Química de Los Flavonoides, Aislamiento y Caracterización

8/18/2019 Química de Los Flavonoides, Aislamiento y Caracterización

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Química de los Flavonoides,Aislamiento y caracterización de

Isoflavonas y su ActividadBiológica

Q.F Heinz JungbluthGanoza

Lima, UIGV, Junio 2013


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Introducción

• Pigmentos naturales con unaestructura carbonada C3-C-C3 omas, es!ec"#camente con un gru!o$enilben%o!irano, de!endiendo de launión del gru!o arom&tico con eln'cleo ben%o!irano (cromano) ser&n,

*a+onoides 2-$enilben%o!irano,iso*a+onoides 3-ben%o!irano,neo*a+onoides -ben%o!irano


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2-$enil en%o!irano


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Iso*a+onoides


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.eo*a+onoides


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/la+onoides inoritarios


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Botánica


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Iso*a+onas

• istribución Las Iso*a+onas se a4an!resentes ma4oritariamente en la $amilia delas leguminosas (/abaceae) ,

!re$erentemente en la sub$amilia!a!ilionideae, e5isten grandes re+isiones dein+estigaciones sobre la !resencia deIso*a+onas en esta sub$amilia como la de

Veitc (2006, 2007)8 9e encuentran !resentesen los $rutos de esta $amilia (Legumbre) 4 enlas ra"ces o ri%omas (mecanismo de #:acionde .itrogeno)


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Química


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Iso*a+onas

• Caracter"sticas ;u"micas resaltantesLas iso*a+onas di#eren de susres!ecti+os *a+onoides !or lamigración de un anillo arom&tico deC2 a C38 a4ores cambios en laestructura de!ender&n de su


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Iso*a+onas


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Biosíntesis


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ios"ntesis

Las Iso*a+onas !roceden de laruta de los /enil!ro!anoides,!ero el !aso crucial !aracon+ertirse en Iso*a+onas estaen la con+ersión de lares!ecti+a *a+anona en unaIso*a+ona, la en%ima ;uereali%a este !roceso es la 2-idro5iiso*a+anona sintetasa(2


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ios"ntesis• >egulación• La +"a del &cido si?"mico es de!endiente de la lu%8• La acción de la $enilalanina amonioliasa, ;ue inicia la +"a biosint=tica

de los *a+onoides, es $undamental !ara la +ida de las !lantas 4 !orello est& estrictamente regulada8 @ntre otros $actores, la $enilalanina

amonioliasa es acti+ada !or la lu%, 4 de!ende adem&s de laconcentración de di$erentes ormonas +egetales8 La acti+idad de la$enilalanina amonioliasa suele aumentar cuando a los +egetales se lessomete a situaciones de estr=s, como !uede ser la $alta de agua(Aestr=s "dricoA), in$ecciones $'ngicas o bacterianas, radiaciones UV,4 el $r"o (!or esto 'ltimo las !lantas sometidas a ba:as tem!eraturas

suelen !resentar coloraciones ro:i%as en tallos 4 o:as, 4 cuando losin+iernos son mu4 $r"os, las *ores desarrollan colores mu4 intensos enla !rima+era siguiente)8

•


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Fitoquímica


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OBTENCION DELMATERIAL

9@[email protected] @ I.V@9DIGCIE.

- Colectar !lanta com!leta,*or 4 $ruto8

- Por du!licado8- notar nombre +ern&culo

4 cient"#co8-


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islamiento

• @5isten mucas +ias de aislar 4se!arar una iso*a+onas, lo masim!ortante es reconocer el material

del cual se esta e5tra4endo (material+egetal, muestra biológica,limento), la !resencia de

carboidratos 4 com!uestosli!o#licos, a$ectara el desarrollo delmetodo8


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islamiento

• 9P@ (9olid Pase @5traction) Para!oder e+itar la ma4or cantidad deinterru!ciones en la matri%, como

medio de !uri#cación !odemosutili%ar cartucos de 9P@ C1Helu4endo el e5tracto en el cartuco 4

luego !asando a tra+=s del mismoeE< con !e;ueBas concentracionesde cido ac=tico8


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islamiento

• Partiendo de una muestra +egetalLa utili%ación de aterial 9eco,!odr"a acer decrecer la !resencia

de Iso*a+onas, de !re$erencia utili%armaterial $resco8 /la+onoidesaltamente acilados suelen ser l&biles

a tem!eraturas mu4 altas 4$recuentemente son degradadosdurante el !roceso de secado8


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islamiento

• 9i estamos buscando agliconas en el material +egetal,!odemos reali%ar un la+ado con sol+entes no !olarescomo el caso de cloruro de etileno, =ter di et"lico,acetato de etilo8 (aun;ue se encuentra raramente ba:o

la $orma de agliconas)• .ormalmente la e5tracción !odemos reali%arla ba:o une;ui!o so5let a 0 C durante 2 oras 4 com!robar la!resencia de gliconas en dico e5tracto8

• Luego !odemos !roceder a reali%ar una e5tracción conme%clas de eE


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islamiento

• Los *a+onoides en el material+egetal se encuentran siem!recon:ugados con o-glic o c-glic,

raramente se encuentra ba:o la$orma de aglicona8

• Para casos !ractico de aislamiento

sera necesario se!arar estosglucósidos del es;ueleto de los*a+onoides, !ara esto se !ro!one

una idroli%ar acida8


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islamiento

9istemas Cromatogrcos !ara lae5tracción e5isten +arios sistemas!ara la e5tracción de las Iso*a+onas

mediante columnas Cromatogrcas8/ases estacionarias Poliamida,9e!ade5 LP

/ases ó+iles igración 4 mi5turas decom!uestos Polares a


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9ol+entes dedesarrollo

9erie

eluotro!a

@l !oder elu4enteaumenta con la

Polaridad deldisol+ente

-


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Extracción de

Flavonoides

aceración li5i+iación

/iltración

9e!aración !or resina@>LID@ 2

>ecu!erar en eE<

>otae+a!orar a 0C

isol+er en gua

glicona

9ometer a


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Caracteri%ación

• 9on mol=culas di$"ciles decaracteri%ar, normalmente sedeterminan ba:o el brillo en

!resencia de *uorescencia, de colora%ul intenso, ;ue cambia a arrónintenso en !resencia de +a!ores de

amoniaco8


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Caracter"sticas

es!ectrales de lasIso*a+onas


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@s!ectrosco!ia UV

La banda II de absorción de lasIso*a+onas normalmente ocurre en laregión de 2K-260 nm 4 generalmenteno es a$ectada !or el incremento de la


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@s!ectrosco!ia u+

>eacti+os de es!la%amiento


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D=cnicas @s!ectrom=tricas

• Los ti!os de an&lisis mas im!ortantes!ara el traba:o con *a+onoides, sonlos relacionados con la

@s!ectrometr"a de 9, 9M9 4 la>. 1< 4 >. 13C8

• @l traba:o con I> no a4uda en gran

manera, debido a la cantidad deseBales iguales, ;ue se sola!ar"an8


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Espectrometría de masas


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@s una t=cnica instrumental so#sticada ;ue

se!ara 4 detecta iones en $ase gaseosa8 9e basa

en ioni%ar mol=culas gaseosas con+irti=ndolas eniones (generalmente cationes), ;ue se se!aran al

ser acelerados !or un anali%ador de masa la

se!aración se basa en la distinta relación mM% delos iones8

Espectrometría de masas


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ESPECTRÓMETRO DE MASAS

Componentes del instrumento

Introducción dela muestra

Fuente deionización

Separador demasas

Detectoriónico

Procesador

de seal

Re!istrador

El acoplamiento entre C" #$P%C con EM se analizar& m&sadelante


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Ionización por impacto electrónico Ionización 'uímica

Fuente de (om(ardeo con &tomos r&pidos

Desorción con l&ser

Ionización a presión atmos)*rica+

- Electronebulización asistida con un gas: electrospray

- Ionización química a presión atmosférica

- Fotoionización a presión atmosférica

Fuentes de ionización

$P%C


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Ionización por impacto electrónico

placa de repulsión

placas focalizadoras

haz de electrones !" e#$

moléculas neutrasmoléculas neutras

placas aceleradoras

%""" #$

filamento de &

iones

M , e M-, , .e

ion molecular


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Fra!mentación del ion molecular

Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos)

Fragmentación del

ion molecular

ABCD! ! ABCD (ABCD)"! BCD ! ABCDA!

Colisión seguida de

#ragmentación

ABCD! ADBC! BC ! AD!

AD ! BC!$eordenamiento seguido de#ragmentación

ABCD ! e ABCD! ! " e

ABCD! A! ! BCD

A ! BCD! BC! ! D

CD ! AB!

AB ! CD!

B ! A!

A ! B!

D ! C!

C ! D!


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Ionización 'uímica

C$/, , C$/ C$0, , C$1

C$1, , C$/ C.$0, , $.

C$0, , M$ M$., , C$/

C.$0, , M$ M, , C.$2

C$/ , e 3alta ener!ía4 C$/, # C$1,

"as reacti5o metano6 iso(utano6 amoníaco 3c&mara de

ionización de 7alta8 presión a 9: torr4

Trans)erencia protónica entre mol*cula reacti5a # analito


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Espectrómetro de masas de sector ma!n*tico

Espectrómetro de masas de cuadrupolo

Espectrómetro de masas de tiempo de 5uelo Espectrómetro de masas de trampa iónica

e%a!a&o! &e $a"a"


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Espectrómetro de masas de sector ma!n*tico


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;cómo se separan los iones de distinta masa<

m + masa

5 + 5elocidad de la partículam + masa z + car!a= + di)erencia de potencial

FM > ?z5

FC > m5. @r

m5. @r > ?z5

5 > ?zr@m

FM + )uerza centrípetaFC + )uerza centrí)u!a ? + campo ma!n*tico r + radio de cur5atura

?zr@m > 3.z=@m4

m@z > ?.r . @.=

Ecin*tica > m5. > z=

5 > 3.z=@m4


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' ( ) mm


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*

o t e n c i a l c o r r i e n

t e d i r e c t a

tiempomasa

* o t e n c i a l d e r a d i o f r e c u e n c i a

Relación de 5oltaBes durante un (arrido de masa con unanalizador cuadrupolo


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EM de tiempo de 5uelo 3TOF+ time o) )li!t4

pulsos de +"" #, +"""-."""" /eces0s


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Espectrómetro de masas de trampa iónica

electrodo anularcentral

tapata!a

=r)


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Es'uema detector de trampa iónica 3ITP4


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Espectros de masas

Ener!ía de ionización de la mol*cula

"rupos )uncionales de la mol*cula

M*todo de ionización

Presión # temperatura de tra(aBo

Diseo instrumental

Dependen de+

Espectros de masas o(tenidos por impacto electrónico


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Espectros de masas o(tenidos por impacto electrónico

En este e1emplo el picobase se forma por pérdidade 23+

Etil(encenopico (ase

ion molecular 3ion 7parent84

45 6 fragmento de

mayor masa

molécula con n7mero par de 8 6 M, con masa par

molécula con n7mero impar de 86 M, con masa impar

% 3 6 4-% F 6 4-923+6 4-9; 3F 6 4-."83+ 6 4-9! 2.3. 6 4-.)3

.

< 6 4-9=

>tomos y gruposfrecuentementedesplazados

Espectros de masas de cloruro de metileno


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Espectros de masas de cloruro de metileno

9+293.+;2l. m( =;$

9.293.+;2l+!2l m( =)$9+293.+;2l+!2l m( =!$

9.293.+!2l. m( ==$

Picos isotópicos9.293.+;2l. m( =%$

pico base 6 pérdida de 2l

Impacto electrónico


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El ion molecular 3m@z > ..24 pr&cticamente no se distin!ue


Espectros de masas de pento(ar(ital 3sedante4


Espectros de masas de 9decanol 3PM > 904


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Espectros de masas de 9 decanol 3PM 904




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Sistemas de acople

Cromato!ra)ía "aseosa Espectrometría de Masas


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Separador de corro 3columnas rellenas4


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desde el

2?

constricciónde salida

tubo de /idrioporoso

c@mara dee/acuación

hacia labomba

collarín que se atornillaen el recept@culo defuente iónica

constricciónde entrada

A c@marade

ionización

Ensam(laBe con columnas capilares


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Sistema de acople

Cromato!ra)ía %í'uida Espectrometría de Masas

Sistema de ionización


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Ele(t!onebuliza(i)n a"i"ti&a (on

un ga" Ele(t!o"%!a' +EI,


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Electrospra# 3ESI4

18 La $ase mó+il 4 el analito senebuli%an (dis!ersados en !e;ueBasgotas)

28 @l sol+ente de la $ase mó+il see+a!ora de las gotas (desol+atación)

38 La densidad de carga en las gotasaumenta asta alcan%ar el l"mite>aleig (10e VMcm3) 4 luego la gotasu$re e5!losiones de Coulomb 4 serom!e en gotas m&s !e;ueBas8

8 a:o la in*uencia de !otencialeselectrost&ticos en la c&mara de s!ra4(nube), el ion analito se desorbe de lagota8

El t


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Electrospra#

lí'uido

aerosol


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-Cun&o e" a%!o%ia&o t!aba/a! en EI0


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-Cun&o e" a%!o%ia&o t!aba/a! en EI0

- oluto" ionizable" &e alto ' ba/o %e"o $ole(ula!. El

analito &e inte!*" &ebe "e! (a%az &e %o!ta! (a!ga en

"olu(i)n

E/e$%lo"1

a) uestras ;ue contienen etero&tomos carbamatos,ben%odiace!inas

b) Ncidos o bases

c) @s!ecies iónicas $os$atos, con:ugados con gru!os sul$ato,

aminas, etc

d) uestras ;ue se multi-cargan en solución (e: !=!tidos,

!roteinas,

oligonucleotidos)


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Ioniza(i)n 3u5$i(a a %!e"i)n

at$o"#*!i(a

A6CI

I i ió í i ió t )* i 3APCI4


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Ionización 'uímica a presión atmos)*rica 3APCI4

18 La $ase mó+il 4 elanalito se nebuli%an(dis!ersados en!e;ueBas gotas)

28 Las gotas see+a!oran8

38 Las mol=culas de $asemó+il se ioni%an !orelectrones !ro+enientes

de una descargael=ctrica8

8 Las mol=culas deanalito se ioni%an !or losiones de la $ase mó+il8


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•Ca muestra y el sol/ente/aporizados entran en la región

corona entre la agu1a y el capilar

•Cas moléculas de sol/ente seionizan en la región corona dedescarga, transform@ndose eniones gaseosos reacti/os

•Estos iones reacti/osreaccionan con las moléculas demuestra, ioniz@ndolas


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Ionización 'uímica a presión atmos)*rica

H3O+(H2O)16

-C & i & t b / A6CI0


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-Cun&o e" a%!o%ia&o t!aba/a! en A6CI0

Mue"t!a"1 Com!uestos de !eso molecularM!olaridad

intermedias P


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Fotoioniza(i)n a %!e"i)n at$o"#*!i(a

A66I

A**I modo positi/o$


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A**I modo positi/o$

@l sol+ente 4 la muestra senebuli%an 4 soncom!letamente

+a!ori%ados !orcale$acción8

O La ioni%ación del sol+ente4 la muestra ocurre !or

bombardeo con $otones a!artir de una l&m!ara UV


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Ca molécula de analito 4 se ioniza a ion molecular si el potencialde ionización del analito es menor a la energía del fotón$

El ion 45 puede eDtraer un hidrógeno del sol/ente para formar4535

Gn dopante fotoionizable en eDceso y rinde muchos ionesmoleculares

El analito se ioniza por transferencia protónica a partir deldopante o sol/ente

El ión molecular del dopante ioniza al analito por transferenciaelectrónica


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2 @ d A**I


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H2u@ndo usar A**I

• *uede ionizar compuestos que no se ionizan bien con EBIo A*2I e1: *A3s$• Jiene me1or sensibilidad global para algunos compuestosJ32-tetrahidrocanabinol, @cido benzoico, /itaminas no

hidrosolubles$

• Jiene me1or sensibilidad a ba1as /elocidades de flu1o que A*2I

• Es robusto y altamente reproducible

Selección del sistema C%@EM


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Selección del sistema C%@EM

9"""

8o polar 4uy polar

9""""

9"""""

* e s o m

o l e c u l a r

*olaridad del analito

ESI

APCI

APPI


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Re!istros !r&)icos C"EM # C%EM

2romatograma de corriente iónica total

2romatograma de ión seleccionado

Arreglo tridimensional: seKal en función del tiempo informacióncromatogr@fica$ y en función de la relación m0z informaciónespectroscópica$

Síntesis de 9?r(utano a partir de (utanol 3C"EM4


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23+23.$+


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Com(ustión de tela tratada con producto i!ní)u!o

2romatograma decorriente iónicatotal JI2$

E4 de pico 9.benceno$

Con)irmación presencia de cocaína en orina por C"masa


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Con)irmación presencia de cocaína en orina por C" masa

2romatograma de corriente iónica total

E4 del pico a 99; min

E4 de testigo de cocaína m ( +"+$a igual tiempo de elución

Mezcla de 2 er(icidas resuelta por $P%Cmasas


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2romatogramacon/encionalcon detecciónG#

2romatograma de masas de corriente iónica total

Metección deun ionseleccionadom0z ( +9.corresponde a435 formado apartir deimazaquina demasa ( +99$

Nepresentación de la estructura tridimensional de datos 2?-E4 en


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Nepresentación de la estructura tridimensional de datos 2? E4 enmodo barrido completo full-scan$

Be obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma iónico de un iónseleccionado a determinada masa$ y los espectros de masas adeterminados tiempos de retención$

9 en /la+onoides


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9 en /la+onoides

• Cantidad de muestra necesaria enos de un1mg, esta t=cnica :unto con el an&lisis UV 4los reacti+os de des!la%amiento8

• La t=cnica a escoger !uede +ariar

de!endiendo de la matri% 4 ti!o de*a+onoides a anali%ar8 (/, LI, DE/, @I)

• @l an&lisis se debe lle+ar a cabo siem!re conagliconas, esto debido a ;ue los glucósidosson altamente termol&biles, incluso e5istiendouna gran !resión de +ac"o (3 510-K Dorr)


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>.


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>.

• @sta tecnica es mu4 usada !ara el analisis de*a+onoides, es!ecialmente en las iso*a+onas, al serestructuras altamente metiladas8

• demas de ser mu4 solubles en el sol+ente ;ue se

utili%a !ara la >. CCL3, sin embargo otra +e% seobser+a ;ue el analisis de los glicosidos, disminu4ela solubilidad en CCL3

• 9in embargo el uso de 9E d, $acilita desobremanera el analisis de glicosidos8

• La utili%acion de D9 tambie es a!ro!iada !ara elanalisis de /la+onoides, 4a ;ue generan ra!idamentederi+ados de estos8


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Para la elucidación


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de la estructuratomaremos encuenta los

siguientes !untos• Protones del

nillo • Protones del

nillo • Protones del

nillo C• Protones del

Glucósido• eto5i 4 ceto5i

Protones• Protones del

carbono 4 .ota Dener encuenta si se usa D9, todos los E<terminales seran Drimetilsilil esteres8


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Los !rotones de los carbonos 4 de las iso*a+onas ;uecontengan sustituciones en los carbonos K 4 6, !resentaran 2

dobletes (J 28Kc!s) en el rango de 80 4 8K8 Los dobletescorres!ondientes a


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Etro caso com'n es ;ue la iso*a+ona !resente una sustitución en el C-6 Cuando >


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nillo !ara nuestro inter=s en las iso*a+onas, losdes!la%amientos como dobletes entre 682 4 68K 4 8K 4 681,nos dar&n la e5!licación de un enlace C-C en la !osición3, corroborando la !resencia de la estructura

corres!ondiente a las Iso*a+onas8


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Farmacología

Iso*a+onas


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Iso*a+onas

• Las Iso*a+onas !resentan una gran cantidadde acti+idades, aun;ue cabe resaltar ;ue lama4or cantidad de Iso*a+onas !resentaracti+idad estrog=nica, de a" ;ue reciben el

nombre de /itoestrógenos8• @stos com!uestos !resentan una estructura

est=rica mu4 similar a la de esteroidal de losestrógenos, !or lo cual se unen $&cilmente a

los rece!tores estrog=nicos8 e a" ;ue!roduces una in#nidad de e$ectosestrog=nicos o anti estrog=nicos8

bsorción, etabolismo 4 e5creción


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bsorción, etabolismo 4 e5creción

• Las iso*a+onas son absorbidas a ni+el dela !arte su!erior del intestino delgado8Pasan la barrera ematica alrededor deuna ora des!u=s de aber sido ingeridas8

• 9on absorbidas ba:o la $orma de aglicona,!or lo ;ue !re+iamente se reali%ada unidrolisis en%im&tica, !or la -glicosidasa

de la *ora bacteriana o !or la en%imainstestinal, lactasa-*ori%ina idrolasa8


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ecanismo de cción


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ecanismo de cción9"ntomaseno!a'sicosLas iso*a+onas consu estructuraest=rica similar a ladel estrógeno, se

une a sitio rece!torde estrógenos,!roduciendo e$ectos+asomotoresim!ortantes,di+ersos estudios

cl"nicos, dan comodosis diaria 13K mgde Iso*a+onase5!resadas comomg de Genisteina8

@$ectos en=#cos


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@$ectos en=#cos

• nticancer"geno Uno de las !osiblese5!licaciones, o modelos demecanismo de acción es tan

indicados a ;ue las iso*a+onas,e+itan la !roli$eración de c=lulascancer"genas acti+ando las +"as de

a!o!tosis, inibición de la Dirosinauinasa, 4 regulación de los ciclosormonales8

@$ectos en=#cos


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@$ectos en=#cos

• @$ectos sobre la cognición @l ecode acti+ar rece!tores ormonales, dacomo resultado un incremento en la

!roducción de neurotransmisores, locuales +an a !roducir una ma4oracti+idad cerebral, llegando a

me:orar los !rocesos cogniti+os delcerebro8


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Practica de Laboratorio


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Practica de Laboratorio

• Draer• ta !roblema (!lanta, material

+egetal, materia biologico), ;ue

contenga una cantidad 4 moleculaconocida de Iso*a+onas8

• Jeringas de 10 ml

• Guantes• Guarda!ol+os• ucas Ganas de traba:ar


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FIN

Gracias

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