separadora rellena con unaresina de intercambio iónico con detecciónprincipalmente conductimétrica, lo que requie-re una segunda columna cuya finalidad es eli-minar los iones del fondo, también medianteun proceso de intercambio iónico (columnasupresora).

Como se ha señalado anteriormente,Martin y Synge habían considerado ya en 1941,la posibilidad de separar compuestos gaseososmediante cromatografía de partición. Esta po-sibilidad fue llevada a la práctica por el propioMartin, quien el 1950 se había trasladado alNational Institute of Medical Research en Lon-dres, donde se le unió como colaborador unjoven científico, Anthony Trafford James(Cardiff, 1922). James, que se había graduado

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en Londres en 1943 y doctorado en 1946, tratóen un principio, a instancias de Martin, de con-tinuar con el desarrollo de una columnacromatográfica con algún sistema de distribu-ción entre fases distinto a la partición, pero noobtuvo resultados. Ante estos desalentadoresinicios, Martin, con el fin (como él mismo re-conocería después) de levantar la moral de sucolaborador, sugirió a éste que tratase de po-ner en práctica una idea que ya había incluidoen su primer artículo sobre la cromatografíade partición: usar un gas, en lugar de un líqui-do, como fase móvil. Seis semanas más tardehabían conseguido separar una mezcla deamoniaco con metil, dimetil y trimetilamina, yen 1952 publicaron el primer artículo sobreesta nueva técnica cromatográfica: Gas-LiquidPartition Chromatography. A Technique for theAnalysis of Volatile Materials [51]. La separa-ción de sustancias volátiles mediantecromatografía de gases no podía servirse delcolor de las mismas ni del uso de reactivos re-veladores para visualizar la posición de las ban-das, como se podía hacer en cromatografía delíquidos. James y Martin solucionaron el pro-blema mediante recolección de fracciones delgas a la salida de la columna en distintas por-ciones de disolución y valoración de cada unade las fracciones, operación que pudo agilizarseempleando un valorador automático que cons-truyó el propio Martin. Más adelante se intro-dujo el uso de detectores instrumentales, comoel de conductividad térmica, el de ionizaciónde llama y el de captura electrónica. En dosaños el empleo de la cromatografía gas-líqui-do se extendió por laboratorios de todo el mun-do: prácticamente cualquier muestra orgánicapodía ser analizada por esta técnica, siendo enla industria petroquímica donde alcanzó un ma-yor grado de implantación. Los avances másrecientes en cromatografía de gases se han al-canzado en el uso de acoplamiento a sistemaspost-columna (detectores de mayor sensibili-dad y selectividad como la espectrometría demasas), o bien a sistemas pre-columna, comomicro-extracción en fase sólida, espacio en ca-beza o cromatografía multidimensional.

El desarrollo de las técnicas cromato-gráficas en la segunda mitad del siglo XX fueespectacular, no sólo en cuanto al perfecciona-miento de las modalidades ya conocidas, sino

también en cuanto a la introducción de otrasnuevas. Con la introducción de la cromato-grafía gas-líquido por James y Martin parecíaque se había alcanzado la máxima versatilidadposible en las técnicas de separación, en tantoque la cromatografía líquido-líquido, por en-tonces mucho más lenta y de menor resolu-ción, había quedado relegada a una posiciónmuy secundaria. En 1963, John CalvinGiddins, en la Universidad de Utah (USA)propone una modalidad de cromatografía delíquidos claramente inspirada en algunas de lascaracterísticas propias de la cromatografía degases, y expone las bases de la técnica en suartículo Liquid Chromatography withOperating Conditions Analogous to those of GasChromatography [52]. Para incrementar la re-solución de las separaciones, el tamaño de par-tícula del relleno de la columna tenía que sersometido a una reducción drástica en compa-ración con el empleado en cromatografía delíquidos convencional. En estas condiciones elflujo de fase móvil sólo podrá alcanzar valoresútiles si se aplica una presión suficientementeelevada. Esta modalidad, denominadacromatografía de líquidos de alta resolución(HPLC) empezó a emplearse de forma gene-ralizada en la década de los 70 en diversas áreasde la bioquímica y la biotecnología, utilizandoprincipalmente detectores fotométricos yelectroquímicos, expresamente diseñados yconstruidos para este fin.

Una de las técnicas cromatográficas queaparecieron después de la cromatografía gas-líquido es la cromatografía de capa fina, unamodalidad de cromatografía plana introduci-da en 1956 por Ergon Stahl en la Universidadde Mainz (Alemania) [53]. Stahl comprobóque el tamaño de poro del papel de filtro em-pleado en cromatografía sobre papel era exce-sivamente grande para ciertas separaciones quetenía que llevar a cabo, por lo que preparó unasplacas de vidrio sobre las que pulverizó finassuspensiones de alúmina o sílice. Después dehomogeneizar y secar cuidadosamente la capaasí formada, el soporte quedaba dispuesto paraoperar de forma semejante a como se hacía encromatografía sobre papel. El mecanismo deretención de los solutos consistía esencialmen-te en un proceso de adsorción sobre una faseestacionaria sólida, por lo que, como el mismo

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Stahl reconocería, su dispositivo equivalía esen-cialmente a la vieja columna cromatográfica deTsvet, pero en forma abierta.

A finales de los años 50 y principio delos 60 se propone una nueva modalidad deseparación cromatográfica basada en el uso degeles porosos como relleno de la columna, quepermite separaciones en función del tamañode los solutos: la cromatografía de exclusiónmolecular, desarrollada por Jerker Olof Porathen la Universidad de Upsala y Per Flodin enlos laboratorios de la empresa farmacéuticaPharmacia de la misma ciudad sueca. Esta téc-nica es de especial eficacia en la separación demacromoléculas, por lo que se aplica enbiotecnología y química de los polímeros. Laseparación de muchas macromoléculas de ori-gen biológico como proteínas, polisacáridos oácidos nucléicos, difícil de conseguir con siste-mas convencionales, puede hacerse mediantecromatografía por afinidad, basada eninteracciones soluto-fase estacionaria altamenteselectivas (como enzima-sustrato, enzima-inhibidor, antígeno-anticuerpo, etc.). A partirde los años 80 comenzaron a emplearse los flui-dos supercríticos (fluidos sometidos a condi-ciones de presión y temperatura por encimade su punto crítico, con lo que adquieren unestado diferente del líquido y del gaseoso) confines analíticos. La cromatografía de fluidossupercríticos presenta algunas ventajas defini-das sobre la cromatografía de gases y lacromatografía de líquidos de alta resolución,pero su uso no ha llegado a generalizarse.

Han transcurrido cien años desde queMijail Tsvet llevara a cabo los experimentos quedieron lugar a la cromatografía. Durante esetiempo las técnicas cromatográficas han sidosometidas a procesos de instrumentación,automatización, miniaturización y compu-terización, y el conocimiento y control de losprocesos físico-químicos que rigen lasinteracciones entre soluto, fase estacionaria yfase móvil han alcanzado niveles en muchoscasos difícilmente superables. No obstante, lasbases de la separación cromatográfica han cam-biado esencialmente muy poco respecto a lasprimeras descripciones que hizo Tsvet. En cir-cunstancias menos desfavorables que las queconcurrieron en la vida de Tsvet, éste habría

sido, sin duda, un digno candidato al premioNobel de química. No fue así, pero la veintenade científicos que alcanzaron tal galardón va-liéndose de la cromatografía para llevar a cabosus investigaciones constituyen una prueba fe-haciente de la transcendencia de su invento.

3. Análisis polarográficoLa polarografía es una técnica

electroquímica de análisis basada en la medidade la intensidad de la corriente que fluye porun circuito como consecuencia de la reacciónelectroquímica que se produce en un electro-do de gotas de mercurio al aplicar a éste unpotencial determinado. La importancia de lapolarografía como método de análisis cuanti-tativo radica en que la intensidad de la corriente(intensidad límite de difusión) resulta ser pro-porcional a la concentración de la especie quí-mica que reacciona en la superficie del electro-do. En 1959 la Real Academia Sueca de lasCiencias concedió el premio Nobel de quími-ca “por el descubrimiento y desarrollo de losmétodos de análisis polarográfico”, al químicocheco Jaroslav Heyrovsky casi cuarenta añosdespués de que éste diera a conocer sus prime-ros resultados en 1922 [54]. La contribuciónque con la polarografía hacía Heyrovsky a laelectroquímica supuso la introducción de unatécnica instrumental que impulsaría de formaespectacular la química analítica, iniciándosecon ello la era de la moderna electroquímicaanalítica o electroanálisis.

Los fenómenos electroquímicos asocia-dos a la interacción entre la electricidad y lamateria empezaron a ser estudiados a finalesdel siglo XVIII, siendo probablemente el fa-moso experimento del médico italiano Galvanicon las ancas de una rana, en 1791, el primerodel que se tiene noticia, y el que serviría degermen para el posterior desarrollo de laelectroquímica. Luigi Galvani (1737-1798) fueprofesor de Anatomía y Obstetricia en la Uni-versidad de Bolonia hasta que fue destituidode su cátedra en 1797 por mostrar su oposi-ción a la creación de la República Cisalpina,tras la ocupación de Italia por las tropas deNapoleón. En su laboratorio de anatomía,

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Galvani observó en 1791 que las ancas de unarana que mantenía suspendidas de un ganchode cobre, que a su vez pendía de una barra dehierro, experimentaban bruscas sacudidas cuan-do se las tocaba con ambos metales Galvani,más interesado por la anatomía que por la elec-tricidad, interpretó este fenómeno suponien-do que los tejidos animales contenían una es-pecie de fuerza vital a la que denominó electri-cidad animal, y que era la que provocaba losmovimientos de los músculos cuando éstos alcontactaban con un metal. Parece ser que elexperimento de Galvani se hizo tremendamen-te popular en Europa, siendo raro el mucha-cho que no trataba de cazar alguno de esosanimalitos para reproducir tan espectacularmilagro. Tres años después el físico tambiénitaliano Alejandro Volta (1745-1827) demos-tró que el único elemento prescindible del ex-perimento de Galvani era, precisamente, la ranay, con ello, la inexistencia de la electricidadanimal: la electricidad se generaba como con-secuencia del contacto entre el cobre y el hie-rro, y el papel de las ancas de la rana era mera-mente el de sensor de la electricidad produci-da. Volta logró generar electricidad entre dosdiscos de metales distintos (plata y cinc) sepa-rados por un trozo de tela impregnado en di-solución de sal. Comprobó, además, que elfenómeno era tanto más sensible cuanto ma-yor era en número de elementos metal-disolu-ción-metal, por lo que construyó un dispositi-vo generador de corriente constituido por va-ras decenas de dichos elementos apilados, alque denominó por ello pila, término que sesigue empleando en la actualidad, asociado in-distintamente a los nombres de los dos cientí-ficos mencionados (pila galvánica o pilavoltaica). Volta llegó a construir una pila degrandes dimensiones, con el apoyo deNapoleón, quien, fascinado por el invento,instauró el premio Volta para científicos que sedistinguieran en sus trabajos sobre electricidad,premio que alcanzó gran prestigio en la Euro-pa de principios del siglo XIX.

El primer premio Volta fue concedidoal químico británico Sir Humphrey Davy(1778-1829) quien en 1807 había consegui-do aislar varios metales (sodio, potasio, calcio,estroncio y bario) mediante el empleo de lacorriente eléctrica, y publicó además una teo-

ría de la electrolisis [55]. Unos años antes lostambién británicos Anthony Carlisle (1768-1840) y William Nicholson (1753-1815) ha-bían demostrado que el agua puede descom-ponerse por medio de la corriente eléctrica, yotro británico, William Cruickhanks (1745-1800) que durante la electrolisis los metalesreaccionan en el polo negativo y los elementosno metálicos lo hacen en el positivo.Cruickhanks fue también el primero en em-plear la electrolisis con fines analíticos cualita-tivos: la formación de un depósito de cobreservía para identificar la presencia de dicho ele-mento en la disolución electrolizada. Más ade-lante el método electrolítico se aplicaría a laidentificación de otros metales, como arséni-co, plomo y manganeso.

La relación cuantitativa entre la canti-dad de electricidad invertida en la electrolisis yel peso de sustancia reaccionada fue estableci-da por el británico Faraday entre 1832 y 1834,cuando enunció las leyes de la electrolisis.Michel Faraday (1791-1867) nació enNewington, Surrey, al sur de Inglaterra y co-menzó a trabajar muy joven como ayudantede Davy, en cuyo laboratorio de Londres pudoexperimentar con la electrodeposición de losmetales alcalinos y alcalinotérreos en forma deamalgamas. Construyó un culombímetro degases con el que podía medir la cantidad deelectricidad a través del volumen de hidróge-no y de oxígeno obtenidos en la electrolisis delagua, y sus observaciones le permitieron enun-ciar sus famosas leyes, según las cuales el pesode sustancia que reacciona durante un experi-mento de electrolisis es proporcional a la can-tidad de corriente y al equivalente químico dela sustancia. Se debe también a Faraday la in-troducción de los términos electrolisis, elec-trodo, ánodo, cátodo, anión y catión.

La primera aplicación de la electrolisiscon fines analíticos cuantitativos se debe alnorteamericano Wolcott Gibbs (1822-1908)*

graduado en Medicina en Nueva York aunque,

* No debe confundirse con el científico coetáneo y tam-bién norteamericano Josiah William Gibbs (1839-1903), químico teórico, profesor de la Universidad deYale, y a quien se debe el enunciado de la regla de lasfases.

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a su regreso a los Estados Unidos después deuna estancia en Europa durante la que trabajócon Liebig y con Dumas comenzara a enseñarFísica y Química y llegase después a ser profe-sor de Ciencias Naturales en la Universidad deHarvard. Gibbs determinó cuantitativamentecobre mediante electrolisis, pesando el depó-sito que se formaba en un crisol de platino queutilizaba como cátodo, determinó también ní-quel de forma similar, y denominóelectrogravimetría a este método de análisiscuantitativo [56]. El método resultaba ser muyexacto, y en los años siguientes se propusieronmétodos electrogravimétricos para la determi-nación de otros metales, como plata, cinc, plo-mo, mercurio, cadmio y manganeso, y se pu-blicó la primera monografía sobre esta técnica:Quantitative analyse auf electrolytischen Wege(Análisis cuantitativo por medios electrolíticos),con el que su autor, el alemán AlexanderClassen (1843-1934), profesor de QuímicaAnalítica en la Universidad de Aachen, hacíaimportantes aportaciones a la teoría y la prác-tica de la electrogravimetría.

Durante unos treinta años las determi-naciones electrogravimétricas se llevaron a cabomanteniendo la corriente aproximadamenteconstante. Esta forma de operar no permitecontrolar el potencial del electrodo, por lo que,en caso de la presencia de varios iones metáli-cos en la disolución, el depósito formado du-rante la electrolisis estará constituido no porun metal puro, sino por una mezcla de meta-les, lo que impide la determinación individualde cada uno de ellos. Este problema pudosolucionarse gracias a los avances que se pro-dujeron en la electroquímica teórica en las dosúltimas décadas del siglo XIX, y que permitie-ron conocer la importancia del control delpotencial del electrodo durante los procesosde electrolisis. Uno de los avances más signifi-cativos se debe a Nernst, quien en 1889 publi-có su famosa ecuación [57], mediante la quese establecía la dependencia entre el potencialde equilibrio y las actividades de las especiesquímicas en la disolución. Walther HermannNernst (1864-1941) fue primero ayudante deOstwald, luego profesor de la Universidad deGöttingen y finalmente director del Institutode Física Experimental de la Universidad deBerlín entre 1924 y 1933, año en que fue des-

tituido debido a su manifiesta oposición al na-zismo. Nernst había sido distinguido con elpremio Nobel de Química en 1920, y se leconsidera, junto con Arrhenius y Ostwald,fundador de la química física. Después de queLe Blanc midiera experimentalmente el poten-cial de descomposición de numerosos compues-tos metálicos en disolución [58], las determi-naciones electrogravimétricas comenzaron aefectuarse a potencial constante, lo que per-mitía determinar selectivamente unos metalesen presencia de otros (electroseparación) [59].La introducción del electrodo auxiliar en 1908por el alemán Henry Julius Salomon Sand(1873-1944) permitió controlar con gran pre-cisión el potencial del electrodo durante lasdeterminaciones electrogravimétricas [60].

A principios del siglo XX el uso de lasreacciones electroquímicas en análisis estabalimitado a las determinaciones electrogravi-métricas y a las electroseparaciones. En los pri-meros años veinte, Jaroslav Heyrovsky (Figu-ra 9) introduciría una nueva y decisiva línea enlos métodos de electroanálisis con la medidade la intensidad de la corriente producida en laelectrolisis cuando se usa un electrodo de go-tas de mercurio, lo que constituiría el princi-pio del análisis polarográfico.

Figura 9. Jaroslav Heyrovsky(1890-1967)

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Jaroslav Heyrovsky nació en Praga en1890. Su padre, Leopold Heyrovsky, era pro-fesor de Derecho Romano en la UniversidadKarlova (Carolina) de Praga*, de la que llega-ría a ser rector. El ambiente de estudio que sevivía en la familia propició las inquietudes deljoven Jaroslav, que se interesó en su adoles-cencia por la botánica, la zoología, lamineralogía, la astronomía, la música y el de-porte. En el Akademické Gymnasium (escuelasecundaria) de Praga estudió matemáticas, fí-sica, química, latín y griego y, después de su-perada la prueba de madurez, en 1910 ingresóen la Facultad de Filosofía de Praga, dondeestudió física, química y matemáticas. Intere-sado por los estudios de química-física, que porentonces no podía cursar en Praga, consiguióingresar en 1910 en el University College deLondres, donde estudió con Sir WilliamRamsay, profesor de química general y premioNobel de química en 1904 por el descubri-miento de los gases nobles. En 1913 Heyrovskyobtiene el grado de bachelor (licenciado) enCiencias. Ese mismo año se retira el profesorRamsay, siendo sustituído por FrederickGeorge Donnan, que reorienta las líneas deinvestigación hacia el campo de laelectroquímica, asignando a Heyrovsky un pro-yecto de tesis sobre la medida del potencial deelectrodo del aluminio. Pronto advierteHeyrovsky las dificultades, tanto experimenta-les como de interpretación, que surgen comoconsecuencia de los fenómenos superficiales depasivación y de desprendimiento de gas hidró-geno, por lo que, a instancias de Donnan, co-mienza a utilizar una amalgama líquida de alu-minio con la ayuda de un capilar de vidrio parapoder renovar convenientemente la superficiedel metal. Pero sus trabajos son bruscamenteinterrumpidos: en 1914, durante una visita asu familia en Praga, estalla la primera Guerra

Mundial, lo que le impide regresar a Londres,al ser reclutado por el ejército austro-húnga-ro. Heyrovsky no es destinado al frente, sino aun hospital en Austria, cerca de Innsbruck,como ayudante de radiología, donde disponede tiempo para ultimar el trabajo experimentaly redactar la memoria de su tesisElectroafinidad del Aluminio que, una vez fi-nalizada, remite a la Facultad de Filosofía de laUniversidad Checa de Praga, en la que, des-pués de terminada la guerra, obtiene el títulode doctor en 1918.

Uno de los miembros del tribunal dedoctorado que juzgó los méritos de Heyrovsky,el profesor Bohumil Kucera, propuso al nuevodoctor trabajar en un proyecto ya iniciado so-bre el efecto del potencial eléctrico sobre latensión superficial del mercurio. Kucera habíatratado de sustituir el uso del electrómetro ca-pilar estático —en el que no había flujo demercurio— construido a tal efecto por el físicofrancés Gabriel Lippmann en 1887, por el deun capilar dinámico en el que la variable medi-da sería el peso de las gotas de mercurio des-prendidas. Los resultados obtenidos por Kuceramostraban ciertas anomalías en algunas de lascurvas electrocapilares, cuyo estudio encomen-dó a Heyrovsky. El trabajo experimental de ésteconsistía en recoger sucesivas porciones de 50gotas de mercurio cada una para, después desecadas convenientemente, pesarlas y represen-tar este peso frente al voltaje aplicado. Esta ta-rea era harto tediosa, y Heyrovsky introdujouna modificación que conducía a resultadosmucho más rápidos, consistente en medir eltiempo de goteo, igualmente influenciado porel potencial, por lo que constituía una alterna-tiva ventajosa para obtener las curvaselectrocapilares. De esta manera reprodujo lasanomalías que había observado Kucera, con-sistentes en la aparición de pequeños picos enlas curvas obtenidas en presencia de iones me-tálicos como cinc, cadmio, manganeso o ba-rio. Pensaba Heyrovsky en un principio queeste efecto podría ser utilizado para medir lospotenciales de electrodeposición de los distin-tos metales, pero la convicción de que los fe-nómenos más interesantes eran los asociados alas reacciones de electrolisis en la superficie delmercurio le hizo cambiar de estrategia.

* La Universidad Karlova de Praga, la más antigua de laEuropa central, fue fundada por el rey Carlos IV en1348. A finales del siglo XVIII se había impuesto elalemán como lengua oficial de la universidad, pero losmovimientos nacionalistas durante el siglo XIX obli-garon al gobierno de Viena en 1882 a dividir la uni-versidad Karlova en otras dos, una alemana y otracheca, la Universidad Checa de Praga. Después de lafundación del estado checoslovaco en 1918, la Uni-versidad Checa recuperó el antiguo nombre de Uni-versidad Karlova de Praga.

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En 1919 Heyrovsky se había incorpora-do como profesor ayudante al departamentode Química Inorgánica y Analítica donde, unaño después, fue habilitado como profesor aso-ciado de Química Física. Heyrovsky no habíaolvidado los años pasados en Inglaterra*, y de-cidió enviar un resumen de sus trabajos sobrelas propiedades del aluminio y los aluminatosa la Universidad de Londres, donde los habíainiciado bajo la dirección del profesor Donnan,para optar al grado de doctor por esa universi-dad, lo que obtuvo en 1921. Ese mismo añofallecía el profesor Kucera, por lo queHeyrovsky prosiguió el trabajo enelectroquímica según su propia iniciativa, loque le llevó a medir la corriente eléctrica quese producía a diferentes voltajes aplicados alelectrodo. Para llevar a cabo estos experimen-tos hubo de pedir prestados un galvanómetrosuficientemente sensible y un potenciómetro.Heyrovsky obtuvo sus primeros resultados el10 de febrero de1922, según consta en su cua-derno de laboratorio. En el experimento usóuna disolución de hidróxido sódico, un elec-trodo de gotas de mercurio como cátodo y unacierta cantidad de mercurio introducida en elfondo del recipiente como contraelectrodo(ánodo) y leía en el galvanómetro la intensi-dad de corriente producida a diferentes valo-res del voltaje aplicado. En el cuaderno de la-boratorio aparecen todas estas anotaciones,incluyendo las rítmicas oscilaciones produci-das por la caída de las gotas de mercurio (Fi-gura 10). La representación de la intensidadde la corriente frente al potencial dio lugar a laprimera curva intensidad-potencial, en la quese aprecian dos aumentos consecutivos de lacorriente correspondientes a la reducción deloxígeno disuelto —más adelante Heyrovskycomprendería la conveniencia de eliminarlo—y un tercero debido a la reducción del ion sodiopara formar amalgama (Figura 11). Estos re-sultados fueron publicados ese mismo año enla revista checa Chemické listy [55], y constitu-yen el nacimiento de la polarografía. En expe-

rimentos posteriores Heyrovsky procedió a eli-minar previamente el oxígeno disuelto median-te una corriente de hidrógeno que generabaen un aparato de Kipp, lo que le permitió, du-rante los dos años siguientes, obtener las cur-vas intensidad-potencial producidas en la re-ducción de otros iones metálicos, así como dealgunas sustancias orgánicas.

* Los cuatro años que Heyrovsky estuvo en Londresimprimieron ciertos rasgos en su comportamiento:hasta el final de su vida escribió en inglés las anotacio-nes en su libro de laboratorio, mantuvo siempre untrato extremadamente cortés con sus subordinados...y conservó la costumbre de tomar el té a diario.

Figura 10. Página del cuaderno de laboratorio de Heyrovskycon anotaciones de potenciales e intensidades.

Figura 11. Primera curva intensidad-potencial, obtenidapunto a punto por Heyrovsky el 10 de febrero de 1922.

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El trabajo manual de obtención de lascurvas intensidad-potencial punto a punto re-sultaba extremadamente lento y tedioso. En1923 Heyrovsky conoce al químico-físico ja-ponés Masuzo Shikata (1895-1964), que ha-bía trabajado dos años en Berlín sobre quími-ca de superficies. La colaboración entreHeyrovsky y Shikata consistió en el diseño yconstrucción de un aparato que permitía va-riar el potencial automáticamente y registrar laintensidad de la corriente. El primer aparatode estas características, construido en 1925[61], empleaba un ingenioso aunque laborio-so dispositivo fotográfico para registrar la in-tensidad de la corriente (Figura 12). El apara-to fue denominado polarógrafo, y la técnica queestudiaba los procesos de electrolisis en el elec-trodo de gotas de mercurio polarografía. En1933 Heyrovsky había viajado a Londres paraparticipar en la General Discussion of theFaraday Society sobre las reacciones y equili-brios en los electrodos, en la que informó de-talladamente sobre sus resultados enpolarografía e introdujo el término wave (olau onda)* para referirse a la morfología típicade las curvas intensidad-potencial.

En 1926 Heyrovsky es nombrado pro-fesor ordinarius (catedrático) de Química Fí-sica en la Universidad Karlova de Praga, y enlos años siguientes colaboran en el departamen-to científicos que alcanzarían renombre en elcampo de la polarografía, tanto en Checoslo-vaquia como en otros países europeos. Así su-cedió, entre otros, con Wiktor Kemula (1902-1985), quien diseñaría el primer electrodo degota de mercurio suspendida (HMDE) en laUniversidad de Varsovia, o con Rudolf Brdicka(1906-1970), que estudió, en el Instituto dePolarografía de Praga, las denominadas ondaspolarográficas cinéticas y catalíticas, o conDionyz Ilkovic (1907-1980), primero ayudantede investigación de Heyrovsky en Praga y fi-nalmente profesor en la Universidad deBratislava, a quien se debe la deducción, en1934, de la ecuación fundamental de la inten-sidad de difusión polarográfica, conocida porecuación de Ilkovic.

Heyrovsky mantuvo siempre la convic-ción de que los resultados de la investigaciónhan de ser objeto de pronta difusión entre lacomunidad científica. En 1929 fundó, juntocon el profesor Emil Votocek, de la Universi-dad Técnica de Praga, la revista Collection ofCzechoslovak Chemical Communications, cuyapolítica era fomentar la publicación de los tra-bajos de científicos checos en otros idiomaseuropeos, principalmente en inglés. El primerlibro sobre polarografía se publicó en 1932,pero curiosamente no fue escrito porHeyrovsky, sino por uno de sus primeros cola-boradores, G. Semerano [62], que fundaría uninstituto de polarografía en Padua. En 1933aparece el primer libro de Heyrovsky, en checo[63], del que cuatro años más tarde se editaríauna traducción rusa. Heyrovsky viajó por pri-mera vez a los Estados Unidos en 1933, im-partiendo cursos y seminarios en las universi-dades de Berkeley y Stanford en California, enel Instituto de Tecnología de California, en lasuniversidades de Minnesota y Wisconsin, en laOhio State University y en las universidades dePrinceton y Cornell, lo que contribuiríasustancialmente a la difusión de las técnicaspolarográficas en aquel país.

Con la ocupación de Checoslovaquia porel ejército alemán en 1939 la Universidad

Figura 12. Esquema del primer polárografo, con registrofotográfico, construido por Heyrovsky y Shikata en 1925.

* Aunque en las publicaciones en castellano se suele uti-lizar el término onda, parece que la acepción ola re-presentaría mejor la morfología sigmoide de las cur-vas intensidad-potencial.

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Karlova de Praga fue clausurada, aunque ellaboratorio de Heyrovsky fue respetado debi-do a la influencia de un colega alemán. Duran-te la segunda Guerra Mundial, Heyrovsky sededicó a preparar su nuevo libro, que se publi-caría en Viena en 1941 [64] y cuya versióninglesa se publicaría en Estados Unidos en1944 [65].

Finalizada la guerra, la UniversidadKarlova de Praga reanuda sus actividades aca-démicas, con lo que el departamento de Quí-mica Física vuelve a ser el principal núcleo dela investigación en polarografía. En 1950 sefunda en Praga el Instituto Polarográfico Cen-tral, cuyo primer director es Heyrovsky quien,por motivos de salud, había limitado sus acti-vidades académicas en la universidad, a la quepermanecía vinculado, no obstante, como pro-fesor honorario. Durante los dos años siguien-tes a su creación, el Instituto PolarográficoCentral experimenta una fuerte expansión y en1952 se convierte en el Instituto Polarográficode la Academia Checoslovaca de las Ciencias.El progreso de la polarografía en todo el mun-do era ya una realidad en los años 50, y suempleo como método de análisis cuantitativo,principalmente de iones metálicos, se habíageneralizado en las industrias metalúrgica, quí-mica, farmacéutica y alimentaria. En 1951 secelebraba en Praga el primer Congreso Inter-nacional de Polarografía.

El impacto causado por la polarografíaen la comunidad científica había llegado tam-bién al la Real Academia Sueca de las Ciencias:en los años 1938, 1939 y 1948 Heyrovsky fi-guraba entre los científicos propuestos para laconcesión del premio Nobel de química, peroal final el premio fue para otros científicos (R.Kuhn, A.F.J. Butenandt y L. Ruzicka, y A.Tiselius, respectivamente)*. Heyrovsky habríade esperar aun once años: en septiembre de1959 se dio a conocer oficialmente la conce-sión del premio Nobel de Química a JaroslavHeyrovsky, quien lo recibió el 11 de diciem-bre de ese mismo año. En su discurso ante la

Academia Sueca, Heyrovsky presentó de for-ma sistemática los trabajos que había desarro-llado durante los últimos treinta y ocho años,desde las características de los capilares emplea-dos, el concepto e importancia de la intensi-dad límite de difusión y la ecuación de Ilkovic,hasta las aplicaciones más recientes de las téc-nicas polarográficas.

El reconocimiento oficial de las aporta-ciones de Heyrovsky a la electroquímica y elelectroanálisis durante casi cuarenta años detrabajo había llegado finalmente, pero las fa-cultades físicas del científico estaban ya muymermadas y su creatividad muy limitada.Jaroslav Heyrovsky murió en Praga siete añosmás tarde, el 27 de marzo de 1967, y fue ente-rrado en el cementerio Vysehrad de Praga,donde antes lo habían sido los músicos BiedrichSmetana y Antonin Dvorak, entre otros artis-tas y escritores.

Como anteriormente se ha señalado, lavisita de Heyrovsky a los Estados Unidos en1933 despertó el interés por la polarografía enmuchos investigadores de aquél país, dondeuno de los que contribuyó de forma más acti-va al desarrollo de las técnicas polarográficasfue Kolthoff en la Universidad de Minnesota.Izaac Maurits Kolthoff (1894-1993) habíanacido en Almelo (Holanda), y ya en sus estu-dios elementales comenzó a mostrar su interéspor la química. En 1911 se matriculó en laEscuela de Farmacia de la Universidad deUtrech, donde adquirió los primeros conoci-mientos de química analítica, una materia porentonces casi totalmente empírica. Después deobtener su diploma de farmacéutico en 1915,cursó asignaturas de química física y químicacoloidal en la Universidad de Utrech, y prepa-ró una tesis que, con el título Fundamentos deIodimetría, presentó en 1918 para obtener eltítulo de doctor en Química. En la Universi-dad de Utrech, donde había conseguido unnombramiento de privaat docent (ayudante)en electroquímica, publicó numerosos artícu-los sobre temas diversos de química, comoquímica de los coloides o el concepto de pH(que había sido definido en 1909 por el danésSorensen), muchos de ellos en inglés, lo quehizo que sus trabajos fuesen conocidos rápida-mente en Europa y en Estados Unidos.

* Parece que el hecho de que durante la guerraHeyrovsky hubiera podido continuar su trabajo en laUniversidad Karlova de Praga, clausurada por los na-zis, fue interpretado en algunos círculos como un sig-no de colaboracionismo.

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Después de una breve estancia enNorteamérica (Canadá y USA) en 1924,Kolthoff regresó allí de forma que sería defini-tiva en 1927, contratado como profesor de laDivisión Analítica de la Escuela de Química dela Universidad de Minnesota, donde perma-neció hasta 1962, año en que se retiró oficial-mente, ya que, de hecho, nunca abandonó elmundo académico hasta su muerte, a los 99años, acaecida en 1993. Kolthoff fue un inves-tigador que se interesó por materias muy di-versas en química analítica, tanto clásica comoinstrumental. Una de ellas fue el electroanálisis.Inmediatamente después de la visita deHeyrovsky a la Universidad de Minnesota en1933, Kolthoff encomendó proyectos de in-vestigación en electroanálisis a sus discípulosJ.J. Lingane (con el electrodo de gotas demercurio) y H. Laitinen (con electrodo sólidode platino). En 1941 Kolthoff y Lingane pu-blican su libro Polarography, del que aparece-ría en 1952 una segunda edición ampliada, endos volúmenes [66]. En 1940 Kolthoff intro-dujo el término voltammetry (voltampe-rometría) para referirse a la técnica de obten-ción de curvas intensidad-potencial emplean-do electrodos sólidos en sustitución del elec-trodo de gotas de mercurio.

Estando en desacuerdo con la situaciónde la química analítica cuando empezó a in-vestigar (a principios del siglo XX era conside-rada más un arte que una ciencia), Kolthoff hasido el químico que más ha contribuido a trans-formarla. Para ello tomó como base los funda-mentos que habían incorporado a la teoría dela química científicos como J.W. Gibbs, J.H.Vant’Hoff, S. Arrhenius, W. Nernst y N.J.Bjerrum, y edificó sobre aquéllos las bases teó-ricas de los métodos analíticos. La investiga-ción de Kolthoff abarcó prácticamente la tota-lidad de los campos de la química analítica, encada uno de los cuales solía publicar, ademásde los artículos originales, una monografía enla que se presentaban las bases teóricas y susprincipales aplicaciones. Kolthoff siempre tra-taba de mantener un equilibrio entre la teoríay la práctica en el trabajo científico. Entendíaque la investigación en química analítica teníaque buscar objetivos de utilidad pero que, almismo tiempo, era necesario que la metodo-logía tuviese una firme base teórica en la que

sustentarse. Una frase suya que llegó a hacersefamosa resume esta filosofía: Theory guides,experiment decides. (La teoría guía, el experi-mento decide).

El desarrollo de la polarografía a partirde los años 50 estuvo marcado por la búsque-da de límites de detección más bajos (enpolarografía clásica el límite de detección, im-puesto por la corriente capacitiva, se halla en-tre 10-4 y 10-5 M). Para conseguir este objetivose desarrollaron, entre otras, las técnicas depolarografía de impulsos normal (NPP) y dife-rencial (DPP), mediante las que se consigueincrementar la corriente faradaica y disminuirla corriente capacitiva [67].

La voltamperometría con electrodos só-lidos en condiciones de difusión convectiva ovoltamperometría hidrodinámica llegó a adqui-rir un uso generalizado a partir de lacomercialización de los electrodos rotatoriospara los que el ruso Veniamin Levich habíadesarrollado entre 1942 y 1944 un rigurosotratamiento matemático que conduce a la ecua-ción de la intensidad límite en condicioneshidrodinámicas conocida como ecuación deLevich [68]. La voltamperometría con electro-dos sólidos adquirió una nueva perspectivacuando empezaron a diseñarse detectoresamperométricos para cromatografía de líqui-dos de alta resolución [69].

La tendencia de la instrumentación ana-lítica a la miniaturización se manifiesta en elcampo de los sensores. El biólogo norteameri-cano Leland C. Clark, diseñó un sensor para ladeterminación de oxígeno disuelto basado enla medida de la intensidad de la corriente pro-ducida en la reducción del oxígeno en un elec-trodo de platino. Este sensor se popularizó conel nombre de electrodo de Clark, y constituyela base de los modernos biosensoresamperométricos, basados en la inmovilizaciónde enzimas que catalizan una reacciónbioquímica y el empleo de mediadores redoxque catalizan la transferencia de electrones.

Desde que, hace más de ochenta años,Heyrovsky realizara los primeros experimen-tos que darían lugar al desarrollo de lapolarografía, la forma de llevar a cabo las de-

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terminaciones ha experimentado cambios sus-tanciales: el electrodo de gotas de mercurio hasido drásticamente modificado o, alternativa-mente, sustituido por electrodos sólidos deplatino o carbono, la instrumentación ha sidoobjeto de mejoras tendentes a alcanzar mayorsensibilidad, precisión, rapidez y automatismo,y la terminología ha tenido que incorporar ele-mentos inexistentes (e innecesarios) en lapolarografía clásica: voltamperometría, impul-sos, muestreo, detectores, sensores... Pero laeficacia actual de la metodología electroanalíticano habría sido posible sin el ¿invento o descu-brimiento? de Heyrovsky. Petr Zuman, uno delos más destacados discípulos de Heyrovsky,elude responder a la anterior disyuntiva apli-cando la reflexión:

“Como con otros descubrimientos, el dela polarografía se produjo porque la per-sona adecuada se hallaba en el lugar ade-cuado en el momento adecuado” [70].

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