REPORTE FINAL DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN EN EL PERIODO DE FEBRERO DE 2005 A ENERO DE 2006. PROYECTO INDIVIDUAL A CORTO PLAZO (1 año) TÍTULO: Espectroscopía Raman aplicada al área de alimentos NOMBRE DEL DIRECTOR DEL PROYECTO: Mario Cervantes Contreras NUMERO DE REGISTRO: 20050532 UNIDAD DE ADSCRIPCIÓN: Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI) El trabajo realizado en este proyecto se desarrolló sobre dos productos alimenticios: Aceites comestibles y Pulque. Observación: El titulo del proyecto menciona solo la espectroscopia Raman, sin embargo, fue necesario realizar sobre todo una caracterización microbiológica en el pulque Pulque

Introducción.

La palabra pulque también tiene una raíz náhuatl que es poliuhqui, que quiere decir descompuesto. Es una bebida alcohólica que se obtiene por la fermentación del aguamiel, la savia azucarada de varias especies de magueyes pulqueros.

El pulque es una bebida típica de México, consumida por poblaciones indígenas y mestizas de muchas regiones del país, particularmente en las áreas de la meseta central. En tiempo de los aztecas dicha bebida tenía un significado religioso muy importante, pues se utilizaba como ofrenda para el dios Mayahuel, deidad del pulque. Sin embargo, con la caída del imperio azteca el pulque perdió su importancia dentro de los rituales religiosos y en la actualidad permanece solo como una bebida popular.

Es una bebida alcohólica, blanca y espesa, del altiplano de México, que se obtiene haciendo fermentar el aguamiel o jugo extraído del maguey con el acocote. Su consumo varía de acuerdo con el gusto del consumidor, así como la ocasión. Los principales consumidores de pulque son personas de bajos recursos económicos, aunque en las festividades también es consumido por la clase media para acompañar la comida tradicional. Dicha bebida tiene una gran importancia nutricional, pues no solo es ingerido como bebida alcohólica, sino como un complemento alimenticio por su alto contenido de proteínas y vitaminas del complejo B.

Tradicionalmente se le ha asignado al pulque algunas cualidades medicinales, por lo que es utilizado para combatir algunos desórdenes gastrointestinales, anorexia e infecciones renales. Además del pulque común, existe el llamado pulque curado al que se le adicionan diversos vegetales durante la fermentación y principalmente frutas. El pulque es la bebida fermentada indígena de México que ha sido más estudiada desde diversos puntos de vista, debido a su gran importancia económica y social.

La producción de bebidas alcohólica es conocida desde tiempos muy remotos, pero recien en el siglo XVII se pudo demostrar que los responsables de la fermentación son microorganismos principalmente las levaduras. En 1912 se aisló por primera vez una bacteria productora de etanol, que fue catalogada posteriormente como Zymomonas mobilis. Inicialmente se postulaba que el mecanismo de utilización de glucosa y fructosa en Zymomonas, era igual al de las levaduras. Sin embargo en realidad Zymomonas no utiliza la via glicolítica, sino la de Entner-Doudoroff y de acuerdo al balance energético de esta via sólo se produce un mol de ATP por mol de glucosa utilizado.

Las levaduras que se pueden aislar del pulque se denominan Saccharomyces su nombre signific saccharo: azúcar y myces: hongo. Se encuentra naturalmente en uvas, frutos, melazas, mieles y aguas azucaradas. Tiene un metabolismo aeróbico y anaeróbico. El alcohol es producido por vía anaeróbica (Glicolisis anaeróbica) se produce etanol CO2 y células como producto de la fermentación

A. CARACTERIZACION MICROBIOLOGIA DE LAS POBLACIONES PRESENTES EN LA ELBORACION ANTERSANAL DEL PULQUE.

1. MATERIALES Y METODOS 1.1. Sitio de estudio. La zona de estudio estaba localizada en el estado de Tlaxcala, en

el pueblo de San Simón Tlatlahuquitepec. 1.2. Muestreo: Los muestreos se relizaron en frasco de plástico de 20cc previamente

esterilizados, tomando 15 cc de material líquido correspondiente a cada una de las etapas del proceso e identificadas como: Agua miel ( savia del maguey), semilla ( inoculo y semilla madre), contra punta ( 24 horas de fermentación) y punta ( 48 horas de fermentación).

1.3. Aislamiento primario. Se realizó por medio de la micro técnica de dilución decimal y siembra en placa, tomando 0.5 cc de cada muestra y colocandola en 4.5 de agua peptonada al 0.1 % p/v (10-1) a partir de 10-1 se hicieron diluciones hasta 10-6. Se tomaron 20ul de cada dilución y se sembraron en cajas de agar PDAA (levaduras) y agar LW (Zymomonas sp). Las cajas se incubaron por 48 horas para bacterias y 5 días para hongos. Posteriormente se realizó el recuento de colonias expresado como UFC/ml de muestra analizada y se seleccionaron las más

representativas de los dos grupos. La purificación de colonias se realizó por medio de pases sucesivos en medios específicos (Pedroza et al, 2002).

1.4. Coloración de Gram: A partir de las colonias aisladas se tomo una muestra con asa de platino y se coloco sobre una lámina portaobjetos, se dejo secar y se fijo con calor por 30 segundos. La coloración de Gram se realizo siguiendo la secuencia cristal violeta, lugol, alcohol acetona y fucsina de Gram realizando un lavado con agua entre cada colorante. Las láminas dejaron secar y se observaron en microscopia de luz con aumento de 100x.

1.5. Microscopia electrónica de barrido: Se tomo una muestra con asa de platino y se coloco sobre una lámina portaobjeto, tratando de distribuir la muestra homogéneamente. La película se dejo secar a temperatura ambiente y se fijo con calor por 1 minuto, flameando la lámina portaobjeto por la parte trasera.

1.6. Cuantificación de azúcares reductores totales. Para cuantificación de azúcares reductores totales se realizó por medio de la técnica colorimétrica de oxido-reducción del ácido 3,5- dinitrosalicílico, empleando glucosa anhidra como patrón primario. Las muestras se centrifugaron 20 minutos a 5 rpm y se tomo el sobranadante para la cuantificación. Los resultados están expresados como g/l de azúcares reductores.

1.7. Cuantificación de proteínas totales: Se realizó por la técnica colorimétrica de azul de comassie G250. reportado por Bradfor. Como patrón primario se utilizó albúmina de suero bovino BSA.

2. RESULTADOS Y DISCUSION.

2.1. Sitio de muestreo. Se realizó en San Simón Tlatlahuquitepec, Tlaxcala,

México.

Figura 1. San Simón Tlatlahuquitepec, Tlaxcala. Sitio de muestreo.

2.2. Muestreos por etapas. El proceso se inicia con la recolección del agua miel a partir de las diferentes plantas habilitadas para la producción que están protegidas de roedores e insectos por medio de una cubierta hecha en piedra o con las mismas hojas de la planta. El agua miel se recupera utilizando un succionador conocido como acocote. Posteriormente se pasa el recipiente de recolección. El fondo de la piña de raspa para que continúe drenando agua miel y se tapa, el proceso de recolección se realiza dos veces al día. El agua miel se transporta hasta el sitio de elaboración, ahí se mezcla con la semilla que es un concentrado de agua miel fermentada y se coloca en fermentar, el producto a mitad de proceso (24 horas de fermentación ) es denominado contrapunta y el producto final (48 horas de fermentación) es llamado punta. Se lleva a cabo a temperatura ambiente y debe evitarse el contacto con detergentes, desinfectante, aromatizantes y perfumes para evitar el daño en el proceso de fermentación que posiblemente esta asociado con la inhibición de las poblaciones microbianas responsables de la fermentación que pueden ser susceptibles a compuestos químicos. En la figura 2 se observa el proceso completo de elaboración artesanal de pulque.

Productor Limpieza de la penca Agua miel fresca

Recuperación Agua miel apta para proceso de fermentación

Medición de textura de la semilla Mezcla semilla y agua miel Punta. Etapa final deproceso

Figura 2. Elaboración artesanal de pulque por etapas de proceso. Fuente los autores

Aislamiento primario.

Mediante la técnica de dilución decimal y siembra sobre medios de cultivo agarizados, se puede estimar la población presente en una muestra desconocida a partir de la capacidad que tienen los microorganismos para utilizar los componentes del medio de cultivo y crecer formando unidades independientes denominadas colonias, que tendrán características morfológicas específicas para cada género. La diferenciación se puede hacer gracias que en la técnica se emplean medios selectivos para cada grupo y se pueden obtener colonias totalmente diferentes, como se observa en la figura 3 en la cual se puede ver se presentan dos tipos de colonias, unas de color blanco, cremosas, grandes y de borde regular características de levaduras y otras más pequeñas blancas casi transparentes que corresponden a bacterias posiblemente del género Zymomonas sp

De acuerdo al recuento de poblaciones en la figura 4 se puede observar que existe un consorcio entre levaduras y bacterias. Estos grupos presentes en el agua miel son los responsables de la fermentación alcohólica y se mantienen durante todo el proceso, sin embargo la cantidad varia de acuerdo al paso. En la semilla se presentaron los mayores recuentos posiblemente con recuentos de bacterias de 23x106 ufc/ml y 43x107 ufc/ml hongos levaduriformes. Por que este producto actúa como inoculo y es un concentrado líquido en proceso de fermentación tal como ocurre en otras bebidas fermentadas tradicionales como la chicha y guarapo. En la contrapunta y la punta las poblaciones se mantienen aproximadamente iguales entre 104 y 105 ufc/ml, siendo altas por que los microorganismos utilizan la azucares y proteínas presentes en el agua miel como fuente de carbono y energía, determinando que haya crecimiento. Como producto final del metabolismo queda el etanol sustancia que le da las características de bebida alcohólica fermentada.

A B

Figura 3. Recuento de poblaciones fúngicas en agar PDAA (A) y bacterianas en agar LW (B).

Agua miel Semilla Contrapunta Punta10000

100000

1000000

1E7

1E8

1E9

Uni

dade

s fo

rmad

oras

de

colo

nia

(ufc

/ml)

Etapa del proceso

Levaduras Bacterias

Figura 4. Comportamiento de las poblaciones bacterianas y fúngicas en cada etapa de proceso

2.3. Aislamiento secundario de levaduras y bacterias en medios específicos para cada grupo.

Por medio de pases sucesivos en medios agarizados se logro aislar a las microorganismos más importantes del estudio Saccharomyces sp y Zymomonas sp. El primero es un organismo eucariótico (figura A5) aislado que se puede aislar a partir de diferentes ecosistemas, sin embargo esta muy asociado con la producción de bebidas fermentadas con granos, semillas y agua miles. Es responsable de la fermentación alcohólica del vino y la cerveza. En el presente estudio solamente se pudo determinar género (Saccharomyces sp). El segundo es procariote perteneciente al género Zymomonas sp. La literatura reporta que esta bacteria esta implicada en la producción de bebidas alcohólicas sola ó en consorcio con levaduras, ha sido aislada a partir de cidra, melaza y el presente estudio a partir de agua miel para pulque.

Con respecto a la coloración de gram, se puedo observar las características típicas de los dos géneros, las levaduras son célula esféricas o ligeramente ovaladas, grandes 100 um aproximadamente y de color azul. Las bacterias son coco bacilos Gram negativos cortos. Figura 6.

A B

Figura 5. Aislamiento de levaduras y bacterias. (A) Saccharomyces sp agar

PDAA, (B) Zymomonas sp en agar LW.

A B

Figura 6. Coloración de Gram. (A) Cocobacilos Gram negativos del género Zymomonas sp. (B) Células levaduriformes de Saccharomyces sp. Aumento 100x

2.4. Microscopia electrónica de barrido

Figura 6. Células levaduriformes de Saccharomyces sp. Observadas por microscopia electrónica de barrido. 1500x y 3000x

2.5. Cuantificación de azúcares reductores totales y proteínas. Empleando una técnica colorimétrica de oxido reducción se pudo estimar la concentración de g/l de azúcares reductores totales y proteínas presentes en las etapas muestreadas, encontrando que al inicio del proceso (agua miel) se obtuvieron la mayor cantidad de azúcares y proteínas, determinando que sea un sustrato nutricionalmente rico que favorece el crecimiento de poblaciones microbianas que utilizan los compuestos del agua miel para producir células, Co2 y etanol. De acuerdo a los grupos recuperados, son dos las rutas metabolicas que se estan llevando a cabo para la fermentación y obtención del pulque. Las levaduras utilizan la vía de glicólisis anaeróbia y las bacterias la vía de Entner-Doudoroff. El contenido de azucar y proteína va disminuyendo en función del tiempo de fermentación, sin embargo no llega a ser consumido en su totalidad es por esto que el pulque al final del proceso ó etapa denominada como punta tienen un ligero sabor dulce, contenido de proteína y dependiendo de los días de fermentación mayor contenido alcohólico. En la tabla 1 se observa el contenido de azúcares reductores y proteína.

Tabla 1. Azúcares reductores totales y proteínas.

Parámetro Agua miel Semilla Contrapunta Punta Azúcares

reductores g/l 25 5.2 7.2 5.3

Proteína g/L 2.3 0.98 1.2 0.6

B. CARACTERIZACIÓN VIBRACIONAL MEDIANTE MICROESPECTROSCOPIA RAMAN. Los espectros Raman se obtuvieron con un sistema microraman LABRAM. La longitud focal del espectrometro fue de 300 mm. Como fuente de excitación se utilizo una linea de 632.817 nm de un laser de HeNe de 20 mW, polarizado 500:1 En la figura 6 se obserban las celdas levaduriformes de Saccharomyces sp, sobre una de estas celdas se realizó la microespectroscopia Raman. Los espectros obtenidos se muestran en la figuras 7, 8, 9 y 10.

Inte

nsity

(A. U

.)

Raman shift (cm-1)

Semilla

AB

C

F

D

EG

H

I

J

K

Figura 7. Espectro Raman de la semilla

In

tens

ity (A

. U.)

Raman shift (cm-1)

Agua miel

AB

C

D E

F

GH

I

J

K

Figura 8. Espectro Raman del agua miel

Inte

nsity

(A. U

.)

Raman shift (cm-1)

Contrapunta

I

J K

Figura 9. Espectro Raman del pulque con 24 horas de fermentación (contrapunta)

In

tens

ity (A

. U.)

Raman shift (cm-1)

Punta

A

D F

G H

I

J K

Figura 10. Espectro Raman del pulque a 48 horas de fermentación (punta)

En la tabla 2 se resumen los diferentes grupos funcionales asignados

ETIQUETA

A Tirosine doublet B C-C o C-N skeletal stretch C Amide III D CH2 in phase twist E CH3F CH2 scissoring G Monosubstituted aromatic ring H Amide I band I Se verificó que esta señal es ruido y no es confiable

J Se verificó que esta señal es ruido y no es confiable

K CH stretch of various amino acids

Tabla 2. Resumen los diferentes grupos funcionales asignados para las muestras del pulque

Aceites comestibles

Las mediciones Raman se obtuvieron en el mimo equipo mencionado anteriormente. En particular nos interesa la region de varios aminoácidos (2800-3100) que corresponden al tipo C-H stretch. Los espectros Raman se muestran en las figuras 11, 12, 13 y 14.

2600 2700 2800 2900 3000 3100 3200 3300 3400

Inte

nsity

(A. U

.)

Wavenumber (cm-1)

A

Figura 11. Espectro Raman de aceite tipo A

2600 2700 2800 2900 3000 3100 3200 3300 3400

Inte

nsity

(A. U

.)

Wavenumber (cm-1)

B

Figura 12. Espectro Raman de la muestra B

2600 2800 3000 3200 3400

0

100

200

Inte

nsity

Wavenumber (cm-1)

C

Figura 13. Espectro Raman de la muestra C

Inte

nsity

Wavenumber (cm-1)

D

Figura 14. Espectro Raman de la muestra C En la tabla 3 se muestran las características de estas muestras de aceite

Muestra A Mixto de soya, oliva, girasol y colorante natural B Mixto alto oleico C Aceite de oliva extra virgen D Aceite de oliva 100 % puro

Tabla 3. Características de las muestras de aceite

A B C D Tipos de aminoacidos 2849.4 2848.6 2850.3 2849.5 Met (2848 w) 2864.4 2859.7 2865.9 2859.6 His (2873 w) 2904.1 2900.2 2897.3 2903.2 Arg (2905 m-s) 2932.6 2931.7 2931.8 2932.1 Met (2935 s) 2964.1 2964.8 2948.9 2959.4 Ala (2961 s), cystine (2963 m) 3010.1 3006.6 3005.7 3005.8 Met (3002 w), Ala (3005 w), Pro (3005 s), Cys (3008 w)

Tabla 4. Asignaciones de los resultados de ajustes a los espectros Raman. Todas las unidades están dadas en cm-1. Las abreviaciones para los aminoácidos están dados por Dood (1986). OBSERVACIONES GENERALES SOBRE ESTE PROYECTO: En este proyecto se presentaron trabajos en un congreso nacional y en un congreso internacional. Se envió un articulo a una revista de circulación nacional. Se le dio una beca PIFI al alumno: Francisco Javier Guzmán Rodríguez.