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Reflexiones sobre la gestión de conocimiento y los sistemas de producción ovina y caprina en

Colombia

ARTÍCULO DE REFLEXIÓN

Oscar Ospina1, Alexandra Montoya2, Iván Montoya3, Henry Grajales4

1,Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.

2,Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia. 3,Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.

4,Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.

[email protected]

(Recibido: 3 de Octubre de 2014 Aprobado: 29 de Enero 2015 Actualizado: 25 de junio de 2015)

DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.1

RESUMEN: El crecimiento ondulante en el inventario y sostenido en el consumo per cápita del ovino-caprino en Colombia, crea la oportunidad y/o necesidad de aprovechar no solo las ventajas comparativas, sino también el impulsar la generación de ventajas competitivas que lleven a la ovinocultura y la caprinocultura dentro del camino de la competitividad y la globalización, aprovechando las oportunidades en el mercado nacional y de exportación. El eficaz aprovechamiento de las ventajas comparativas y la generación de ventajas competitivas implican la incorporación de los datos, la información y el conocimiento como factores de producción dentro de un proceso ordenado, bajo el marco de un sistema de “Gestión del Conocimiento”. El presente trabajo aborda una reflexión acerca de los aportes que se podrían dar desde la teoría general de sistemas, la matriz de creación del conocimiento, la epistemología evolucionaria y la cibernética del conocimiento a la conceptualización de un sistema de Gestión del Conocimiento para ovinos y caprinos.

Palabras clave: epistemología, conocimiento, pequeños rumiantes

Reflections on knowledge management and sheep and goat production systems in Colombia

ABSTRACT: The undulant growth in the inventory and the sustained growth in the per capita sheep and goat consumption in Colombia, creates the opportunity and/or the need to take the most not only of the comparative advantages, but also take the chance to promote

Veterinaria y Zootecnía ISSN 2011-5415 Vol 8 No.2, julio - diciembre de 2014

©Universidad de Caldas 1

the generation of competitive advantages that take sheep and goat breeding in the way of competitiveness and globalization, taking advantage of the opportunities in the domestic and export markets. The efficient use of comparative advantages and the generation of competitive advantages involve incorporation of data, information and knowledge as factors of production within an orderly process under the framework of a “Knowledge Management” system. This work addresses a reflection on the contributions that could emerge from the general systems theory, the matrix of knowledge creation, evolutionary epistemology and knowledge cybernetics for the conceptualization of a Knowledge Management System for sheep and goats breeding.

Key words: epistemology, knowledge, small ruminants

Introducción

Los sistemas de producción de ovinos y caprinos en Colombia han crecido de manera significativa en los últimos años produciendo animales para consumo nacional y exportación (Castellanos et al., 2010; Ospina et al., 2011; Vega et al., 2014). De manera general se produce con poca intervención humana, las ovejas y las cabras son casi silvestres, llevando a que sea la naturaleza y su capacidad la que en gran medida sostenga la actividad, generando productos con poco control, baja productividad y pobre calidad (Nonaka & Toyama, 2003; Castellanos et al., 2010; Moreno & Grajales, 2014).

La cultura ganadera tradicional, aunada con el pobre nivel de información y el escaso conocimiento explícito utilizado en los procesos productivos, hace que la manera de trabajar de los ovinocultores y caprinocultores se fundamente en la tradición oral, mitos y leyendas, que llevan a tener ganaderías con bajos niveles de organización, alto nivel de improvisación, inadecuado desarrollo y apropiación de tecnologías, poca o nula planeación, bajos niveles de desempeño y mínimas oportunidades de un crecimiento planificado y consciente hacia el mercado, los gremios y el Estado, quedando relegados a la fuerza de las modas, del capricho de los ciclos biológicos y sin las bondades de las “ventajas competitivas”, desatendiendo las oportunidades presentes en el mercado interno y externo (Morales & Pech, 2000; Nonaka, 2000; Montuschi, 2001; Senge, 2005; Castellanos et al., 2010; Ospina et al., 2011; Moreno & Grajales, 2014; Vega et al., 2014).

La gestión del conocimiento es una disciplina de la gestión que busca tener impacto en el procesamiento del conocimiento, tiene como propósito incrementar la potencialidad de una organización para ejecutarlo y de esta forma mejorar la calidad de sus conductas, del procesamiento organizacional y la habilidad para adaptarse al ambiente (Rodríguez & Dante, 2008).


©Universidad de Caldas Veterinaria y Zootecnía. 2014; 8(2): 01-14

El objetivo del presente trabajo es abordar las bases conceptuales que tendría un sistema de gestión del conocimiento para granjas ovinas y caprinas, como herramienta de generación de ventajas competitivas en Colombia. Se avanza sobre elementos de la matriz de creación del conocimiento, la teoría de los tres mundos de la epistemología evolucionaria, el ciclo observación, orientación, decisión y acción –OODA– de la cibernética del conocimiento y la teoría general de sistemas.

Planteamiento del problema

En los trabajos hechos por el Instituto Colombiano Agropecuario –ICA– y la Agencia Alemana de Cooperación Técnica Internacional –GTZ–, se señala la escasa información existente y el insuficiente conocimiento productivo y reproductivo que hay de la ovinocultura y la caprinocultura (Gall & Reule, 1989). Siguen vigentes los planteamientos que hacía la FAO para América Latina en 1989, en donde se planteaba que esta zona se encuentra lejos de utilizar de manera óptima los recursos naturales primarios y es por eso que aún existe un gran margen para incrementar la productividad en la mayoría de los sistemas de producción pecuarios, pero esto depende de factores más relacionados con los humanos que con los animales, en donde están el individualismo, el nivel de educación y cultura. Asimismo, se encuentra una correlación positiva entre el nivel de manejo de conocimientos del productor y la factibilidad de optimizar el funcionamiento de un sistema pecuario (Castellanos & Arellano, 1989; Moreno & Grajales, 2014).

Los sistemas de producción de ovinos y caprinos en Colombia, producen animales para consumo nacional y para exportación (Antillas Holandesas), con apenas ventajas comparativas, con una producción que se realiza bajo un manejo tradicional, sin mucha inversión, tecnología y desarrollo empresarial (Espinel & Martínez, 2006; Moreno & Grajales, 2014; Vega et al., 2014). Los mismos están constituidos por granjas con diferentes niveles tecnológicos, aunque predomina el nivel bajo, que se caracteriza por su escaso nivel sanitario, bajos parámetros reproductivos, falta de asistencia técnica y de gestión, todo esto redundando en menores rendimientos del rebaño, detrimento en la calidad de los animales y su productividad (Castellanos et al., 2010; Moreno & Grajales, 2014).

La agenda de investigación y desarrollo tecnológico para la cadena cárnica ovino caprina 2010 del Ministerio de Agricultura (Castellanos et al., 2010;, , define para Colombia que los objetivos de crecimiento y desarrollo del sector agrícola dependen de una mayor inserción en los mercados internacionales y de la ampliación del mercado interno. Estos objetivos están relacionados con el incremento de la competitividad de la producción nacional, que es consecuencia no solo de las ventajas comparativas que provee la naturaleza, sino también de la capacidad de introducción constante de conocimiento y de nuevas tecnologías que



lleven a la generación de ventajas competitivas (Ospina et al., 2011) y su aseguramiento mediante la incorporación de Buenas Prácticas Ganaderas –BPG– (Grajales & Afanador, 2014; Vega et al., 2014).

La pegunta de reflexión de este trabajo es: ¿Cómo se podría diseñar un sistema de gestión del conocimiento para hacer más competitivo a los sectores ovino y caprino colombianos?

Marco teórico

Teoría General de Sistemas –TGS–

La TGS plantea que los sistemas transforman las corrientes de entrada o insumos, en corrientes de salida o productos, mediante el proceso de conversión. El proceso genera desorden y pérdidas de energía o entropía, la pérdida de energía en el sistema es contrarrestada mediante la neguentropía, que es la fuerza contraria a la entropía. La neguentropía es la cantidad de información necesaria para organizar un sistema. En los sistemas, la información es generada por un componente especializado que se denomina subsistemas de control o de retroalimentación negativa, que son la base para el desarrollo de los sistemas de información (Bertalanffy, 1950; Johansen, 2004).

Teoría de la información

En el universo suceden eventos en el espacio del tiempo que al ser representados mediante signos o símbolos se convierten en datos, estos datos al ser procesados por métodos estadísticos se convierten en información. La información es la regularidad observada en un fenómeno que se puede medir mediante bites; cuando un conjunto de bites de información se interrelacionan en una estructura que tiene lógica racional y se aplica en un contexto se produce conocimiento; cuando este conocimiento se utiliza en una realidad que afecta la producción de bienes o servicios dentro de una organización, se convierte en tecnología (Bellinger, 1997; Martín, 2007; Frías, 2009).

Esta característica de la información cumple la ley de los incrementos en la cual, en la medida en que la información se interrelaciona, se amplifica y lleva a que mediante la transformación de datos a conocimiento se genere aún más información (Johansen, 2004).

Sistemas de producción ovina y caprina

Desde la perspectiva de la teoría general de sistemas, se entiende a una ganadería ovina o caprina como un proceso de transformación de energía solar, desde pasto a carne, lana y/o leche para el consumo humano, pasando sucesivamente por los subsistemas: nutrición, alimentación, población, reproducción, producción, y economía (Figura

1) (Aguilera, 1989; Sánchez & Reinés, 2001; Machado & Campos, 2008).



Este proceso de transformación de la energía genera entropía o pérdida de energía, que en los sistemas ovinos o caprinos, según la teoría del diezmo, del 100% de la energía que se captura en forma de vegetales el 1% se convierte en energía en forma de carne, leche y/o lana disponible para consumo humano (Aguilera, 1989; Sánchez & Reinés, 2001; Machado & Campos, 2008). El sistema tiene una entropía o pérdidas de energía del 99%; para controlar o disminuir esta entropía es necesario que el sistema genere neguentropía, lo que se logra fundamentalmente a través de la información (Johansen, 2004).

La información en un sistema de producción (ovina o caprina) está presente en dos formas: la primera, producto de la evolución, se encuentra almacenada en nucleótidos –ADN– (Parker & Walker, 2010); la segunda, producto de la observación empírica o científica que se encuentra almacenada en el sistema de gestión de conocimiento formal o informal con el que el sistema trabaje (Marcos, 1991).

En este contexto, se podría abordar el conocimiento desde la perspectiva de su origen, naturaleza y potencial uso en los sistemas de producción, entrando en el terreno de la epistemología, la economía y la administración.

Epistemología

La comprensión moderna del conocimiento propone la identificación de dos dimensiones, la epistemológica y la ontológica. La epistemológica, a su vez, indica que el conocimiento es de dos tipos: conocimiento tácito y conocimiento explícito; el primero, producto de la experiencia cotidiana, transmitido por tradición oral, mitos y leyendas, de generación en generación, es un conocimiento que no tiene un origen formal; el segundo, el explícito, es el que se ha documentado y puede ser combinado, analizado, validado y socializado; este conocimiento generalmente es de origen formal o generado mediante un método sistemático o científico (Nonaka, 1994; Ospina et al., 2011).



Desde el punto de vista de la dimensión ontológico, se plantea que el conocimiento se puede generar a nivel de individuo, grupo, organización e ínter-organizaciones (Nonaka, 1994).

La creación de conocimiento se da cuando se combina el conocimiento tácito con el explícito, siguiendo la matriz de creación de conocimiento (Nonaka, 1994) (Figura 2). En la creación de conocimiento, según el modelo de Nonaka. (1999), se “socializa” cuando se pasa el conocimiento de tácito a tácito, esto sucede cuando el conocimiento pasa de una persona a otra de manera verbal o espontanea; se “externaliza” cuando el conocimiento pasa de tácito a explícito, es decir, se documenta el conocimiento tácito dentro de un método o modelo sistemático; se “combina” cuando el conocimiento explícito se mezcla o sinergisa con otro conocimiento explícito y se obtiene como resultado un nuevo producto más evolucionado; se “interioriza” cuando el conocimiento explícito se lleva de nuevo a tácito y éste se incorpora al proceso normal de análisis y toma de decisiones, dando origen a la matriz de creación del conocimiento que al cerrar el ciclo y volver a comenzar avanza sobre el siguiente ser ontológico dando origen a la espiral de creación de conocimiento en las organizaciones (Figura 2).

Ventajas competitivas

Desde el punto de vista de la economía, el conocimiento y la capacidad de crearlo y utilizarlo, son consideradas la más importantes fuentes de firmes y sostenibles ventajas competitivas (Nonaka & Toyama, 2003). En este sentido, Senge (2005) plantea que la única fuente de ventaja competitiva sostenida está en la capacidad de la organización de aprender más rápido que la competencia. En una organización, la capacidad de construir conocimiento es el generador de ventajas competitivas (Senge, 2005).

El paradigma de la gestión del conocimiento plantea a los activos intangibles de las empresas como generadores de ventajas competitivas y la planeación del conocimiento en función de ésta (Senge, 2005).



Gestión del conocimiento

La gestión del conocimiento es una disciplina de la gestión que busca tener impacto en el procesamiento del conocimiento, tiene como propósito incrementar la potencialidad de una organización para ejecutarlo y de esta forma mejorar la calidad de sus conductas, del procesamiento organizacional y la habilidad para adaptarse al ambiente (Rodríguez & Ponjuán, 2008) y, por supuesto, con miras a mejorar la competitividad de las organizaciones.

Se identifican dos grandes etapas en la gestión del conocimiento, la primera se dio a principios de los años noventa, en ella se entendía el conocimiento como un inventario estático que ofrecía fortalezas para hacer competitiva a la organización. En esa etapa, se pensaba en un inventario de conocimiento como activo estratégico, que se deja disponible mediante un sistema de información o de gestión documental, que conecta a la cadena de producción o ejecución de un proyecto (Danskin et al., 2005; Morales & Varas, 2007). La segunda etapa se da después de mediados de los noventa, en ésta se entiende a la empresa o proyecto como una “organización que aprende”, que crea conocimiento para generar ventajas competitivas que le permitan adaptarse al entorno (Rodríguez & Ponjuán, 2008).

Gestión del conocimiento y las metáforas biológicas

Las metáforas biológicas aplican conceptos de la biología a la administración y la economía (Martínez, 2004). En la gestión del conocimiento, el punto de vista de la naturaleza biológica del conocimiento al entenderlo como una “organización que aprende”, provee las bases para tomar conceptos: autopoiésis, cibernética del conocimiento y epistemología evolucionaria.

Autopoiésis: Para que un sistema complejo sea considerado autopoiético (autosostenible en el tiempo) requiere cumplir 6 características clave (Hall, 2005):

• El sistema tiene componentes identificables pertenecientes a él y diferenciables del entorno. • Los componentes identificados realizan algún proceso dentro del sistema. • El sistema es dinámico, tiene interacciones y procesos. • El proceso mantiene la integridad del sistema. • El sistema de manera intrínseca produce sus propios componentes. • El sistema es autónomo.

La autopoiésis implica que el sistema es autosostenible, se adapta y evoluciona según las condiciones del entorno. El conocimiento tácito está inmerso en el sistema, en la granja, en las rutinas conectadas que producen las salidas de productos (corderos, lana, leche, etc.), está



inmerso en las palabras y modismos propios del sistema y su gente (ovinovultura o caprinocultura), que le va sumando conocimiento en el transcurrir del tiempo. El conocimiento explícito está codificado y distribuido por los procesos en una variada documentación física (registros), conformando la herencia o la memoria de la organización. En una organización que aprende, el proceso cognitivo incrementa el nivel o valor del conocimiento a través del tiempo. Una organización que aprende necesita adaptarse a cambios impredecibles en un ambiente competitivo (Hall, 2005).

Epistemología evolucionaria: En la epistemología evolucionaria propuesta por Popper se tienen 4 elementos guía (Popper, 1978, 1999; Hall, 2005):

• Todo organismo está constantemente envuelto en problemas de existencia y resolviéndolos. • Todo problema resuelto proviene de un proceso de ensayo y error. • Se eliminan formas no satisfactorias como en la selección natural. • Hay un P1 que es el problema inicial y un P2 que es la solución propuesta.

Se plantea la existencia de tres mundos. El primer mundo corresponde a aquel donde están los procesos de transformación de insumos a productos, lo rige la bioquímica, la física y/o el metabolismo, busca persistir en el tiempo. El segundo mundo corresponde al plano del conocimiento tácito con el que la organización entiende el mundo que la rodea. El tercer mundo corresponde al conocimiento explícito que se da en dos formas: como herencia codificada en el ADN y como el contenido lógico almacenado en los sistemas de información, los libros, documentos, etc. En la medida en que el conocimiento explícito explica al primer mundo y éste puede ser utilizado por el segundo mundo, el del tácito, el conocimiento es válido y se incrementa o si no, muere y se desecha. Solo aquel conocimiento que genera resultados positivos sobrevive (Popper, 1978, 1999; Hall, 2005).

Cibernética de una organización que aprende Ciclo OODA: El conocimiento puede entonces verse como crítico para que un individuo u organización sea competitivo y sobreviva, para que esto se logre el conocimiento cumple un ciclo cibernético de cuatro pasos OODA, como se muestra en la Figura 3 (Boyd, 1996; Hall, 2005):

• Observación: Corresponde a la información que recoge la organización del entorno, incluye fuentes externas de información, paradigmas, resultados de acciones previas. • Orientación: Determina la dirección para hacer evolucionar la organización, incluye procesos cognitivos complejos. En esta fase desde el entorno se afecta al



conocimiento tácito, la historia del conocimiento, las rutinas, la cultura y tradición, se hace la selección de entradas, incluye procesos de recolección, análisis, síntesis de conocimiento. La memoria y la historia del conocimiento pueden cambiar por acción del conocimiento explícito, que también determina la orientación de la organización. • Decisión: Corresponde a la hipótesis escogida o el plan de acción a ejecutar. • Acción: Ejecución de las decisiones en respuesta a los controles y limitaciones internas y externas. Los elementos del Ciclo OODA identifican de manera sistemática los elementos que conforman el proceso que realiza el conocimiento dentro de una organización, permitiendo identificar puntos sobre los cuales hacer mediciones sobre el proceso del mismo.

Reflexión

Al Integrar en un solo modelo los conceptos de la teoría de sistemas, los sistemas de producción ovinos o caprinos, la matriz de creación del conocimiento, la teoría de los tres mundos y el Ciclo OODA, se tiene:

Según la teoría general de sistemas, se entiende a una ganadería ovina o caprina como un proceso de transformación de energía solar desde pasto a carne, lana y/o leche como productos para el consumo humano. Este proceso de transformación de energía genera entropía o pérdida de energía, que en un sistema de producción, según la teoría del diezmo, del 100% de la energía que se atrapa en forma de vegetales el 1% se convierte en energía en forma de carne, leche y/o lana disponible para consumo humano. El proceso del sistema genera una entropía natural o una pérdida de energía estimada en un 99%. Si se quisiera controlar o disminuir esta entropía y aumentar la productividad del sistema, es necesario que este genere neguentropía, lo que se logra a través de la incorporación de información. La información en un sistema de producción ovina o caprina está presente en dos formas; la primera, producto de la evolución, se encuentra almacenada en el ADN; la segunda, se encuentra en el sistema administrativo formal o informal que direccione la granja. El sistema administrativo para su funcionamiento utiliza conocimiento, que a su vez es de dos tipos:



tácito y explícito; el tácito es el producto de la tradición oral, mitos y leyendas y la experiencia personal; el explícito es el conocimiento escrito, formal, producido por un método sistemático. La generación de ventajas competitivas se da a partir de la incorporación de conocimiento explícito a los procesos de producción de las granjas. De manera natural, las granjas ovinas o caprinas, basan la toma de decisiones sobre el conocimiento tácito, que corresponde a la tradición oral, mitos y leyendas que llegan a través de miembros de la comunidad, colegas o familiares cercanos, más la experiencia del productor, conformando la cultura ovina o caprina que rige a la granja, con poca o nula incorporación de conocimiento explícito. Esta situación hace que el nivel de conocimiento formal sea limitado, dando paso a que las ventajas comparativas sean las relevantes al momento de enfrentar el mercado. Si se quiere generar ventajas competitivas, es necesario que el sistema incorpore conocimiento explícito mediante la utilización de la matriz de creación del conocimiento, que mediante sus cuatro pasos: socialización, exteriorización, combinación e interiorización, permite la incorporación del conocimiento explícito al tácito, subir el nivel de conocimiento formal en la granja que lleve a una acertada y ordenada toma de decisiones, que permitan aumentar la neguentropía, controlar el sistema de producción, disminuir la entropía e incrementar el nivel de productividad del sistema.

La fuente de las estadísticas, que dan soporte al conocimiento explícito, se deben generar mediante un sistema de información que, midiendo los subsistemas de la granja, provee elementos para incorporar a la matriz de creación de conocimiento (Figura 4).



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Propuesta sistema de gestión del conocimiento

Se parte de identificar los tres mundos de la teoría evolucionaria del conocimiento de la siguiente manera: el primer mundo es donde está la granja, el segundo mundo es donde está el productor y su conocimiento tácito, el tercer mundo es donde están los sistemas de información, la asistencia técnica y los investigadores. Se incorpora conocimiento explícito, al tácito, cuando se pone en marcha la matriz de creación del conocimiento que incorpora conocimiento desde el tercer mundo, al segundo mundo. El segundo mundo pone a prueba el nuevo conocimiento cuando entra a modificar el primer mundo. El cambio generado o el efecto del nuevo conocimiento, es evaluado por el tercer mundo mediante el Ciclo OODA (observación, orientación, decisión y acción), validando o desechando el conocimiento, generado en un proceso cibernético del conocimiento, que puede construir conocimiento útil en un proceso autónomo.



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Determinación de parámetros cinéticos de Lactobacillus casei en dos medios probióticos1

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Henry Jurado-Gámez2, 3, Fredy Calpa-Yamá3, Aura Chaspuengal-Tulcán3

1,Financiado por la Vicerrectoría de Posgrados y Relaciones Internacionales (VIPRI), Universidad de Nariño, Pasto, Colombia.

2,Programa de Zootecnia, Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño, Pasto,

Colombia. 3,Grupo de investigación en Procesos Biotecnológicos Aplicados a la

Producción Animal - Fisiología y Etología Animal (PROBIOTEC-FISE), Pasto, Colombia.

[email protected]

(Recibido: 2 de Mayo de 2014 Aprobado: 21 de Agosto de 2014 Actualizado: 25 de junio de 2015)

DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.2

RESUMEN: El objetivo de la presente investigación fue evaluar las mejores condiciones de la cinética de fermentación de Lactobacillus casei en dos medios probióticos (MRS y Pro). En cada medio se evaluó el máximo crecimiento en relación con producción de biomasa, conteo de microorganismos viables en placa (UFC/ml), determinación de pH, consumo de azúcares totales (mg/L) y producción de ácido láctico (%). Se usó un diseño de bloques al azar con dos tratamientos (medios Pro y MRS), 11 bloques correspondientes a los tiempos de evaluación y 2 réplicas por cada uno. La prueba se efectuó cada 2:24 horas durante un día; se obtuvo la fase exponencial de crecimiento (UFC/ml) al tiempo 7 (16:48 horas) y tiempo 6 (14:24 horas) de la cinética, alcanzando valores de 3,0 x 1011 y 7,3 x 108 UFC/ml respectivamente, y una concentración de proteínas de 46,95 g/L y 45,83 g/L para el tiempo 7 y 6 respectivamente. Los resultados estadísticos no encontraron diferencias estadísticas significativas (P>0,05). La prueba por HPLC indicó que las cepas de L. casei eran homofermentivas, presentando una producción de ácido láctico superior al 80%. En la muestra P (L. casei), el pico No. 9 (tr –tiempo de retención– = 12,1 min), presenta un tiempo de retención similar al del pico No. 2 del estándar de calibración, por lo que posiblemente el péptido de esta muestra presente una cadena de aminoácidos compuesta por VAL-TIR-VAL (PM = 379,5). El pico No. 3 del estándar, que corresponde al péptido metionina enkefalina acetato, de composición (TIR-GLI-GLI-FA-MET) M6638 (PM = 573,7 para la base libre), presenta un tiempo de retención similar al del pico No. 12 de la muestra



P (L. casei). Los valores en los dos medios indican ser adecuados para la preparación de inóculos probióticos.

Palabras clave: bacteria, biomasa, salud, fermentación

Determination of kinetic parameters of Lactobacilluscasei in two probiotics media

ABSTRACT: The objective of this investigation was to evaluate the best conditions of the kinetic fermentation of Lactobacillus casei in two probiotic media (MRS and Pro). In each media maximal growth related to biomass production, counting of viable microorganisms in plaque (CFU/ml), determination of pH, total sugar consumption (mg/L) and lactic acid production (%) was evaluated. A randomized blocks design with two treatments (media Pro and MRS), eleven blocks corresponding to the time of the evaluation and 2 replicas for each one, was used. The test was carried out every 2:24 hours during one day; the exponential phase of growth (CFU/ml) was obtained at period 7 (16:48 hours) and period 6 (14:24 hours) of kinetics, reaching values of 3.0 x 1011 and 7.3 x 108 CFU/ml respectively, and a protein concentration of 46.95g/L and 45.83g/L for the period 7 and 6 respectively. Statistical results did not show significant differences (P>0.05). The HPL C test indicated that L. casei strains were homofermentative presenting a lactic acid production higher than 80%. In sample P (L.casei), peak No. 9 (rt– retention time–= 12.1min), has a similar retention time to the peak No 2 from the calibration standard, reason why possibly, the peptides of this sample show an amino acids chain composed of VAL-TIR-VAL (MW =379.5). The peak No. 3, of the standard which corresponds to the peptide methionine enkephalin acetate, composition (TIR-GLY-GLY-FA-MET) M6638 (MW = 573.7 for the free base) has a retention time similar to that of peak No. 12 from sample P (L.casei). The values in the two media indicate they are suitable for the preparation of inoculum probiotic.

Key words: bacterium, biomass, health, fermentation

Introducción

Lactobacillus casei es una bacteria ácido-láctica que posee el estatus de Generalmente Reconocida como Segura (GRAS), además, de catalogarse como probiótico; este último corresponde al cultivo de microorganismos vivos (bacterias, hongos y levaduras) que actúan directa o indirectamente sobre bacterias patógenas Gram-negativas en el tubo digestivo, actuando por competición física o de nutrientes, por secreción de bacteriocinas, producción de ácidos o por inmunidad cruzada (Susamo & Ocampo, 2006). La importancia de su uso en la alimentación de animales de granja se basa en las propiedades que se



les atribuyen para mejorar la eficiencia de conversión alimenticia y como promotores del crecimiento (Rosmini et al., 2004).

Lactobacillus casei ha sido ampliamente estudiada y utilizada en la industria en procesos de fermentación a partir de varios sustratos como harinas, leche, carnes, conservas. Este microorganismo se encuentra de forma natural en vegetales fermentados, leche, carne, intestino, boca y ambiente (Collins et al., 1989). En estudios previos se ha reportado el uso de L. casei para la fermentación de suero de leche y la optimización en la producción de biomasa a partir de este sustrato (Ruales & Vallejo, 2007). Estudios in vivo e in vitro sobre sustratos como suero de leche han demostrado su capacidad probiótica al aprovechar los nutrientes y generar productos o metabolitos de interés (Escobar, 2008).

La investigación tuvo como objetivos: evaluar las mejores condiciones de la cinética de fermentación de Lactobacillus casei en un medio probiótico comparado con el comercial MRS; y determinar el máximo crecimiento de microorganismos viables en placa (UFC/ml, expresado como la fase logarítmica de crecimiento), determinar el consumo de azúcares totales, pH y producción de ácido láctico en los periodos evaluados.

Materiales y Métodos

El presente estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología y el Laboratorio especializado de la sección de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de Nariño (Torobajo) ubicado en la ciudad de Pasto, Nariño. En la investigación se utilizó Lactobacillus casei, una cepa de referencia ATCC® 334™* de colección American Type Culture Collection, obtenida de un laboratorio reconocido.

La reconstitución de la cepa se hizo en base a agar nutritivo (Nutrient Agar) marca Oxoid CM0003 de 500 g, elaborado por Oxoid Ltd (Basingstoke, Hampshire, England). A las 24 horas se realizó la reconstitución de la cepa de acuerdo a las instrucciones para microorganismos KWIK-STIK™. Inmediatamente después, se verificó su crecimiento y se repicó en agar MRS comercial, incubándose por 24 horas a 35°C. Este procedimiento se realizó en cámara de flujo laminar tipo II, para evitar contaminación del medio. Enseguida, se verificó el crecimiento, morfología (macroscópica y microscópica) y la pureza mediante tinción de Gram. Para la conservación de la cepa, se realizó repique cada cinco días en medio sólido (agar MRS) y cada ocho días en medio líquido (caldo MRS), estos preservados se incubaron por 20-24 horas a 35-37°C y se almacenaron refrigerados en nevera a 4°C. Asimismo, cada vez que se realizó un nuevo repique o siembra se confirmó su pureza mediante tinción de Gram.

Posterior a este procedimiento, se inoculó una alícuota con la cepa en un Erlenmeyer que contenía 40 ml de caldo MRS comercial estéril. La incubación tuvo un tiempo de 24 horas a 37°C. Terminado este periodo



se realizó un repique de 4 ml y se colocó en otros 40 ml de caldo MRS con las condiciones mencionadas anteriormente.

El porcentaje de inóculo fue ajustado a un 10% v/v al inicio de la fermentación (Crueger & Crueger, 1993), esto se logró preparando 90 ml de caldo MRS, en el cual se adicionaron 10 ml del inóculo probiótico con aplicación de la regla. Después se calculó el número de bacterias por ml.

Se tomó 1 ml del caldo comercial MRS para realizar una lectura directa en espectrofotómetro a 625 nm, se adicionó caldo estéril cuando la población encontrada fue mayor a la establecida; esto se realizó a través del cálculo matemático propuesto por Guerrero (apud Montes et al., 2003).

Para ello se realizó el siguiente cálculo:

Se tomó como M1 a la población o densidad celular que se debe ajustar, M2 como la densidad utilizada en la primera fermentación (0,125 densidad óptica equivalente a 1,50 x 108 bact/ml), V1 es 1 ml proveniente del inóculo total (10/90), X1 fue la cantidad que contenía M2, V2 es el valor que se agrega a 1 ml, para ajustar a 1,50 x 108 bact/ml, V3 equivale a 100 ml de inóculo total, X2 cantidad de caldo MRS comercial estéril que se agrega a V3 para ajustar la población al valor de M2.

Se utilizaron dos medios de cultivo, medio MRS comercial y medio Pro (Tabla 1).



La cinética de fermentación se efectuó en un Erlenmeyer con 600 ml del medio y la bacteria probiótica ajustada (540 ml del medio y 60 ml del inóculo) a 32°C, en agitación constante en incubadora shaker a 100 rpm a 32°C.

La técnica de conteo en placa propicia la información del número de células viables durante el proceso en términos de UFC/ml, permitiendo determinar la evolución de la producción de biomasa. Las medidas por peso seco y turbidimetría no se efectuaron debido una elevada cantidad de sólidos en suspensión del medio de cultivo. Se diluyó 1 ml de muestra en 9 ml de agua peptonada al 0,1%, para realizar los conteos. Luego se hicieron diluciones decimales en las cuales se sembraron 100 µl en cajas de Petri con MRS más azul de anilina. Estas cajas fueron incubadas a 32°C y se observaron entre las 24 y las 48 horas. Únicamente fueron consideradas las cajas que presentaron conteos de 30 a 300 UFC/ml observadas durante el periodo de 24 a 48 horas; el número de colonias encontradas se multiplicó por el inverso de la disolución y por 10 con el fin de obtener su valor en UFC/ml formadas (LANARA, 1981), finalmente fueron trabajadas en transformación a logaritmo natural para los análisis estadísticos.

La evolución del pH se valoró mediante la medición con un pHmetro digital Jenco® Vision Plus (San Diego, California, Norte América).

La determinación de azúcares se realizó por el método de Dubois (Antrona), para ello se preparó previamente una curva patrón con diversas concentraciones de la solución usada como patrón (Figura 1). Los resultados de la lectura de densidad óptica fueron graficados contra la concentración en mg/L, para obtener la ecuación de la recta. Obtenidas las muestras de los diferentes tiempos de la cinética se procedió a realizar las lecturas de absorbancia a las muestras en espectrofotómetro a 625 nm, y se procedió a aplicar la fórmula despejando los valores de X para cada tiempo, teniendo en cuenta que se trabajó en base a una dilución de 1/100 y 1/1000 para MRS y Pro, respectivamente.



La determinación de proteínas se realizó por el método de Lowry modificado. Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu para dar un complejo color azul. La intensidad del color depende del número de aminoácidos presentes y enlaces peptídicos y cambiará según la clase de proteína; la solución azul muestra una absorbancia máxima a 750 nm. Rango de linealidad entre 0-300 mg/L.

Procedimiento: Se ajustó 1 ml de patrones de la curva estándar y muestras por duplicado, enseguida se adicionó 0,5 ml de NaOH 2 N a todos los tubos, se colocó en baño María a temperatura de ebullición durante 10 minutos. Se dejó reposar en baño de agua fría, para adicionar 0,5 ml de H2SO4 2,6 N. A continuación se adicionó 0,9 ml de solución A y se llevó por 10 minutos a baño María a 50°C, luego se dejó reposar en baño de agua fría; después se adicionó 0,1 ml de solución B y se colocó por 10 minutos en la oscuridad, para finalmente adicionar 3 ml de la solución C.

Reactivos:

Solución A: Diluir 0,5 g de tartrato de sodio y potasio, 25 g de carbonato de sodio, 125 ml de hidróxido de sodio 1 N en 125 ml de agua destilada.

Solución B: Diluir 2 g de tartrato de sodio y potasio, 1 g de sulfato de cobre en 10 ml de hidróxido de sodio 1 N.

Solución C: Preparar una solución de agua destilada y reactivo de Folin-Ciocalteu en proporción 14:1 (preparar al momento de usar).

Solución estándar de seroalbúmina bovina: Disolver 15 mg en 50 ml de agua destilada, el resto se almacena en congelador (concentración final 300 mg/L).



La determinación de producción de ácido láctico se realizó aplicando el método de titulación con hidróxido de sodio 0,1 N.

Los resultados obtenidos permitieron determinar si la cepa resulta ser la más adecuada en términos tiempo-tasa de crecimiento durante el proceso de fermentación para establecer el tiempo de duración en la producción de biomasa.

Los cálculos de fermentación para las cinéticas se definieron de acuerdo con Crueger & Crueger (1993) y Rodríguez et al. (2003). Siendo la velocidad específica de crecimiento definida por la ecuación:

El tiempo de duplicación celular:

El análisis de producción de ácidos orgánicos se realizó por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), permitiendo caracterizar las bacterias en homo o heterofermentativas, estableciendo un perfil característico para cada especie (Brizuela, 2003), descartando fácilmente cepas con perfiles idénticos. El caldo de crecimiento se centrifugó a 8500 rpm, filtrando el sobrenadante por membrana de 0,45 micras. Los ácidos orgánicos fueron determinados por HPLC así: solvente de fase móvil, ácido sulfúrico a pH 1,5; presión 800-900 PSI; volumen inyectado: 20 L; temperatura del horno: 65ºC; columna BIORAD Aminex HPX87 H con soporte de resina trasplantada H+ (copolímero de estireno y bisulfato de divinilbenzeno).

Para la identificación de los péptidos posibles presentes en el sobrenadante de L. casei, la muestra para análisis de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) se preparó de la siguiente forma:

• La cepa se cultivó en caldo MRS por 24 horas a 32°C, posteriormente se ajustó por espectrofotometría a una densidad óptica 0,125 en escala McFarland patrón 0,5 equivalente a una concentración de 1,5 x 108 bacterias/ml. • Se trasfirieron muestras en tubos Eppendorf y se centrifugaron a 18000 rpm, durante 30 minutos a 4°C. • El sobrenadante se filtró utilizando membranas PVDF de 0,2 micras y se llevó a lectura.



Las condiciones del análisis fueron las siguientes:

Equipo: Cromatógrafo Líquido HPLC Waters – Bomba Binaria 1525. Columna: C18 300A (Jupiter, Phenomenex 150 mm x 4,6 mm). Detector: PDA 2998 a 214 y 280 nm Scan (200-350 nm). Inyector: Rheodyne Loop de 20 μL. Fase móvil: Modo de separación gradiente. Composición: A (Agua: TFA 0,1%) B (Agua: Acetonitrilo: TFA, 0,1%).

Para el conteo de microorganismos viables en placa UFC/ml obtenidos durante la cinética de fermentación se adoptó un diseño en bloques al azar (DBA) dado el número de datos utilizados, los medios se consideraron como los dos tratamientos y las horas de evaluación correspondieron a los bloques (11 tiempos), se evaluó el comportamiento desde el tiempo 0 (cero horas), hasta el tiempo 11 (24 horas); se consideraron dos réplicas para cada medio y tiempo.

Para analizar pH, consumo de azúcar total (mg/L) y % de ácido láctico resultado de la cinética, se aplicó un análisis de regresión tomando como variable dependiente las UFC/ml formadas; el modelo usado fue el siguiente:

Los datos obtenidos se analizaron en SAS 9.1.3 versión 2007 y fueron sometidos a un análisis de varianza ANDEVA y prueba de significancia de Tukey para comparar variaciones que resulten estadísticamente significativas (P<0,05) (Solarte et al., 2009).

Resultados y Discusión

En la Figura 2 se observa el crecimiento de la cepa probiótica cada 2:24 horas durante 24 horas en 11 tiempos de evaluación. El medio Pro alcanza su fase exponencial más rápido que el medio MRS, con una caída después de las 14:24 horas de iniciado el proceso.



El máximo crecimiento (UFC/ml) para L. casei en los medios MRS y Pro, se obtuvo al tiempo 7 (16:48 horas) y tiempo 6 (14:24 horas) de la cinética, es decir, al alcanzar la fase exponencial de crecimiento, con valores de 7,3 x 108 UFC/ml y de 3,0 x 1011 UFC/ml respectivamente, mostrándose así una mayor ventaja con 2:24 horas anticipadas para el medio Pro, respuesta positiva ya que se facilita la generación de inóculos probióticos con menor tiempo y menores costos de producción (Tabla 2). La concentración de proteínas fue de 46,95 g/L y 45,83 g/L para el tiempo 7 y 6 respectivamente. Posteriormente se presenta una disminución de estos parámetros.

Estos resultados son importantes por cuanto indican que la formación de la biomasa por parte de L. casei en los dos medios (MRS y Pro) en los dos tiempos de mayor crecimiento hacen que presenten un adecuado consumo de proteínas, y así el medio Pro puede ser adecuado para el desarrollo de este microorganismo en la fase exponencial. De igual manera, al comparar estos resultados se puede observar que no se evidenciaron diferencias estadísticamente significativas (P>0,05) entre los efectos de los medios Pro y MRS.

De igual manera, se permite observar que no se presentaron diferencias estadísticamente significativas (P>0,05) entre los medios de cultivo, no obstante, al considerar los periodos de evaluación tomando diferentes tiempos, estadísticamente sí existe diferencia entre las horas de evaluación (P<0,05), de esta manera el efecto producido por el tiempo fue bloqueado y permitió un mejor análisis de los tratamientos. El error estándar no fue considerado dentro del análisis estadístico ya que el R cuadrado alcanzó un valor considerablemente alto (73%).



Finalmente, el análisis de ANOVA revela que los dos tipos de medios no presentan diferencias estadísticas significativas (P>0,05), por consiguiente, ambos pueden ser usados como medio de cultivo en laboratorio, aunque a favor del medio Pro se debe considerar su mayor producción de biomasa y menor costo de producción para la elaboración de inóculos probióticos en futuros estudios para el suministro a animales in vivo.

De esta manera, los valores obtenidos en la prueba expresan ser adecuados para ser utilizados en la preparación de inóculos con propiedades probióticas, ya que al alcanzar poblaciones elevadas permitirá hacer una competencia frente al microorganismo patógeno, facilitando la colonización del tracto gastrointestinal (Zamudio & Zabaleta, 2003).

Con la cinética efectuada se determinó tiempo requerido para obtener el máximo crecimiento microbiano en los medios MRS y Pro, siendo de 16:48 horas (tiempo 7) y 14:24 horas (tiempo 6) respectivamente. Estos resultados tienen relación con los encontrados por Ramírez (2005), en un medio similar a base de azúcar blanco, leche de soya, suero de leche y salvado de trigo con un cultivo de una cepa probiótica asilada de un probiótico comercial, la cual alcanzó el máximo crecimiento a las 15 horas (tiempo 5) del proceso con 6,2 x 1011 UFC/ml. Asimismo, Montes et al. (2003) indicaron que en la fermentación por 12 horas en medio elaborado a base de melaza y leche en polvo con cultivo de Lactobacillus casei subsp. rhamnosus se presentó el pico máximo de crecimiento de la bacteria en el tiempo 10 (11 horas), determinándose así el tiempo de cosecha con una biomasa de 9,3 x 1011 UFC/ml. Finalmente, se debe tener en cuenta que la curva de cinética de fermentación dependerá de los siguientes factores: tipo de cepa probiótica, tiempo y periodos de evaluación, medio y condiciones de cultivo.

Para que se presenten efectos beneficiosos, los Lactobacillus deben sobrevivir y adherirse a la pared del tubo digestivo en número suficiente, como indican los resultados de la viabilidad (UFC/ml) para L. casei, y que al mismo tiempo le permitirán una eficiente colonización en la mucosa intestinal. Uno de los criterios de selección más importantes para determinar qué microorganismos serán utilizados como potenciales probióticos, es la habilidad de adherirse a la mucosa



intestinal debido a que es un prerrequisito para poder colonizar el intestino (León, 2012).

Los estudios de medios y condiciones de cultivo que permitan la obtención de altas concentraciones de microorganismos (>107 UFC/ml), han sido el objetivo fundamental cuando se trabaja con bacterias ácido-lácticas, como microorganismos iniciadores y como aditivos probióticos para aumentar el valor nutritivo de los productos. De esta forma, la biomasa de estos microorganismos ha adquirido un mayor valor y una mayor demanda. Infortunadamente, los métodos de cultivo industrial de probióticos se caracterizan por sufrir de la inhibición del crecimiento celular debido a la producción de ácido láctico, un producto primario de su metabolismo (Mack et al., 2003).

En este sentido es difícil proponer una cantidad precisada, ya que depende de la normatividad y legislación de cada país, pero se ha propuesto que deben contar con una población mínima de 106 UFC/ml, mientras que Ouwehand et al. (2002) y otros autores denotan que debe tener la cantidad necesaria para que se ingiera 109 UFC/ml.

En la Figura 3 se observa cómo en la fase exponencial hay mayor producción de biomasa a pH de 5,94 y 6,01 en el medio MRS y Pro respectivamente, y finaliza con valores de 5,74 y 5,57 a las 24 horas de la cinética.

Los Lactobacillus como microorganismos acidúricos, pueden crecer a pH inferiores a 5 (Kandler & Weiss, 1986). Estudios revelan cómo diferentes pH influyen sobre el crecimiento de L. casei, encontrando que la bacteria probiótica no crece adecuadamente cuando es inoculada en un medio de cultivo a pH de 5, comparada con otros pH de 6 y 7 en donde hubo un mayor crecimiento (García & Jerez, 2004).




Los valores de pH encontrados en los tiempos de cinética favorecen los procesos de fermentación, en la producción de inóculos; entre las cepas que soportan pH de 2,5 se encuentran Lactobacillus casei (ATCC 27139, FAGRO 98, FAGRO 98LP) y Lactobacillus rhamnosus (FAGRO 36,5 y FAGRO 53,1), indicando que son capaces de sobrevivir al ambiente del tracto gastrointestinal, no son afectadas por pH ácidos y a concentraciones altas de sales biliares (León, 2012). Por lo anterior, estas cepas serían capaces de soportar la acidez que se presenta en el estómago de especies como el cuy y el cerdo (alrededor de 4,0), siendo uno de los principales obstáculos para el paso a través del tracto gastrointestinal.

La evolución del pH fue relacionado con el incremento en cada unidad Ln UFC/ml mediante análisis de regresión, siendo el pH la variable independiente que presenta un valor de B1, -0,32244 en el medio MRS y de -0,15537 en el medio Pro, lo que significa que por cada unidad logarítmica del crecimiento de colonia el pH disminuye en -0,32244 y -0,15537 unidades de pH para cada medio, notándose una mayor caída del pH en el medio Pro.



El consumo de azúcares totales presentó valores de 4,36 mg/L y 33,48 mg/L para los medios MRS y Pro respectivamente, a las 16:48 horas y 14:24 horas de efectuada la cinética, respectivamente (Figura 4).

Mediante el análisis de regresión se relacionó el consumo de azúcares totales y la formación de UFC/ml hasta la fase logarítmica de crecimiento a través del tiempo durante el proceso fermentativo. La pendiente de la recta (B1, -0,4355) en el medio MRS indica que, en promedio a cada incremento de una unidad logarítmica de UFC/ml, se consume el azúcar total en 0,4355 mg/L; igualmente sucede en el medio Pro que presenta un valor de B1, -1,228, significa que 1,228 mg/L de azúcar son consumidos por cada unidad Ln UFC/ml.

Comparando los dos valores de las variables independientes, se considera que el consumo de azúcar es menor en MRS, que en el medio probiótico, donde la concentración de azúcares es más significativa dadas las condiciones de las materias primas utilizadas, permitiéndole a los microorganismos contar con una mayor cantidad de nutrientes, sin que estos lleguen a ser un factor limitante para su crecimiento.




Según Jurado (2009) y Ramírez et al. (2011), las BAL (bacterias ácido lácticas) requieren para su multiplicación de azúcares como lactosa y glucosa, además de aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento; no obstante, la leche constituye un medio especial y satisfactorio para la proliferación de este tipo de bacterias, mientras la mayoría de las especies necesitan además varios aminoácidos (Parra, 2010) y vitaminas del grupo B (lactoflavina, tiamina, biotina, ácido nicotínico, ácido pantotéico, ácido fólico).

En general, para que L. casei se implante y colonice dentro del tracto del animal, es indispensable que disponga de una dieta rica en sustratos prebióticos, algunos de estos son de naturaleza lignocelulósica (oligosacáridos, fructooligosacáridos, fibra, cereales), derivados de la lactosa (galactooligosacáridos, lactulosa, lactitol), inulina entre otros; para este caso, la función como prebiótico la cumple el salvado de trigo (fibra insoluble) (Jurado, 2009).

La leche de soya es una buena fuente de hidratos de carbono, principalmente sacarosa, rafinosa y estaquiosa, así como proteínas y magnesio; durante la fermentación, más del 60% del contenido inicial de estaquiosa, rafinosa y sacarosa en la leche de soya se metaboliza por las bacterias. El azúcar es otra fuente importante de carbono, que favorece la producción de energía y la producción del ácido láctico.

Los medios MRS y Pro presentaron 0,36% y 0,71% de ácido láctico al tiempo 7 y 6, respectivamente. Los resultados valorados mediante el método de titulación se muestran en la Figura 5.




La producción de ácido láctico se ve reflejada como producto de la fermentación de azúcares por BAL, y es considerado un metabolito generado por ciertos microorganismos y es clasificado como GRAS (generalmente reconocido como seguro) para su empleo como aditivo alimenticio por la FDA (Administración de Drogas y Alimentos) (Parra, 2010). La producción de ácido láctico se da a partir de la fermentación de las hexosas a ácido láctico por la vía Embden-Meyerhof (Samaniego & Sosa, 2012). Además, el potencial de la producción de ácido láctico así como peróxido de hidrógeno y bacteriocinas principalmente de las cepas probióticas se ve reflejado por su papel bactericida, su acción se da por atacar el metabolismo de las bacterias patógenas o atacar sus estructuras como, por ejemplo, la membrana citoplasmática (González et al., 2003).

La producción de ácido láctico fue valorada mediante análisis de regresión, determinando el efecto del ácido láctico sobre el número de colonias, la variación positiva de 0,03846 % de ácido láctico incrementa en una unidad Ln UFC/ml para MRS. En el medio Pro los resultados fueron similares, por cada incremento en una unidad de Ln UFC/ml la acidez se incrementa en 0,01929%, un estado muy favorable debido al hecho de que durante la cinética tal evento marca cierta



diferencia para establecer el punto exacto para la cosecha del cultivo probiótico.

La prueba por HPLC indicó que las cepas de L. casei eran homofermentivas, presentando una producción de ácido láctico superior al 80% (Tabla 4), el cual podría contribuir a disminuir el pH del medio y actuar como inhibidor de microorganismos patógenos (Ramírez, 2005). El 20% restante se evidenció que correspondía a ácido cítrico, ácido succínico, ácido acético y etanol (Tabla 3).

La identificación tentativa de los péptidos se realizó por análisis de los picos de los espectros UV integrados por el sistema de detección de PDA. Se utiliza como una mezcla de referencia estándar de péptido (Sigma H2016) utilizado en las mismas condiciones (Tabla 4 y Figura 6a).

Los resultados reportados para el análisis de las muestras, con el uso de HPLC (espectro UV 214 nm), se observan en la Tabla 5.



En la muestra P (L. casei), el pico No. 9 (tr = 12,1 min) presenta un tiempo de retención similar al del pico No. 2 del estándar de calibración, por lo que posiblemente el péptido de esta muestra presente una cadena de aminoácidos compuesta por VAL-TIR-VAL (PM = 379,5). Los espectros UV presentan longitudes similares de máxima absorción.

El pico No. 3 del estándar, que corresponde al péptido metionina enkefalina acetato, de composición (TIR-GLI-GLI-FA-MET)M6638 (PM =573,7 para la base libre), presenta un tiempo de retención similar al del pico No. 12 de la muestra P (L. casei). Los máximos de absorbancia de los espectros presentan longitudes de máxima absorción muy cercanas, sin que se evidencie una diferencia marcada.




Los resultados de la producción de biomasa relacionada con distintos factores aparecen en la Tabla 6.

De acuerdo a los resultados obtenidos en la cinética, el medio Pro resultó ser el más adecuado, alcanzó el valor mayor de μh-1, y por lo tanto el tiempo de duplicación celular es menor, lo que se ve reflejado al haber alcanzado una mayor concentración celular en la fase logarítmica a las 14:24 horas. Como se puede observar en los resultados encontrados, el medio MRS presenta desventajas debido a que presentaría un tiempo de duplicación celular muy elevado y esto implica que al llegar a la fase logarítmica la concentración celular será mucho menor, con respecto al medio Pro.

Por otro lado, se deben tener en cuenta los costos de producción, ya que estos son de gran interés en el proceso de producción a nivel industrial



en la elaboración de inóculos. De acuerdo con Jurado (2009), el costo de 500 g del medio MRS es aproximadamente $210.000 (USD 108,46), y el costo de elaboración de un litro de este medio comercial es $27.142,86 (USD 14,02); comparado con el medio Pro elaborado con azúcar blanco, leche de soya, salvado de trigo y leche en polvo el costo por litro del medio probiótico asciende a únicamente a $2.775 (USD 1,42).

El tiempo requerido para alcanzar la fase logarítmica en los medios MRS y Pro, fue a las 16:48 horas (tiempo 7) y 14:24 horas (tiempo 6) respectivamente. El crecimiento bacteriano expresado como UFC/ml demostró valores de 7,3 x 108 UFC/ml para MRS y 3,0 x 1011 UFC/ml para Pro. Los valores obtenidos en los dos medios indican ser adecuados para ser utilizados en la preparación de inóculos con propiedades probióticas, que posteriormente podrían ser utilizados en ensayos in vivo en especies de gran importancia zootécnica como los son cuyes, cerdos y aves, que ayudarían a obtener una mejoría en la producción y salud animal.

Agradecimientos

Al personal de los Laboratorios Especializados y Laboratorio de Microbiología de Ciencias Pecuarias de la Universidad de Nariño, y a todas las personas que de una u otra manera colaboraron en el desarrollo del proyecto.


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Clasificación fenomenológica de las crisis epilépticas en caninos

SHORT ARTICLE

Lina Maria Delgado-Garcia1, 2, Sergio Eduardo Linares-Villalba2

1,Departamento de Clínica Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinária y Zootecnia. UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil.

2,Grupo de Investigación CIENVET, Facultad de CienciasAgropecuarias, Universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia.

[email protected]

(Recibido: 07 de Septiembre de 2014 Aprobado: 06 de Abril de 2015 Actualizado: 07 de julio de 2015)

DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.3

RESUMEN: El estudio de las crisis epilépticas en caninos es relevante en investigación, ya que son un modelo natural de epilepsia, como en clínica de pequeños animales, debido a su alta frecuencia en el atendimiento neurológico. Este trabajo adaptó el apéndice “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva” en la clínica de pacientes caninos con crisis epiléptica para clasificar su fenomenología y reconocer una zona sintomatogénica. El análisis de la fenomenología y la zona sintomatogénica sugieren que caninos con crisis epiléptica presentan áreas cerebrales sensibles de generar actividad neuronal anormal, específicamente; la alta frecuencia del grupo fenomenológico Motor definió una localización en el lóbulo parietal-frontal.

Palabras clave: epilepsia, ictus, semiología, sintomatología, zona sintomatogénica

Phenomenological classification of epileptic seizures in dogs

ABSTRACT: The study of canine seizure is relevant in research as a natural model of epilepsy in small animal clinic, because of its high frequency in the neurology service. This work adapted the “Ictal Phenomenology. Glossary of Descriptive Ictal Terminology” appendix in the clinic of canine patients with epileptic crisis to classify its phenomenology and recognize a symptomatology zone. The Phenomenology and the symptomatology zone analysis suggest that canines in epileptic crisis present brain areas sensible of generating abnormal neuronal activity, specifically; the high frequency of the phenomenological motor group defined a parietal-frontal lobe localization.

Key words: epilepsy, ictus, semiology, symptomatology zone, symptomatology



Introducción

Las crisis epilépticas son comunes en humanos, caninos y felinos (Berendt,1999; Berendt et al.,2004; Chandler, 2006; Pákozdy et al., 2010; Thomas, 2010; Lorenz et al., 2011).El estudio de las crisis epilépticas en caninos es relevante en investigación, ya que son un modelo natural de epilepsia (Potschka et al., 2013), como en clínica de pequeños animales, debido a su alta frecuencia en el atendimiento neurológico (Moore, 2013).Según la Liga Internacional contra la Epilepsia (ILAE) las crisis epilépticas o ictus son una manifestación transitoria de signos y/o síntomas debido a una actividad neuronal anormal excesiva o sincrónica en el cerebro (Blume-Chair et al., 2001; Berg et al., 2010; Fisher et al., 2010); siendo una convulsión un término legal, no especifico y de uso inapropiado, para describir una crisis epiléptica (Blume-Chair et al., 2001).

Históricamente, el primer documento conocido sobre epilepsia y crisis epiléptica es la Clasificación Internacional de la ILAE, de Merlis (1970), el cual tuvo en cuenta aspectos clínicos básicos; posteriormente, fue divulgada la clasificación World Health Organization (WHO, 1987; 1994) basada en la descripción de la sintomatología ictal y paralelamente la Clasificación de las Crisis Epilépticas(Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy, 1981) y la Clasificación de las Epilepsias y Síndromes Epilépticos(Commision on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy,1989) concerniente, primariamente, a síndromes. En 1997, tras una amplia revisión de los documentos anteriores, la comisión de la ILAE creó un esquema diagnóstico constituido por apéndices que incluyó terminología y conceptos estandarizados para describir pacientes con epilepsia y crisis epilépticas (Engel, 2001), facilitando el abordaje clínico para determinar los estudios diagnósticos y las estrategias terapéuticas a ser tomadas (Engel, 2001,2006).

El apéndice “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva” es usado actualmente para describir crisis epilépticas (Blume-Chair et al., 2001; Engel, 2001; Berg et al., 2010). En medicina veterinaria es apenas reportado en estudios de carácter descriptivo (Berendt,1999; Berendt et al., 2004), siendo aún desconocido para la mayoría de los clínicos veterinarios de pequeños animales.

La zona sintomatogénica es el área de la corteza cerebral que una vez activada por una descarga epileptiforme produce síntomas ictales o crisis epilépticas siendo detectada a través del análisis de la sintomatología o fenomenología ictal, el histórico de las crisis o el análisis de registros de video (Rosenow & Luders, 2001).Los trabajos de Acharya et al. (1997) y Hammer et al. (1999) en niños con epilepsia fueron pioneros en detectar la zona sintomagénica a través de la sintomatología ictal, así sugirieron relaciones entre síntomas y zona sintomagénica que actualmente son aplicadas, la figura 1 muestra un esquema de sus principales hallazgos. Con el objetivo de difundir esta terminología y demostrar una aplicación práctica en la clínica de pequeños animales, este trabajo adaptó el apéndice “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva” en la clínica de pacientes caninos con crisis epiléptica para clasificar su fenomenología y reconocer una zona sintomatogénica.




Fueron seleccionados los registros clínicos de 31 pacientes caninos sin distinción de raza, sexo o edad con anamnesis de crisis epiléptica atendidos en el Hospital Veterinario Diego Villegas Toro, de la Universidad de Caldas, durante el periodo 2009-2011.Para cada registro se adoptó el documento “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Descriptiva”(tabla 1), considerando aquellos comportamientos que pueden ser observados en pacientes veterinarios se relacionó la sintomatología descrita en la anamnesis con los conceptos para fenomenología Motor, No motor y Autonómica, así como su zona sintomatogénica(tabla 2).





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Análisis estadístico

Se realizó análisis de frecuencia y probabilidad para la fenomenología de las crisis epilépticas y la zona sintomatogénica.




La figura 2 muestra el análisis de la fenomenología de las crisis epilépticas, el grupo Motor está presente en todas las crisis, con alta frecuencia y probabilidad para todos los grupos fenomenológicos y de la asociación Motor, No Motor y Autonómico. La figura 3 muestra el análisis de la zona sintomatogénica, se destacó que el lóbulo parietal estuvo presente en todas las crisis con alta frecuencia y probabilidad del lóbulo frontal contralateral.



Fueron estudiados los registros de 31 pacientes caninos con anamnesis de crisis epiléptica (tabla 2), para cada registro se adoptaron los parámetros del apéndice “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva” siendo la sintomatología distribuida en los grupos fenomenológicos Motor, No motor y Autonómico y sugiriendo una zona sintomatogénica. El apéndice contiene terminología estandarizada en el área de la salud, destinada a comunicar lo que se observay/o lo que el paciente reporta durante una crisis epiléptica (Blume-Chair et al., 2001); en medicina, la descripción semiológica es a menudo obtenida de la familia y cuidadores de pacientes derivando en términos comunes para los síntomas ictales (Berg et al., 2010).

En el caso del clínico veterinario, la descripción de la fenomenología se basa enteramente en las observaciones del propietario y clínicos siendo el apéndice y los conceptos de la ILAE herramientas previamente usadas en estudios descriptivos en epilepsia canina y felina (Berendt et al., 2004; Chandler, 2006; Pákozdy et al., 2010; Ekenstedt,2013; Mariani, 2013),sin embargo, un estudio demostró que existe niveles relativamente bajos de acuerdo entre la presencia de una crisis epiléptica, el tipo de crisis y la semiología reportada por clínicos veterinarios especialistas y no especialistas (Packer et al., 2015).

De este modo, la correcta descripción de la fenomenología en una crisis epiléptica provee un vocabulario que facilita la comunicación entre clínicos (Rosenow & Luders, 2001) y permite realizar diagnósticos confiables (Packer et al.,2015).

El ictus o crisis epiléptica es reconocido por la disfunción de una o más de las funciones motoras (alteraciones musculares o movimientos involuntarios) y autonómicas, con pérdida de la conciencia y automatismos (movimientos repetitivos) o comportamientos paroxísticos (disturbios psíquicos) (Licht et al., 2002; Graeff Viana & Vahia, 2007; Lorenz et al., 2011; Morita et al., 2011; Mariani, 2013). El análisis de la fenomenología de cada crisis epiléptica fue eficaz en reconocer estas disfunciones,



específicamente en el caso del grupo fenomenológico Motor; presente en todas las crisis (figura 1)comprometiendo el componente óseo-muscular del paciente; permitió distinguir entre signos motores elementares (signos tónicos, mioclónicos, tónico-clónicos y atónicos) y automatismos o signos que acometen actividades musculares coordinadas o movimientos voluntarios (tabla 2).

Otro hallazgo relevante en el análisis fue la alta frecuencia y probabilidad de los grupos fenomenológicos No motor y Autonómico, así como su asociación con el grupo Motor (figura 1). Al respecto, se considera que signos somatosensoriales o síntomas sensoriales especiales y psíquicos involucran disturbios de funciones y áreas cerebrales superiores o especializadas (Berendt et al., 2004). Estas funciones son poco familiarizadas con crisis epilépticas en pacientes veterinarios y a menudo pasan desapercibidas en la anamnesis; siendo los signos autonómicos y comportamentales poco reportados entre los clínicos (Packer et al., 2015).

El análisis de la fenomenología de las crisis epilépticas, además de que suministró información descriptiva detallada, es también una herramienta útil para la detección de la zona sintomatogénica. En medicina, la fenomenología de pacientes con epilepsia y crisis epilépticas es usada para distinguir los patrones de crisis epilépticas de cada lóbulo cerebral y determinar su plan terapéutico(Yacubian, 1998). Este trabajo usó los hallazgos de Acharya et al. (1997) y Hammer et al. (1999) (figura 1) para la localización y análisis de la zona sintomatogénica en todas las crisis epilépticas de caninos, deduciendo quela participación en todas las crisis del grupo fenomenológico Motor derivó en una localización en el lóbulo parietal y frontal contralateral. La asociación crisis motora y localización parietal-frontal ha sido igualmente encontrada en estudios fenomenológicos (Mariani et al., 2013) y estudios clínico–patológicos (Morita et al., 2011).

Conclusiones

El apéndice “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva” permitió describir la fenomenología de las crisis epilépticas en caninos, con lo cual se comprobó que la adopción de la péndice en la evaluación clínica de pacientes con crisis epiléptica contribuye en la universalización de los conceptos y la comunicación entre clínicos, además de ser eficaz en detectar la zona sintomatogénica de cada paciente.

El análisis de la fenomenología y la zona sintomatogénica sugiere que caninos con crisis epiléptica presentan áreas cerebrales sensibles de generar actividad neuronal anormal, específicamente; la alta frecuencia del grupo fenomenológico motor definió una localización en el lóbulo parietal-frontal. Múltiples estudios son necesarios para entender los mecanismos fisiológicos implicados en la susceptibilidad de esta área cerebral y mejorar el conocimiento sobre las crisis epilépticas en caninos.



Agradecimientos

Programa “Joven Investigador” de COLCIENCIAS, Vicerrectoría de Investigaciones y Posgrados (H022) y Hospital Veterinario Diego Villegas Toro, Universidad de Caldas.


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Osteoartrose: aspectos clínicos e novas perspectivas terapêuticas baseadas na terapia regenerativa

REVIEW ARTICLE

Esteban Osorio-Carmona1, Cleuza Maria de Faria Rezende2

1,Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil. 2,Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias, Escola de Veterinária,

Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil.

[email protected]

(Recibido: 22 de Enero de 2015 Aprobado: 23 de Abril de 2015Actualizado: 25 de junio de 2015)

DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.4

RESUMO: As doenças articulares em animais de pequeno porte representam uma alta porcentagem na rotina hospitalar. A alta freqüência de lesões articulares decorrentes de diferentes fatores (fraturas intra-articulares, ruptura de ligamentos, doenças predisponentes, dentre outras) exige terapias mais efetivas. O objetivo do tratamento das doenças articulares após a correção das causas primárias é diminuir a dor e retardar o avanço da osteoartrose. O equilíbrio no metabolismo da cartilagem é de vital importância para a manutenção da integridade da matriz extracelular e das outras estruturas que formam a cartilagem. O desequilíbrio entre as citocinas e fatores de crescimento pode levar a alterações irreversíveis e incapacitantes na superfície articular das principais articulações. A osteoartrose caracteriza-se pela alteração da estrutura da cartilagem articular, diminuição dos movimentos articulares acompanhada de crepitação, formação de osteófitos, claudicação, dor e perda da função. Os tratamentos disponíveis na atualidade incluem os conservativos e cirúrgicos que visam estabilizar as articulações e aliviar a dor embora não previnam a progressão da doença articular degenerativa. O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma substância autóloga obtida a partir de sangue total submetido a processos de centrifugação e ativação que tem mostrado potencial terapêutico no tratamento de algumas doenças e em diversas áreas da medicina humana e veterinária. O objetivo deste levantamento bibliográfico é revisar os principais aspectos da osteoartrose, o papel das citocinas no desenvolvimento da mesma, as características do plasma rico em plaquetas, sua obtenção e seu emprego como nova alternativa terapêutica nas principais lesões articulares que acometem os animais domésticos.

Palavras chave: cães, fatores de crescimento, doença articular degenerativa, plasma rico em plaquetas



Osteoartritis: aspectos clínicos y nuevas perspectivas terapéuticas basadas en la terapia regenerativa

RESUMEN: Las enfermedades articulares en animales de pequeño porte representan un alto porcentaje en la rutina de los hospitales veterinarios. La alta frecuencia de lesiones articulares derivadas de diferentes factores (fracturas intra-articulares, ruptura de ligamentos, enfermedades predisponentes, entre otras) exige terapias más efectivas. El objetivo del tratamiento de las enfermedades articulares después de la corrección de las causas primarias es disminuir el dolor y retardar el avance de la osteoartritis. El equilibrio en el metabolismo del cartílago es de vital importancia para el mantenimiento de la integridad de la matriz extracelular y de las otras estructuras que forman el cartílago. El desequilibrio entre las citocinas y los factores de crecimiento puede llevar a alteraciones irreversibles e incapacitantes en la superficie articular de las principales articulaciones. La osteoartritis se caracteriza por la alteración de la estructura del cartílago articular, disminución de los movimientos articulares acompañado de crepitación, formación de osteófitos, claudicación, dolor y pérdida de la función. Los tratamientos disponibles en la actualidad incluyen los conservativos y quirúrgicos que tratan de estabilizar las articulaciones y aliviar el dolor, pero no prevenir la progresión de la enfermedad articular degenerativa. El plasma rico en plaquetas (PRP) es una sustancia autóloga obtenida a partir de la sangre total sometida a procesos de centrifugación y activación que han mostrado potencial terapéutico en el tratamiento de algunas enfermedades y en diversas áreas de la medicina humana y veterinaria. El objetivo de esta presentación bibliográfica es revisar los principales aspectos de la osteoartritis, el papel de las citocinas en el desarrollo de esta, las características del plasma rico en plaquetas, procesos de obtención y su uso como nueva alternativa terapéutica en las principales lesiones articulares que afectan a los animales domésticos.

Palabras clave: canino, factores de crecimiento, enfermedad articular degenerativa, plasma rico en plaquetas.

Osteoarthritis: clinical aspects and new therapeutic perspectives based on regenerative therapy

ABSTRACT: Joint diseases in small animals represent a high percentage in the routine of veterinary hospitals. The high frequency of joint injuries resulting from various factors (intra-articular fractures, ruptured ligaments, predisposing diseases, etc.) requires more effective therapies. The goal of treatment of joint diseases after correction of the primary causes is to decrease pain and delay the progression of osteoartritis. Equilibrium in the cartilage metabolism is critical for maintaining the integrity of the extracellular matrix and the other structures that form the cartilage. The imbalance between cytokines and growth factors can lead to irreversible and disabling alterations in the joint surface of the major joints. Osteoarthritis is characterized by alteration of the structure of articular cartilage, decrease in joint movement accompanied by crackling, osteophyte formation, lameness, pain and loss of function. The currently available treatments include conservative and surgical ones trying to stabilize joints and relieve pain, but not to prevent the progression of the degenerative joint disease. Platelet rich plasma (PRP) is an autologous substance obtained from whole blood subjected to centrifugation and activation processes that have shown therapeutic potential in the treatment of certain diseases and in various areas of human



and veterinary medicine. The objective of this bibliographical presentation is to review the main aspects of osteoarthritis, the role of cytokines in its development, the characteristics of platelet-rich plasma, processes for its obtation and use as a new therapeutic alternative in the main joint injuries affecting domestic animals.

Key words: canine, growth factors, degenerative joint disease, platelet rich plasma

Introdução

As doenças ortopédicas, especialmente as articulares, representam uma grande porcentagem de casos na rotina dos hospitais veterinários e podem acometer animais de qualquer idade ou sexo (Tatarunas, 2004). Essas afecções, decorrentes principalmente de lesões traumáticas significativas, podem afetar os ossos e ligamentos, comprometendo assim a estabilidade articular e a integridade da articulação.

Dentre as lesões articulares destacam-se as displasias, osteocondroses, luxações e lesões ligamentares associadas a rupturas completas ou não que acometem as articulações femoro-tibio-patelar (FTP), coxofemoral (CF), escápulo-umeral (EU) e úmero-rádio-ulnar (URU), principalmente. Alterações nestas articulações são as que causam maior comprometimento na deambulação do animal.

A estrutura mais freqüentemente acometida na articulação FTP é o ligamento cruzado cranial (LCCr), cuja ruptura, seja parcial ou completa, produz instabilidade articular que ocasiona o desenvolvimento da osteoartrose (OA) (Arnold et al., 1979; Innes et al., 2000; Johnson et al., 1994; Maletius & Messner, 1999; Wainer et al., 1998).

São relatadas na literatura diferentes modalidades terapêuticas para o tratamento da ruptura total ou parcial do LCCr, como protocolos conservativos e tratamentos cirúrgicos que incluem técnicas extra e intra-capsulares. As técnicas cirúrgicas têm como objetivos o restabelecimento da estabilidade articular e o retardamento do progresso da OA (Chang et al., 2003; Codesido et al., 2009; Dürselen et al., 1996; Huang et al., 2008; Meisterling et al., 2009; Muzzi et al., 2009).

Novas alternativas terapêuticas que se baseiam na aplicação intra-articular de diferentes tipos de células autógenas, obtidas de diferentes fontes, são propostas para favorecer a recuperação dos tecidos lesionados. Essas células possuem características intrínsecas tais como fatores de crescimento e pluri-potencialidade para proliferar e se diferenciar em diferentes tipos celulares que podem modular a regeneração tecidual. Estas novas terapias são conhecidas como terapia regenerativa e engenharia tecidual (Huang et al., 2008; Petrigliano et al., 2006; Silva, 2012). A terapia celular regenerativa inclui principalmente células tronco, células tronco mesenquimais, e concentrados autólogos de plaquetas, cuja literatura relata o efeito benéfico de seu uso na reparação e cicatrização de tecidos doentes ou lesionados. Os resultados mostram grande potencial terapêutico do plasma rico em plaquetas (PRP) quando empregado em humanos na reparação dental e maxilar (Oates et al., 1993; Rodriguez-Florez et al., 2012), em cavalos para o tratamento de lesões



musculoesqueléticas (Carmona, 2006) e em cães como terapia coadjuvante no tratamento da osteoartrose adquirida (Silva, 2012).

Estudos experimentais têm mostrado o efeito favorável do emprego de PRP no retorno das funções após lesões ligamentares, lesões traumáticas na cartilagem articular e em fraturas, mas ainda há controvérsia sobre sua ação nos tecidos articulares (Milano et al., 2010; Patel et al., 2013; Torres, 2006; Weibrich et al., 2004). Assim, o objetivo desta revisão é analisar aspectos como a homeostase da cartilagem, os fatores bioquímicos envolvidos no equilíbrio articular, a osteoartrose e seus fatores desencadeantes e o PRP, incluindo a função das plaquetas, princípios biológicos do PRP, seus componentes estruturais, substâncias empregadas para sua ativação, sua obtenção e seu uso na medicina humana e veterinária.

Homeostase da cartilagem, citocinas e seu papel nas doenças articulares

Nas articulações sinoviais, a cartilagem articular proporciona proteção ao osso subcondral contra as cargas mecânicas e as forças de corte. Esse tecido conjuntivo altamente especializado é composto principalmente por água, colágeno e proteoglicanos que formam uma fibra rígida reforçada com alta resistência e capacidade para absorver impactos (Stockwell, 1991).

A cartilagem articular é um tecido conectivo avascular, aneural e alinfatico desenhado para distribuir as cargas mecânicas e proporcionar uma superfície de resistência ao desgaste para as estruturas articulares (Buckwalter & Mankin, 1998; Mobasheri &Henrotin, 2010).

O tecido cartilaginoso é feito de matriz extracelular (MEC). Os condrócitos são as principais células na cartilagem articular normal e são muito ativos, eles são os principais responsáveis pela manutenção da MEC. Acredita-se que a integridade da matriz é mantida pelo equilíbrio entre as citocinas anabólicas (fatores de crescimento) tais como o Insulinic Growth Factor (IGF) e o Transforming Growth Factor β (TGF-β) que induzem a produção das macromoléculas que formam a cartilagem articular e os efeitos catabólicos das citocinas interleucina 1α (IL-1α), interleucina 1β (IL-1β) e o fator de necrose tumoral α (FNT-α), as quais induzem a produção de metaloproteinases específicas degradadoras da matriz (Shinmei et al., 1990; Westacott & Sharif, 1996).

O papel e o mecanismo de ação das citocinas na progressão da OA têm recebido especial atenção nas pesquisas recentes devido à particular interação entre a cartilagem articular e a sinovia na fisiopatologia da doença (Pelletier et al., 1991; Westacott & Sharif, 1996).

A manutenção da homeostase da matriz da cartilagem articular requer renovação dos componentes da matriz, principalmente do colágeno e dos proteoglicanos. Acredita-se que os condrócitos e os sinoviócitos são estimulados, através de receptores de membrana específicos, pelas citocinas, tais como a IL-1 e o FNT-α para produzir proteases da matriz cartilaginosa e para suprimir a síntese de colágeno e proteoglicanos (Pelletier et al., 1991). Assim as citocinas não só favorecem a destruição do tecido, mas também inibem a reparação do mesmo (Pelletier et al., 1991).



Muitos fatores de crescimento tais como o TGF-β, podem neutralizar o efeito das citocinas pela estimulação da síntese dos componentes da matriz ou atuando como inibidores naturais das enzimas degradadoras da cartilagem (Pelletier et al., 1991).

As citocinas são liberadas por algumas células em resposta a um sinal específico e influenciam a função das células, exercendo um efeito positivo ou negativo na expressão genética (Arend & Dayer, 1993). Estas moléculas têm uma vida média relativamente curta, fazendo com que usualmente exerçam sua função nas células do local onde são liberadas (Arend & Dayer, 1993).

As citocinas são sintetizadas por células como monócitos, macrófagos, sinoviócitos e fibroblastos, os quais se encontram aumentados na sinovia inflamada, podendo assim modular o metabolismo dos tecidos conjuntivos (Larrick & Kunkel, 1988).

Os tecidos conjuntivos são caracterizados pela abundância da sua MEC. Para o funcionamento dos tecidos, requer-se uma arquitetura normal dessa matriz cuja homeostase é controlada principalmente pelas células do tecido conectivo através da regulação dos eventos de síntese e degradação estimuladas pelas citocinas que atuam como mensageiros intracelulares (Pelletier et al., 1991; Westacott & Sharif, 1996). As células da MEC além de sintetizar os componentes estruturais essenciais da matriz como o colágeno e os proteoglicanos, produzem as proteases responsáveis pela renovação desses componentes (Pelletier et al., 1991; Westacott & Sharif, 1996).

Acredita-se que a super-regulação ou um excesso das citocinas tem um papel determinante na fisiopatologia de muitas doenças articulares, principalmente na OA, embora esse papel ainda não seja bem estabelecido (Westacott & Sharif, 1996).

Em tecidos normais, a homeostase da matriz pode ser considerada balanceada quando a taxa da nova síntese de matriz é igual à taxa de degradação da mesma, sendo que não há nem perda nem ganho neto de tecido. Um desequilíbrio na síntese e degradação é comumente associado com estados patológicos (Pelletier et al., 1991).

Os processos degradativos e de síntese são controlados por proteínas extracelulares denominadas fatores de crescimento ou citocinas. Os fatores de crescimento tais como o IGF e o TGF- β são associados principalmente com a estimulação da formação de tecido conectivo, enquanto as citocinas, tais como a IL-1 e o FNT-α são principalmente associados com a estimulação da degradação da MEC (Gupta, 1988; Pelletier et al., 1991). É sabido que algumas citocinas antagonizam os efeitos de outras como, por exemplo, a atividade da IL-1 é diminuída na presença do TGF- β e do IGF, possivelmente devido à sub-regulação do receptor da IL-1 (Harvey et al., 1991; Tyler, 1989; Westacott & Sharif, 1996). Esses mecanismos de controle são essenciais para manter a integridade dos tecidos. Alterações no equilíbrio dos mecanismos de ação das citocinas podem contribuir ou desencadear processos destrutivos e degradativos das articulações (Westacott & Sharif, 1996).

Osteoartrose

A OA é uma doença multifatorial e com diferentes fatores predisponentes (Stockwell, 1991) que pode acometer qualquer articulação, incluindo a articulação coxo-femoral



(CF), a úmero-rádio-ulnar (URU) e a fêmoro-tíbio-patelar (FTP) (Franklin et al., 2009; Rychel, 2010). Esta doença é a mais comum das afecções articulares nos animais domésticos, afetando a integridade da cartilagem articular e causando dor e disfunção. As alterações no osso subcondral e a perda da cartilagem resultam em inflamação, claudicação, diminuição na amplitude dos movimentos, dor e incapacidade física (Johnston et al., 2007; Liu et al., 2003; Westacott & Sharif, 1996).

O diagnóstico da OA está baseado principalmente nos exames clínicos e imagenológicos. Na maioria dos casos, entretanto, há discrepância entre os sinais clínicos e o surgimento das alterações articulares (Henrotin et al., 2012).

Animais de médio e grande porte são os mais acometidos, desenvolvendo sinais clínicos mais graves ou iniciando o processo degenerativo precocemente, embora animais de todos os tamanhos, sexos e raças de cães e gatos possam ser acometidos pela doença (Rychel, 2010).

Instabilidade, incongruência e injúria articular são fatores que predispõem à OA devido ao estresse anormal na cartilagem articular e à inflamação crônica (Ray & Ray, 2008). Dentre os principais fatores predisponentes pode se citar a displasia URU e CF, cirurgias ortopédicas, ruptura do ligamento cruzado cranial (RLCCr), fraturas articulares e incongruências resultantes de traumas ou de deformidades angulares dos membros (Rychel, 2010).

Independente da causa que originou o processo degenerativo, a cartilagem acometida é usualmente mais fina e mais hidratada que a cartilagem das articulações normais (Liu et al., 2003; McDevitt & Muir, 1976). Os níveis das macromoléculas que compõem a MEC encontram-se aumentados nas cartilagens afetadas pela OA, indicando que os condrócitos dessas cartilagens sintetizam agrecanos imaturos e maiores, confirmando a formação de cartilagem imatura (Adams & Grant, 1987; Liu et al., 2003).

Quando ocorre a RLCCr com o subseqüente desenvolvimento da OA, pode-se observar o rompimento e remodelamento da rede de colágeno na zona superficial da cartilagem articular (Guilak et al., 1994) com aumento nos níveis de mRNA de colágeno tipo II e sua expressão na cartilagem (Matyas et al., 2002; Matyas et al., 1997a; Matyas et al., 1997b).

A OA resulta de uma complexa interação entre fatores bioquímicos ou inflamatórios e biomecânicos (De Rezende et al., 2013). As alterações associadas com o processo degenerativo envolvem todos os tecidos articulares, incluindo a cápsula articular, osso subcondral, ligamentos e músculos, resultando em dano e destruição da cartilagem articular (Innes et al., 2000; Johnston, 1997; Pond & Nuki, 1973; Rayward et al., 2004).

Fatores bioquímicos

Alguns estudos recentes postulam a OA como uma doença inflamatória que se perpetua, causada por respostas mediadas por condrócitos e sinoviócitos (Bonnet & Walsh, 2005; Konttinen et al., 2012; Pincus, 2001; De Rezende et al., 2013), na qual os níveis séricos e sinoviais de citocinas inflamatórias são maiores em pacientes com OA (Pearle et al., 2007; De Rezende et al., 2013; Sohn et al., 2012).



As mudanças bioquímicas na cartilagem acometida por OA afetam os dois principais componentes da MEC: o colágeno e os proteoglicanos, sendo que os últimos são as primeiras macromoléculas da matriz a ser acometidas. Durante o processo patológico há uma diminuição dos proteoglicanos da cartilagem articular, que indica a gravidade da doença (Liu et al., 2003; Mankin, et al., 1974; Pelletier et al., 1991). Em estádios avançados os condrócitos são incapazes de compensar a diminuição dos proteoglicanos, resultando assim em perda da MEC (Pelletier et al., 1991).

As citocinas pró-inflamatórias, tais como a IL-1, a IL-6 e o FNT-α e as quimiocinas têm sido encontradas em quantidades elevadas em articulações de humanos com artrite reumatóide, assim como citocinas antiinflamatórias tais como a IL-10. A IL-1 e o FNT-α estão entre as primeiras citocinas liberadas pelos monócitos ativados e pelos macrófagos na resposta imune. Uma vez liberadas elas agem nas células do sistema não imune como as células endoteliais, condrócitos e osteoblastos para produzir mais IL-1 e FNT- α aumentando a concentração de citocinas que resulta em inflamação acentuada (Cartier et al., 1999).

Blom et al. (2007) realizaram um estudo no qual foram empregados dois grupos, no primeiro grupo, foi realizada a depleção dos macrófagos e no segundo grupo não foi feita a depleção dos macrófagos e induziram a OA através da colagenase. O grupo no qual houve a depleção dos macrófagos sinoviais antes da indução da OA não apresentou degradação da cartilagem, o que significa que os macrófagos têm papel fundamental na patogênese da OA e não é apenas conseqüência dela. A IL-1 e o FNT- α induzem outras interleucinas como a IL-6, as quais promovem a infiltração celular, a hematopoiese e a angiogênese através da proliferação das células endoteliais. Por meio destes mecanismos, as citocinas pró-inflamatórias liberadas pelos macrófagos poderiam ser responsáveis por algumas das mudanças inflamatórias em determinadas doenças articulares e podem estimular os sinoviócitos e os condrócitos para produzir e ativar as metaloproteinases, que tem um papel fundamental no processo destrutivo da cartilagem articular (Carter et al., 1999; Coughlan et al., 1998a; Coughlan et al., 1998b). A IL-1 e o FNT- α atuam sinergicamente para induzir e manter a inflamação e a erosão articular nas artrites (Brennan et al., 1998).

Um dos sinais clínicos observados em pacientes com OA é o aumento de volume articular, causado pelo derrame articular ou espessamento articular, demonstrando assim a presença de sinovite (De Rezende et al., 2013). A sinovite e o derrame articular são considerados fatores que induzem a perda da cartilagem na articulação inicialmente sem OA (Roemer et al., 2011). Tem-se encontrado uma associação direta entre o grau de sinovite e o deterioramento da articulação (Ayral et al., 2005).

Aproximadamente 50% dos casos de OA em caninos apresentam sinovite de moderada, a acentuada em biopsias sinoviais (Baines, 1994). Esta sinovite é caracterizada por hipertrofia e hiperplasia das células da intima sinovial, proliferação das vilosidades e infiltração moderada de linfócitos, células plasmáticas e monócitos (Cartier et al., 1999; May et al., 1992).

Num estudo em ratos, pesquisou-se o efeito da IL-1 e do FNT- α no desenvolvimento da artrite aguda injetando estas substâncias na articulação FTP na dose de 3, 10 ou 30µg. Observou-se dois dias após que a IL-1 induziu significativamente e dose-dependente, um aumento na inflamação (de moderada a acentuada), na reabsorção



óssea (de mínima a moderada) e na formação de osteoclastos (de mínima a moderada). Em contraste, o FNT- α induziu mínima a moderada inflamação, mas teve pouco efeito na reabsorção óssea e na proliferação de osteoclastos. Tanto a IL-1 quanto o FNT- α induziram discreta degeneração na cartilagem articular (Bolon et al., 2004). Os autores concluíram que ambas as citocinas estimulam o processo inflamatório, mas que a IL-1 é a citocina que leva à destruição do osso subcondral (Bolon et al., 2004).

É Indiscutível o papel fundamental que desempenham as citocinas no processo fisiopatológico da OA ao promover degradação da cartilagem articular e dos componentes da MEC através de enzimas liberadas por condrócitos e sinoviócitos estimulados por estas moléculas, ao mesmo tempo em que aumentam a resposta inflamatória do tecido local, favorecendo e perpetuando o processo inflamatório.

Fatores biomecânicos

Os fatores biomecânicos na OA estão relacionados com alterações no movimento e as forças físicas que agem sobre pontos localizados da articulação (De Rezende et al., 2013). A OA é uma resposta patofisiológica de uma articulação a um insulto mecânico e representa a tentativa da articulação de corrigir um estresse mecânico anormal e de reparar a lesão resultante (Brandt et al., 2009; De Rezende et al., 2013).

O estresse mecânico ao qual são submetidos às articulações com OA, atua também como desencadeador da resposta inflamatória (Kawakita et al., 2012). O estresse é captado e interpretado pelos mecanorreceptores, que ativam as cascatas inflamatórias exatamente como ocorre na ativação pelas citocinas (Piscoya et al., 2005).

Existem diferentes fatores que podem levar a um aumento anormal das forças que agem em áreas localizadas da articulação, dentre os quais se destacam os defeitos anatômicos congênitos, lesões adquiridas que promovem instabilidade articular, sobrepeso e combinação destes fatores (De Rezende et al., 2013). Embora os fatores biomecânicos não sejam a causa da OA, eles têm um papel fundamental no desenvolvimento dessa lesão devido à concentração do estresse intra-articular que estimula a resposta inflamatória (De Rezende et al., 2013).

Outros estudos em humanos tem encontrado também que as lesões em estruturas como os meniscos aumentam o risco do desenvolvimento de OA (Englund et al., 2009), pois estas lesões precedem a perda da cartilagem articular. Cirurgias para remoção de lesões nos meniscos, mesmo remoções parciais, aumentam o estresse focal na cartilagem e causam altas taxas de OA (Papalia et al., 2011).

As displasias congênitas aumentam o risco de desenvolvimento da OA (Lane et al., 2000). Joelhos em varus ou valgus sofrem lesões no compartimento articular medial e lateral, respectivamente, causada pelo aumento das cargas fisiológicas que atuam sobre a articulação FTP (Felson et al., 2003).

Injúria repetitiva parece ser um fator importante para a síntese de citocinas e qualquer alteração no equilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias e antiinflamatórias que pode contribuir para o desenvolvimento do processo degenerativo. A produção insuficiente de fatores de crescimento e o desequilíbrio entre a inibição e a produção de metaloproteinases podem contribuir para o catabolismo da cartilagem (Johnston,



1997). Os fatores biomecânicos agem então, como predisponentes para o surgimento dos fatores bioquímicos, ao produzir uma resposta inflamatória localizada causada pela distribuição inadequada das cargas e forças que agem sobre os componentes articulares.

Após o desencadeamento do processo degenerativo, seu desenvolvimento e progressão são inevitáveis mesmo que a causa primaria biomecânica ou bioquímica tenham recebido o tratamento adequado. A OA é um processo doloroso e incapacitante e o objetivo primário do tratamento é o alivio da dor. Geralmente empregam-se agentes modificadores da osteoartrose, para diminuir a dor e manter ou melhorar a função articular. É necessário, entretanto, tratar a causa primária do problema (Rezende & Gobi, 2009).

Os principais agentes empregados são os glicosaminoglicanos polissulfatados, o sulfato de condroitin e o acido hialurônico intra-articular, que podem diminuir a dor, a inflamação e restabelecer o ambiente articular. Eles possuem substâncias como glicolipídeos, glicoproteínas, glicosaminoglicanos, proteoglicanos dentre outros, que desenvolvem um papel fundamental na formação das superfícies articulares, tendões, tecido sinovial, ossos e têm participação no metabolismo da cartilagem articular (Anvisa, 2012; Canapp, 2013). Embora estas substâncias sejam empregadas com freqüência na rotina, elas nem sempre têm os efeitos desejados e não oferecem um controle satisfatório no desenvolvimento da OA.

Tem sido relatado também, o uso de antiinflamatórios não esteroidais na tentativa de diminuir a inflamação e a dor causadas pelo processo degenerativo. Em muitos casos, estes medicamentos oferecem poucos benefícios sobre o controle da doença e muitas vezes podem ter efeitos deletérios sobre a articulação e sobre outros sistemas corporais (Clark, 2006; Filho & Rahal, 2008; Lees et al., 2004).

Devido à ausência de um tratamento satisfatório para prevenir o desenvolvimento da OA e suas conseqüências, tem se realizado pesquisas empregando a terapia celular. Neste contexto surgem os estudos de avaliação do efeito do PRP em diferentes tecidos orgânicos (Carmona et al., 2011; Choi et al., 2005; Froum et al., 2002; Gobbi & Vitale, 2012; Hakimi et al., 2010; Silva, 2012; Silva et al., 2012a). Os resultados mostram a eficiência desta substância para acelerar o processo de cicatrização, na redução da inflamação e da dor, além de disponibilizar os fatores de crescimento essenciais para direcionar a reparação do tecido lesado.

Plasma rico em plaquetas: obtenção e emprego

Fisiologia das plaquetas

As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos derivados dos megacariócitos da medula óssea, cujo diâmetro varia de um a três µm nos cães e de dois a seis µm nos gatos, com uma vida média entre seis a dez dias. Estas células são multifuncionais e atuam em vários processos fisiológicos como a homeostase, manutenção e regulação do tônus vascular, formação e retração do coágulo (Boudreaux et al., 2010; Harrison, 2005; Wilkerson et al., 2001).



Essas células também atuam na reparação de feridas e no início da cicatrização tecidual, uma vez que elas contem fatores de crescimento, citocinas e mediadores inflamatórios que agem produzindo quimiotaxia, proliferação e diferenciação celular, neovascularização, angiogênese e deposição de MEC, além de atuar na resposta imune (Carmona, 2006; Carrasco et al., 2009; Sanchez et al., 2003; Silva et al., 2013; Silva et al., 2012b).

Após a injúria tecidual as plaquetas chegam ao local e entram em contato com o colágeno e o fator de Von Willebrand expostos dentro da MEC, produzindo-se assim a ativação das mesmas com conseqüente liberação de citocinas, fatores de crescimento e diferentes mediadores pro-inflamatórios que aumentam a agregação plaquetária e a ativação das vias da coagulação para a formação do coágulo de fibrina, exercendo assim, suas funções na coagulação, inflamação, formação de tecido de granulação, epitelialização e remodelação do tecido de cicatrização (Blair & Flaumenhaft, 2009; Boswell et al., 2012; Iacopetti et al., 2012; Mishra et al., 2009; Silva, 2012; Verhamme & Hoylaerts, 2009).

As plaquetas contêm no seu interior uma variedade de grânulos encarregados de secretardiferentes substâncias depois de ativadas. Os principais grânulos são os grânulos α, os grânulos densos e os grânulos lisosomais, os quais exercem uma função diferente durante o período de reparação das feridas. As principais substâncias secretadas pelos grânulos após a ativação são os fatores de crescimento (PDGF, TGF-β, IGF, FGF, EGF, VEGF), citocinas, fator de Von Willebrand, serotonina, fator V, XI e XIII, fibrinogênio, ATP, fibronectina, dentre outros que exercem diferentes funções no processo de cicatrização (Gobbi & Vitale, 2012; Intini, 2009).

Após a injúria do tecido, a membrana celular libera tromboxanos e prostaglandinas2α, levando a uma vasoconstrição inicial (Broughton et al., 2006a). Posteriormente, as plaquetas são ativadas pela exposição às proteínas da MEC como colágeno, o fator de Von Willebrand e fibronectinas dentre outras (Smith & Roukis, 2009), fazendo com que inicie a agregação plaquetária e a formação inicial de um trombo (Broughton et al., 2006b; Witte & Barbul, 1997). Esse processo chamado ativação inclui mudanças na morfologia da plaqueta e a liberação do conteúdo dos grânulos (Behnke & Forer, 1998; Diegelmann & Evans, 2004). As substâncias liberadas pelos grânulos densos potencializam a ativação plaquetária.

Durante a fase de ativação, os grânulos α unem-se à membrana da plaqueta para liberar os fatores de crescimento, as citocinas e quimiocinas que auxiliam na migração e crescimento celular. Este processo se inicia nos primeiros dez minutos após a ativação e termina aproximadamente uma hora depois (Behnke & Forer, 1998; Diegelmann & Evans, 2004; Marx, 2004).

A liberação das substâncias contidas nos grânulos das plaquetas ocorre durante a vida útil das mesmas (Froum et al., 2002; Marx, 2004).

Plasma Rico em Plaquetas

O PRP, também conhecido como concentrado autólogo de plaquetas, é utilizado para favorecer o processo de reparação de feridas e lesões em diferentes tecidos como o cutâneo, musculoesquelético, intestinal, dentre outros (Boswell et al., 2012;



Yamaguchi et al., 2012) e para proporcionar uma MEC com capacidade para permitir o desempenho mecânico e funcional dos tecidos sadios (Wasterlain et al., 2012).

O PRP é uma fração de plasma obtida de sangue autólogo que possui uma concentração de plaquetas três a cinco vezes superiores aos níveis basais do sangue total e é considerada uma fonte natural de fatores de crescimento (Carrasco et al., 2009; Gonzalez, 2006; Jo et al., 2012; Kon et al., 2012; Marx et al., 1998; Rodriguez-Florez et al., 2012).

O mecanismo de ação do PRP está fundamentado na quantidade de plaquetas concentradas que são aplicadas diretamente sobre os tecidos lesados (Choi et al., 2005; Silva, 2012; Wasterlain et al., 2012; Yamaguchi et al., 2012), e na modulação dos processos cicatriciais através dos fatores de crescimento e de outras substâncias, presentes nos grânulos α das plaquetas, que após sua liberação, iniciam e mantêm o processo de regeneração tecidual (Beca et al., 2007; Mishra et al., 2009; Textor, 2011).

Os fatores de crescimento, mediadores pro-inflamatórios, fibrina e outras sustâncias são capazes de influenciar o meio onde são aplicadas para produzirem mitose celular, recrutamento de outras células, proliferação e diferenciação celular, síntese de proteínas da MEC como colágeno e substâncias que promovem a angiogênese e neovascularização (Anitua et al., 2012; Freymiller & Aghaloo, 2004; Iacopetti et al., 2012; Lee et al., 2012; Mishra et al., 2009; Silva et al., 2012a).

Dentre os principais fatores de crescimento liberados dos grânulos encontram-se o TGF-β, o Platelet Derived Growth Factor (PDGF), o Vascular Endotelial Growth Factor (VEGF), o Fibroblast Growth Factor (FGF), o Insulinic Growth Factor (IFG), o Epidermic Growth Factor (EGF) dentre outros (Beca et al., 2007; Gonzalez, 2006; Iacopetti et al., 2012; Lee et al., 2012; Rodriguez-Florez et al., 2012; Silva, 2012a; Silva et al., 2011a). Esses fatores de crescimento têm várias funções e atuam em conjunto com as citocinas e as outras sustâncias pro-inflamatórias para regenerar os tecidos. Dentre as principais funções dos diferentes fatores de crescimento pode-se citar:

• PDGF: é o primeiro fator de crescimento presente na ferida, inicia a reparação do tecido conectivo e suas principais funções incluem a mitogênese de células como os neutrófilos, monócitos e fibroblastos que agem na reparação tecidual, angiogênese das células endoteliais dos capilares e ativação dos macrófagos (Bennett & Schultz, 1993; Hakimi et al., 2010; Marx et al., 1998; Smith & Roukis, 2009);

• TGF-β: promove a proliferação, migração celular e síntese de proteínas da MEC como o colágeno (Anitua et al., 2005; Bennett & Schultz, 1993; Hakimi et al., 2010; Sanchez et al., 2003), além de produzir mitogênese e quimiotaxia de osteoblastos e inibe a atividade dos osteoclastos (Bennett & Schultz, 1993). Induz a osteogênese e a condrogênese (Joyce et al., 1990);

• IGF: produz proliferação celular que estimula a síntese de proteínas da MEC, tem efeitos quimiotáticos e mitôgenicos (Bennett & Schultz, 1993; Goh et al., 2003), aumenta a síntese de colágeno tipo I e III;



• VEGF, FGF: produzem quimiotaxia e estimulam a mitogênese de células endoteliais e vasculares, promovendo a angiogênese e a vascularização (Anitua et al., 2005; Bennett & Schultz, 1993; Intini, 2009; Smith & Roukis, 2009). O VEGF estimula a angiogênese (Intini, 2009);

• EGF: estimula a migração quimiotática de células epiteliais ao tempo que estimula a mitose dessas células (Bennett & Schultz, 1993), estimula a proliferação celular (Goh et al., 2003) e a síntese da MEC (Kang & Kang, 1999).

Para que essas sustâncias possam ter efeito terapêutico devem ser concentradas em níveis adequados para proporcionar os fatores de crescimento e outras moléculas numa quantidade suficiente para estimular a neovascularização, o incremento no aporte sanguíneo e de nutrientes necessários para a regeneração do tecido lesado (Boswell et al., 2012; Gobbi & Vitale, 2012; Tiwari & Bhargava, 2013; Xie et al., 2013b). A concentração celular pode aumentar ou diminuir segundo o método empregado na obtenção do PRP.

Ativação do PRP

Além da concentração das plaquetas é necessária a ativação das mesmas para que seja liberado o conteúdo dos grânulos e, dependendo da sustância empregada pode-se obter um gel ou um liquido de consistência viscosa que permite a ativação das plaquetas mediante diferentes vias.

Batroxobina: induz a ativação das plaquetas pela formação e polimerização da fibrina a partir do fibrinogênio e interação da fibrina com sais de cálcio. A ativação e liberação dos grânulos são lentas (Mazzuco et al., 2008; Silva, 2012b; Wang et al., 2001).

Trombina: media a agregação das plaquetas, a liberação do ADP, tromboxano A2, serotonina, e epinefrina, além da produção de fibrina a partir do fibrinogênio (Jennings et al., 2009; Silva et al., 2012a).

Gluconato de cálcio: o cálcio é um importante segundo mensageiro na cascata de ativação das plaquetas, pois, media as respostas características da ativação plaquetária tais como mudanças na forma da plaqueta, secreção dos grânulos e agregação. Ativar as plaquetas com gluconato de cálcio leva a um aumento deste no citosol e conseqüentemente a um aumento da resposta das funções das plaquetas que são diretamente dependentes do cálcio. Essas respostas são ativação da integrina, liberação de uma segunda onda de mediadores, ADP e tromboxano A2 e a expressão da atividade procoagulante das plaquetas, principalmente pela geração de trombina (Bergmeier & Stefanini, 2009; Roberts et al., 2004).

Após a adição dos diferentes produtos para a ativação das plaquetas, o PRP ativado e pronto para ser empregado, deve ser imediatamente aplicado no local lesado para evitar que a de granulação e os fatores de crescimento liberados sejam depositados fora do local de interesse (Mazzuco et al., 2008).

É importante considerar que diferentes fatores extrínsecos podem influenciar na qualidade do PRP e na quantidade de plaquetas concentradas mediante os diferentes



métodos. Dentre esses fatores tem-se: a fração colhida após a centrifugação, a força de centrifugação, o tempo de centrifugação, a substância empregada para ativar as plaquetas e o conteúdo de leucócitos (Ehrenfest et al., 2008; Silva et al., 2013; Tiwari & Bhargava, 2013).

Giraldo et al. (2013) demonstraram na sua pesquisa que há outros fatores adicionais que também influenciam a qualidade e o conteúdo celular do PRP. Fatores intrínsecos como a raça, a idade e o sexo afetam diretamente os resultados hematológicos, a quantidade de plaquetas, a concentração dos fatores de crescimento e das proteínas entre outros aspectos. Esses fatores intrínsecos interagem com os fatores extrínsecos influenciando a presentação celular e molecular do PRP.

Obtenção do PRP

OPRP, fonte natural de fatores de crescimento e substâncias pró-inflamatória pode ser obtido mediante diferentes métodos (Argüelles et al., 2006). Na medicina veterinária são descritos três métodos empregados com sucesso para este fim, que são o método manual ou método do tubo com única centrifugação (Silva et al., 2011b; Silva, 2012), o método manual com dupla centrifugação (Virchenko & Aspenberg, 2006; Xie et al., 2013a) e o método semi-automatizado (Ehrenfest et al., 2008; Textor, 2011). A concentração de plaquetas depende do tempo e da força da centrifugação empregada e da quantidade de sangue total para a produção do PRP (Anitua et al., 2009; Baksh et al., 2013; Jo et al., 2012).

Método do tubo com centrifugação única

Neste método é coletada uma quantidade determinada de sangue total, que varia de acordo com a espécie, em tubos com solução ACD-A. Esta solução contém citrato de trisódio (22 g/L), ácido cítrico (8 g/L) e dextrose (24,5 g/L) (Argüelles et al., 2006; Silva, 2012) e age como anticoagulante. Posteriormente, as amostras são centrifugadas a velocidades que variam de 85 a 1220 g (Argüelles et al., 2006; Silva et al., 2011a; Silva et al., 2011b; Virchenko & Aspenberg, 2006) durante 5 a 20 minutos. Com este método, são obtidas duas frações diferentes de concentrados de plaquetas, sendo que a primeira corresponde aos 50% imediatamente acima da capa leucocitária (PRP) e a segunda aos 50% localizados acima da primeira fração que é denominada plasma pobre em plaquetas (PPP).

Posteriormente, com auxilio de uma micropipeta de volume fixo, ambas as frações são separadas e depositadas em tubos de polipropileno para a avaliação, mediante impedância volumétrica do hematócrito, plaquetas, leucócitos,valores relativos e absolutos de linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos (Argüelles et al., 2006; Silva et al., 2011a).

Esta mesma avaliação é feita também em amostras de sangue total para se obter os valores de referência para posterior comparação com os valores do PRP (Jo et al., 2012; Virchenko & Aspenberg, 2006).



Método do tubo com centrifugação dupla

Este método segue os princípios básicos do método do tubo com centrifugação única, mas após a primeira centrifugação, a fração correspondente aos primeiros 50% imediatamente acima da capa leucocitária é coletada em tubos de polipropileno e é novamente centrifugada a velocidades que variam de 240 a 3600 g durante períodos de tempo que variam de 5 a 20 minutos (Argüelles et al., 2006; Choi et al., 2005; Lee et al., 2012; Virchenko & Aspenberg, 2006; Xie et al., 2013a). Após a centrifugação o produto obtido pode ser dividido em duas frações (A e B), onde a primeira corresponde a 25% da fração mais baixa no tubo (PRP) e a segunda aos 75% da fração restante (PPP). Posteriormente, as plaquetas obtidas após a segunda centrifugação são suspendidas em plasma, ficando o produto disponível para seu uso (Argüelles et al., 2006).

Método semi-automatizado

Este método é caracterizado pelo emprego de aparelhos de alta tecnologia para concentrar as plaquetas mediante o processo de centrifugação. Durante este procedimento pretende-se separar o plasma pobre em plaquetas e a fração sanguínea do PRP (Froum et al., 2002; Hakimi et al., 2010).

Para obter o PRP com este método é colhida uma determinada quantidade de sangue total que varia de acordo com a espécie (entre cinco até 50 ml), que posteriormente é depositada em tubos de PRP para ser centrifugada a uma velocidade que varia de 3200 a 5600g durante 15 a 20 minutos. Após este procedimento o sangue é separado em PPP e PRP, descartando o PPP. O PRP é submetido à análise celular para avaliar seu conteúdo e realiza-se a contagem celular no sangue total para comparar com o PRP e avaliar sua qualidade e, portanto, a eficiência do método (Tiwari & Bhargava, 2013).

Independente do método empregado para se obter o PRP, é importante avaliar se foi eficiente para concentrar as plaquetas. Devem ser consideradas também a força empregada na centrifugação e a duração do processo, pois a quantidade de plaquetas concentradas e a viabilidade das mesmas são altamente dependentes desses pontos críticos (Choi et al., 2005; Ehrenfest et al., 2008; Weibrich et al., 2004).

Usos do PRP

Muitas pesquisas têm sido realizadas para avaliar os efeitos terapêuticos dos concentrados de plaquetas, em medicina humana e em veterinária envolvendo cirurgias maxilo-faciais, ortopedia e tratamentos periodontais (Marx et al., 1998; Rodriguez-Florez et al., 2012; Torres, 2006), recuperação de lesões musculoesqueléticas em cavalos (Carmona et al., 2011; Carmona, 2006; Iacopetti et al., 2012), como terapia para a osteoartrose adquirida em cães (Silva, 2012) e após tratamento da ruptura do ligamento cruzado cranial (Xie et al., 2013b).

Os resultados obtidos mostraram grande potencial de regeneração, fato que tem estimulado ainda mais as pesquisas para o melhor entendimento da ação do PRP.

Em estudos realizados em pacientes humanos o PRP foi empregado para estimular a proliferação celular de tenócitos e melhorar a expressão gênica de MEC em tendões.



Os resultados mostraram um aumento significativo da proliferação e densidade celular aos sete e 14 dias dependendo da dose aplicada, e estímulo significativo da expressão gênica de colágeno tipo I e tipo III durante os mesmos períodos de tempo (Jo et al., 2012; Tohidnezhad et al., 2011). Outros estudos avaliaram o efeito do PRP sobre a osteoartrose em humanos com significativa redução da dor, redução da rigidez articular, da função física e do score total da doença quando foi comparado com um tratamento placebo (Patel et al., 2013). Na medicina veterinária, o PRP tem sido avaliado em cavalos para determinar seu efeito na recuperação de feridas cutâneas e musculares de difícil cicatrização, mostrando uma melhora clinica significativa com estímulo da formação de tecido de granulação e diminuição da produção de fibrina e de secreções serosas nas primeiras três semanas após o tratamento, diminuição da inflamação e melhora da cicatrização da ferida e da aparência cosmética da mesma (Iacopetti et al., 2012). Outro estudo num eqüino com lesão traumática da articulação escápulo-umeral mostrou efeito favorável do tratamento com PRP, logo após o terceiro dia da aplicação, com redução do aumento do volume articular e inicio de apoio no membro. Melhora gradativa foi verificada ao longo do tratamento (Carmona & López, 2011).

Em pequenos animais, também tem sido avaliados os efeitos do PRP, principalmente em cães. Num dos estudos avaliou-se seu efeito na expressão gênica em modelo canino de tratamento do ligamento cruzado cranial, encontrando-se um aumento nos níveis de mRNA de substâncias como colágeno tipo I e III, metaloproteinases da matriz 1 e 13 e TGF-β às duas, seis e 12 semanas após a cirurgia de substituição do ligamento. O PRP pode alterar a expressão de alguns genes específicos, especialmente durante os estágios precoces da remodelação do enxerto, fato que pode explicar seu efeito benéfico no processo de maturação dos enxertos empregados na reparação do ligamento cruzado cranial (Xie et al., 2013a). Outro estudo em cães avaliou o efeito do PRP na revascularização e reinervação de autoenxertos empregados na reparação do ligamento cruzado cranial, onde foi observado um incremento na expressão do mRNA de moléculas como o VEGF, trombospondina 1, neurotropina 3 e fator de crescimento neural (Xie et al., 2013b).

O PRP foi utilizado na cicatrização de anastomose intestinal em ratos, cujo resultado mostrou que os grupos de animais tratados com PRP tiveram um aumento significativo nos valores da pressão de ruptura anastomótica e na concentração de hidroxiprolina, enquanto as concentrações altas de PRP ocasionaram diminuição significativa nesses mesmos valores e concentrações baixas não tiveram nenhum efeito nos parâmetros avaliados. As concentrações do PRP interferem na eficácia dessa terapia. (Yamaguchi et al., 2010).

Outro estudo no qual foram utilizados cães que sofreram ruptura do ligamento cruzado cranial espontânea e que foram submetidos a tratamento cirúrgico acompanhado de terapia com PRP ou com agentes modificadores da OA e que foram submetidos a avaliações radiográficas e em plataforma de força, encontrou que no grupo tratado com PRP os valores de apoio na plataforma de força do membro acometido e tratado com PRP foram aumentando até igualar os valores do membro contralateral ao longo do estudo, fato que não ocorreu no grupo que não recebeu esse tratamento. Isso sugere que a injeção intra-articular dessa substância foi favorável nas alterações degenerativas articulares pelo menos durante o tempo do estudo (Silva, 2012).



Considerações finais

A área da terapia regenerativa constitui-se numa nova modalidade terapêutica que vem ganhando espaço no tratamento de diferentes doenças tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária. O emprego de substâncias autólogas e principalmente de células obtidas a partir de diferentes fontes biológicas representa uma excelente alternativa terapêutica para abordar o tratamento de algumas afecções que até agora não tem nenhum tratamento satisfatório.

Como foi descrito acima, o PRP é relativamente fácil de coletar, seguro para seu uso em diversos pacientes, é um importante modulador das respostas inflamatórias desatadas após que acontece alguma injúria tecidual, sendo fundamental no controle e resolução da fase inflamatória, regulando a migração de diferentes tipos de células como os neutrófilos e os macrófagos responsáveis pela fagocitose e limpeza do local afetado.

Adicionalmente, o alto conteúdo de fatores de crescimento liberado através das plaquetas e de outras fontes estimula a fase de proliferação, durante a qual tem lugar a síntese da matriz extracelular e a vascularização do local, fatores que propiciam um melhor ambiente para a chegada dos fatores de crescimento e das células que influem na regeneração do tecido lesado e aperfeiçoam a formação de um tecido novo com propriedades mecânicas e biológicas similares aos tecidos sadios.

Para obter um efeito positivo empregando o PRP é necessária a associação de diversos fatores durante sua obtenção. Os pontos críticos a considerar e que podem interferir nos resultados obtidos são o método de coleta do sangue, o tempo e a força de centrifugação, a fração de plasma colida após a centrifugação, a substância empregada para ativar o PRP e a aplicação no local afetado. Falhas em algum desses pontos podem conduzir a erros terapêuticos que podem não ter nenhum efeito benéfico e até causar efeitos deletérios como retraso e alteração no processo de cicatrização.

O PRP tem mostrado resultados importantes e promissores em diversas áreas da medicina e cirurgia veterinárias, demonstrando seu potencial quando foi empregado em diferentes pesquisas e como tratamento em alguns casos clínicos. Seus resultados benéficos foram demonstrados em diferentes tecidos tratados, principalmente no musculoesquelético, onde foram obtidos resultados significativamente melhores quando se emprego o PRP e se comparou com os tratamentos convencionais. Os concentrados autólogos de plaquetas também foram empregados em cirurgias abdominais, como coadjuvante na reparação de feridas cutâneas infectadas e de difícil cicatrização, em fraturas, no tratamento de doenças articulares como a osteoartrose, lesões da cartilagem, tendões e ligamentos e em todos os casos comprovou-se a sua contribuição positiva no processo de reparação tecidual.



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Calidad de leches crudas en empresas ganaderas doble propósito en el departamento de Córdoba (Colombia) en condiciones de máxima

precipitación1

RESEARCH ARTICLE

Virginia Rodríguez Rodríguez2, Alfonso Calderón Rangel3, Arles Acosta Ruiz4

1,Financiado por la División de Investigaciones y Extensión de la Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.

2,Grupo de Investigaciones Microbiológicas y Biomédicas de Córdoba (GIMBIC), Programa de Bacteriología, Universidad de Córdoba, Montería,

Colombia. 3,Estudiante del Doctorado en Medicina Tropical, SUE-Caribe, Universidad

de Córdoba. Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico (IIBT), Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba,

Montería, Colombia. 4,Laboratorio de Lactología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,

Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.

[email protected]

(Recibido: 23 de Marzo de 2014 Aprobado: 10 de Septiembre de 2014 Actualizado: 01 de julio de 2015)

DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.5

RESUMEN: El propósito en la producción agropecuaria es la obtención de alimentos de excelente calidad composicional y microbiológica para disminuir los riesgos en salud pública. En la leche, los altos conteos de mesófilos indican una deficiente manipulación y la presencia de coliformes es evidencia de contaminación. El objetivo del presente estudio fue conocer la calidad fisicoquímica, microbiológica y sanidad de la ubre en leches crudas provenientes de empresas ganaderas doble propósito en Córdoba (Colombia), durante máxima precipitación. Mediante un muestreo no probabilístico y un estudio transversal, se recolectaron muestras de leche cruda en 149 empresas ganaderas. Los datos obtenidos se analizaron por estadística descriptiva. Los parámetros fisicoquímicos se encontraron dentro de los valores normales de la legislación colombiana; los promedios del recuento de mesófilos, de coliformes totales, de fecales y el recuento de células somáticas fueron altos. Las variables analizadas permiten establecer que la calidad fisicoquímica es buena, pero hay deficiencias en la calidad microbiológica y la sanidad de las ubres.

Palabras clave: antibióticos, calidad, coliformes, composición leche cruda, mesófilos, recuento de células somáticas



Quality of raw milk in dual purpose cattle farms in the Department of Córdoba (Colombia), under maximum precipitation conditions

ABSTRACT: The purpose in agricultural production is to obtain food of excellent compositional and microbiological quality to reduce public health risks. In milk, high numbers of mesophilic counts indicate poor handling and the presence of coliforms are evidence of contamination. The objective of this study was to determine,the physicochemical, microbiological quality and the udder health in raw milk in a period of maximum precipitation, from dual purpose farms in the Department of Córdoba (Colombia). Using a non-probabilistic sampling and a cross-sectional study, 149 samples of raw milk were collected in dual purpose cattle farms. The obtained data was analyzed using descriptive statistics..The physicochemical parameters were found within the normal range according to Colombian legislation. The averages of mesophilic, total coliform, fecal counts and the count of somatic cells were high. The variables analyzed establish that the physicochemical quality is good but there are shortcomings in the microbiological quality and udder health.

Key words: antibiotics, composition, coliform, mesophilic, raw milk, quality, somatic cell counter

Introducción

La tendencia mundial en la producción agropecuaria es la obtención de alimentos de excelente calidad e inocuos para el consumo humano y son las empresas ganaderas productoras de leche, el eslabón primario, desde donde se debe empezar a garantizar las condiciones para la obtención de un producto de óptima calidad dentro de la cadena láctea (Calderón et al., 2006).

Un estudio previo en Colombia ha propuesto que una leche de excelente calidad debe presentar los porcentajes de proteína mayores a 3,2%, grasa mayor a 3,5%, sólidos totales mayores a 12,2%, recuentos de mesófilos inferiores a 50000 UFC/ml, células somáticas menores a 100000 CS/ml (Calderón et al., 2006); y la legislación colombiana establece que la leche para consumo humano debe ser libres de inhibidores o de sustancias extrañas y se debe asegurar su inocuidad (MinProtección, 2006).

En Colombia la normatividad oficial establece como parámetro de calidad microbiológica el recuento de mesófilos (MinProtección, 2006) y se define a los mesófilos como bacterias que crecen en un rango de temperatura entre 20 y 40oC; este parámetro es un indicador de la calidad microbiológica de la leche cruda (Chacón, 2004). Un bajo recuento de mesófilos no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas; igualmente, un elevado recuento de mesófilos no significa presencia de flora patógena, sino excesiva contaminación de la materia prima y deficiente manipulación durante el proceso de manufactura (Ortiz & Ríos, 2006). Dentro del grupo de los coliformes totales están los coliformes fecales, evidencia de que un alimento ha sido contaminado con materia fecal (Salomón et al., 2006).

Las células somáticas son indicativas del grado de inflamación de las glándulas mamarias (mastitis) como consecuencia de la agresión de patógenos u otros factores de



índole traumática. Así, el recuento de células somáticas (RCS) aumenta en la leche en proporción directa con la severidad del cuadro infeccioso; su cuantificación constituye uno de los parámetros de mayor interés para determinar el estado sanitario de la ubre y la calidad de la leche que se produce (Cerón et al., 2007; Calderón et al., 2012).

Altos recuentos de mesófilos y células somáticas en el momento de la pasteurización, liberan enzimas proteolíticas que disminuyen la vida útil del producto (Calderón et al., 2006) y además reducen los porcentajes de las características fisicoquímicas y rendimientos de la leche cuando se somete a procesos de coagulación (Calderón et al., 2012). Además de establecer la calidad fisicoquímica, el objetivo general fue conocer la calidad microbiológica, incluyendo la determinación de coliformes totales y fecales en leches crudas para proponer estrategias de manejo que permitan aumentar la competitividad de la leche del sistema doble propósito en el departamento de Córdoba.


Tipo de estudio

Descriptivo de corte transversal.

Lugar de estudio

Se realizó en ocho municipios del departamento de Córdoba (Colombia).

Tamaño de muestra

Se estimó que en el departamento de Córdoba hay 19.097 empresas ganaderas tipo doble propósito; tomando una prevalencia del 10%, una confiablidad del 95% y una amplitud de intervalo del 0,1; como resultado se obtuvo 134 empresas ganaderas, pero se aumentó el número a 149 empresas a evaluar, pertenecientes a 3 empresas acopiadoras y procesadoras de leche. Estas muestras fueron tomadas en época de máxima precipitación.

Criterios de selección

Las empresas ganaderas se seleccionaron teniendo en cuenta su ubicación dentro de Córdoba, que sean manejadas bajo el sistema doble propósito, y consentimiento y participación activa de los propietarios o administradores, quienes respondieron una encuesta de manejo general sobre aspectos administrativos de las empresas.

Toma de muestra

Para la determinación de los diferentes parámetros fisicoquímicos y microbiológicos en cada una de las empresas se tomó una muestra de leche cruda de 200 ml de la siguiente forma. Cuando la leche fue almacenada en un sólo recipiente por medio de un agitador manual de acero inoxidable estéril, se homogenizo durante 3 o 4 minutos y con un cucharón de acero inoxidable estéril se obtuvo la muestra de 200 ml; cuando la leche se almacenó en diferentes cantinas o recipientes de plástico, en cada uno de estos recipientes se obtuvo una muestra siguiendo la metodología anteriormente descrita y de la sumatoria de las muestras se extrajo la muestra; donde hubo tanque refrigerado,



previa agitación por 10 minutos se tomó la muestra de 200 ml de leche por medio de un cucharón de acero inoxidable estéril. Todas las muestras se recolectaron en frascos estériles tapa rosca azul, previamente rotulados, y se conservaron en refrigeración (4°C) hasta su procesamiento en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Salud, Programa de Bacteriología, donde se realizaron los análisis microbiológicos y residuos de antibióticos, y una alícuota al Laboratorio de Lactología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia donde se implementó el análisis fisicoquímico y el RCS; las muestras se procesaron antes de 6 horas después de su recolección.

Determinación de parámetros fisicoquímicos

Para la determinación de los parámetros fisicoquímicos se hizo por duplicado, la densidad se implementó por el método de termolactodensímetro de Quevenne y su lectura se reportó a 15oC (Icontec, 1993), la acidez se evaluó por la titulación con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N (Icontec, 1993) y el resultado se informó como porcentaje de ácido láctico (% de a. láctico); el porcentaje de grasa (% de grasa) por el método de Gerber (Gerber, 1994), el porcentaje de proteína (% de proteína) y de lactosa (% de lactosa) por un analizador ultrasónico de leche (Biolac 60), sólidos no grasos (% de SNG) por el refractómetro de Bertuczi, los sólidos totales (% de ST) por el método de la estufa y el porcentaje de minerales y adición de agua por el analizador ultrasónico de leche (Biolac 60). Para la discusión de la calidad físicoquímica de la leche cruda se tomó como referencia lo estipulado en el Decreto 616 de 2006 (MinProtección, 2006).

Determinación de parámetros microbiológicos

El recuento de mesófilos aerobios se determinó por medio del recuento estándar en placa (SPC), la determinación de coliformes totales por el número más probable (NMP), los coliformes fecales por la prueba de MacKenzie; estas determinaciones se efectuaron de acuerdo con los protocolos descritos por el Invima (1998) y se reportaron como NMP. El análisis de residuos de antibióticos (inhibidores) mediante la prueba colorimétrica (Delvotest), que se implementó de acuerdo con las especificaciones de la casa comercial.

Determinación de la sanidad de la ubre

El recuento de las células somáticas (RCS) se realizó mediante determinación fluorescente por medio del contador óptico de células, que emplea yoduro de propidio (DeLaval, 2005).

Análisis de resultados

Se realizó un análisis descriptivo de las variables fisicoquímicas, microbiológicas y sanidad de la ubre. El software implementado para el análisis estadístico fue SAS (2001).




Se tomaron 149 muestras de leche cruda que proveen a tres empresas procesadoras en Córdoba; la empresa uno aportó el 51% (76/149), la dos el 22% (33/149) y la tres el 27% (40/14) de las muestras; la distribucion y porcentaje de las empresas ganaderas por municipio se muestra en la Tabla 1. El total de vacas en ordeño fue de 4675 con un mínimo de 3 y un máxino de 220 vacas por empresa, el volumen de producción por finca fluctuó entre 10 y 1010 L y la producción promedio fue de 3,7 L con un mínimo de 2 y un máximo de 9 L.

En la mayoría de las fincas evaluadas (99,93%) el ordeño fue realizado en forma manual; el 96,64% (144/149) cuentan con un establo destinado para el ordeño, de estos el 59,06% (88/149) estaban cubiertos y en el 40,94% (61/149) parcialmente cubiertos. Los pisos del lugar destinado para el ordeño en el 58,38% (87/149) fue tierra y en el 41,62% (62/149) cemento. Solamente el 2,01% (3/149) de las empresas cuentan con tanque de refrigeración para la conservación de la leche. El 99,33% (148/149) filtran la leche y los sistemas utilizados para filtrar son: colador plástico 56,08% (83/148), filtro desechable 36,49% (54/148), tela 4,05% (6/148), colador metálico 2,03% (3/148), solamente en el 1,35% (2/149) el filtro fue en línea que correspondió a 2 fincas con ordeño mecánico.

De las 149 empresas ganaderas involucradas, sólo el 52,34% (78/149) realizan la prueba del CMT. El 58,38% (87/149) no están certificadas como fincas libres de brucelosis y en el 80,53% (1207/149) no declaradas libres de tuberculosis bovina; planes preventivos que deben que deben instaurar las empresas para certificarse en buenas prácticas ganaderas (MinProtección, 2006; ICA, 2008).

Al evaluar el manejo que le dan a la leche procedente de vacas que reciben tratamientos con antibióticos, el 78,52% (117/149) de las empresas no ordeñan y dejan que las crías se la mamen, el 8,05% (12/149) ordeñan y sumnistran esta leche a los animales de compañía (caninos y felinos), el 5,36% (8/149) descartan la leche, el 8,05% (8/149) se entrega para consumo humano y en el 0,67% (1/149) fue



autoconsumo humano. Es ideal que leche proveniente de vacas tratadas con antibióticos no sea destinada para consumo humano y se descarte su uso, ya que su ingestión puede provocar alergias, disbacteriosis, sobrecrecimientos y resistencia bacteriana (Máttar et al., 2009). Se hace necesario implementar controles en plantas para detectar su presencia; debido a que en muchas ocasiones es comercializada con empresas que no realizan los respectivos análisis (Calderón et al., 2008).

La distribución de la densidad de acuerdo a los parámetros de la legislación colombiana (Figura 1). El promedio de la densidad en este estudio (Tabla 2) está dentro del rango normal establecido por la legislación colombiana. Valores de 1,032±0,001 y de 1,032±0,007 g/ml, han sido reportados en leches sin mastitis subclínica en la región (Calderón et al., 2011; Calderón et al., 2012). En México, mayores valores de densidades se asociaron con altos porcentajes de proteína y sólidos totales (Bernal et al., 2007).



La clasificación de la acidez con relación a la legislación colombiana (Figura 2). El promedio de la acidez en este estudio (Tabla 2) está dentro del rango señalado como normal dentro de la legislación colombiana. Valores más altos (0,19±0,18% y 0,17±0,01%) han sido reportados en Córdoba (Calderón et al., 2007; Calderón et al., 2012), donde el incremento se asoció con la falta de refrigeración de la leche, almacenamiento en materiales no apropiados y la alta temperatura ambiental en la zona. Una alta acidez es un indicador del detrimento bacteriológico de la leche y de un mal manejo antes de su recepción en las plantas procesadoras de leche (Chacón, 2004). En México, hallaron diferencias significativas entre muestras de máxima y mínima precipitación, donde la mayor acidez se presentó en la época seca por las altas temperaturas ambientales y la falta de enfriamiento de la leche (Álvarez et al., 2012). Igualmente, en Barinas (Venezuela) encontraron diferencias significativas en la época de mínima precipitación y entre la finca y la planta por la manipulación no adecuada (García et al., 2013).

La distribución de la grasa de acuerdo a los parámetros de la legislación colombiana (Figura 3). El promedio del porcentaje de la grasa obtenido en este estudio (Tabla 2); este valor puede deberse al tipo racial adaptado en la zona donde hay cruces Bos taurus x Bos indicus (Briñez et al., 2008) y al sistema de pastoreo evidenciado en el 100% de las empresas evaluadas. Se determinó que la época del año desempeña un papel importante en la variación de los componentes de la leche para los porcentajes de grasa y proteína, siendo estos más altos durante la época poco lluviosa (White et al., 2002). En leches de ganado Gyr en Brasil, se observaron que altos RCS no se asociaron con la reducción del porcentaje de grasa (Barbosa et al., 2013).



El promedio del porcentaje de la lactosa fue de 4,59%±0,25 (Tabla 2). Valores más altos (4,79±0,187% y 4,90±0,23%) han sido determinados en la región (Calderón et al., 2011; Calderón et al., 2012) en leche sin mastitis subclínica. El porcentaje de lactosa no presentó cambios significativos entre las épocas seca, de lluvias e invierno (Álvarez et al., 2012) y leches con altos RCS disminuyen el porcentaje de lactosa (Barbosa et al., 2013).

La distribución del porcentaje de la proteína (Figura 4). El promedio del porcentaje de proteína fue 2,98±0,17 (Tabla 2). Valores de 3,6±0,42 y de 3,22±0,09 han sido reportados en leches sin mastitis subclínica en empresas ganaderas del sistema doble propósito en Montería (Calderón et al., 2007; Calderón et al., 2011) y de 3,28±0,23% (Calderón et al., 2012). Este bajo promedio obtenido en el presente estudio puede deberse a la falta de una selección genética, a la poca suplementación y altos RCS que afectan la calidad fisicoquímica de la leche (Calderón et al., 2012). Mayores porcentajes de proteína han sido reportados en México en condiciones similares de manejo (Álvarez et al., 2012) de 3,29% (García et al., 2013), de 3,49% en Venezuela. En Paraguay hallaron que altos RCS disminuyeron el porcentaje de proteína (Sandoval et al., 2011). Se ha observado que el porcentaje de proteína varió por la época del año (Álvarez et al., 2012) y altos RCS están afectando el porcentaje de proteína en leches de vacas en tres ganaderías Gyr del Brasil (Barbosa et al., 2013).



La distribución del porcentaje de los sólidos totales (Figura 5) y el promedio de la densidad en este estudio (Tabla 2). Mayores porcentajes de sólidos totales han sido reportados en otras latitudes como: 12,37% en Brasil (Newton et al., 2004), 12,97% en Canadá y 13,95% en Nueva Zelanda por Machado et al. (2000) y 12,18%±0,42 en Argentina (Revelli et al., 2011); valores que se pueden deber a la selección y mejoramiento animal. Se determinó que el porcentaje de sólidos totales no presentó cambios significativos por época del año (Álvarez et al., 2012) y que altos RCS redujeron el porcentaje de sólidos totales (Sandoval et al., 2011).



El promedio de los mesófilos fue de 1039216,78±1351600,52 UFC/ml, con un valor mínimo de 1000 y máximo de 9400000 UFC/ml (Tabla 2); este alto recuento de mesófilos puede deberse a que solo el 2,01% (3/149) de las empresas cuentan con tanque de refrigeración para la conservación de la leche; igualmente, factores como las malas condiciones higiénicas de los establos, la falta de implementación de prácticas de higienización de pezones, la inadecuada rutina de limpieza, la inapropiada desinfección de los pezones, la deficiente desinfección de los recipientes usados en el ordeño, pueden aumentar el recuento de mesófilos; pero, estos factores de manejo no fueron evaluados dentro de este estudio. En el Oriente antioqueño proponen que al mejorar las variables de manejo se mejora la calidad bacteriológica de la leche (Ruiz et al., 2012). En Hidalgo (México), que para mejorar la calidad bacteriológica de la leche se debe reducir el tiempo de exposición a factores ambientales como: temperatura, humedad, polvo (Cervantes et al., 2013). En diferentes regiones de Colombia establecieron que el 93,9% de las leches presentaron recuentos de mesófilos hasta de 200000 y de estas el 84,49% hasta 100000 UFC/ml parámetro exigido por la Comunidad Europea y Estados Unidos, y el 47,53%de las muestras presentaron mesófilos por debajo de los 25000 UFC/ml (Vásquez et al., 2012).

Solamente el 27,51% (41/149) de las empresas ganaderas, de acuerdo a la Resolución 000017 de 2012 (MinProtección, 2012), deben recibir bonificación ya que los mesófilos fueron menores a 200000 UFC/ml (Tabla 3). Un promedio de 160,346±213,354 UFC/ml fue reportado para la misma región y se encontraron diferencias entre leche no refrigerada (235,450±252,559 UFC/ml) y leche refrigerada (74,514±125,222 UFC/ml) (Calderón et al., 2012), donde estas diferencias se debieron al sistema de enfriamiento de la leche cuyo objetivo es inhibir el crecimiento bacteriano, ampliar el tiempo de almacenamiento en finca para disminuir los costos de transporte de la leche (DeLaval, 2006). Valores 4500 UFC/ml han sido reportados en San Pedro de los Milagros en el norte de Antioquía, con ordeños manuales y mecánicos en sistemas especializados de producción de leche (Ruiz et al., 2012).

La distribución de los coliformes totales (NMP/ml) en el 12,08% (18/149) fueron menores a 50 NMP/ml; en el 2,01% (3/149) de las muestras de leche los coliformes totales oscilaron entre 51 a 100 NMP/ml; en el 14,09% (21/149) los coliformes totales fluctuaron entre 101 a 750 NMP/ml y en el 71,82% (107/149) los coliformes fueron mayores a 750 NMP/ml. La normatividad colombiana no establece el recuento de coliformes totales y fecales como criterio para evaluar la calidad microbiológica de la leche cruda; la alta carga de bacterias contaminantes en la leche disminuye la vida útil



de los productos elaborados, reduce la calidad organoléptica y nutricional e interfiere en los procesos de fermentación ácido láctica y en la coagulación enzimática promoviendo el deterioro o proteólisis de las caseínas (Signorini et al., 2008). Recuentos elevados de bacterias mesófilas aerobias (BMA), bacterias coliformes totales (BCT) y bacterias psicrófilas pueden ser una fuente de transmisión de intoxicaciones alimentarias (Silanikove et al., 2010). Mediante programas de prevención en el ordeño se puede disminuir el riesgo de transmisión de enfermedades, pero en los procesos de manufactura como producción de quesos se ha aislado E. coli, indicador de contaminación fecal o deficiente higienización durante la fabricación de los quesos (Durán et al., 2010); lo cual constituye un riesgo para la salud pública, de origen manufacturero.

El 71,81% de las empresas ganaderas vinculadas al estudio presentaron BCT superiores a 750 NMP/ml. En Paipa (Boyacá) determinaron coliformes totales y fecales en leches crudas y concluyeron que su presencia fue por la no implementación de las buenas prácticas en el ordeño, almacenamiento y transporte de la leche (Neira & De Silvestri, 2006). La presencia de un número elevado de BCT constituye una evidencia del inadecuado manejo higiénico-sanitario de la leche cruda; además de ser indicativo de la probable presencia de cepas patógenas (Higgins et al., 2007).

En el 12,08% (18/14) de las muestras de leche el BCT fue menor a 50 NMP/ml, que es ideal en cualquier sistema de producción de leche. Para disminuir los coliformes en leche cruda se deben implementar buenas prácticas de manejo como: implementación del presellado con productos recomendados para este fin, tiempo adecuado del presellado, secado de los pezones con papel desechable, uso de guantes de látex recomendados para el ordeño y almacenamiento de la leche a 4oC en recipientes adecuados y recomendados por la normatividad e industria de alimentos; prácticas que garantizan pezones limpios, secos y sanos, primera norma para obtener leche de excelente calidad bacteriológica. En Venezuela, en leches crudas se encontraron valores de 1,2 x 103 UFC/ml de BCT, señalando que esta carga microbiana se debió a que no existieron las condiciones higiénicas necesarias en la recolección de las muestras (Monsalve & González, 2005).

La distribución del recuento de coliformes fecales (NMP/ml) en leches crudas en el 40,26% (60/149) fueron menores a 100 NMP/ml, en el 18,12% (27/149) se presentaron entre 101 y 1000´y en el 41,62% (62/149) fueron mayores a 1001 NMP/ml.

Solo el 0,68% (1/149) de las muestras analizadas se detectó la presencia de inhibidores o antibióticos. Un estudio previo en la misma región, determinó que en el 25% de las muestras de leches crudas se detectó la presencia de inhibidores, lo que constituye un riesgo para la salud pública (Máttar et al., 2009). En Santa Rosa de Osos (norte de Antioquia) detectaron la presencia de residuos de medicamentos entre el 4,6 al 19,6% y no observaron asociación estadística entre RCS y la presencia de residuos, y sugieren la existencia de problemas de mastitis subclínica como también la violación a la normatividad que establece, para la leche de consumo humano, que debe ser libre de residuos de antimicrobianos y demás inhibidores (Reyes et al., 2010).

El promedio del RCS en el actual estudio fue de 385181±254015 CS/ml con un valor mínimo de 15000 y máximo de 1231500 CS/ml (Tabla 2). En leches sin mastitis subclínica en empresas ganaderas del sistema doble propósito en Monería, el RCS fue



de 230000±5650 CS/ml que fue considerado como bajo (Calderón et al., 2011), y cuando se compararon leches con bajos y altos (230000±5650 y 1253000±424500) RCS se afectó significativamente la calidad fisicoquímica y se disminuyó en un 5,58% el rendimiento en la producción de queso costeño (Calderón et al., 2011). Un promedio de 345133±302241 CS/ml fue reportado para la misma región (Calderón et al., 2012). En otras regiones de Colombia como el norte de Antioquia se han reportado RCS menores o iguales a 400000 CS/ml (Posada et al., 2010); parámetro aceptado por la industria y algunos países como USA (Ruegg & Pantoja, 2013). Recuentos ≥500000 CS/ml podría haber hasta el 16% de los cuartos infectados, una reducción del 6% en la producción de leche (NMC, 1996; Sharif & Muhammad, 2008) y pérdidas en la calidad (Calderón et al., 2012). Igualmente en diferentes regiones de Colombia, se ha obtenido un promedio de 642000 CS/ml y en el 39,54% de la leche no superó los estándares internacionales para RCS; para ser competitivos en mercados internacionales se debe disminuir este recuento (Vásquez et al., 2012) ya que altos RCS están afectando el porcentaje de proteína (Barbosa et al., 2013).

En el 6,71% (10/149) de las empresas ganaderas el RCS fue menor o igual a 100000 CS/ml (Tabla 4), siendo este recuento excelente para la sanidad de la ubre; en el 17,44% (26/149) el RCS fue menor o igual a 200000 (Tabla 4) considerado como bueno, y en el 75,85% (Tabla 4) los RCS fueron mayores a 400000 CS/ml donde se están presentando casos subclínicos y clínicos, y donde es necesario implementar de forma inmediata medidas de prevención y control de la mastitis bovina.

Conclusiones

Las variables fisicoquímicas analizadas en las leches crudas presentaron una buena calidad composicional y se encontraron dentro de los límites establecidos en la normatividad colombiana; pero, su calidad microbiológica y sanidad de la ubres son deficientes y se hace necesario implementar programas de aseguramiento de la calidad de la leche, para obtener una materia prima de óptima calidad para la industria.



Agradecimientos

Los autores agradecen a las estudiantes Rosa Ana Gutiérrez Tordecilla y Luz Esthela Parodi Urango, a los empresarios y administradores de las empresas ganaderas, sin cuya colaboración no hubiese sido posible haber adelantado este estudio, y a la División de Investigaciones y Extensión de la Universidad de Córdoba por la financiación del proyecto.


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Caracterización parasitaria de la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y su efecto en la producción de la estación piscícola flotante Intiyaco, en

el lago Guamuez (Nariño)1


Julbrinner Salas-Benavides2, Jorge Nelson López-Macías3, Alba Lucy Ortega-Salas4, Vilma Yolanda Gómez-Nieves5

1,2,3,4,5,Departamento de Recursos Hidrobiológicos, Programa de Ingeniería en Producción Acuícola, Universidad de Nariño, Pasto, Colombia

[email protected]

(Recibido: 20 de Noviembre de 2014 Aprobado: 06 de Mayo de 2015 Actualizado: 03 de julio de 2015)

DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.6

RESUMEN: La investigación se desarrolló durante 12 meses en la Estación Piscícola de jaulas flotantes Intiyaco de la Universidad de Nariño, localizada en el lago Guamuez, departamento de Nariño. Se analizaron 194 ejemplares de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) con rango de peso entre 8,74 y 168,85 g, talla de 100,12 mm a 220,66 mm. El estudio se propuso identificar las principales entidades parasitarias que afectan la especie íctica O. mykiss, evaluar el índice de prevalencia, el efecto de la asociación entre las patologías parasitarias y su impacto en las distintas etapas del cultivo en la producción.

Los datos fueron sometidos a análisis monofactorial multivariante Chi cuadrado de Pearson y análisis de regresión logística, utilizando el programa estadístico IBM SPSS 20 – Statistical Package (2013). Los resultados demuestran que las patologías parasitarias se encuentran principalmente en la cámara branquial, con prevalencias significativas (P<0,05), de las especies: Gyrodactylus sp (34,76 %); Dactylogyrus sp (27,59 %); Trichodina sp (21,67 %); e Ichthyophthirius sp (15,98 %). La investigación demostró que el 35 % de las larvas y el 23 % de los juveniles de trucha arcoíris presentaron infestaciones por exoparasitosis. El análisis diferencial del número de parásitos, valor promedio de peso y talla de los animales de O. mykiss, por etapa de cultivo en jaulas flotantes, determinó mayor prevalencia de parásitos unicelulares durante la fase larvaria de trucha arcoíris, afectando el peso y la talla de los animales enfermos (9,28 g y 10,98 mm) en comparación con los animales sanos (12,75 g y 180,37 mm). Igualmente, el número de animales enfermos durante la etapa de larvicultura fue superior en 65,5 %, con respecto a los ejemplares infestados de la fase de levante.

Palabras clave: edema, congestión, necrosis, parásitos , prevalencia, tremátodos



Parasitical characterization of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) and its effect on fish production in the ‘Intiyaco’ floating fish station in the Guamez

Lake, Nariño (Colombia)

ABSTRACT: The study was performed during 12 months in floating cages at the ‘Intiyaco’ fish station, which belongs to Universidad de Nariño, located in the Guamez lake, in the Department of Nariño (Colombia). A total of 194 specimens of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) with a weight range from 8.74 to 168.85 grams, and total length from 100.12 mm to 220.66 mm were analyzed. The study aimed to identify the main parasitic entities that affect the O.myk iss species and to evaluate the prevalence rate, the effect of the association between parasitical pathologies and their impact in the different stages of cultivation and production. Data were subjected to Multivariate Analysis, Chi square test and logistic regression analysis using the SPSS 20 - Statistical Package (2013). Results demonstrate that parasitic patologies are mainly found in the gill chamber, with significant prevalence (P<0.05) of the following species: Gyrodactylus (34.76%);Dactylogyrussp (27.59%); Trichodinasp(21.67%); and Ichthyophthiriussp (15.98%). The research demonstrated that 35% larvae and 23% juvenile rainbow trout showed exoparasitosis infestations. The differential analysis of the number of parasites, average value of total length and weight of O. mykiss fish per cultured stage in floating cages determined higher prevalence of unicellular parasites during the larval stage of rainbow trout, affecting the weight and length of diseased fish (9.28 g and 10.98 mm) compared to healthy animals (12.75 g and 180.37 mm). Also the number of animals getting sick during the larviculture phase was higher than 65.5% in relation to species infested during the growing phase.

Key words: edema, congestion, trematodes, necrosis, prevalence, parasites

Introducción

Las aguas continentales son altamente susceptibles de contaminación, razón por la cual su importancia como fuente de pesquerías naturales tiende a disminuir. Por otro lado, la población mundial, aún en países en desarrollo, está sufriendo un rápido cambio hacia la urbanización, haciendo que el hombre sea más dependiente de un suministro comercial de alimento a través de mercados organizados que intervengan en la cadena de seguridad alimentaria. Lo anterior incrementa la presión sobre los recursos naturales entre los cuales se encuentran los hidrobiológicos, con su gran potencial inexplotado, desempeñando un papel importante en la generación no solo de alimentos, sino también de divisas (López-Macías, 2014).

En opinión de López-Macías (2014) los peces deben ser cultivados a altas densidades de siembra, en volúmenes pequeños, para optimizar el aprovechamiento del agua en la producción intensiva de proteína animal. Por tanto, es inevitable el desarrollo de condiciones que favorecen la propagación de enfermedades por la acumulación de metabolitos y deterioro de las condiciones fisicoquímicas y bacteriológicas del medio acuático. La mortalidad de organismos ícticos en áreas pequeñas (estanques, cajas, jaulas, entre otros) puede constituir un problema económico grave, por lo que justifica tomar medidas para prevenir dichas pérdidas.



La aparición de una enfermedad acuícola requiere que un agente patógeno exista, un huésped apropiado esté presente y condiciones ambientales de estrés tales como: la superpoblación; desnutrición; contenido bajo de oxígeno; solubilización y/o precipitación de materia orgánica; cambios en pH; temperatura y deficiencias vitamínicas. Así mismo, el piscicultor utiliza gran cantidad de medicamentos y químicos para una diversidad de enfermedades y parásitos generando no solo problemas de resistencia de los microorganismos, sino también la destrucción del fitoplancton y, por ende, la alteración total de la productividad primaria del medio acuático. Además, los fármacos usados en acuicultura representan hasta el 10 % de los costos directos en la truchicultura del suroccidente colombiano (Vuong et al., 1999; Keiser & Utzinger, 2005; Torres et al., 2007; López-Macías, 2014). Por esta razón, debe implementarse una producción limpia que disminuya la incidencia de patógenos.

El departamento de Nariño es líder en Colombia en la producción de trucha de altura, principalmente en el lago Guamuez; infortunadamente, este cuerpo de agua de altiplano, enfrenta desde hace varios años un gran deterioro medioambiental debido a las descargas de basuras, aguas residuales domésticas, deforestación intensa de los bosques naturales de la cuenca, actividades agrícolas y ganaderas que erosionan los suelos e incrementan la cantidad de sólidos disueltos, afectando negativamente el hábitat de los peces, toda vez que aumenta la turbidez por la disminución del oxígeno disuelto, con alteración de los procesos de respiración, visión y olfato y con ello la respuesta inmunológica de los peces, causando así enfermedades y subsecuentemente el metabolismo oxidativo de los nutrientes, lo que incide en las variables de incremento de peso, talla y conversión alimenticia, impactando la rentabilidad de la truchicultura (López & Rubio, 2003).

El cultivo de trucha en el lago Guamuez es una alternativa novedosa, frente a otras formas de producción, debido a que incentiva el mantenimiento de las fuentes de agua, la conservación de los boques primarios, el manejo adecuado de la microcuenca hidrográfica, facilita el uso integral y el manejo racional de las materias primas y recursos locales, incrementa la eficiencia tecnológica en las diferentes etapas del ciclo productivo, reduce los costos unitarios e incorpora valor agregado. Así mismo, la truchicultura puede alcanzar gran importancia dentro del sistema alimentario por la producción de bienes de gran relevancia desde el punto de vista nutricional por ubicarse en áreas deprimidas o de mediano desarrollo del departamento de Nariño, donde puede originar una serie de actividades conexas como la pesca deportiva y el turismo ecológico que estimulan el crecimiento económico.

El cultivo de trucha arcoíris está limitado por la alta mortalidad de alevinos durante la larvicultura y levante debido a la infestación de parásitos, siendo dominantes las especies pertenecientes a trematodos monogenésicos y parásitos unicelulares, los cuales, además de ocasionar considerables daños con altas mortalidades en los diferentes sistemas de producción, son también indicadores biológicos y determinan la distribución de los hospedadores, teniendo en cuenta el hábitat, sitio de infección y alta especificidad, señalando ásí el grado de polución de los ambientes al estar las poblaciones parasitarias favorecidas por las bajas concentraciones de oxígeno y alta turbidez que aumentan el número de parásitos por hospedador, predisponiendo la presencia de la enfermedad con su impacto sobre la rentabilidad del cultivo (López & Rubio, 2001).




Se analizaron 194 ejemplares de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) con un rango de peso entre 8,74 y 168,85 g, talla de 100,12 mm a 220,66 mm, recolectados aleatoriamente durante 12 meses en el periodo comprendido entre marzo de 2013 y abril de 2014; los animales muestreados fueron 76 (39,0 %) y 32 (16,6 %) larvas en época de lluvias y de menor precipitación respectivamente, así mismo, 54 (27,8 %) juveniles en época de máxima precipitación y 32 (16,6 %) juveniles en época de menor precipitación, provenientes de la Estación Piscícola Intiyaco de la Universidad de Nariño ubicada en lago Guamuez, vereda El Puerto, corregimiento de El Encano, municipio de Pasto, Colombia, en los 2840 msnm, 13 ºC de temperatura y, coordenadas geográficas de 01º 06’3.80” N y 77º 07’2.26” W.

Los ejemplares se distribuyeron aleatoriamente en 16 jaulas flotantes de 10 m3, localizadas en la Estación Piscícola Intiyaco, cada jaula consistía en una bolsa de malla multifilamento con un ojo de ¼ a ½ pulgada, según la fase de desarrollo de los ejemplares cultivados, con dimensiones 2 m de largo, 2 m de ancho y 2,5 m de profundidad, recubierta con una malla polisombra. Las truchas fueron trasladadas vivas, moribundas o recién muertas en recipientes plásticos (50 L) al Laboratorio de Fisiopatología Acuática del Departamento de Recursos Hidrobiológicos de la Universidad de Nariño para su posterior proceso.

Se analizaron las siguientes variables:

Peso. Ejemplares analizados de trucha arcoíris de Intiyaco. Talla. Longitud total y estándar de los ejemplares de trucha arcoíris. Morbilidad. Número de los ejemplares enfermos por parasitosis causadas por

trematodos monogénicos y parásitos monocelulares en la Estación Piscícola de Intiyaco.

Etapa de Cultivo. Número de los ejemplares infestados en diferentes fases de producción en la Estación Piscícola Intiyaco.

Parasitosis. Presencia de parásitos en los peces observados.

Pruebas estadísticas

Las pruebas estadísticas aplicadas en el ensayo se realizaron mediante el programa estadístico IBM SPSS 20 – Statistical Package (2013).

Análisis monofactorial multivariante

Este análisis respondió a la pregunta: ¿hay diferencia entre las enfermedades producidas por trematodos monogénicos y parásitos monocelulares con respecto a la talla, peso y variabilidad temporal en la producción de trucha arcoíris en la Estación Piscícola Intiyaco?

Chi cuadrado de Pearson

El procedimiento estableció la posible asociación entre la presencia de las enfermedades parasitarias y la valoración de peso y talla de las truchas estudiadas,



teniendo en cuenta que todos los ejemplares recibieron el mismo tipo de alimento balanceado, suministrado en igual porcentaje por unidad de peso vivo diariamente.

Análisis de regresión logística

¿Cuáles son los factores de producción piscícola (etapa de cultivo, peso y talla, asociados con las enfermedades parasitarias en la Estación Piscícola Intiyaco?


Los análisis de las 194 unidades muestrales demostraron la incidencia de parásitos externos sobre piel y cámara branquial, pero ausencia de patógenos internos en los ejemplares estudiados. Lo anterior indica que la ausencia de endoparásitos de tipo gastrointestinal y muscular corrobora la efectiva y adecuada práctica sanitaria de cultivar peces en recintos flotantes, impidiendo de esta forma la propagación de estos patógenos por la imposibilidad física de acceder a un huésped intermediario.

Las variables de estudio de la población de trucha arcoíris en la Estación Piscícola Intiyaco, y su interacción con la comunidad parasitaria, establecen que la abundancia parasitaria promedio, por etapa (larvas y juveniles) y época (máxima y mínima precipitación), así como talla y peso de los ejemplares de trucha arcoíris, no se ajustan a la distribución normal (DN), por tanto, la frecuencia de los géneros parasitarios, (Gyrodactylus sp, Dactylogyrus sp, Trichodina sp e Ichthyophthirius sp) talla y peso de O. mykiss, son estadísticamente significativos (Tabla 1).

La concentración parasitaria (# de parásitos) fue estadísticamente significativa (P<0,05) en el tejido branquial de los peces analizados, sus valores fueron 59,46 y 66,86 individuos por 4 arcos branquiales (simetría bilateral), respectivamente, para las épocas de menor y mayor precipitación. Según López-Macías (2014) todo pez debe poseer parásitos que le permita al sistema inmunológico estimularse en situaciones de infestaciones masivas. En el caso de los tremátodos parasitarios, el mismo autor recomienda, que en condiciones de homeóstasis, el número por arco branquial debe ser inferior a siete. La prueba T, determina que la concentración de los parásitos en el tejido branquial de los ejemplares analizados es significativamente mayor al valor máximo permitido (P<0,001) (Tabla1).

Las patologías parasitarias se registraron exclusivamente en tejido branquial, con prevalencias significativas (P<0,05) del orden de Gyrodactylus sp (34,76 %),



Dactylogyrus sp (27,59 %), Trichodina sp (21,67 %) e Ichthyophthirius sp (15,98 %) (Figura 1).

Según Salgado-Maldonado & Rubio-Godoy (2014), el conocimiento actual de los parásitos de agua dulce en el neotrópico se ha limitado a la evolución e historia biogeográfica de los peces hospederos y la clasificación taxonómica de las entidades parasitarias; en contraste, los estudios de comunidades de parásitos en peces es limitado (Vidal-Martínez, 2003); sin embargo, se ha mostrado alta variación en composición de especies, riqueza y diversidad. La diferencia más importante entre la infracomunidad parasitaria proveniente de zonas templadas y tropicales se debe a la presencia, en estas últimas, de un componente predecible formado por parásitos especialistas (Holmes, 1990; Kennedy & Hartvigsen, 2000; (Vidal-Martínez et al., 2002).

Violante-González (2006), Violante-González, Aguirre-Macedo & Mendoza-Franco (2007), al estudiar las poblaciones de parásitos metazoarios de peces, caracterizaron la parasitofauna, la temporalidad y los patrones que estructuran las comunidades de varias especies de peces, definiendo así, que las comunidades de los hospederos son pobres en número de especies parasitarias, pero alto en número de individuos parasitantes; lo anterior está de acuerdo con lo observado en el presente estudio.

El mayor daño inducido al tejido branquial de O. mykiss está caracterizado por edema, necrosis y telagentiasis; síntomas causados por Gyrodactylus sp que difiere significativamente de los demás géneros parasitarios (Figura 2).



La estimación de los parámetros, peso y talla de los ejemplares de O. mykiss, de esta investigación, fueron significativos (P<0,05), de 9,90±1,28 a 10,21±1,28 g y de 142,20±20,1 a 140,70±20,1 mm, respectivamente.

El análisis multivariante determinó diferencias estadísticas (P<0,005) entre los cuatro géneros de parásitos, respecto de su abundancia del hospedero, pero no detecto diferencias con proporción a las épocas y la variable talla de O. mykiss. También estableció diferencias entre el número de parásitos y las épocas de mayor y menor precipitación y crecimiento en talla de los ejemplares (Tabla 2).

Las infracomunidades parasitarias en peces marinos pueden ser más diversas que las poblaciones de peces de agua dulce (Kennedy & Bush, 1986; Kennedy & Williams, 1989; Kennedy & Bakke, 1989; Kennedy & Hartvigsen, 2000). Según Holmes (1990), los helmintos gastrointestinales de peces marinos varían en el número de especies e individuos, por lo tanto sus poblaciones son más complejas que dichas comunidades en los peces dulceacuícolas. El mismo autor observó que la mayoría de los parásitos se



comportan como especies generalistas, sin embargo, algunas son especialistas a nivel del género del hospedero, las cuales se presentan como especies dominantes.

Los estudios de dinámica de poblaciones de los parásitos en peces involucran determinar la extensión en el tiempo y en el espacio de los parámetros bioecológicos del pez hospedero siendo relevantes para examinar los engranajes biológicos de abundancia, composición, transmisión y distribución de los ensamblajes parasitarios (Rohde, 1993; Rohde, Hayward & Heap, 1995; Chisholm & I., 2003; Benz & Bullard, 2004; Poulin, 2007).

Argáez-García (2010) analizan el efecto de la temporalidad en las comunidades de helmintos, observando mayor riqueza y abundancia de especies durante la temporada de lluvias, aunque la diversidad no presentó diferencias significativas entre temporadas. A nivel de infracomunidad, el estudio citado demostró que todas las especies de parásitos son generalistas, que indica entonces, baja predictibilidad y una estructuración basada principalmente en el azar y la distribución de los hospederos intermediarios. Sin embargo, a nivel de comunidad componente, los valores de prevalencia y abundancia de las especies dominantes muestran un patrón de estructuración basado en el dominio de las especies más abundantes; de la misma manera, como se presenta en el presente estudio, existen diferencias significativas en el número de individuos (abundancia) parasitarios; así, en el periodo de mínima precipitación, el porcentaje de huéspedes es de 31,3 % y 68,7 %, en máximo régimen de lluvias (Figura 3).

Según Weins (2000) y Putman (1994), existen pocos estudios del efecto de la temporalidad tropical (secas y lluvias) en la composición y estructura de la parasitofauna; sin embargo, los mismos autores comprobaron que la respuesta de las comunidades de parásitos a la temporalidad se puede reflejar en la presencia y ausencia de especies parasitarias o en la abundancia de las mismas.



En la definición, si existe asociación o dependencia entre el número de parásitos, el peso y talla de los ejemplares infectados de O. mykiss; mediante análisis de correlación de Pearson, se identifica asociación lineal positiva significativa estadísticamente entre el peso de trucha arcoíris y la talla de los mismos (R= 0,96; P<0,001). El coeficiente de determinación (R2 = 0,92) permite inferir que la variabilidad del peso se explica en un 92 %, por la variabilidad en la talla de trucha arcoíris. Igualmente, este análisis define dependencia lineal negativa significativa entre el peso del hospedante y el número de parásitos (R= -0,22; P<0,001). El coeficiente de determinación (R2 = 0,048) permite inferir que la variabilidad del peso se explica en un 4,8 %, por la variabilidad en el número de parásitos (Tabla 3).

No existe relación de dependencia significativa (Chi-cuadrado de Pearson P>0,001) entre los géneros parasitarios y la época de prevalencia de mayor o menor precipitación (Tabla 4).

El análisis diferencial del número de parásitos, valor promedio de peso y talla de los animales de O. mykiss, por etapa de cultivo en jaulas flotantes, determinó mayor prevalencia de parásitos unicelulares durante la fase larvaria de trucha arcoíris, afectando el peso y la talla de los animales enfermos (9,28 g y 10,98 mm) en comparación con los animales sanos (12,75 g y 180,37 mm). Igualmente, el número de animales enfermos durante la etapa de larvicultura (38) fue superior en 65,5 % con respecto a los ejemplares infestados de la fase de levante (20) (Figura 4).



El porcentaje de relación del número de parásitos en larvas y juveniles de O. mykiss, según la época de mayor precipitación, estimó 24,25 % mayor invasión en esta primera fase; el valor promedio de peso y talla de sus animales señaló respectivamente 37,4 % y 67,3 %, con un mejor indicador en juveniles que en larvas. Durante el periodo de menor precipitación, el número de parásitos en larvas ocurrió en 58,12 % (Figuras 3 y 4).

El peso y talla de los ejemplares afectados con parásitos unicelulares durante la etapa de larvicultura en la estación piscícola Intiyaco fue inferior en 16,16 % a los datos reportados por Salas (2012) en condiciones similares de cultivo (Incremento de Peso Diario 1,5 g día-1 e Incremento de longitud Diaria de 0,462 mm día-1). Igual situación se presenta durante la fase de levante (Tabla 5).

El análisis monofactorial aplicado para establecer si existe diferencias en el peso y talla de los ejemplares infestados por arriba del límite permisible (López-Macías, 2014) y los “no infectados” señala alta significancia (P<0,05); así, se deduce que en presencia de parásitos, el peso tiene menor promedio (10,82±1,81 g) que en ausencia de patógenos (114,44±32,24 g); sin embargo, la variable talla no presentó diferencias estadísticas en presencia o ausencia de estas entidades parasitarias, 120,76 ± 30,81mm y 150,15±20,52 mm, respectivamente (Figura 5).



La caracterización cualitativa del opérculo como zona de exposición al ataque de parásitos, se definió con atrofia bilateral y congestión interna; condición prevalente en el margen izquierdo de este hueso. Los ejemplares presentaron esta parasitosis en el 23 % de los animales juveniles y en el 35 % de las larvas (Figura 6). Con relación al estudio de la piel, se estableció 30 % de lesiones de despigmentación y 40 % de hiperpigmentación, en los ejemplares infestados con parásitos monogenésicos.

El análisis somático, por definición anatómica externa de los hospederos, determinó que el compromiso en las aletas medias, específicamente las aletas dorsal y anal, exhiben necrosis en 10 % de su superficie tisular y la aleta caudal presentó necrosis del 80 % de su estructura histológica.



La calidad de agua en la producción, según los registros fisicoquímicos de pH, temperatura y oxígeno disuelto (O2 mg.L-1), saturación O2, dióxido de carbono (CO2 mg.L-1) y capa fótica (zona trofogénica-fotosíntesis), durante el periodo de estudio, estimados en dos sitios (A: al interior de los módulos de cultivo y B: al exterior de las jaulas a dos metros de distancia de ellas), demuestran que los rangos de estos parámetros se mantuvieron en los límites aceptables de disponibilidad de oxígeno para una especie sensible a este parámetro; condición aerobia satisfactoria al límite de la subsaturación (OD 50 %) y predominio de bicarbonatos (HCO3

-1), en condición de pH neutro y niveles bajos de CO2 ideales fisiológicamente en el metabolismo energético rentable en la producción de trucha arcoíris en el lago Guamuez (Roldán & Ramírez, 2008; Vásquez, 2005; Boyd, 2000; López-Macías, 2014) (Figura 7).

Conclusiones

Las patologías parasitarias se registraron principalmente en la cámara branquial, con prevalencias significativas (P<0,05) de las siguientes especies: Gyrodactylus sp (34,76 %); Dactylogyrus sp (27,59 %); Trichodina sp (21,67 %); e Ichthyophthirius sp (15,98 %). Los ejemplares presentaron exoparasitosis en el 35 % de las larvas y el 23 % de los juveniles. El análisis diferencial del número de parásitos, valor promedio de peso y talla de los animales de O. mykiss por etapa de cultivo en jaulas flotantes, determinó mayor prevalencia de parásitos unicelulares durante la fase larvaria de trucha arcoíris, afectando el peso y la talla de los animales enfermos (9,28 g y 120,75 mm) en comparación con los animales sanos (10,98 g y 180,37 mm). Igualmente, el número de animales enfermos durante la etapa de larvicultura fue superior en 65,55 %, con respecto a los ejemplares infestados de la fase de levante.

Porcentualmente, la relación del número de parásitos en larvas y juveniles de O. mykiss en época de mayor precipitación presenta 24,25 % de mayor invasión en esta primera fase; el valor promedio en peso y talla señaló respectivamente 37,4 % y 67,3



% con un mejor indicador en juveniles que en larvas; así mismo, durante el periodo de menor precipitación, el número de parásitos en larvas prevaleció en 58,12 %.

La infestación ectoparasitaria compromete el 10 % de las aletas dorsal y anal, así como en el 80 % la superficie tisular de la aleta caudal con necrosis histológica.

Agradecimientos

Vicerrectoría de Investigaciones, Posgrados y Relaciones Internacionales de la Universidad de Nariño – VIPRI.


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Evaluación clínica de la otitis parasitaria bovina (Rhabditis bovis) en la raza Gyr1


José Alberto Cardona-Álvarez2, 5, Mastoby Miguel Martínez-Martínez3, Jair Pérez-Osorio4

1,Financiado por la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.

2,Grupo de investigación en Medicina de Grandes Animales (MEGA), Departamento de Ciencias Pecuarias, Universidad de Córdoba, Montería,

Colombia. 3 Departamento de Ciencias Pecuarias, Universidad de Córdoba, Montería,

Colombia. 4 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Salle, Bogotá,

Colombia. 5 Bolsista do Programa Estudantes-Convênio de Pós-Graduação – PEC-PG,

da CAPES/CNPq – Brasil.

[email protected]

(Recibido: 3 de Octubre de 2014 Aprobado: 2 de Diciembre de 2014 Actualizado: 03 de julio de 2015)

DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.7

RESUMEN: El objetivo del presente artículo fue realizar un informe detallado sobre la otitis parasitaria bovina (Rhabditis bovis) en la raza Gyr. En la cual se incluyen aspectos epidemiológicos de orden nacional e internacional, geográficos, manifestaciones clínicas, métodos diagnósticos y tratamiento. La otitis parasitaria clínica es causada por nematodos rhabditiformes, que causa malestar en los animales de la raza Gyr puros, generando pérdidas económicas en la industria ganadera. Se pretende actualizar y generar conciencia en los médicos veterinarios sobre el diagnóstico, el seguimiento epidemiológico y las estrategias de control de la enfermedad.

Palabras clave: nematodo, rhabditiformes, parásitos (Fuente: MeSH)

Clinical evaluation of bovine parasitic otitis (Rhabditis bovis) in the race Gyr

ABSTRACT: The objective of this article was to conduct a detailed report on bovine parasitic otitis (Rhabditis bovis) on the Gyr breed. Epidemiological aspects, of the national and international order including geographical, clinical, diagnostic methods and treatment are included. The clinical parasitic otitis is caused by rhabditiform nematodes that cause discomfort in pure breed Gyr animals, generating economic losses in the cattle industry. It is intended to update and generate awareness among veterinarians about diagnosis, epidemiological monitoring of the disease and the strategies for disease control.



Key words: nematode, rhabditiform, parasites (Source: MeSH)

Introducción

La otitis parasitaria bovina es causada por nematodos del género Rhabditis, se presenta principalmente en bovinos de la raza Gyr e Indubrasil. La raza Gyr parece estar predispuesta a la enfermedad en comparación con otras razas, debido a la conformación anatómica del pabellón auricular, el cual es alargado, pendulante, en forma tubular, con su porción superior enrollada sobre sí misma, abriéndose gradualmente hacia fuera, curvándose hacia adentro, lo que favorece la retención de cerumen, proporcionando así un ambiente propicio para la reproducción y permanencia del parásito (Leite et al., 1993; Vieira et al., 1998; Vieira et al., 2001) (Figura 1).

Epidemiología

Condiciones agroecológicas

Se ha reportado en algunos países con explotaciones en clima caliente y húmedo, como Tanzania (Msolla et al., 1993), Kenia (Round, 1962; Matandala et al., 2002) y Zimbabwe (Ushewokunze-Obatolu et al., 1999). Aunque la mayoría de reportes son de Brasil, principalmente en Minas Gerais, Goiás, Pernambuco, São Paulo, Rio de Janeiro y Espírito Santo (Leite et al., 1993; Verocai et al., 2007; Beltrame et al., 2011). En Colombia, solo se ha reportado la enfermedad en bovinos puros de la raza Gyr en el departamento de Córdoba (Cardona et al., 2010).

Vieira et al. (2001) y Duarte & Hamdan (2004) expresan que el género Rhabditis es un parásito saprófito que habita en zonas de bosque húmedo tropical, que vive



comúnmente en materias fecales, tierras húmedas y materia orgánica en descomposición. Por otra parte, Abdalla et al. (2008), Souza et al. (2008) y Santos et al. (2009) afirman que esta condición parasitaria es común en rebaños que se encuentran en países de bosque húmedo tropical, sumada a las características propicias que favorecen las orejas de los bovinos de la raza Gyr (Leite et al., 1993; Vieira et al., 2001).

Parece ser que el hospedero adquiere el parásito en las primeras etapas de su vida cuando está descansando o acostado en el suelo, debido a que todo el ciclo del parásito sucede en el hospedero reiniciando el ciclo con la muerte del mismo; las larvas adquieren su estado adulto antes de la 48 horas, en este punto pueden copular; el macho deposita su esperma en la Receptacula seminis de la hembra, la cual copula una sola vez en su vida, ya que los huevos eclosionan en su interior matándola y sirviendo como recipiente para su descendencia, mientras que el macho continúa activamente moviéndose en busca de hembras aún no fertilizadas (Vieira et al., 2001; Duarte & Hamdan, 2004).

Fuentes de contagio/Factores de riesgo

Los principales factores de riesgo para el contagio son las actividades grupales como baños ectoparasiticidas, vacunación, vermifugación y otras prácticas zootécnicas, asimismo el contacto de animales enfermos con animales sanos en los sitios de libre desplazamiento (Msolla et al., 1986; Msolla et al., 1987). Sin embargo, se reporta que un factor de riesgo importante lo constituye la presencia exagerada de moscas, adicionalmente la época lluviosa favorece la presentación de la enfermedad (Ushewokunze-Obatolu et al., 1999).

Frecuencia/Prevalencia

Existen diversos reportes de frecuencia de presentación de otitis parasitaria en países tropicales con características agroecológicas similares, como los reportados por Leite et al. (1993) con 93% en el estado de Minas Gerais; Vieira et al. (1998) con 78,43% en el estado de Goiás; Duarte et al. (2001) con 60,1% en el estado de Minas Gerais y Verocai et al. (2007) con 90,9% en Rio de Janeiro. En Colombia solo se ha determinado la frecuencia de presentación en bovinos Gyr puros de seis ganaderías del departamento de Córdoba con 63,2% (Cardona et al., 2012) y en tres explotaciones ganaderas del departamento de Sucre con una frecuencia de presentación del 85,6% (Cardona et al., 2014). No existen datos en la literatura consultada sobre la influencia de la edad y el sexo en la presentación de otitis parasitaria por Rhabditis bovis.

Manifestaciones clínicas

Es preciso tener en cuenta la anamnesis, el tiempo de padecimiento de la enfermedad y la evolución del cuadro, así como la observación directa de la motilidad del parásito en el cerumen como datos importantes para el diagnóstico clínico de otitis parasitaria bovina por Rhabditis spp. (Vieira et al., 2001; Santos et al., 2009).

Las manifestaciones clínicas incluyen: a la inspección se puede observar que algunos animales presentan movimientos laterales súbitos de la cabeza, más en detalle se observa otitis clínica, otorrea que puede ser purulenta (Figura 2), olor fétido, cierto



grado de estenosis del conducto auditivo y prurito intenso expresado con movimientos constantes y rascado excesivo de las orejas (Duarte & Hamdan, 2004; Verocai et al., 2009). Por otra parte, algunas otitis pueden llegar a producir síndrome vestibular, y concomitantemente se puede producir lesión del nervio facial (Abdalla et al., 2008; Souza et al., 2008).

Vieira et al. (1998) y Vieira et al. (2001) describen que los animales con otitis parasitaria en la mayoría de los casos presentan la afección en ambas orejas, acompañados principalmente de otorrea con secreción algunas veces purulenta y fétida, dolor a la palpación en las bases de los orejas y linfadenitis de los nódulos linfáticos mandibulares.

Diagnóstico

A la inspección del conducto auditivo externo, se puede observar cierto grado de estenosis así como la otorrea algunas veces purulenta, y en forma directa el movimiento de los parásitos, de igual forma se puede percibir el olor fétido de las secreciones (Duarte & Hamdan, 2004; Cardona et al., 2010; Cardona et al., 2012; Cardona et al., 2014).

Al examinar clínicamente ambos conductos auditivos, de acuerdo con el protocolo propuesto por Leite et al. (1994), se puede establecer la presencia de otitis clínica con



presencia de olor fétido, otorrea, eritema y estenosis. Las muestras de cerumen se obtienen por hisopado del conducto auditivo externo, pudiéndose observar en forma directa el movimiento del parásito en el cerumen. Posteriormente, el material se deposita en tubos de ensayo con alcohol al 70% y transportados a temperatura ambiente para su evaluación microscópica en el Laboratorio de Parasitología, donde se determinará la presencia de nematodos en diferentes estadios evolutivos (larvas y adultos) según Duarte et al. (2001), y clasificados como pertenecientes al género Rhabditis spp. de acuerdo con Leite et al. (1994), Sudhaus & Kiontke (1996) y Santos et al. (2009).

Igualmente, después de la colecta del cerumen por hisopado, se puede observar en forma directa en el estereoscopio, el movimiento del parásito (Figura 3).

En el laboratorio se puede corroborar la presencia de larvas y adultos del parásito por observación microscópica y caracterizarlo dentro del género Rhabditis de acuerdo con Leite et al. (1994), Sudhaus & Kiontke (1996) y Santos et al. (2009) (Figura 4).



Tratamiento

Se han instaurado una gran cantidad de tratamientos con el fin de controlar la enfermedad, sin embargo todas las estrategias utilizadas han demostrado ser ineficientes, dada la constante reinfestación. Es así como Viera et al. (2001) probaron dos tratamientos, uno a base de una aplicación tópica de triclorfon al 3%, con dimetilsulfóxido (DMSO) al 1% y utilizando como vehículo la nitrofurazona en pasta; el otro tratamiento fue una solución de alcohol/éter en relación 1:1 con 2% de sulfato de cobre; ambos tratamientos fueron aplicados una sola vez, no encontrando resultados satisfactorios. Por otra parte, Radostits et al. (2002) manifestaron que eliminaron el parásito y la secreción purulenta en el interior del conducto auditivo externo, utilizando moxidectina y un antibiótico de amplio espectro, sin embargo Santos et al. (2009), basándose en esa apreciación, realizaron tratamientos con moxidectina en bovinos positivos a otitis parasitaria, pero con resultados insatisfactorios.

Verocai et al. (2009) realizaron un experimento con el fin de evaluar la eficacia del sulfóxido de albendazol administrado oralmente y de la ivermectina en forma de “pour-on” en el tratamiento de la otitis parasitária bovina, en el cual se demostró que la ivermectina es ineficaz en el control de parásito, mientras que el sulfóxido de albendazol demostró ser efectivo solo en un 25% al día 21 postratamiento.

Debido a la ineficacia de los tratamientos hasta ahora evaluados, es necesaria la instauración de nuevos estudios con el fin de establecer una estrategia terapéutica adecuada y eficaz, evaluando vías alternativas de administración, así como el conocimiento de los factores predisponentes como son el control de moscas en el verano, los descornes de los terneros, así como la adquisición de animales de la raza Gyr o Indubrasil sin evidencia clínica de la enfermedad.



Conclusiones

Las características epidemiológicas (temperatura y humedad relativa), las manifestaciones clínicas (antecedentes, rascado, inquietud, otorrea), las características del cerumen del conducto auditivo externo (color, olor y movimiento del parásito), así como la observación del parásito en el laboratorio (estereoscopio y microscopio), permiten diagnosticar otitis parasitaria clínica por nematodos rhabditiformes (Rhabditis bovis) en bovinos de la raza Gyr. De igual forma, se plantea la necesidad de realizar más investigaciones sobre el estado epidemiológico de la enfermedad en las explotaciones de bovinos Gyr puros en los diferentes departamentos de Colombia, y sobre las posibles estrategias de manejo y control de la enfermedad.


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Evaluación del conocimiento sobre enfermedades zoonóticas en estudiantes de bachillerato de instituciones educativas del sector rural

del municipio de Pasto, Nariño1


Juan Manuel Astaiza-Martínez2, Carmenza Janneth Benavides-Melo2, Darío Antonio Vallejo-Timarán3

1,Financiado por la Vicerrectoría de Investigaciones y relaciones Internacionales (VIPRI) de la Universidad de Nariño, Pasto, Colombia.

2,Grupo de Investigación en Salud Pública y Epidemiología (SAPUEP), Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño, Pasto, Colombia. 3,Grupo de Investigación en Medicina Interna y Farmacología Veterinaria

(MIFARVET), Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño, Pasto, Colombia.

[email protected]

(Recibido: 7 de Julio de 2014 Aprobado: 10 de Septiembre de 2014 Actualizado: 03 de julio de 2015)

DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.8

RESUMEN: Las zoonosis son enfermedades poco conocidas en términos generales por la población, siendo en los países en vías de desarrollo una importante causa de morbimortalidad y pérdidas económicas. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el conocimiento de estudiantes de bachillerato de instituciones educativas del sector rural del municipio de Pasto sobre algunas enfermedades zoonóticas, a través de capacitaciones dirigidas por profesionales y estudiantes del programa de Medicina Veterinaria de la Universidad de Nariño. En el proceso participaron 16 instituciones rurales con estudiantes de diferentes grados de bachillerato, a los cuales se les aplicó un cuestionario antes y después de la capacitación sobre conceptos generales, toxocariosis, toxoplasmosis, rabia, brucelosis, tuberculosis, cisticercosis y leptospirosis. El cambio cognoscitivo pasó de tener el mayor porcentaje de estudiantes dentro de un nivel de conocimientos “insuficiente” en la fase de diagnóstico a un nivel cognitivo “excelente” en la fase de evaluación. Se concluye que existe desconocimiento sobre las enfermedades zoonóticas en la población rural evaluada y la educación sanitaria es una herramienta eficaz y necesaria para contribuir de esta manera al control y prevención de este tipo de enfermedades.

Palabras clave: colegios rurales, educación sanitaria, salud, zoonosis

Assessment of the knowledge about zoonotic diseases in high school students of educational institutions from the rural area of the municipality of Pasto, Nariño

ABSTRACT: Zoonotic diseases are little known in general terms by the population, being a major cause of morbidity, mortality and economic losses in developing countries. The aim of this study was to assess the knowledge of high school students from educational institutions in the rural area of the municipality of



Pasto about some zoonotic diseases through training conducted by professionals and students from the Veterinary Medicine program at Universidad de Nariño. The process involved 16 rural institutions with students from different high school grade levels who were applied a questionnaire before and after training about general concepts, toxocariasis, toxoplasmosis, rabies, brucellosis, tuberculosis, cysticercosis and leptospirosis. Cognitive change went from having the highest percentage of students within an "insufficient” level of knowledge in the diagnostic stage to an "excellent" cognitive level in the evaluation stage. It is concluded that there is lack of awareness about zoonotic diseases within the rural population assessed and sanitary education is a useful and necessary tool for contributing to the control and prevention of these diseases.

Key words: health, rural schools, sanitary education, zoonoses

Introducción

La convivencia entre el hombre y los animales no siempre tiene lugar en condiciones óptimas de higiene y seguridad. Por otra parte, las normas correctas para establecer una adecuada relación entre ellos no siempre son conocidas o aplicadas, los riesgos más notorios que surgen de estas situaciones son la transmisión de enfermedades entre los animales y el hombre, la ocurrencia de lesiones y la contaminación del ambiente (Marcos et al., 1996).

En el año 1959 la OMS definió las zoonosis como “las enfermedades e infecciones que se transmiten de los animales al hombre y viceversa”. Esta definición básica se conserva, a pesar de múltiples propuestas que apuntan a detallarla o adicionarle conceptos. Para clasificar las zoonosis se han utilizado como criterios centrales, mas no únicos, el agente infeccioso que la produce y el modo de transmisión. Aunque en muchos países se han logrado controlar algunas de las zoonosis, en el panorama mundial de salud pública la importancia de las zoonosis se debe a su persistencia, carácter emergente y reemergente (Agudelo Suárez, 2012).

En los países en vías de desarrollo con un contexto socio económico y social desfavorable (por ejemplo, en las zonas suburbanas y rurales), son una importante causa de morbimortalidad y suponen cuantiosas pérdidas económicas. La convivencia con animales, la ausencia de infraestructuras sanitarias y el bajo nivel cultural continúan siendo los principales aliados de estas enfermedades, así como la ausencia de políticas públicas eficaces y continuas de promoción y educación de la salud (Dabanch, 2003; Ballesteros et al., 2013).

El riesgo de contraer una enfermedad zoonótica es, en principio, común a toda la población, pero tiene una especial trascendencia en niños, personas inmunodeprimidas y en personas cuya actividad laboral se desarrolla con animales y/o productos derivados de los mismos (Dabanch, 2003).

Las zoonosis son enfermedades poco conocidas, en términos generales, por la población. Hay desconocimiento y confusión acerca de lo que son en realidad estas enfermedades, sus mecanismos de transmisión, los efectos en el ser humano y las



medidas de prevención. Tanto en el ámbito de lo privado (familiar) como de lo público (vecinos, clientes, trabajadores) la tendencia es a ignorar la posibilidad de un riesgo importante para la salud propia y de los demás, todo ello para relacionarse en unos casos con menor angustia con el animal, si éste comparte el hogar, o bien para evitar el cambio de costumbres o prácticas profesionales, siempre incómodos y a veces costosos económicamente (Del Pozo, 2001).

Especialmente en el medio rural, todo ello choca con hábitos y actitudes culturales fuertemente arraigados. La evidencia de que existen grandes resistencias (en gran parte inconscientes) en la población a valorar y asumir el riesgo de contraer una enfermedad zoonótica, indica la relativa ineficacia de cualquier campaña de comunicación concebida en la dirección exclusiva de la información. Informar de las zoonosis, del proceso de contagio, de los riesgos que se corren y de las medidas oportunas para prevenirlas, apenas puede decirse que sea una medida que permita por sí misma modificar los comportamientos, dado que el problema se sitúa menos en el “saber” que en el “querer saber” (Del Pozo, 2001).

Los problemas relacionadas con la sanidad animal y, en consecuencia, la salud pública pueden ser minimizados cuando se aplica una educación en salud, por lo que es necesario educar a la gente, no solo con anuncios y revelaciones en medios de comunicación masivos, sino también con programas sistemáticos de educación para la salud, contribuyendo al proceso en el que la comunidad aumenta su capacidad para resolver sus problemas de salud e intensificar su propia participación (Moreira et al., 2013).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el conocimiento de estudiantes de bachillerato de instituciones educativas del sector rural del municipio de Pasto sobre algunas enfermedades zoonóticas.


El estudio consistió básicamente en una intervención educativa sobre enfermedades zoonóticas, la cual incluyó zoonosis como: Toxocariosis, Toxoplasmosis, Rabia, Brucelosis, Cisticercosis, Tuberculosis y Leptospirosis.

La intervención educativa abarcó el concepto de zoonosis además de las formas de transmisión, agentes causales, reservorios, tipos de alimentos involucrados, sintomatología y las medidas preventivas de estas zoonosis.

Este programa de Educación Sanitaria se realizó en 16 instituciones rurales de bachillerato registradas en la Secretaria Municipal de Pasto: Institución Nuestra Señora de Guadalupe, Instituciones Municipales de Cristo Rey, Marco Fidel Suárez, Mocondino, Cabrera, Agualongo, Francisco de la Villota, José Antonio Galán, Eduardo Romo Rosero, Santa Teresita, Encano, Francisco José de Caldas, Obonuco, María Nazareth, Morasurco y la Institución Educativa Municipal INEM Luis Delfín Insuasty Rodríguez de la modalidad agropecuaria (Alcaldía de Pasto, 2013).

Inicialmente se realizó un test evaluativo dirigido a los estudiantes cuyo propósito fue determinar el conocimiento previo acerca de las enfermedades zoonóticas, el cual fue



diseñado en lenguaje sencillo y mediante preguntas de selección múltiple con única respuesta.

En la segunda visita se llevó a cabo la intervención educativa (capacitación sanitaria) realizada por dos docentes médicos veterinarios y dos estudiantes de último año del programa de Medicina Veterinaria de la Universidad de Nariño, durante el primer semestre de 2013. La capacitación se hizo mediante la ayuda de diapositivas donde se explicó mediante lenguaje sencillo, imágenes y esquemas los conceptos básicos sobre enfermedad, agentes infecciosos, grupos de riesgo, agentes etiológicos, mecanismos de transmisión, síntomas y medidas de prevención y control. En promedio cada tema se abordó en un tiempo de 20 minutos, con la participación de grupos de 20 estudiantes. Al finalizar la capacitación se realizó de nuevo el test evaluativo para evaluar el nivel de captación de la información suministrada acerca de las enfermedades zoonóticas y por ende la calidad de la capacitación.

Finalmente se realizó la entrega de material didáctico (manuales sobre enfermedades zoonóticas) elaborado para este proyecto, a los estudiantes y a la biblioteca de cada institución. El análisis de los datos obtenidos se realizó de manera descriptiva y se presentan de manera porcentual, para su análisis se utilizó el paquete estadístico SPSS bajo licencia Shareware.


En el estudio participaron 584 estudiantes de diferentes grados (6º a 11º).

En la fase de diagnóstico se encontró un nivel de conocimiento acerca de las enfermedades zoonóticas de 27,71%, siendo evidente un menor grado cognitivo en las enfermedades causadas por parásitos como la cisticercosis (11,59%) y la toxocariosis (10,64%) y en las enfermedades bacterianas como brucelosis (11,25%). El mayor grado de conocimiento fue en rabia (48,83%) (Figura 1).

Situación preocupante si se tiene en cuenta que las zoonosis son una realidad en la población y la falta de conocimientos básicos sobre estas enfermedades es debido a la escasa entrega de información a comunidades rurales y urbanas (Marcos, 2004; Logroño, 2011).



Posterior a la capacitación (Figura 2) el nivel global de conocimiento aumentó hasta un 72,4% siendo el mayor en rabia (90,30%), y el menor en leptospirosis (52,19%).

La toxoplasmosis fue la enfermedad en la cual se logró el mayor incremento en el nivel de conocimiento el cual fue de un 67,32% ya que pasó de 16,11% a 83,43%; seguido de la cisticercosis y la brucelosis donde se incrementó el nivel de conocimiento en un 58,84% y 52,48% respectivamente.

Datos relevantes, si se tiene en cuenta que la educación en salud e instrucción sobre higiene, en especial cuidados con los niños a menudo se subestima, aunque en muchos casos es casi suficiente para evitar zoonosis como la equinococosis, toxocariosis, tuberculosis bovina y otras (Vega, 2009).

Además, refuerza el hecho de que la educación sanitaria es un proceso que influye en la transmisión de todo lo que se conoce sobre la salud dentro de los patrones deseables de la conducta individual y colectiva (Bartolo, et al., 2008).

Comparación fase de diagnóstico – fase de evaluación

En la fase de diagnóstico se encontró un promedio de 27,95% de preguntas aprobadas, en comparación con un promedio de 72,78% de preguntas aprobadas en la evaluación realizada después de la capacitación (Figura 3).

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Debido a que no hubo una distribución normal en los datos, para estimar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se realizó una prueba de comparación de medias de t-Student (Tabla 1).

Según lo anterior, el porcentaje promedio de preguntas aprobadas en la fase de diagnóstico fue de 27,9% y en la fase de evaluación fue de 72,7%, por lo tanto hubo un incremento de 44,8% en el número de preguntas aprobadas después de la capacitación.

Mediante el estadístico t-Student se establece que existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias del porcentaje de preguntas aprobadas antes y después de la capacitación (valor de P 0,001). Con un 95% de confianza, se afirma que la capacitación sobre enfermedades zoonóticas tiene un efecto positivo en los estudiantes de colegios rurales, incrementando sus conocimientos en un 44,8%.

Adopción de conocimientos y cambio cognoscitivo. La adopción de conocimientos en el estudio fue de 44,8% (Figura 4). Por lo tanto, la probabilidad de incrementar los conocimientos sobre enfermedades zoonóticas es dos veces mayor si el estudiante recibe capacitación.



Para determinar el cambio cognoscitivo de los estudiantes durante el proceso de capacitación se asignaron categorías de acuerdo al porcentaje de aciertos por parte de los estudiantes según la Tabla 2.

Con base en lo anterior se determinó el cambio cognoscitivo de los estudiantes antes y después de la capacitación. El nivel de conocimiento inicial de los estudiantes se estableció en la fase de diagnóstico (Figura 5).

Se evidencia que el cambio cognoscitivo antes y después de la capacitación pasó de tener el mayor porcentaje de estudiantes dentro de un nivel de conocimientos “insuficiente” en la fase de diagnóstico a un nivel cognitivo “excelente” en la fase de evaluación (Figura 6).



Con un 95% de confianza se afirma que existe un crecimiento exponencial en el nivel de conocimientos y la adopción de conocimientos de estudiantes que reciben capacitación en enfermedades zoonóticas. De igual manera, la capacitación permite un cambio cognitivo de insuficiente a excelente en la comprensión de enfermedades zoonóticas. Por lo tanto, la intervención sanitaria tuvo un impacto positivo en la población objeto de estudio.

Dato alentador si se tiene en cuenta que el alumno de enseñanza básica rural además de motivar a sus padres o apoderados, es capaz de transmitir una buena calidad de información en el 65,9% de los casos, convirtiéndose en maestro al participar en la entrega de información a sus familiares y amigos (Bartolo et al., 2008).

Finalmente, es importante considerar que el número de charlas dictadas puede influir, ya que hay autores que aseguran la importancia de mantener la continuidad a través del tiempo en este tipo de intervenciones educativas para lograr un buen resultado (Bartolo et al., 2008). Ya que estas medidas de intervención en Promoción de la Salud de ámbito comunitario si se diseñan con carácter continuado, con una determinación de objetivos concretos y sobre una población definida por los datos epidemiológicos disponibles, eliminan progresivamente las situaciones de riesgo y operan en el sentido de la responsabilización de la población propietaria de animales y de los sectores profesionales directamente relacionados con el riesgo de zoonosis (Del Pozo, 2001).

El trabajo desarrollado se limitó a un tiempo determinado, pero se requiere dar continuidad por parte de las instituciones a este tipo de capacitaciones para realmente lograr un impacto en la comunidad a través de los estudiantes capacitados que más adelante podría ser evaluado.



Conclusiones

En la población objeto de estudio se observó un bajo nivel de conocimiento sobre enfermedades zoonóticas, principalmente en toxocariosis lo cual refleja la necesidad de intensificar campañas respecto a este tema, más aún cuando en nuestro medio es tan frecuente la tenencia de mascotas y su estrecha relación con los niños que son la población más vulnerable. Los conocimientos más amplios tanto en la fase de diagnóstico como posterior a la capacitación se observaron en rabia, lo cual podría asociarse a las campañas oficiales que sobre esta enfermedad se hacen, con un impacto positivo en la población.

En general, el nivel de conocimientos mejoró a partir de las capacitaciones ofrecidas, lo cual permite deducir que la educación sanitaria es una herramienta eficaz para incrementar el nivel de conocimiento en la población y de esta manera contribuir al control y prevención de este tipo de enfermedades, además sirve de base para que las instituciones participantes ejecuten trabajos continuos de concientización sobre las zoonosis en sus alumnos, proyectada a la población rural en general.

Agradecimientos

Los autores expresan sus agradecimientos a los médicos veterinarios Mario Fernando Jojoa Puerres y José Luis Bolaños Domínguez, quienes participaron en el proceso de capacitación.


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Diarrea neonatal bovina en un hato del altiplano norte de Antioquia (Colombia), un estudio descriptivo1


David Andrey Cadavid-Betancur2, Carlos Andrés Giraldo-Echeverri2, Santiago Sierra-Bedoya2, Mateo Montoya-Pino2, Jenny Jovana Chaparro-Gutiérrez3,

Juan Esteban Restrepo-Botero2, 4, Martha Olivera-Ángel2.

1,Financiado por la Universidad de Antioquia (Convocatoria de Regionalización 2012 y Estrategia de Sostenibilidad Grupo de Investigación

Biogénesis) y Colciencias (Programa Jóvenes Investigadores e Innovadores – Convocatoria 2012).

2,Grupo de Investigación Biogénesis, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

3,Grupo de Investigación Vericel, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

4,Cooperativa Colanta Ltda, Medellín, Colombia.

[email protected]

(Recibido: 26 de Noviembre de 2014 Aprobado: 22 de Abril de 2015 Actualizado: 03 de julio de 2015)

DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.9

RESUMEN: La diarrea neonatal bovina es una enfermedad cuya etiología puede ser infecciosa o no infecciosa, afecta los neonatos bovinos especialmente durante las tres primeras semanas de vida y causa serias pérdidas económicas en el sector lechero a nivel mundial. En este estudio se describió la enfermedad en un hato de producción lechera en el altiplano norte de Antioquia. Se evaluó una cohorte de 60 terneros durante su primer mes de vida mediante examen clínico, análisis hematológicos, de serología, y ELISA en materia fecal para Cryptosporidium parvum, rotavirus bovino tipo A, coronavirus bovino y E. coli K99. Adicionalmente, se estimó la concentración de inmunoglobulinas en el calostro suministrado y la transferencia pasiva de inmunoglobulinas. Se encontraron proporciones de morbilidad por diarrea de 94,92%, mortalidad general de 17,58% y letalidad del 15,79%. Entre los animales enfermos se encontró un porcentaje de 89,47%, 47,37%, 7,02% y 0% para cada agente patógeno respectivamente. Se evidenció un alto porcentaje de animales con linfocitos reactivos, lo que indica la infección con agentes parasitarios o virales. Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que puede existir circulación de agentes involucrados en la diarrea neonatal bovina en la zona, lo que genera preocupación por el desconocimiento del estatus sanitario del altiplano norte de Antioquia en general.

Palabras clave: Cryptosporidium parvum, ELISA, inmunidad pasiva, rotavirus bovino



Bovine neonatal diarrhea in a herd in the Northern Antioquia (Colombia) Highlands, a descriptive study

ABSTRACT: Bovine neonatal diarrhea is a disease, with etiology that can be infectious or non-infectious, which affects calves during the first three and causes serious economic losses in the dairy industry worldwide. This study describes the disease in a dairy herd in the Northern Antioquia Highlands. A cohort of 60 calves was evaluated during the first month of life through clinical examinations, haematological and serology analysis, and ELISA in fecal samples to detect Cryptosporidium parvum, bovine rotavirus type A, bovine coronavirus and E. coli K99. Additionally, the concentration of immunoglobulin in the colostrum administered and the passive transfer of immunoglobulin were estimated. Proportions of morbidity because of diarrhea were 94.92%, general mortality 17.58%, and lethality 15.79%. Among the group of sick animals 89.47%, 47.37%, 7.02% and 0% were found for each pathogenic agent respectively. A high percentage of animals with reactive lymphocytes were observed which indicates parasitic or viral infection. The results obtained from this study suggest that circulation of agents involved in bovine neonatal diarrhea can exist in the area, which generates concern because of the unknown sanitary status in the Northern Antioquia Highlands.

Key words: bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, ELISA, passive immunity

Introducción

La diarrea neonatal bovina (DNB) genera pérdidas económicas en la industria láctea debido a la alta morbilidad, retraso en el crecimiento y los altos costos en el tratamiento (Lundborg et al., 2005; Afshari et al., 2012; Aguirre, 2012). Es un cuadro clínico gastrointestinal común y complejo que afecta a los animales recién nacidos, especialmente durante la segunda y tercera semana de vida, donde se presentan alrededor del 70% de los casos (Baquero-Parrado, 2008; Hernández, 2010). Este complejo es causado por una gran variedad de condiciones (ambientales, nutricionales, genéticas); y, por lo general, no es exclusivo de un solo agente; de esta manera, su presentación está influenciada por las características intrínsecas del animal, su estatus nutricional e inmunológico, el manejo del hato, el medio ambiente y la variedad de agentes infecciosos involucrados (Hernández, 2010; Pardo, 2012).

Históricamente, la DNB ha sido atribuida principalmente a los agentes infecciosos: rotavirus bovino tipo A (RVB-A), coronavirus bovino (CVB), virus de la diarrea viral bovina (VDVB), Salmonella spp., Escherichia coli (K99), Clostridium perfringens tipo C, Cryptosporidium parvum y otras especies de Coccidia sp. (Cho et al., 2013). La transmisión de estos agentes ocurre por vía oral-oral en los primeros días de vida cuando el neonato consume calostro directamente de la madre infectada o permanece en lugares donde la vaca ha defecado. El principal síntoma de los individuos afectados es diarrea de consistencia blanda o líquida, en algunos casos es de tipo hemorrágico (Ganaba et al., 1995; Trotz-Williams et al., 2007; Boileau & Kapil, 2010). En general, la diarrea ocurre por mala absorción debido al daño completo de la célula epitelial infectada, a la alteración de los mecanismos de absorción o al aumento de las secreciones celulares, siendo en este último caso una diarrea por hipersecreción. Otros



síntomas clínicos incluyen depresión, debilidad, anorexia y deshidratación que puede variar entre 8 y 10%, además de alteraciones de los parámetros sanguíneos, como aumento del volumen del paquete celular y el conteo de leucocitos totales, lo cual sugiere deshidratación. Además, hay reportes de neutrofilia y leucocitosis en estadios tempranos de la diarrea (Malik et al., 2013). En 6 a 12 horas se pueden producir desequilibrios electrolíticos donde predominan la hiperkalemia e hiponatremia, acidosis metabólica, insuficiencia circulatoria, shock y muerte (Ganaba et al., 1995; Boileau & Kapil, 2010).

El diagnóstico de los agentes infecciosos se ha realizado a través de diferentes técnicas de laboratorio como aislamiento viral, microscopía electrónica, ELISA, cultivo de bacterias, microscopía directa sobre extendidos de materia fecal con tinción para agentes ácido-alcohol resistentes (Ziehl Neelsen) y técnicas de flotación (Pardo, 2012; Cho et al., 2013). Otras técnicas diagnósticas basadas en la detección de ácidos nucleicos como PCR, RT-PCR e inmunofluorescencia han tenido gran acogida, dado que incrementan la sensibilidad y la rapidez en el diagnóstico (Cho et al., 2013).

El objetivo de este estudio fue caracterizar la enfermedad diarreica neonatal en términos de agentes infecciosos involucrados, parámetros sanguíneos alterados y transferencia de inmunidad pasiva; en bovinos de un hato en una zona de alta producción lechera del departamento de Antioquia (Colombia).


El estudio fue realizado en un hato especializado de producción de leche ubicado en el municipio de Belmira, en el Norte del departamento de Antioquia (Colombia) en una zona de vida de Bosque húmedo Montano Bajo (Bh-MB), a una altura de 2550 msnm y con temperatura promedio de 14°C (Holdridge, 1967). La pastura predominante es Pennisetum clandestinum.

Los neonatos son separados de las vacas durante el primer día posparto después de consumir calostro y llevados a terneriles, donde conviven con animales de hasta una semana de edad; luego, salen a potrero donde son manejados con animales de hasta un mes de edad. La alimentación consiste en calostro durante los tres primeros días y, posteriormente, cuatro litros diarios de leche hasta los tres meses de edad.

Un grupo de animales (n = 60) (40 hembras y 20 machos), nacidos en el periodo mayo a julio de 2013, fueron observados durante su primer mes de vida. Los animales fueron en un 50% de raza Jersey, 10% Holstein y el restante 40% cruces de las razas Jersey, Holstein y Pardo Suizo.

En la primera hora posparto se colectó de cada madre una muestra de calostro de 450 ml en promedio para el análisis inmediato de inmunoglobulinas. Entre las primeras 56 horas posteriores al nacimiento (Pardo, 2012), a cada neonato se le extrajo una muestra de suero sin anticoagulante, que fue congelada (-20ºC) hasta el análisis de la transferencia pasiva de inmunoglobulinas (TPI).

La definición de caso clínico fue: aquellos terneros con cuadros caracterizados por la excreción de heces fluidas, frecuentes, abundantes; y con anorexia (Pardo, 2012). Se midió el tiempo en días desde el nacimiento hasta el inicio de la diarrea. Una vez



detectado el caso y antes del inicio de cualquier tratamiento, se colectaron muestras de materia fecal directamente del recto, las cuales fueron colocadas en frascos de coprológico estériles. Todos los animales fueron muestreados de igual forma al mes de vida para análisis por ELISA. Las muestrasse conservaron en tubos de microcentrífuga a -20°C, para el análisis. Fueron incluidos aquellos animales que presentaron el cuadro clínico, hijos de vacas de dos partos o más. Se excluyeron animales que presentaran cualquier tipo de manifestación clínica de enfermedad diferente a diarrea.

A los animales les fueron tomadas muestras de sangre por punción de la vena yugular y colocadas en tubos con y sin anticoagulante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para las pruebas hematológicas y químicas respectivamente, se remitieron a la Unidad de Diagnóstico Veterinario de la Universidad de Antioquia para su análisis.

Para el trabajo con los animales se obtuvo aval del Comité de Ética para la Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia, mediante Acta N° 78 del 09 de agosto de 2012.

Para la aproximación a la concentración de inmunoglobulinas en calostro se empleó un calostrómetro (Biogenics, Mapleton, EUA). Se colocaron 500 ml de calostro a 20°C en el recipiente y se siguieron las instrucciones de medición establecidas por el fabricante y reportadas en la literatura, que indica que los resultados pueden ser registrados en mg Ig/ml y con valores cualitativos (excelente, aceptable o pobre calidad) (Harp et al., 1995; Aguirre, 2012).

Para la aproximación a la concentración de inmunoglobulinas séricas se empleó la prueba de precipitación de sulfito de sodio. Se prepararon tres soluciones de sulfito de sodio al 14, 16 y 18% en agua destilada. Posteriormente, se colocaron 1,9 ml de cada solución en tres tubos de ensayo y se adicionó 0,1 ml de suero sanguíneo a cada uno, mezclando muy bien. La interpretación del nivel de inmunoglobulinas séricas se realizó de la siguiente manera: precipitación en los tres tubos (adecuado, ≥1500 mg Ig/dl de suero), en los tubos con 16 y 18% (aceptable, 500-1500 mg Ig/dl de suero), solo en el tubo 18% o ninguna precipitación (pobre o nula, ≤500 mg Ig/dl de suero) (Weaver et al., 2000a; García et al., 2006). Se utilizaron sueros de animales recién nacidos como controles negativos de la prueba, colectados previo al consumo de calostro, mientras que como controles positivos de la prueba fueron utilizados sueros de animales sanos de un mes de edad.

Todas las muestras de materia fecal fueron examinadas mediante ELISA, para el antígeno de cuatro agentes patógenos que han sido reportados como involucrados en la DNB: RVB-A, CVB, E. coli (K99) y C. parvum; usando un kit comercial (Bio-X Diagnostics, Jemelle, Bélgica). El procedimiento se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. La lectura se realizó con el Espectrofotómetro para Microplacas Epoch (BioTek Instruments, Winooski, EUA). La sensibilidad del test para C. parvum, CVB, RVB-A y E. coli (K99) es de 100, 93, 97 y 100% respectivamente, la especificidad es de 88, 96, 100 y 100% en el mismo orden, de acuerdo con el fabricante.

Se analizaron 22 parámetros en el hemograma de las muestras de sangre con anticoagulante (descritos más adelante) y hallazgos celulares anormales como siderocitos, macroplaquetas, cuerpos de Howell-Jolly, linfocitos reactivos, entre otros. El hemograma fue realizado por el método de Impedancia Eléctrica en el equipo



Abacus junior VET 5 (Diatron, Budapest, Hungría), adicionalmente se hizo recuento visual por microscopía óptica a un aumento de 1000X sobre el extendido de sangre (Olympus, Tokio, Japón). Los valores de creatinina sérica, urea y aspartato aminotransferasa (AST) fueron medidos por turbidimetría usando el equipo Analyzer A15 (Biosystems, Barcelona, España).

Se realizaron análisis descriptivos de todas las variables en estudio. Se realizó la prueba de Shapiro-Wilk para evaluar distribución normal de los datos y de acuerdo a ello se calcularon medias o medianas, desviaciones estándar e intervalos de confianza del 95%, para las variables: concentración de inmunoglobulinas en calostro, tiempo al inicio de la diarrea, recuento de leucocitos, recuento de linfocitos, recuento de células intermedias, recuento de granulocitos, linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, bandas, recuento de eritrocitos, hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular media, hemoglobina corpuscular media, concentración de hemoglobina corpuscular media, amplitud de distribución eritrocitaria, recuento de plaquetas, plaquetocrito, volumen plaquetario medio, amplitud de distribución plaquetaria, proteínas plasmáticas, creatinina sérica, nitrógeno ureico en sangre, úrea y aspartato aminotransferasa. Se establecieron proporciones para las variables: presencia de macroplaquetas, hipocromía, poiquilositosis, crenocitos, acantocistos, eritroblastos, policromatofilia, cuerpos de Howell-Jolly, siderocitos, agregados plaquetarios, linfocitos reactivos, calidad del calostro y la TPI (excelente, aceptable y pobre o nula), presencia de diarrea, mortalidad, letalidad (cociente entre el número de animales que murieron a causa de la enfermedad y el número de animales enfermos), presencia de cada agente infeccioso, coinfección y diferencia entre lecturas. Todos los análisis fueron realizados en el programa estadístico STATA SE 13.0 (StataCorp, Texas, EUA).


Al evaluar el calostro de las madres, 57 (95%) tenían calostro de calidad aceptable a excelente y solo tres (5%) presentaron calostro de mala calidad. La prueba de sulfito de sodio arrojó que 54 (89,47%) animales presentaron una absorción de inmunoglobulinas adecuada (concentración aproximada >1500 mg Ig/dl) y solo tres (5,26%) presentaron absorción pobre o nula (concentración aproximada <500 mg Ig/dl).

Se encontró que 57 terneros presentaron diarrea, lo que corresponde a una prevalencia de 94,9%. Todos los casos iniciaron antes de finalizar la segunda semana de vida, el inicio se dio en promedio a los 7,4 días (IC95% 6,87-8,01). Se registró una mortalidad de 10 animales (17,58%). En la Tabla 1 se muestran los resultados del diagnóstico de agentes infecciosos, así como las coinfecciones encontradas. Tres animales (5%) que no presentaron diarrea, fueron negativos a todos los patógenos.

En los análisis de hematología y química sanguínea de los animales que presentaron DNB no se encontraron parámetros alterados cuando se compararon con los valores de referencia del laboratorio. Cuando se compararon con los valores de referencia utilizados por la Unidad de Diagnóstico. Se encontraron agregación plaquetaria (5,88%) y linfocitos reactivos (52,94%).



Como se reporta en la literatura, la DNB en este caso es la principal enfermedad que afecta los terneros durante las primeras semanas de vida. Sin embargo, contrario a otros estudios donde se reporta que el cuadro clínico inicia entre la segunda y tercera semana de vida, la diarrea inició desde la primera semana de vida y todos los casos se presentaron antes de finalizar la segunda semana, con un promedio de inicio de 7,4 días (Trotz-Williams et al., 2008; Baumgartner, 2012).

Según los reportes de la literatura la morbilidad y la mortalidad pueden variar entre estudios, en este caso la morbilidad del 94,92% se encontró por encima de los valores más altos reportados con un 80% en otros países y muy por encima de los valores reportados en estudios realizados en el país donde se reporta como máximo una morbilidad del 37,5% en Antioquia, un 26,10% y 10,3% en la Sabana de Bogotá (Escobar & Oliver, 1997; Pardo, 2012). La mortalidad de igual forma es variable y aunque no es tan alta como lo reportado en otros países donde se habla hasta de un 75% (Von Buenau et al., 2005), sí se encontró con valores más altos comparados con reportes de mortalidad general en terneros durante los primeros meses de vida con un máximo de 11,5% en la Sabana de Bogotá (Pardo, 2012). Esto sugiere que las condiciones de manejo de la granja podrían ser las responsables del incremento de los casos como se ha reportado en la literatura para otros lugares (Trotz-Williams et al., 2007; Pardo, 2012).

Por otro lado, la calidad del calostro no sería una de las causas de estas altas proporciones de morbilidad y mortalidad pues los resultados muestran una adecuada TPI, acorde con lo reportado por varios autores (Weaver et al, 2000b; Wallace et al., 2006; Trotz-Williams et al., 2007). En los casos donde la TPI fue pobre, dos de los terneros murieron. La morbilidad tan alta podría indicar que la diarrea y la respuesta inmunológica por parte del neonato, dependerían de otros factores como las particularidades de los agentes etiológicos involucrados.

En un estudio de la Sabana de Bogotá, al realizar el diagnóstico tanto en animales sanos como enfermos se encontró una proporción de positividad de 38,3%, 19,7%, 7,5% y 0,75% a Cryptosporidium sp., RVB-A, E. coli (K99) y CVB respectivamente, diagnosticados por la técnica de ELISA (Pardo, 2012). En el presente estudio, de igual manera el Cryptosporidium parvum fue el agente de mayor importancia seguido por el RVB. Sin embargo, en este caso no se presentaron animales positivos a E. coli (K99) y la proporción de positividad a los otros tres agentes fue superior. Esto podría deberse a que para este trabajo únicamente se diagnosticó una granja, lo que implica una posible mayor carga de patógenos inherente a las condiciones de manejo, producción y medio ambiente del hato. Al igual que en el estudio de la Sabana de Bogotá y en otros reportes de la literatura, la coinfección entre dos o más agentes patógenos es común encontrarla en el cuadro diarreico, siendo una de las de mayor proporción la combinación Cryptosporidium parvum y RVB-A (Cho et al., 2013).

El 90% de los animales fueron positivos a Cryptosporidium parvum, el cual se considera uno de los parásitos más comúnmente hallados en casos de DNB (Cho et al., 2013; Cho & Yoon, 2014). Sin embargo, no es el calostro el que puede ofrecer alguna protección (Weaver et al., 2000b; Cho & Yoon, 2014), ya que los animales expuestos al parásito durante la primera semana de vida desarrollan diarrea y eliminan ooquistes; como el sistema inmunológico en la mucosa del íleon en neonatos bovinos es inmaduro e incapaz de responder a la infección, así el calostro contenga una buena



concentración de inmunoglobulinas tipo IgG, IgA e IgM y la TPI ocurra adecuadamente, este parásito es capaz de inducir la diarrea (Wyatt, 2000). Según Wyatt, la diarrea inducida por Cryptosporidium puede deberse a que la colonización de las células intestinales ocurre predominantemente por linfocitos T γδ y hay relativamente pocos linfocitos TCD4+ y CD8+. Adicionalmente, esta población de linfocitos tiene un fenotipo sIgM+, que inmunológicamente no responde de forma efectiva contra C. parvum (Wyatt, 2000). Durante la fase aguda de la criptosporidiosis se da el reclutamiento de los linfocitos CD4+ y CD8+ en la mucosa del íleon y el cambio de isotipo de las células B para producir IgA, IgG1 e IgG2 se da hacia la segunda semana de vida, cuando la mucosa ya está infectada. Estas células son necesarias para poner fin a la infección con eficacia (Wyatt, 2000).

En este estudio la lectura de las pruebas de ELISA se realizó al momento del inicio del cuadro clínico, reportando una alta proporción de exposición de Cryptosporidium parvum y RVB-A, que puede sugerir una coinfección, como ha sido reportado en otros estudios (Pardo, 2012; Cho et al., 2013).

Por el tiempo promedio para el inicio de la diarrea que en este caso fue de 7,4 días, se podría hipotetizar que el agente causante inicial fue el RVB-A (52%), ya que se ha reportado como el agente que afecta a los animales principalmente durante la primera semana de vida, facilitando la colonización de otros agentes patógenos en la segunda y tercera semana de edad (Bicknell & Noon, 1993; Pardo, 2012; Cho & Yoon, 2014), tiempo para el cual la presencia de Cryptosporidium parvum en mucho más común como agente involucrado si se compara con otros periodos (Avendaño et al., 2014).

La infección por Cryptosporidium parvum se debe a factores de riesgo reportados por Trotz-Williams et al. (2007) y Pardo (2012). En este caso, la infección se podría asociar con el consumo de calostro directamente desde la ubre la cual se puede contaminar con materia fecal, además la permanencia del neonato con la madre por más de una hora después del nacimiento aumenta la posibilidad de infección. En las observaciones realizadas en este estudio, los neonatos permanecieron con la madre durante el primer consumo de calostro, esto explicaría la exposición temprana al parásito y el desarrollo de signos clínicos después de los 6 días siguientes a la exposición, como lo reporta la literatura (Wyatt et al., 2010).

Los análisis hematológicos presentaron alteraciones en cuanto se presentó una alta proporción de animales enfermos con linfocitos reactivos, mas no otros parámetros, contrario a lo que reporta la literatura durante los cuadros de diarrea debido a la infección y a la deshidratación que ocurre (Baquero-Parrado, 2008; Malik et al., 2013; Cho & Yoon, 2014). La explicación a esta situación podría estar apoyada en que las muestras de sangre fueron colectadas al inicio del cuadro clínico, y para ese momento es posible que las alteraciones en los perfiles hematológicos aún no se hayan presentado. Según la literatura, cuando se presentan abundantes linfocitos reactivos es porque el animal está siendo estimulado antigénicamente, son indicadores del inicio de una infección causada principalmente por virus y parásitos y son característicos en la respuesta frente a la infección por Cryptosporidium parvum y RVB-A (Harp et al., 1995).



Conclusiones

Se evidencia la presencia de varios agentes causales de DNB. Ante el desconocimiento de la situación de la enfermedad en la región, se pone de manifiesto la necesidad de realizar un estudio epidemiológico amplio que permita comprender la ocurrencia, la etiología infecciosa y los factores asociados no infecciosos en el altiplano norte.

Agradecimientos

A los recursos del Fondo de Sostenibilidad CODI - U. de A. 2014-1015; a la administración y empleados de la Finca El Pantano por el apoyo en el trabajo de campo; y al estudiante de Medicina Veterinaria, Juan Diego Vásquez Serna.


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