Reemplazar el uso de petróleo

Reducir la generación de CO2

Tecnología simple y eficiente

Extraer y fermentar los azucares presentes en lignocelulosa.

• Alto rendimiento de maíz (OGM).

• Almidón: recuperación y estructura.

• Diseño y producción de enzimas amilolíticas.

• Microorganismos modificados para una fermentación eficiente.

• Recuperación de etanol a través de bioprocesos de alta eficiencia.

• Fuentes alternas de azúcares fermentables: celulosa y hemicelulosas.

El futuro de la industria del bioetanol dependerá de múltiples “biotecnologías” entre otras:

Desarrollo de nuevos biocatalizadores etanologénicos

Embden-Meyerhof-Parnas Entner-Doudoroff Vía de las Pentosas

PIRUVATOTCA

Lactato

Acetato

Acetyl-CoA +

CO2 H2Etanol

PDH (0.4 mM)

LDH (7 mM) PFL (2 mM)

Piruvato Decarboxilasa (0.4mM) (PDC)

Acetaldehído +CO2

Alcohol Deshidrogenasa II

(ADHII)

Zymomonas mobilis

Formato

Etanol

HEXOSAS + PENTOSAS

Características del sustrato

• La celulosa es un polisacárido formado por unidades de glucosa unidas mediante

enlaces β-1,4 glucosídicos.

• La configuración β le permite a la celulosa formar cadenas largas, lineales y paralelas,

unidas entre sí formando una estructura cristalina y organizada.

Principal componente estructural de los vegetales

• La mayor parte de la “fase amorfa” de celulosa corresponde a las cadenas que se

encuentran en la superficie de la estructura mientras que los componentes cristalinos

ocupan el núcleo

CELULASAS

Complejo enzimático que hidroliza los enlaces b- glucosídicos en la celulosa.

Formado por:oendo-β-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4)

(Cx)oexo-β-1,4-glucanasa (celobiohidrolasa EC 3.2.1.19) (C1)

oβ-glucosidasa (celobiasa EC 3.4.1.21) (Cb)

MECANISMO ENZIMÁTICO

1. La endo β-1,4-glucanasa actúa al azar sobre los enlaces β-1,4 glucosídicos de la celulosa de las zonas amorfas y la conviente en oligosacáridos.

endo β-1,4-glucanasa

MECANISMO ENZIMÁTICO

2. La exo β-1,4-glucanasa, o celobiohidrolasa, es una enzima que corta la cadena 1,4 β-D-glucano a partir del extremo no reductor de la molécula de celulosa y de las celodextrinas, lo que provoca la remoción de unidades de celobiosa (2 moléculas de glucosa)

CBH de T. reesei

MECANISMO ENZIMÁTICO

3. La β-glucosidasa o celobiasa rompe el enlace de la molécula de celobiosa, para obtener moléculas de glucosa

celobiasa

• Sinergísticamente después de la endo- actúa la exo β-1,4-glucanasa que corta la cadena a partir del extremo no reductor de la molécula de celulosa, lo que provoca la remoción de unidades de celobiosa.

• Ambas enzimas Endoglucanasa y Exoglucanasa son inhibidas por la celobiosa, lo que disminuye la eficiencia de la hidrólisis.

Una vez degradadas las zonas amorfas de la celulosa, la región cristalina comienza a

ser hidrolizada como resultado de la acción sinergística de la endoglucanasa y la exoglucanasa.

La degradación de la celobiosa a glucosa mediante la acción de la β-1,4-glucosidasa es requrida para desinhibir a las otras enzimas

• La hipótesis C1-Cx se propuso para explicar la acción de las celulasas de hongos en la hidrólisis de la celulosa, en ella se denota a los componentes de la celulasa como C1 (a la CBH) y como Cx (a la EG), también se considera al componente βG (β-glucosidasa), el cual completa la hidrólisis de las cadenas cortas de oligosacáridos a celobiosa y glucosa.

EXOCELULASA:Actúa en el extremo no reductor,

obteniendo glucosas de la cadena de celulosa.

exocelulasa

(1) Transferencia de la mayor parte de las enzimas en fase acuosa a la superficie de las partículas de celulosa.

(2) Adsorción de las enzimas y la formación de complejos enzima-sustrato (ES).

(3) Hidrólisis .

(4) Transferencia de la celulodextrinas, la glucosa y la celobiosa, desde la superficie de las partículas de celulosa a la fase acuosa.

(5) Hidrólisis de celulodextrinas y celobiosa en glucosa en la fase acuosa.

La adsorción de las enzimas y la formación de complejos enzima-sustrato se consideran los pasos críticos en la hidrólisis enzimática de celulosa.

Una vez degradada las zonas amorfas de la celulosa, tiene lugar la hidrólisis de la región cristalina como resultado de la acción sinergística de la endoglucanasa y la exoglucanasa.

Métodos de análisis de actividad enzimática

Papel filtroCantidad de azúcar que se forma en 1 hora cuando 50 mg de papel filtro Whatman #1 se incuba con 0.5 mL de enzima a pH 4.8 (buffer de citratos) en un vol. total de 1.5 mL

Determinación viscosimétricaSoluciones de CMC y Hidroxietilcelulosa (generan alta viscosidad), la adición de celulasas disminuye la viscosidad del medio (actividad con HEC normalizadas)

Actividad sobre celobiosa; Medición de poder reductor. Avicel (micro-partículas cristalinas de celulosa), posee un menor grado de polimerización y una mayor número de extremos libres en comparación con el algodón.

Microorganismos productores de celulasas

• Las enzimas celulasas son producidas por una

variedad de bacterias y hongos.

• Sin embargo, sólo algunos de ellos producen celulasa

extracelular capaz de hidrolizar la celulosa.

Fuentes de celulasas

Trichoderma virideFungales Trichoderma reesei Penicillum koningii

Cellulomonas sp Celvibrio sp. Bacterias Microbispora bispora Therninibispora sp

Aerobios mesófilos fungales

• Trichoderma viride• Trichoderma reesei• Penicillium pinophilum• Sporotrichum pulverulentum• Fusarium solani• Talaromyces emersonii • Trichoderma koningii

Trichoderma viride

Aparecen en cualquier tipo de suelo, produciendo colonias blancas, amarilla o más típicamente verdes cuando se cultivan.

Actividad específica de T.viride con diferentes sustratos

EnzimaActividad específica

(mg/mL*min)CMC Avicel

Endoglucanasa I

17 19.4

Endoglucanasa II

2.5 0.6

Endoglucanasa III

1.2 2.3

Exoglucanasa 1.0 1.7

Propiedades fisicoquímicas de las enzimas

Enzima T. optima

(°C)

pH óptim

o

Carbohidratos (%)

Peso molecular (Da)

Endoglucanasa I

53-58 4.5 20.9 51,000

Endoglucanasa II

58 4.7-5.3

2.3 59,000

Endoglucanasa III

5.0-55 3.5-3.9

10.0 41,000

Exoglucanasa

70 4.9-5.2

5.8 62,000

Método Koji

Otros Mohos y Bacterias productoras

• Sporotrichum thermophile• Neocallimastix frontalis

• Piromonas communis• Cellulomonas sp

• Acetivibrio cellulolyticus• Clostridium thermocellum

• Las celulasas brindan una forma efectiva de degradar tejidos, aunque es mejor si se usa en combinación con otras enzimas hidrolíticas.

• ¿Cuáles?

Preparados enzimáticos comerciales:

• Crystalzyme PML-MX de Valley Research Inc.• Biocellulase A de Quest Intl.• Celluclast 1.5 L de Novo Nordisk.• Econase Ce-S de Enzyme Development Co.• Cellulase AP30K de Amano Enzyme.• Zymafilt L-300 y Macerex de Enmex S.A. de C.V.• Novozym 342 de Novo Industries.• Cellubrix L de Novo Nordisk. • Cellulase de Bio-Cat Inc.

Genencor launches first ever commercial enzyme product for cellulose ethanol Genencor, a division of Danisco A/S, has announced a biomass enzyme developed specifically for second generation biorefineries called Accellerase™ 1000. The product is a mixture of enzymes that reduces complex lignocellulosic biomass into fermentable sugars -- a step in the production of cellulosic ethanol.

Genencor has been developing its biomass enzymes for well over 10 years. The effort was partially supported by contracts with the US Department of Energy’s (DOE) National Renewable Energy Laboratory (NREL).

Commercial interest in second generation biorefineries, driven in part by government policies to reduce the emission of greenhouse gases and increase energy independence, has accelerated over the past two years in the USA and around the world.

“The biofuels industry is at an inflection point with the development of cellulosic ethanol plants at the pilot and demonstration scale,” “Every biorefinery developer needs to know how enzymes will work in their system. This product aims to address that need and to start a dialogue with potential partners about customized solutions and supply at the industrial scale.”

Cellulase enzyme gets GRAS for beverages

05-Oct-2009Related topics: Industry The FDA has raised no objections to Florida-based Dyadic International’s GRAS application for it cellulase enzyme derived from a GM strain of its patented and proprietary C1 organism. A new liquid enzyme product produced from its C1 technology platform called CeluStar CL will be immediately offered for sale for use in the production of wine, beer and fruit juices, said the company. “Receiving this positive acknowledgement from the FDA regarding our GRAS notification culminates a multi-year product development process and affirms Dyadic's conclusion that its cellulase enzyme is safe for use by our customers. Dyadic intends to continue to utilize its C1 technology platform for the development of additional specialty enzyme products,” said Richard Jundzil, Dyadic's director of development & quality. The GRAS notice is number: GRN 000292.

Extracción de jugo

• En la extracción de jugo con preparados enzimáticos se incrementa el rendimiento y la calidad del jugo, así como la diversidad de componentes.

• El pretratamiento de la pulpa con enzimas provoca un aumento en el contenido de los sólidos solubles comparado con una muestra testigo (sin enzima)

• La ventaja de la maceración enzimática radica en que las enzimas rompan la pared de las células, provocando así un ablandamiento del tejido y facilitando la extracción.

• Se facilita por tanto la extracción del jugo durante el procesamiento industrial, además de que permite mejorar la palatabilidad del jugo.

MACERACION ENZIMATICA

Extracción de leche de coco

• La degradación enzimática con el preparado Trizyme P50 de Triton Chemicals ha mostrado

una extracción total de la leche de coco.

• Los azúcares, principalmente la glucosa que es producto de la degradación de los

polisacáridos, permitió obtener una leche de coco con un mejor sabor, debido a que le

imparten mayor dulzura a la leche.

Extracción de aceites

• El rendimiento del aceite de aguacate aumenta hasta un 30 % después de someter la pulpa de aguacate a un proceso de extracción acuosa enzimática con los preparados comerciales Ultra-SP-L y Olivex.

• En las soya también se ve un aumento de la cantidad de aceite extraído cuando se trata enzimáticamente pasando de un 82.2% a un 99% de extracción.

COST ANALYSIS OF ENZYME PROGRAME ASSUMPTIONS

• Genencor CytolaseTM104@ $22.00/Kg• Extra Virgin Olive Oil value is about $5.30/L• Virgin Olive Oil value is about $4.00/L• Olive Oil yield without enzymes is typically 125 L/1000 Kg of olives.

% Oil Yield Increase Requiered to

Justify Enzyme Use

DosajeEnzyme %

Aprox. EnzymeCost/1000 Kg Olives

ExtraVirginOil

VirginOil

0.1 $22 3.3 4.40.2 $44 6.7 8.90.5 $110 16.7 22.2

• Desarrollo de tecnología para la obtención de biocombustibles , bioetanol, a partir de residuos celulósicos (bagazo, paja, papel, etc)

POTENCIAL EN BIOCOMBUSTIBLES

Iogen, an enzymes producer that operates the world's only cellulose ethanol facility. The plant, in Ontario, has the capacity to make 3 million to 4 million L of ethanol per year by breaking down and fermenting about 40 tons per day of wheat, oat, and barley straw with steam, enzymes, and yeast.

In 2004, Iogen became the first company to produce large quantities of cellulosic ethanol, about 1 million gal per year from wheat straw, at a demonstration plant in Ottawa. Iogen has plans to begin construction in 2007, either in the U.S. or in Canada, on a commercial-scale plant that will produce 40 million gal per year of cellulosic ethanol. Iogen also has partnered with Volkswagen and Royal Dutch/Shell to explore cellulosic ethanol production in Germany.

Bush's latest speech promoting the inclusion of $150 million in next year's federal budget for research into new ways of making ethanol.

Extra development work has brought about a significant reduction in the enzyme cost of ethanol production using corn stover, in Novozymes' case from more than $5.00 per gal to between 10 and 18 cents per gal.

The new energy law includes a federal renewable fuels standard that requires 7.5 billion gal per year of ethanol be blended with gasoline by 2012. Currently, about 12 billion gal of ethanol is produced worldwide and about 4 billion gal in the U.S., nearly all of it made from cornstarch. Overall, the global bioethanol market is expected to grow to nearly 30 billion gal annually by 2020, according to the Renewable Fuels Association.

Composition and proporties of marigold petal carotenoids

Carotenoid

52.1

31.2

6.3

89.6

10.4

0.46

0.45

0.10

------

474 505

474 505

475 506

-----

% Rf-valuea Visible absorptionin CS2, nm

Lutein dipalmitate

Lutein dimyristate

Lutein monoesters

Total

Unknowns (by difference)

Production of colorants from Marigold Flowers

Cultivation ofmarigold plants

Harvesting of Marigold flowersSilage

Pressingdrying

Cell dryerDry flowers

MillingMarigold meal

PelletingHexane extraction

Oleoresin

Hidrolysis PurificationStabilization & Stabilization &

Poultry Products Human ConsumptionProducts

• Overall extraction yield 95%

• Enzyme requeriments as a function of flower freshness

• (higher dosis to avoid silage)

• Optimization of type, concentration, addition mode and reaction

conditions (temperature) of the enzyme system.

• Preincubation

• Relation Hexane/mass of flowers

• Control of water concentration

• Succesive extractions

• Type of agitation

• Higher concentration of Xantophylls in oleoresin

• Higher yields and less extraction steps

• Avoid contamination during silage