5/26/2018 Reporte 1 Extracci n de ADN de Bacterias

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera CampusGuanajuato (UPIIG)

Laboratorio de Biotecnologa Molecular

5BV1

Integrantes:Hugo Ramrez Rodrguez 2011660475Juan Cristbal Garca Garca 2012660213Jose Gilberto Savi Tejeda 2012660319Ricardo Rafael Marn Mosqueda 2010660234

Profesores:Dra. Karla Lizbeth Macias SnchezM. en C. Francisco Snchez LpezDr. Csar Aza Gonzlez

Composicin del gel de agarosa:0.3 g de agarosa + 30 mL de Buffer

Especificaciones de electroforesis:30 min89V

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4W46mA

RESULTADOSSiguiendo el protocolo se llevo a cabo la extraccion y purificacion de ADN plasmdicoproveniente de la bacteria Escherichia Coli.

La experimentacin se llev a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa y atravs del Nanodrop, el cual es un espectrofotmetro de amplio espectro que midemuestras de 1 microlitro con alta precisin y reproducibilidad mediante mtodos detensin superficial. (vila, 2008)

Los resultados obtenidos por cuantificacin por Nanodrop se observan en la tabla 1.

Tabla I. Cuantificacin de DNA por Nanodrop paraEscherichia coli.

Muestra I Muestra II

A260 2.530 4.618

A280 1.609 4.700

A260/280 1.57 0.98

A260/230 0.19 0.81Concentracin de DNA(ng/L)

230.9 126.5

De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede observar en la tabla I quela muestra I se encuentra parcialmente libre de protenas presentes, lo cuales evidenciado por la relacin de absorbancias 260/280 siendo menor a1.75 considerando ste valor como un ptimo para una muestra libre de

protenas, sin embargo en la muestra II ste valor se encuentra muy pordebajo del valor establecido como ptimo, lo cual representa unacontaminacin de la muestra (probablemente por error humano durante latcnica) afectando significativamente los valores de deteccin de DNA enla muestra contenida

La relacin 260/230 hace referencia a la contaminacin correspondiente

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por fenol, cloroformo o carbohidratos. ste valor debe estar por debajo de0.5, observando la tabla I, sobresalen los valores de ambas muestras, yaque en la numero 1 el valor esta dentro del rango marcado mientras que lamuestra 2 esta por arriba del valor lmite, afectando directamente la

cuantificacin de DNA de la muestra.

La tabla anterior ilustra que en ambas muestras se obtuvo unaconcentracin de DNA, sin embargo no es suficiente informacin paradeterminar si se obtuvieron cadenas de DNA en concreto ni su tamao.

La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo normalizado que seutiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata deuna tcnica sencilla y rpida que permite diferenciar fragmentos de ADN,el cual puede localizarse en el gel tiendo con una concentracin baja debromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que seutiliza como colorante. (Sambrook, 1989). En la figura X se muestran los

pozos de la cmara de electroforesis conteniendo la muestra de DNAcuantificar teida con el bromuro de etidio, observndose un color azulmarino.

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(aqui le ponen la foto donde se ven los pozos azules porfa porque yono puedo pegarsela)

Los geles de agarosa permiten una electroforesis rpida, pero con unaresolucin limitada por cuanto las bandas que se forman en los gelestienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece a los poros yno puede controlarse (Querci,2010) lo cual puede ser una posibleexplicacin del porqu las muestras al ser corridas en el gel, presentan laapariencia difusa, evidenciada en la figura X2.

(aqui le ponen la foto de las bandas pegadas porfa, esa creo que la

tiene el joto de pedro, pero aun no me la pasa, si alguien mas la tienese la pone xfa)

Dado que la mayor parte de la potencia producida en el procesoelectrofortico se disipa en forma de calor, pueden producirse efectosperjudiciales como el aumento de la tasa de difusin de los iones de lamuestra y del tampn con el consiguiente ensanchamiento de las muestrasseparadas, formacin de corrientes de conveccin, con la consiguiente

mezcla de las muestras separadas e inestabilidad trmica de lasmuestras, que son bastante sensibles al calor (por ejemplo,desnaturalizacin del ADN) (Querci, 2010).

Alguno de los factores antes mencionados o la combinacin de stos,pudieron ser los causantes de que las bandas presentes en la corrida engel de agarosa no se observan satisfactoriamente, ya que solo se puedenapreciar detalladamente las bandas correspondientes a los marcadores depeso molecular (carriles 1 y 11) en contraste con los dems carriles

correspondientes a las muestras deE. coli donde no se pueden apreciarlas bandas con claridad.

La figura X23 muestra los tamaos correspondientes a cada una de lasbandas correspondientes al marcador empleado en la prctica

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(Hyperladder 1kB,Bioline), con ayuda del marcador podemos determinar eltamao de las bandas obtenidas durante la experimentacion,sin embargoen nuestro caso los resultados no son claros en el gel, como se expresanteriormente.

Figura X23

(http://www.bioline.com/hyperladder-1kb-formerly-hyperladder-i.html)

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ConclusionesMediante tcnicas microbiolgicas se logr la extraccin de ADN plasmdico de labacteria Escherichia coli,el cual fue cuantificado por los mtodos de electroforesis engel de agarosa y por espectrofotometra efectuada por el Nanodrop. (Checar, Erick)

En cuanto a los resultados obtenidos, es importante puntualizar que mediante elmtodo de espectrofotometra efectuada por Nanodrop, se comprob que aunque sepudo extraer de manera adecuada ADN deE.coli, el proceso de purificacin no fue elptimo, debido a que las dos muestra, sugieren contaminacin por protenas debido aque no se alcanz una relacin 260/280>1.75, por lo que para obtener cidos

nucleicos ms puros se sugiere realizar una serie adicional de purificaciones con fenol.(Koort, 2002)

La forma en la que se presentaron las bandas en la electroforesis en gel de agarosasugieren degradacin del DNA, causado posiblemente por una contaminacin denucleasas debido a una purificacin ineficiente, muestras de DNA antiguas,congelamiento y descongelamiento repetido de las muestras ,o bien las muestra sesometieron a calor o friccin causado por la sonicacin durante el proceso de

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extraccin. (Koort, 2002)

CUESTIONARIO1. Qu modificacin realizara para obtener ADN de bajo peso molecular?por qu?Se puede modificar el tiempo de centrifugacin para obtener as un menor

tiempo de replicacin y por lo tanto cadenas ms cortas de ADN. elmodificar el pH puede tambin dar como resultado segmentos de ADN conbajo peso molecular. (falta poner la referencia)

2. En qu otro lquido se puede resuspender el ADN al final delProtocolo?

Agua de grado molecular, debido a que no contiene RNA proteasas,DNAasas ni iones que interfieren en la obtencin de fragmentos de DNA.

3. Menciona que modificacin realizara para obtener ADN de:a) PlantasDebido a que las plantas presentan una pared celular rgida, se puede usarnitrgeno lquido, ya que este rompe los tejidos ms resistentes. Sinembargo, como el tejido en ocasiones es grueso y duro, es necesarioaplicar una fuerza adicional, esto es, triturar o moler el tejido. Las plantas tienen diversas sustancias como carbohidratos, fenoles, etc.Estos son los contaminantes del DNA extrado que se deben eliminar, paraello se puede usar el cetyl-trimetil-bromuro de amonio, que tiene lacapacidad de formar un complejo insoluble con los cidos nucleicos,dejando los contaminantes en el sobrenadante que fcilmente esdesechado.Las centrifugaciones y suspensiones en diversos alcoholes son

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determinados en la experimentacin, slo cambian las condiciones, pero elfundamento es el mismo.( Neal, JR., 1997)

b) Bacterias Gram positivas

No se aplican procesos mecnicos de lisis porque el ADN resulta daado,la proteinasa K es efectiva en bacterias Gram negativas, mas no as enbacterias Gram positivas. Debido a las consideraciones anteriores, uno delos procesos que resultaron exitosos, consiste en aplicar choque trmicode 195C-100C y SDS a una C de 3%. Las bacterias son centrifugadas, ylos sedimentos son lavados con TE y resuspendidas tambin en TE, elSDS se aade y se deja reposar.Pasar a un horno de microondas, disolver en TE.

El DNA es extrado con un mtodo alcalino, en donde se aade unamezcla bsica para desnaturalizar el DNA y la posterior neutralizacin conacetato sdico. El proceso descrito anteriormente es el que mejor se ajusta este tipo de bacterias, y como puede observarse, es ms riguroso que enel caso de bacterias Gram negativas, que llevan un proceso suave deextraccin de DNA.

Referencias Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual. 3 ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344

pgs. vila, A. F. (2008). Ecologa molecular. Mxico, D.F.: Instituto

Nacional de Ecologa, SEMARNAT. Querci, M. (2010). Anlisis de la Presencia de Organismos

Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos.Organizacin Mundial de la Salud. Oficina Regional para Europa.