Redalyc.COLECCIÓN DE GERMOPLASMA DE ESPECIES DE LA

LA GRANJA Revista de Ciencias de la

Vida

ISSN 1390-3799

sserranovupseduec

Universidad Politeacutecnica Salesiana

Ecuador

Cerna Marco Caacuterdenas Silvana Cruz Andrea Jaacutecome Ivonne

COLECCIOacuteN DE GERMOPLASMA DE ESPECIES DE LA FAMILIA Orchidaceae DEL

CANTOacuteN SANTIAGO DE MEacuteNDEZ-MORONA SANTIAGO ECUADOR

LA GRANJA Revista de Ciencias de la Vida vol 20 nuacutem 2 2014 pp 5-19

Universidad Politeacutecnica Salesiana

Cuenca Ecuador

Disponible en httpwwwredalycorgarticulooaid=476047265002

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Artiacuteculo cientiacutefico Scientific paper

BIOTECNOLOGIacuteA

LA GRANJAREVISTA DE

CIENCIAS DE LA VIDA

DOI 1017163lgrn20201401

COLECCIOacuteN DE GERMOPLASMA DE ESPECIES DE LA FAMILIA

Orchidaceae DEL CANTOacuteN SANTIAGO DE MEacuteNDEZ - MORONA

SANTIAGO ECUADOR

COMPILATION OF Orchidaceae FAMILY SPECIES GERMPLASM IN SANTIAGO DE

MENDEZ MORONA SANTIAGO ECUADOR

Marco Cerna Silvana Caacuterdenas Andrea Cruz e Ivonne Jaacutecome

Centro de Investigacioacuten y Valoracioacuten para la Biodiversidad CIVABI Universidad Politeacutecnica Salesiana Av 12 de Octubre N24-22y Wilson Telf (593-2) 3962800 Quito Ecuador

Autor para correspondencia mcernaupseduec

Manuscrito recibido el 25 de junio de 2013 Aceptado tras revisioacuten el 16 de diciembre de 2014

Resumen

Las amenazas antroacutepicas que reciben diversos haacutebitats de las orquiacutedeas han promovido iniciativas en pro de su conservacioacuten porconsiguiente el almacenamiento de semillas de orquiacutedeas en un banco de germoplasma constituye una herramienta biotecnoloacutegicauacutetil para la conservacioacuten de las especies amenazadas de este grupo taxonoacutemico El presente estudio tuvo dos fases una en campoy otra en laboratorio La recoleccioacuten en campo se realizoacute en tres zonas del cantoacuten Santiago de Meacutendez Copal Tres Ranchos y LaDelicia en la provincia de Morona Santiago Ecuador en un aacuterea total de 600m2 aquiacute se obtuvieron 50 orquiacutedeas de 15 geacutenerosdistintos las mismas que fueron conservadas ex situ en un invernadero en la ciudad de Macas hasta que sus caacutepsulas maduraronPosteriormente en el laboratorio de biotecnologiacutea vegetal de la Universidad Politeacutecnica Salesiana de Quito las semillas se extrajerony desecaron se almacenaron las semillas de 12 especies de orquiacutedeas en tubos vacutainers a traveacutes de dos meacutetodos a) en refrigeracioacutena 4C maacutes oscuridad y b) a temperatura ambiente 20 plusmn2 C maacutes luz Se determinoacute que el primer procedimiento es el mas eficientepara conservar semillasesto se evidencioacute con la prueba de viabilidad de tetrazolium 1 mediante conteo de semillas tinturadas enel microscopio Durante la germinacioacuten asimbioacutetica in vitro se evaluaron cinco tratamientos Murashige amp Skoog MampS (T1) MampS+vitaminas (T2) MampS + auxinas (T3) MampS + carboacuten activado 1 (T4) y Knudson C (T5) se determinoacute que los medios oacuteptimos degerminacioacuten in vitro para todas las especies en estudio fueron (T4) seguido de (T1) Las orquiacutedeas indistintamente del tratamientoque presentaron mayor viabilidad fueron Sobralia rosea (90 ) Sievekingia marsupialis (90 ) Maxillaria rufescens y Epidendrum sp 1(75 )

Palabras claves conservacioacuten ex-situ germoplasma orquiacutedeas germinacioacuten in-vitro viabilidad medio de cultivo

LA GRANJA Revista de Ciencias de la Vida 20(2) 2014 5-19ccopy 2014 Universidad Politeacutecnica Salesiana Ecuador 5

Artiacuteculo cientiacutefico Scientific paperBIOTECNOLOGIacuteA

Marco Cerna et al

Abstract

Anthropogenic threats to the habitat of orchids have prompted conservation initiatives such as the creation of an orchid seed germ-plasm bank a key biotechnological tool for the conservation of this threatened species The present study was divided in two stagesa field study and a lab analysis Orchids were collected from three areas of the Santiago de Mendez Morona Santiago region CopalTres Ranchos and La Delicia an area of 600 m2 where 50 orchids of 15 different genus were collected and preserved ex situ in a green-house in the city of Macas until the capsules matured The seeds were later removed and dried in the CIVABI lab of the UniversidadPoliteacutenica Salesiana in Quito where 12 species were stored in vacutainer tubes using the following methods a) refrigerated in thedark at 4C and b) under room temperature 20plusmn 2 C in light conditions By using the 1 tetrazolium viability test and microscopiccounting it was determined that the best method was to keep the seeds in the dark at 4C Five treatments were evaluated in the invitro asymbiotic germination MampS (T1) MampS + vitamins (T2) MampS + auxins (T3) MampS+ 1 activated carbon (T4) and Knudson C(T5) where the T4 and T1 treatments were found to be optimal for in vitro germination for all studied species Notwithstanding thetreatment the orchids that showed the highest viability were Sobralia rosea (90 ) Sievekingia marsupialis (90 ) Maxillaria rufescensand Epidendrum sp 1 (75 )

Keywords ex-situ conservation germplasm orchids in-vitro germination viability culture medium

Forma sugerida de citar Cerna M S Caacuterdenas A Cruz e I Jaacutecome 2014 Coleccioacuten de germoplasma de especiesde la familia Orchidaceae del cantoacuten Santiago de Meacutendez - Morona Santiago EcuadorLa Granja Revista de Ciencias de la Vida Vol 20(2) 5-19 ISSN 1390-3799

6LA GRANJA Revista de Ciencias de la Vida 20(2) 2014 5-19

ccopy 2014 Universidad Politeacutecnica Salesiana Ecuador

Coleccioacuten de germoplasma de especies de la familia Orchidaceae del cantoacuten Santiago deMeacutendez - Morona Santiago Ecuador

1 Introduccioacuten

Los bancos de germoplasma tienen como fin conser-var la biodiversidad fuera de su ambiente naturalenfocando sus esfuerzos a especies identificadas co-mo uacutetiles o que se ha observado que su poblacioacutenestaacute en proceso de disminucioacuten La familia Orchida-ceae es una de las maacutes grandes y diversas del pla-neta pero tambieacuten tiene un nuacutemero significativo deespecies en peligro de extincioacuten De acuerdo con da-tos de la base de datos TROPICOS hasta el 2011 enel Ecuador estaacuten registradas unas 4 250 especies y219 geacuteneros de orquiacutedeas de los cuales seguacuten Leoacuten-Yaacutenez et al (2011) existen 1 707 especies endeacutemicases decir habitan uacutenicamente en este lugar del plane-ta

La principal amenaza que enfrentan las plantasendeacutemicas en nuestro paiacutes es la peacuterdida de su haacutebi-tat ocasionada por actividades humanas el mayorimpacto proviene de la deforestacioacuten a pequentildea ogran escala el cambio de uso del suelo para agri-cultura ganaderiacutea urbanizacioacuten o mineriacutea (Leoacuten-Yaacutenez et al 2011) La FAO (2009) establece que latasa de disminucioacuten de la superficie forestal en elEcuador es del 17 anual afectando de forma sig-nificativa tambieacuten a las especies que habitan en estasaacutereas boscosas

Establecer las estrategias para la conservacioacuten deorquiacutedeas en un paiacutes mega diverso como Ecuadorconstituye una tarea obligatoria y urgente para es-to nuestro paiacutes cuenta con herramientas importan-tes que apoyan a este fin por ejemplo al ser un paiacutesbotaacutenicamente bien explorado cuenta con una lis-ta preliminar de especies en peligro de extincioacuten ytiene varios herbarios activos bien mantenidos (En-dara 2008)

En este marco el objetivo de la investigacioacutenfue el de obtener material geneacutetico de un lugar re-presentativo de la flora que se encuentra en francoproceso de alteracioacuten por parte de las actividadeshumanas Se colectaron muestras de plantas vivasy semillas que fueron luego mantenidas en un in-vernadero con el fin de estudiar su ciclo bioloacutegicofertilizarlas artificialmente y producir semillas Lassemillas colectadas se destinaron a procesos de estu-dio en laboratorio con el propoacutesito de establecer lascondiciones ideales para su almacenamiento con-servacioacuten y multiplicacioacuten in vitro Como resultadode este estudio se han establecido los protocolos pa-ra manejar las especies investigadas y se dispone de

material geneacutetico que en el futuro posiblemente yano se encontraraacuten en su ambiente natural

2 Materiales y meacutetodos

21 Autorizacioacuten de Investigacioacuten Cien-tiacutefica

En diciembre del 2011 se obtuvo el correspondientepermiso de investigacioacuten cientiacutefica en la DireccioacutenProvincial del Ministerio del Ambiente de MoronaSantiago para coleccioacuten y manejo de orquiacutedeas

ldquoAutorizacioacuten de Investigacioacuten Cientiacutefica No17-2011rdquo -Investigacioacuten - B -DPMSMAE Flora

22 Aacuterea de estudio

La coleccioacuten de especies se realizoacute en tres localida-des del cantoacuten Santiago de Meacutendez provincia deMorona Santiago que se encuentra en el valle delriacuteo Upano corresponde a una formacioacuten vegetal deldquoBosque siempre verde pie montanordquo de acuerdocon Leoacuten-Yaacutenez et al (2011) y estaacute a una altitud deentre 650 y 1400 msnm (Anexo1)

23 Teacutecnica de coleccioacuten

En el mes de marzo del 2012 se recolectaron orquiacute-deas de los tres sectores seleccionados del cantoacutenSantiago de Meacutendez mediante la teacutecnica de mues-treo por ldquotransectosrdquo en cada sector se establecierondos transectos de 50 x 2 m (200 m2 y 600m2 en todala zona de estudio) los transectos se marcaron con laayuda una piola de 50m y se colectoacute los especiacutemenesfeacutertiles (Con flores o caacutepsulas) presentes a un metroa cada lado de la piola

Para colectar las muestras se usoacute una podadorade mano podadora aeacuterea y un machete los especiacute-menes colectados fueron marcados con cinta adhe-siva de papel y un marcador permanente se foto-grafioacute la muestra y se guardoacute en una bolsa plaacutesticacubriendo las raiacuteces para transportar las muestrasse usoacute una bolsa plaacutestica grande 5 muestras en ca-da bolsa

Se colectaron 50 individuos en las tres zonas enestudio se etiquetaron y codificaron con el nuacuteme-ro de coleccioacuten del libro de campo de Marco Cer-na del 2012 las especies recolectadas fueron trasla-



Marco Cerna et al

dadas hacia un invernadero de propiedad de NellyCaacuterdenas en la ciudad de Macas Figura 1

24 Establecimiento y adecuacioacuten de lasorquiacutedeas en el invernadero

El invernadero posee una temperatura media de25C humedad 60 Luminosidad 4 000 lux seencuentra a una altura de 1 100 msnm Las orquiacute-deas recolectas en campo fueron adecuadas en ma-cetas con musgo esperando la formacioacuten o madura-cioacuten de caacutepsulas ver Figura 1 Los individuos fue-ron evaluados perioacutedicamente en espera de caacutepsu-las maduras

25 Cosecha traslacioacuten y registro de caacutep-sulas

Entre los meses de abril y julio del 2012 fueron cose-chadas caacutepsulas maduras expuestas a polinizacioacutennatural y artificial El criterio utilizado para diferen-ciar las caacutepsulas maduras de las inmaduras fue latransicioacuten de color verde a verde-amarillo y durezaal presionar metodologiacutea descrita por Kitsaki et al(2004) Las caacutepsulas en el invernadero se guardarony rotularon en sobres de papel con las siguientescaracteriacutesticas nuacutemero de caacutepsula coacutedigo lugar derecoleccioacuten fecha de recoleccioacuten

recolectas en campo fueron adecuadas en macetas con musgo esperando la formacioacuten o maduracioacuten de caacutepsulas ver Figura 1 Los individuos fueron evaluados perioacutedicamente en espera de caacutepsulas maduras

Figura 1 Adecuacioacuten de orquiacutedeas en el Invernadero 25 Cosecha traslacioacuten y registro de caacutepsulas

Entre los meses de abril y julio del 2012 fueron cosechadas caacutepsulas maduras expuestas a polinizacioacuten natural y artificial El criterio utilizado para diferenciar las caacutepsulas maduras de las inmaduras fue la transicioacuten de color verde a verde-amarillo y dureza al presionar metodologiacutea descrita por Kitsaki y otros (2004) Las caacutepsulas en el invernadero se guardaron y rotularon en sobres de papel con las siguientes caracteriacutesticas nuacutemero de caacutepsula coacutedigo lugar de recoleccioacuten fecha de recoleccioacuten

Las capsulas cosechadas fueron transportadas hacia el laboratorio del Centro de Investigacioacuten y Valoracioacuten de la Biodiversidad CIVABI de la Universidad Politeacutecnica Salesiana en Quito para el transporte se usoacute una caja de cartoacuten con sobres de siacutelica gel para reducir la humedad

25 Almacenamiento de semillas

Previamente al almacenamiento se desinfectaron las caacutepsulas cerradas con hipoclorito al 3 y alcohol al 70 luego se abrieron las capsulas con un bisturiacute y se extrajo las semillas ponieacutendolas en tubos de ensayo rotulados con el respectivo coacutedigo y fecha Posteriormente se desecaron las semillas en una campana de desecacioacuten durante dos diacuteas usando arroz deshidratado como agente adsorbente de la humedad Luego de lo cual se tapoacute los tubos de ensayo con un tapoacuten de goma y se extrajo el aire del interior del tubo con la ayuda de una jeringuilla

Figura 1 Adecuacioacuten de orquiacutedeas en el Invernadero

Las caacutepsulas cosechadas fueron transportadashacia el laboratorio del Centro de Investigacioacuten yValoracioacuten de la Biodiversidad CIVABI de la Univer-sidad Politeacutecnica Salesiana en Quito para el trans-porte se usoacute una caja de cartoacuten con sobres de siacutelicagel para reducir la humedad


Previamente al almacenamiento se desinfectaronlas caacutepsulas cerradas con hipoclorito al 3 y alcoholal 70 luego se abrieron las caacutepsulas con un bisturiacutey se extrajo las semillas ponieacutendolas en tubos de en-




sayo rotulados con el respectivo coacutedigo y fecha Pos-teriormente se desecaron las semillas en una cam-pana de desecacioacuten durante dos diacuteas usando arrozdeshidratado como agente adsorbente de la hume-dad Luego de lo cual se tapoacute los tubos de ensayocon un tapoacuten le goma y se extrajo el aire del interior

del tubo con la ayuda de una jeringuilla hipodeacutermi-ca Estas muestras se guardaron en un recipiente decristal y se almacenaron en dos sistemas a- 4C yobscuridad b- en condiciones de laboratorio 20 plusmn 2C maacutes luz ambiental Figura 2

hipodeacutermica Estas muestras se guardaron en un recipiente de cristal y se almacenaron en dos sistemas a- 4ordmC y obscuridad b- en condiciones de laboratorio 20 plusmn 2 ordmC maacutes luz ambiental Figura 2

Figura 2 Semillas almacenadas a) a 4oC en oscuridad y b) en temperatura ambiente 20 plusmn 2 ordmC maacutes luz

26 Viabilidad en semillas

La viabilidad de las semillas fue evaluada al iniciar el experimento y despueacutes de tres meses de ser almacenadas a traveacutes de la prueba de Tetrazolium [2 3 5- cloruro trifenil tetrazolio (CTT)] al 1 para esto se tomoacute 10 mg de semillas de cada especie en tubos eppendorf de 2ml se antildeadioacute 15 ml de agua destilada durante 24 horas (imbibicioacuten) a temperatura ambiente Luego retiramos el agua destilada con una pipeta pasteur y antildeadimos 15 ml de solucioacuten de sacarosa al 10 durante 24 horas a temperatura ambiente Despueacutes retiramos la solucioacuten de sacarosa y antildeadimos la solucioacuten de CTT al 1 (1g en 100 ml de buffer fosfato pH 65) A continuacioacuten se incuboacute en bantildeo Mariacutea a 40oC durante 24 horas en total oscuridad Los resultados se observaron en el microscopio realizando un conteo de semillas tinturadas en rojo (viables) y las no tinturadas (no viables) La teacutecnica fue adaptada en base a Ossenbach y otros (2007)

27 Determinacioacuten del medio oacuteptimo para germinacioacuten in vitro

En esta fase se evaluaron cinco tratamientos T1 [(MampS)] composicioacuten en base a Murashige y Skoog (1962) Stock I 1650 mgl‐1 (NH4NO3) y 1900 mgl‐1 de (KNO3) Stock II 181 mgl‐1 (Mg SO4) 17 mgl‐1 (Mn SO4) 86 mgl‐1 (ZnSO4) 0025 mgl‐1 (Cu SO4) del Stock III 3322 mgl‐1

(Ca Cl2) 083 mgl‐1 (K I) 0025 mgl‐1 (Co Cl2) Stock IV 170 mgl‐1 (K H2 PO4)

Figura 2 Semillas almacenadas a) a 4C en oscuridad y b) en temperatura ambiente 20 plusmn 2 C maacutes luz


La viabilidad de las semillas fue evaluada al iniciarel experimento y despueacutes de tres meses de ser alma-cenadas a traveacutes de la prueba de Tetrazolium [2 35- cloruro trifenil tetrazolio (CTT)] al 1 para estose tomoacute 10 mg de semillas de cada especie en tuboseppendorf de 2ml se antildeadioacute 15 ml de agua destila-da durante 24 horas (imbibicioacuten) a temperatura am-biente Luego retiramos el agua destilada con unapipeta pasteur y antildeadimos 15 ml de solucioacuten de sa-carosa al 10 durante 24 horas a temperatura am-biente Despueacutes retiramos la solucioacuten de sacarosa yantildeadimos la solucioacuten de CTT al 1 (1g en 100 ml debuffer fosfato pH 65) A continuacioacuten se incuboacute en

bantildeo Mariacutea a 40C durante 24 horas en total oscuri-dad Los resultados se observaron en el microscopiorealizando un conteo de semillas tinturadas en rojo(viables) y las no tinturadas (no viables) La teacutecnicafue adaptada en base a Ossenbach et al (2007)

28 Determinacioacuten del medio oacuteptimo pa-ra germinacioacuten in vitro

En esta fase se evaluaron cinco tratamientos

T1 [(MampS)] composicioacuten en base a Murashige ySkoog (1962) Stock I 1650 mg1 (NH4NO3) y 1900mgl1 de (KNO3) Stock II 181 mgl1 (Mg SO4) 17



Marco Cerna et al

mgl1 (Mn SO4) 86 mgl1 (ZnSO4) 0025 mgl1 (CuSO4) del Stock III 3322 mgl11 (Ca Cl2) 083 mgl1

(K I) 0025 mgl1 (Co Cl2) Stock IV 170 mgl1 (KH2 PO4) 62 mgl1 (H3 BO3) 025 mgl1 (Na2MoO4)y Stock V 278 mgl1 (Fe SO4) y 3726 mgl1 (Na2EDTA) A esta base de sales se le antildeadioacute un stock devitaminas Aacutecido nicotiacutenico 025 mgL Piridoxina025 mgL Tiamina01 mgL Glicina4 mgL Mioi-nositol 25 mgL

T2 [(MampS)+Vit] A la base de sales MampS se le antildea-dioacute cinco veces la concentracioacuten normal de vitami-nas es decir Aacutecido Nicotiacutenico 125 mgL Piridoxi-na 125 mgL Tiamina 05 mgL Glicina 20 mgLMioinositol 125 mgL

T3 [(MampS)+24D] A la base de sales MampS se leantildeadioacute 001 mgLde 24-D (auxina)

T4 [(MampS)+CA] A la base de sales MampS se le antildea-dioacute carboacuten activado 1000 mgL

T5 Knudson Comercial composicioacuten en base aKnudson (1946) 250 mgL (K H2 PO4) 6944 mgL(Ca (NO3)2 0016 mgL (Mo O3) 0056 mgL (H3BO3) 122125 mgL (Mg SO4) 568 mgL (Mn SO4)500 mgL ((NH4)2 SO4) 0331 mgL (Zn SO4)00624 mgL (Cu SO4) y 25 mgL (Fe SO4)

A todos los tratamientos se les antildeadioacute 8 gL deagar-agar y se ajustoacute a un pH 58 Se dosificaron losmedios en tubos de ensayo de vidrio (18 x 150mm)se los taponoacute con doble capa de papel aluminio y se-llado con plaacutestico de embalaje Rollopack Finalmen-te fueron auto-clavados a 121C y 103 kpascales depresioacuten por 20 minutos

Desinfeccioacuten de caacutepsulas cerradas se adaptoacute elmeacutetodo de Mayo et al (2010) asiacute se lavaron las caacutep-sulas cerradas con etanol 70 por un minuto sedesinfectaron las caacutepsulas con hipoclorito de sodio25 por cinco minutos se sumergieron nuevamen-te en alcohol 70 por 30 segundos y flameoacute hasta

que el alcohol se queme (3 veces) dentro de la caacute-mara de flujo laminar evitando la diseminacioacuten desemillas en el ambiente

Desinfeccioacuten de semillas se adaptoacute el meacutetodo deSeaton (2000) para el caso de semillas se las colo-coacute en un sobre de papel filtro este sobre se intro-duce en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 3 durante tres minutos luego se sumergen los sobresen alcohol etiacutelico al 70 durante tres minutos final-mente se realizaron tres enjuagues en agua destiladaesteacuteril Este procedimiento se desarrolla en el inte-rior de una caacutemara de flujo laminar

Siembra in vitro se tomaron las semillas de lascaacutepsulas o de los sobres desinfectados con la ayu-da de un bisturiacute esteacuteril y se inocula en los medios decultivo preparados ademaacutes se antildeadioacute dos gotas deagua destilada esteacuteril y una gota de agua oxigena-da Finalmente se flamea la boca del tubo de ensayoy se lo sella con papel aluminio y plaacutestico de emba-laje Rollopack

Incubacioacuten los tubos sembrados fueron incuba-dos en una caacutemara con 3000 lux fotoperiodo de 14horas luz 20 plusmn 2 C y 50 de humedad ambientalrelativa como se muestra en la Figura 3

29 Evaluacioacuten del porcentaje de germi-nacioacuten de las semillas

En abril y septiembre del 2012 se cuantificoacute el nuacute-mero de semillas germinadas usando el meacutetododescrito por Seaton (2000) Los resultados fueronevaluados de acuerdo a las siguientes variables cua-litativas Turgencia (TUR) Color (COL) Fenoliza-cioacuten (FEN) Contaminacioacuten (CON) Estado de la se-milla (ESEM) por otro lado se disentildearon fichas deevaluacioacuten de tubos contaminados germinados ytubos sin actividad proveyeacutendonos un porcentajereferencial




28 Evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten de las semillas En abril y septiembre del 2012 se cuantificoacute el nuacutemero de semillas germinadas usando el meacutetodo descrito por Seaton (2000) Los resultados fueron evaluados de acuerdo a las siguientes variables cualitativas Turgencia (TUR) Color (COL) Fenolizacioacuten (FEN) Contaminacioacuten (CON) Estado de la semilla (ESEM) por otro lado se disentildearon fichas de evaluacioacuten de tubos contaminados germinados y tubos sin actividad proveyeacutendonos un porcentaje referencial

Figura 3 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas Laboratorio CIVABI

3 Resultados y Discusioacuten

31 Recoleccioacuten e Identificacioacuten de orquiacutedeas del Cantoacuten Santiago

Se colectaron 50 individuos pertenecientes a 15 geacuteneros y 24 morfo-especies en un aacuterea de 600m2 muestreados entre las zonas de Sector A Copal Sector B Tres Ranchos y Sector C La Delicia pertenecientes al cantoacuten Santiago de Meacutendez Los geacuteneros colectados fueron Maxillaria Epidendrum Stelis Pleurothallis Huntleya Sobralia Rodriguezia Prosthechea Mormodes Sievekingia Lycaste Elleanthus Cyclopogon Masdevallia y Brassia se detalla en la Tabla 1 Ademaacutes se encontroacute una especie endeacutemica Sievekingia marsupialis esta categorizacioacuten seguacuten la UICN (Unioacuten Internacional para la Conservacioacuten de la Naturaleza) como Casi Amenazada (NT) lo que significa que ldquoEl nuacutemero de individuos de la especie estaacute disminuyendo y en un futuro cercano seraacute especie vulnerablerdquo Esta especie no estaacute descrita dentro del Sistema Nacional de Aacutereas Protegidas SNAP se muestra en la Figura 4


3 Resultados y discusioacuten

31 Recoleccioacuten e identificacioacuten de or-quiacutedeas del cantoacuten Santiago

Se colectaron 50 individuos pertenecientes a 15 geacute-neros y 24 morfo-especies en un aacuterea de 600m2

muestreados entre las zonas de Sector A Copal Sec-tor B Tres Ranchos y Sector C La Delicia pertene-cientes al cantoacuten Santiago de Meacutendez Los geacutene-ros colectados fueron Maxillaria Epidendrum StelisPleurothallis Huntleya Sobralia Rodriguezia Prosthe-chea Mormodes Sievekingia Lycaste Elleanthus Cy-clopogon Masdevallia y Brassia se detalla en la Ta-bla 1 Ademaacutes se encontroacute una especie endeacutemicaSievekingia marsupialis esta categorizacioacuten seguacuten laUICN (Unioacuten Internacional para la Conservacioacuten dela Naturaleza) como Casi Amenazada (NT) lo quesignifica que ldquoEl nuacutemero de individuos de la espe-cie estaacute disminuyendo y en un futuro cercano se-raacute especie vulnerablerdquo Esta especie no estaacute descri-ta dentro del Sistema Nacional de Aacutereas ProtegidasSNAP se muestra en la Figura 4

32 Conservacioacuten en invernadero

En el lapso de cuatro meses de experimentacioacuten enel invernadero del total de especies de orquiacutedeas co-lectadas (50) se cosecharon caacutepsulas maduras de 16individuos se detalla en la Tabla 2

La mayor cosecha de caacutepsulas se realizoacute entrelos meses de abril y junio del 2012 El 32 de orquiacute-deas fructificaron en el lapso de tres meses El 68 restante siguen desarrollaacutendose

33 Pruebas de almacenamiento

Despueacutes de tres meses de almacenamiento de semi-llas de doce morfo especies de orquiacutedeas (Figura 5)se midioacute su viabilidad con la prueba de Tetrazoliumal 1 y se determinoacute un promedio del 90 de via-bilidad para el tratamiento 1 en el sistema de alma-cenamiento a 4C en obscuridad y un 80 de viabi-lidad para el tratamiento 2 en el sistema de almace-namiento a 22C con luz ambiental



Marco Cerna et al

Figura 4 Sievekingia marsupialis especie endeacutemica NT Casi Amenazada categoriacutea UICN a) In situ con caacutepsula b) Abertura de caacutepsula en la caacutemara de flujo c) Floracioacuten en Invernadero Fotos Caacuterdenas y Cruz 2012

Figura 4 Sievekingia marsupialis especie endeacutemica NT Casi Amenazada categoriacutea UICN a) In situ con caacutepsula b)Abertura de caacutepsula en la caacutemara de flujo c) Floracioacuten en Invernadero Fotos Caacuterdenas y Cruz 2012




Tabla 1 Especies colectadas en el cantoacuten Santiago de Meacutendez Coacutedigo en base a libro de campo de Marco Cerna 2012Lugar Sector A (Copal) Sector B (Tres Ranchos) Sector C (La Delicia) NT Casi Amenazada (UICN) No identificada Orquiacutedea Nativa Orquiacutedea Endeacutemica

N Coacutedigo Lugar Especie N Coacutedigo Lugar Especie

1 2036 Sector A Stelis sp 26 2046 Sector C Prosthechea vespa2 2038 Sector A Prosthechea sp 27 2071 Sector C Masdevallia sp 3 2040 Sector A Maxillaria sp 28 2073 Sector C Pleurothallis sp 4 2041 Sector A Sobralia sp 29 2074 Sector C Morfoespecie5 2042 Sector A Huntleya sp 30 2076 Sector C Morfoespecie6 2045 Sector A Elleanthus sp 31 2081 Sector C Morfoespecie7 2048 Sector B Morfoespecie 32 2083 Sector C Morfoespecie8 2054 Sector B Pleurothallis sp 33 2084 Sector C Mormodes sp9 2055 Sector B Maxillaria splendens 34 2086 Sector C Lycaste sp

10 2056 Sector B Morfoespecie 35 2087 Sector C Morfoespecie11 2061 Sector B Morfoespecie 36 2088 Sector C Morfoespecie12 2062 Sector B Maxillaria sp 37 2090 Sector C Maxillaria rufescens13 2096 Sector B Epidendrum nocturna 38 2091 Sector C Maxillaria sp14 2063 Sector C Maxillaria sp 39 2093 Sector C Mormodes sp 15 2066 Sector C Brassia arcuigera 40 2094 Sector C Epidendrum sp16 2067 Sector C Stelis sp 41 2116 Sector C Pleurothallis sp17 2097 Sector C Epidendrum sp 42 2118 Sector C Morfoespecie18 2098 Sector C Maxillaria sp 43 2119 Sector C Morfoespecie19 2103 Sector C Cyclopogon sp 44 2122 Sector C Morfoespecie20 2104 Sector C Maxillaria sp 45 2153 Sector C Morfoespecie21 2106 Sector C Huntleya sp 46 2127 Sector C Rodriguezia batemanii22 2107 Sector C Epidendrum sp 47 2128 Sector C Rodriguezia sp23 2108 Sector C Maxillaria sp 48 2131 Sector C Sobralia rosea24 2113 Sector C Epidendrum sp 49 2151 Sector C Sievekingia marsupialis NT25 2117 Sector C Stelis sp 50 2152 Sector C Maxillaria aff Guareimensis

Tabla 2 Especies colectadas y caacutepsulas cosechadas en invernadero

SECTOR Especies Colectadas Caacutepsulas Cosechadas

Sector A (Copal) 6 2Sector B (Tres Ranchos) 7 1

Sector C (La Delicia) 37 13TOTAL 50 16 (32 )

34 Prueba de viabilidad por especie

Mediante la prueba de Tetrazolium 1 se obtu-vo los siguientes valores de viabilidad para lasespecies Sobralia rosea 90 Sievekingia marsupialis90 (Figura 6) Maxillaria rufescens y Epidendrum sp175

Una observacioacuten importante al comparar resul-tados entre la prueba de viabilidad y germinacioacutencomo mencionan Rao et al (2007) la viabilidad nodebe ser confundida con la capacidad germinativade hecho las semillas viables en dormancia no ne-

cesariamente germinan Pero en este ensayo pudi-mos observar que todas las muestras viables germi-naron


El rendimiento de los medios de cultivo para ger-minacioacuten de semillas de orquiacutedeas en el sistema invitro fue T4 - 97 T1 - 89 T2 - 71 T3 - 69 yT5 - 64 De acuerdo al test de Dunkan con un error



Marco Cerna et al

de 005 se establecioacute dos grupos con diferencias sig-nificativas entre los tratamientos el grupo A con losTratamiento 4 y 1 y en el grupo B los tratamientos 23 y 5 Esto nos indica que el T4 medio MampS con car-

boacuten activado y T1 medio MampS son los medios oacutepti-mos para germinacioacuten de las semillas de las especiesestudiadas (Figura 7) Los resultados por especie semuestran en la Tabla 3

33 Pruebas de Almacenamiento

Despueacutes de tres meses de almacenamiento de semillas de doce morfo especies de orquiacutedeas (Figura 5) se midioacute su viabilidad con la prueba de Tetrazolium al 1 y se determinoacute un promedio del 90 de viabilidad para el tratamiento 1 en el sistema de almacenamiento a 4ordmC en obscuridad y un 80 de viabilidad para el tratamiento 2 en el sistema de almacenamiento a 22degC con luz ambiental

Figura 5 Semillas almacenadas en tubos vacuntainers Foto Caacuterdenas y Cruz 2012

34 Prueba de Viabilidad por especie

Mediante la prueba de Tetrazolium 1 se obtuvo los siguientes valores de viabilidad para las especies Sobralia rosea 90 Sievekingia marsupialis 90 (Figura 6) Maxillaria rufescens y Epidendrum sp1 75

Figura 6 Semilla tentildeida de rojo positivo tetrazolium Sievekingia marsupialis

Una observacioacuten importante al comparar resultados entre la prueba de viabilidad y germinacioacuten como mencionan Rao y otros (2007) la viabilidad no debe ser confundida con la capacidad germinativa de hecho las semillas viables en dormancia no necesariamente germinan Pero en este ensayo pudimos observar que todas las muestras viables germinaron














El rendimiento de los medios de cultivo para germinacioacuten de semillas de orquiacutedeas en el sistema in vitro fue T4 ndash 97 T1 - 89 T2 ndash 71 T3 ndash 69 y T5 ndash 64 De acuerdo al test de Dunkan con un error de 005 se establecioacute dos grupos con diferencias significativas entre los tratamientos el grupo A con los Tratamiento 4 y 1 y en el grupo B los tratamientos 2 3 y 5 Esto nos indica que el T4 medio MampS con carboacuten activado y T1 medio MampS son los medios oacuteptimos para germinacioacuten de las semillas de las especies estudiadas (Figura 7) Los resultados por especie se muestran en la Tabla 3

Figura 7 Medios oacuteptimos de germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas a) MampS+CA (T4) b) en MampS (T1)

Tabla 3 Tratamientos oacuteptimos para germinacioacuten de semillas in vitro por especie

Coacutedigo Especie Medios oacuteptimos de germinacioacuten in vitro

2131 Sobralia rosea T4 T2 y T1

2113 Epidendrum sp 1 T4 T2 y T1

2151 Sievekingia marsupialis T1 y T4

2066 Brassia arcuigera T4 y T1

2097 Epidendrum sp 2 T4 y T1

2090 Maxillaria rufescens T4 y T2




2131 Sobralia rosea T4 T2 y T12113 Epidendrum sp 1 T4 T2 y T12151 Sievekingia marsupialis T1 y T42066 Brassia arcuigera T4 y T12097 Epidendrum sp 2 T4 y T12090 Maxillaria rufescens T4 y T2

Durante la evaluacioacuten de medios de germina-cioacuten in vitro por especie se determinoacute que emplearmedios con carboacuten activado mostraron una tasa degerminacioacuten maacutes alta en comparacioacuten a los trata-mientos sin carboacuten activado Estos resultados coin-ciden con lo propuesto por Margara (1988) Por otraparte concordando con Borges et al (2008) el am-biente oscuro que produce el carboacuten activado tien-de a aparentar condiciones naturales para la germi-nacioacuten de las semillas de orquiacutedeas colabora con laformacioacuten de la clorofila y adsorbe los compuestostoacutexicos

4 Conclusiones y recomendacio-nes

En la zona de estudio se pudo colectar 50 individuoscorrespondientes a 24 morfo-especies pertenecien-tes a 15 geacuteneros de orquiacutedeas en las especies identi-ficadas encontramos a Sievekingia marsupialis espe-cie endeacutemica registrada como Casi Amenazada bajola categorizacioacuten de la UICN ademaacutes no estaacute regis-trada en el sistema nacional de aacutereas protegidas porlo cual se recomienda hacer un estudio de la distri-

bucioacuten de la poblacioacuten en un sistema de informa-cioacuten geograacutefica con el fin de establecer las variacio-nes que se daraacuten en la zona en el futuro y establecersitios en los que se debe priorizar la conservacioacuten

En este estudio se obtuvieron semillas con unpromedio del 85 de viabilidad despueacutes de ser al-macenadas por tres meses en tubos de ensayo al va-ciacuteo (vacutainers) a 4C con 6-10 de humedad rela-tiva (HR) y en condiciones de oscuridad El protoco-lo ideal para determinar la viabilidad de las semillases el de tetrazolium al 1 este dato se pudo corro-borar con los datos experimentales obtenidos en lagerminacioacuten de semillas in-vitro

Los medios oacuteptimos para germinacioacuten in vitro delas semillas de orquiacutedeas en estudio son T4 Mu-rashigeampSkoog + 1 carboacuten activado y T1 Muras-higeampSkoog mientras que los mejores tratamientospara germinacioacuten in vitro por especie fueron ParaSobralia rosea y Epidendrum sp (T4) (T2) y (T1) paraSievekingia marsupialis Brassia arcuigera Epidendrumsp 2 (T1) y (T4) para Maxillaria rufescens (T4) y (T2)

Con la base desarrollada en este trabajo pode-mos iniciar los estudios para determinar los mejo-res protocolos para conservacioacuten a mediano y largoplazo de semillas y embriones ademaacutes es necesario



Marco Cerna et al

la identificacioacuten de los medios de cultivo in vitro pa-ra el desarrollo y mantenimiento de embriones De-bido al nuacutemero elevado de especies con diferentescaracteriacutesticas de adaptacioacuten no es posible aplicarlos resultados de esta investigacioacuten a todas las espe-cies de cada geacutenero y menos a nivel de familia peroconstituyen la liacutenea base para elaborar el protocolopara las demaacutes especies Recalcamos la importanciade tener un banco geneacutetico fundamentado en la po-sibilidad de guardar material que en la naturalezapuede desaparecer y de esta manera incrementar lasposibilidades de conservacioacuten de las especies

5 Agradecimientos

Agradecemos a la Universidad Politeacutecnica Salesia-na quien financioacute el proyecto a traveacutes de los fondospara investigacioacuten bajo el Proyecto ldquoBanco de Ger-moplasma de especies de Orquiacutedeas Endeacutemicas delEcuador fase 1rdquo Al Centro de Investigacioacuten y Valo-racioacuten de la Biodiversidad CIVABI de la Universi-dad Politeacutecnica Salesiana por toda su cooperacioacutenAl Ministerio del Ambiente (MAE) especialmenteal Zootecnista Viacutector Leoacuten por su asistencia teacutecnicay administrativa Ademaacutes Al Sr Gil Cabrera la SraLeonor Tenesaca al Sr Jorge Caacuterdenas la Sra Cla-ra Rodriacuteguez y a la Lcda Paulina Valdivieso por suayuda en los trabajos de coleccioacuten mantenimientoe identificacioacuten de las especies en el campo y en elinvernadero

Referencias

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Tropicos Tropicosorg missouri botanical gardenURL 〈httpwwwtropicosorg〉 consultado 10junio 2012



Marco Cerna et al

Anexos

Anexo 1 Aacuterea de estudio para la coleccioacuten de las especies

Aacuterea de estudio para la coleccioacuten de las especies

La zona de estudio se presenta en la Figura 8 Se establecieron tres sectores para la coleccioacuten de especies

El sector A corresponde a Copal (2o 40rsquo 57rsquorsquoS - 78o 24rsquo00rsquorsquoO) tiene una altura de 1407 msnm es un bosque secundario con abundante vegetacioacuten arbustiva y epiacutefita Presencia constante de deslizamientos y derrumbes debidos a fallas geoloacutegicas activas

El sector B pertenece a Tres Ranchos (2o 44rsquo 34rsquorsquoS - 78o 25rsquo 05rsquorsquo O) a una altura de 963 msnm es un bosque secundario con abundantes arbustos y abundante vegetacioacuten epiacutefita con huellas de extraccioacuten de madera

El sector C La Delicia (02o 44rsquo 46rsquorsquoS - 78o 19rsquo 06rsquorsquoO) con una altura de 644 msnm es un bosque secundario con arbustos y vegetacioacuten epiacutefita con aacutereas pobladas

Figura 8 Ubicacioacuten de las zonas de estudio en el Cantoacuten Santiago de Meacutendez (Codeso 2007)


El sector A corresponde a Copal (2o 40rsquo 57rdquoS - 78o 24rsquo00rdquoO) tiene una altura de 1 407 msnm es unbosque secundario con abundante vegetacioacuten arbustiva y epiacutefita Presencia constante de deslizamientos yderrumbes debidos a fallas geoloacutegicas activas




El sector B pertenece a Tres Ranchos (2 44rsquo 34rdquoS - 78 25rsquo 05rdquo O) a una altura de 963 msnm es unbosque secundario con abundantes arbustos y abundante vegetacioacuten epiacutefita con huellas de extraccioacuten demadera

El sector C La Delicia (02 44rsquo 46rdquoS - 78 19rsquo 06rdquoO) con una altura de 644 msnm es un bosque secun-dario con arbustos y vegetacioacuten epiacutefita con aacutereas pobladas

Este sector estaacute modificado por actividades humanas destacaacutendose aacutereas agriacutecolas y ganaderas


Artiacuteculo cientiacutefico Scientific paper

BIOTECNOLOGIacuteA

LA GRANJAREVISTA DE

CIENCIAS DE LA VIDA

DOI 1017163lgrn20201401

COLECCIOacuteN DE GERMOPLASMA DE ESPECIES DE LA FAMILIA

Orchidaceae DEL CANTOacuteN SANTIAGO DE MEacuteNDEZ - MORONA

SANTIAGO ECUADOR

COMPILATION OF Orchidaceae FAMILY SPECIES GERMPLASM IN SANTIAGO DE

MENDEZ MORONA SANTIAGO ECUADOR

Marco Cerna Silvana Caacuterdenas Andrea Cruz e Ivonne Jaacutecome

Centro de Investigacioacuten y Valoracioacuten para la Biodiversidad CIVABI Universidad Politeacutecnica Salesiana Av 12 de Octubre N24-22y Wilson Telf (593-2) 3962800 Quito Ecuador

Autor para correspondencia mcernaupseduec

Manuscrito recibido el 25 de junio de 2013 Aceptado tras revisioacuten el 16 de diciembre de 2014

Resumen

Las amenazas antroacutepicas que reciben diversos haacutebitats de las orquiacutedeas han promovido iniciativas en pro de su conservacioacuten porconsiguiente el almacenamiento de semillas de orquiacutedeas en un banco de germoplasma constituye una herramienta biotecnoloacutegicauacutetil para la conservacioacuten de las especies amenazadas de este grupo taxonoacutemico El presente estudio tuvo dos fases una en campoy otra en laboratorio La recoleccioacuten en campo se realizoacute en tres zonas del cantoacuten Santiago de Meacutendez Copal Tres Ranchos y LaDelicia en la provincia de Morona Santiago Ecuador en un aacuterea total de 600m2 aquiacute se obtuvieron 50 orquiacutedeas de 15 geacutenerosdistintos las mismas que fueron conservadas ex situ en un invernadero en la ciudad de Macas hasta que sus caacutepsulas maduraronPosteriormente en el laboratorio de biotecnologiacutea vegetal de la Universidad Politeacutecnica Salesiana de Quito las semillas se extrajerony desecaron se almacenaron las semillas de 12 especies de orquiacutedeas en tubos vacutainers a traveacutes de dos meacutetodos a) en refrigeracioacutena 4C maacutes oscuridad y b) a temperatura ambiente 20 plusmn2 C maacutes luz Se determinoacute que el primer procedimiento es el mas eficientepara conservar semillasesto se evidencioacute con la prueba de viabilidad de tetrazolium 1 mediante conteo de semillas tinturadas enel microscopio Durante la germinacioacuten asimbioacutetica in vitro se evaluaron cinco tratamientos Murashige amp Skoog MampS (T1) MampS+vitaminas (T2) MampS + auxinas (T3) MampS + carboacuten activado 1 (T4) y Knudson C (T5) se determinoacute que los medios oacuteptimos degerminacioacuten in vitro para todas las especies en estudio fueron (T4) seguido de (T1) Las orquiacutedeas indistintamente del tratamientoque presentaron mayor viabilidad fueron Sobralia rosea (90 ) Sievekingia marsupialis (90 ) Maxillaria rufescens y Epidendrum sp 1(75 )

Palabras claves conservacioacuten ex-situ germoplasma orquiacutedeas germinacioacuten in-vitro viabilidad medio de cultivo



Marco Cerna et al

Abstract







1 Introduccioacuten


















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5 Agradecimientos


Referencias























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Anexos


















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Documents

Redalyc.COLECCIÓN DE GERMOPLASMA DE ESPECIES DE LA