Requerimientos de calidad en los patrones de bandas brindados por las minicámaras de

Electroforesis Campos Pulsantes y sus aplicaciones en la epidemiología molecular.

José Alfredo Herrera Isidrón (jose@cneuro.edu.cu), Ana María Riverón, Lilia López-Cánovas.

Centro de Neurociencias de Cuba.

Palabras claves: Electroforesis de campos pulsantes, epidemiología molecular, CHEF, TAFE

Resumen

En este trabajo se proponen y validan descriptores para cuantificar el grado de desviación de un patrón

de bandas respecto al patrón ideal correspondiente en las cámaras de Electroforesis de campos pulsante

tipo miniCHEF y miniTAFE. También se identificaron y corrigieron las causas eléctricas y mecánicas

que distorsionan los patrones de bandas y afectan la comparabilidad y reproducibilidad de los patrones.

Se evaluó la capacidad de la cámara miniCHEF para resolver pulsotipos que evidencien las diferencias

entre las moléculas de ADN de cepas de microorganismos del mismo género y especie. Por último se

dotó a las cámaras con elevado formato de muestras y la capacidad de variar a voluntad y

eficientemente la cantidad de reactivos requerida para analizar cantidades variables de muestras.

Introducción

La Electroforesis de Campos Pulsantes (ECP) (Schwartz y Cantor, 1984) permite resolver, en patrones

de bandas, moléculas de ADN inferiores a 5 Mb (Birren y Lai, 1993) y es utilizada en la reclasificación

de bacterias basada en la tipificación molecular (Tai y cols., 2006) como base para establecer

programas de vigilancia epidemiológica (Swaminathan y cols., 2001). La tipificación mediante ECP se

basa en identificar las bandas comunes en los patrones, por lo que estos deben ser reproducibles y

comparables (Busch y Nitschko, 1999). Sin embargo, los patrones resueltos en muchas ocasiones

muestran distorsión de los trayectos de migración y la decisión sobre si tienen calidad o no para

tipificar es subjetiva.

Una condición para obtener patrones de bandas rectos y reproducibles es que las cámaras deben brindar

líneas equipotenciales rectas y paralelas dentro del arreglo de electrodos, lo que se logra tensando los

electrodos en los cámaras TAFE (Transversal Alternating Field Electrophoresis, Gardiner y cols.,

1986). Sin embargo para las cámaras CHEF (Contour Clamped Homogeneous Electric Field) es

necesario un circuito que imponga potenciales específicos en los electrodos.

El uso rutinario de la ECP en la medicina requiere generar los resultados de manera rápida, simple y

barata. Las cámaras miniCHEF y el miniTAFE (Riverón y cols., 1995) redujeron el gasto de reactivos

y el tiempo de separación de las moléculas hasta 5h respecto a los equipos comerciales pues admiten

altos campos eléctricos. Sin embargo se redujo a 6 muestras la capacidad de análisis en cada ECP. Por

tanto, no existen cámaras CHEF, miniCHEF, TAFE o miniTAFE que admitan cantidades de geles y

reactivos ajustables a la cantidad de muestras que deben analizarse en cada corrida.

En este trabajo se introducen mejoras constructivas a las minicámaras para usarlas rutinariamente en la

tipificación molecular de cepas de microorganismos. Para lograrlo se establecieron principios

constructivos y controles para evaluar el funcionamiento de cámaras miniCHEF y miniTAFE que

resuelvan las moléculas de ADN en patrones de bandas comparables en todos los carriles y geles.

Materiales y métodos

Las cámaras miniCHEF y miniTAFE.

Se utilizaron las cámaras miniCHEF o miniTAFE del sistema Guefast-04 (Neuronic S. A., Cuba). La

separación ánodo-cátodo (A+A- o entre B+B-) del miniCHEF es 11,6 cm, (Arencibia y col., 2002 a). El

minigel se colocó sobre una base y se sujetó con escuadras u otros elementos según el diseño

experimental. La separación ánodo-cátodo de los miniTAFE utilizados fue 7,8 cm y el minigel se

inmovilizó en un marco (Arencibia y cols., 2002c). Las cámaras se energizaron con una fuente de

poder de Imax=0,5 A. El tampón utilizado fue TBE 0,5X (TBE 1x: Tris 89 mM, Ácido Bórico 89 mM,

EDTA 2 mM pH 8,0) y su temperatura se mantuvo constante. Los minigeles se prepararon con agarosa

al 1,5% (p/v) en el tampón. Los patrones de bandas se fotografiaron y las distancias migradas por las

moléculas de ADN fueron medidas con el programa GuefastScan (Neuronic).

Los experimentos para evaluar el grado de distorsión de los patrones de bandas.

Se realizaron 91 ECP en miniCHEF y 55 en miniTAFE a moléculas de ADN de Saccharomyces

cerevisiae inmovilizadas en bloques de agarosa de 0,3 x 0,3 x 0,07 cm (ancho x alto x grosor) (López-

Cánovas y cols., 1996). El campo eléctrico, tiempo y cantidad de pulsos aplicados variaron entre los

experimentos. Se propusieron tres descriptores de la calidad de los patrones y se empleó la metodología

ROC (Provost y Fawcett, 2001) para desarrollar clasificadores. Como regla de oro se usó el criterio de

expertos. La validación se realizó con el método ‘dejando-uno-fuera’ (Gamberger y cols., 2006).

Circuitos en cámaras CHEF para obtener campos eléctricos de intensidad homogénea.

Se construyó un circuito de imposición de voltajes (VCUI) similar a otros reportados (Maule y Green,

1991) y se usó como referencia para evaluar un circuito nuevo (VCUII). En ambos circuitos se midió y

comparó el error promedio (AVD, en volt): ∑=

−=24

1

24/i

ii VteVmeAVD donde Vmei: potencial medido

en los electrodos, Vtei: el teórico esperado para E homogéneo. Se utilizaron ambos circuitos para

resolver muestras de ADN de S. cerevisiae en el miniCHEF, las condiciones fueron: T = 20 °C, E = 10

V/cm, Np = 137 y tp = 40 s. Los patrones se compararon con los descriptores desarrollados.

El medio conductor y accesorios de las minicámaras y de preparación de minigeles.

Se resolvieron muestras de S. cerevisiae en miniCHEF garantizando los potenciales apropiados en los

electrodos y altura constante del tampón. Los patrones de bandas se evaluaron y compararon con los

descriptores de la calidad. Se construyeron accesorios para formar los minigeles en cavidades abiertas o

cerradas. Las condiciones de electroforesis fueron: E = 10 V/cm, Np = 225, tp = 40 s y T = 20 °C. Se

construyeron marcos que sobresalían o no de las ranuras de las paredes laterales del miniTAFE para

evaluar si este podía ser un agente distorsionador. El ancho del miniTAFE fue 8,1 cm y las condiciones

empleadas fueron: T = 20 °C, E = 10V/cm, Np = 216 y tp = 50 s o E = 13,5 V/cm, Np = 310 y tp = 70s.

La migración por pulso y la falta de homogeneidad del medio conductor en miniCHEF.

Se corrigió la ecuación de la migración por pulso de ADN en CHEF (López-Cánovas y cols., 1998)

para cambios locales del campo eléctrico y se validaron las correcciones. Se programó en Delphi 5 un

algoritmo que simula las distorsiones de los PPB resueltos en cámaras miniCHEF.

Reproducibilidad en las cámaras miniCHEF y miniTAFE.

Se realizaron 10 electroforesis en miniCHEF donde E=10 V/cm, Np=225, tp=40 s y 15 en miniTAFE

con E=13,5V/cm, Np=420 y tp=30s. Se emplearon los circuitos y accesorios que permitieron obtener

patrones no distorsionados. Se calculó para cada minicámara el coeficiente de variación (CV, %) de las

distancias migradas por las moléculas de 230 y 577 kb de S. cerevisiae en los carriles de cada minigel y

el CV incluyendo los carriles de todos los minigeles. CV = 100•(desv. estándar/media) (Rosner, 1982).

Los patrones se evaluaron con los descriptores.

El miniCHEF para diferenciar aislados del mismo género y especie.

Se caracterizaron, en el miniCHEF, cuatro cepas de Vibrio cholerae cuya relación clonal era conocida

Las moléculas de ADN se cortaron con Not I. Las condiciones de ECP fueron 20 °C, 10 V/cm, las

rampas de tiempo y cantidad de pulsos se seleccionaron por un procedimiento descrito en Resultados.

La similitud entre cepas se calculó como Bsf=2•nbc/(n1+n2), (Dice, 1945), donde, nbc: cantidad de

bandas comunes, n1 y n2: cantidad de bandas resueltas en los patrones.

Cámara miniTAFE de alta capacidad de análisis y ancho interno modificable.

Se partió de un miniTAFE y se calculó el ancho ‘w’ máximo que puede alcanzar a partir de mediciones

iniciales de I al aplicar E de 5, 8,33 y 10 V/cm. La nueva cámara posee tapa y un conjunto de

accesorios, tiene forma de prisma tetragonal de base rectangular y sus paredes laterales poseen una

ranura de 0,3 cm de profundidad por la cual se desliza un marco múltiple que incluye marcos similares

a los del miniTAFE. Para comprobar su funcionamiento, se evaluó si la migración de las moléculas de

ADN era independiente del formato de muestras 13 ó 22 pocillos/minigel y si la oclusión de

compartimentos afectaba las distancias migradas por las moléculas de ADN. Se utilizaron muestras de

S. cerevisiae separadas a E = 10 V/cm, Np = 310, tp = 70 s, en TBE 0,5X a 20 °C.

Resultados y discusión

Descriptores cuantitativos del grado de desviación de un patrón resuelto en cámaras miniCHEF

o miniTAFE con respecto al ideal.

El conjunto de los patrones de bandas resueltos en un gel al aplicar muestras idénticas en los carriles

debería coincidir con un rectángulo (RI) en ausencia de distorsión (Figura 1). Llamaremos ‘patrón de

patrones’ de bandas (PPB) a la imagen compuesta por todos los patrones del gel.

Figura 1. A) Distorsión o desviación en PPBs resueltos en minigeles de ECP. Dcarril: desviación de carril. Dmig: desviación de migración. RI: Rectángulo ideal asociado al PPB según mejor patrón obtenido ‘in silico’. Tf-80 PPB no desviado resuelto en miniTAFE. Ch-21 PPB desviado resuelto en miniCHEF. Muestras: ADN cromosomal de S. cerevisiae. B) Coordenadas para determinar las áreas de desviación en un PPB. Áreas sombreadas: Desviación de carril (a y b) y de migración (m). (Xi,Yi) definen el contorno irregular de las áreas sombreadas. El área del RI (ARI) está definida por las coordenadas (Xcizq,Yini) y (Xcder,Ymax).

Un PPB ideal está contenido exactamente dentro del RI (Figura 4, TF-80), delimitado por los pocillos,

las bandas del ADN de topología lineal más migrados y los lados izquierdo y derecho interceptan los

extremos externos del primer y último pocillo. La Figura 1 muestra el PPB Tf-80 ‘no distorsionado’

que ajustan bien dentro del RI y el Ch-21 ‘distorsionado’ que no lo hace. La ausencia de rectitud en los

trayectos de migración fue denominada como ‘desviación de carril’ y cuando las moléculas de igual

tamaño no migran distancias iguales en el gel ocurre ‘desviación de migración’. Las áreas a y b

identifican la desviación de carril y el área m la de migración (Figura 1). Los descriptores de la calidad

del PPB se definieron como:

Dcarril = [(área a + área b) / ARI] • 100 o desviación de carril respecto a RI (%). Ec 1

Dmig = [área m / ARI] • 100 o desviación de migración respecto a RI (%). Ec 2

Dtotal = Dcarril + Dmig o desviación del patrón en su totalidad respecto a RI (%). Ec 3

Donde: ARI = (Xcder - Xcizq) • (Yini - Ymax).

De los 91 PPBs del miniCHEF, 53 fueron ‘no distorsionado’ (ND), 10 con ‘desviación de migración’

(M), a 15 con ‘desviación de carril (C) y a 13 con ambos tipos de desviación (T). Los expertos

clasificaron como ND a 22 PPBs, de los 55 resueltos en miniTAFE, 7 como T, 13 como M y dos como

C. Las curvas ROC y sus envolventes convexas (ROCCH) de los descriptores Dtotal, Dcarril y Dmig se

muestran en la Figura 2. Las áreas bajo cada curva ROC fueron mayores que 0,93 y por tanto los

Dca

rril

Ch-21

Dmig

Tf-80

RI

y

(xi,yi)área a

gel

pocillos de aplicación

x

yini

ymax

área b

xcder

(xi,yi)

área m

xcizq

ARI

A B

1- especificidad

a se

nsib

ilida

d

Dtotal

e

Dcarril

f

1- especificidad

Dmig

Dmig

c

Dcarril

b

d

sens

ibili

dad

Dtotal

1- especificidad

descriptores son excelentes según los criterios establecidos (Malagó y cols., 2006) (Figura 2).

Figura 2. Curvas ROC de los descriptores de la calidad de PPBs obtenidos en miniCHEF (a, b y c) o miniTAFE (d, e y f). Línea continua: ROCCH o envolvente convexa de la ROC. Cada corte óptimo está circulado y se encuentra en la intersección de la ROCCH con la línea menor costo (línea punteada) y pendiente m = (1-p)•γ / (p•β), donde p: proporción de positivos de la muestra, γ : costo del falso positivo (143 CUC), β: costo del falso negativo (543 CUC).

La eficiencia de cada clasificador se validó con el método ‘dejando-uno-afuera’: se eliminó el PPBi de

la muestra cada vez, se calculó el corte óptimo (κ[-i]) sin él, se clasificó el PPBi para este corte κ[-i] y

se comparó la clasificación obtenida con la esperada según la ‘regla de oro’. Después de repetir este

procedimiento con todos los PPBs, se contabilizaron los aciertos y fracasos y se calcularon la tasa de

error verdadera, sensibilidad y especificidad validadas. La validación reveló tasas de error verdaderas

inferiores a 0,2 y sensibilidades y especificidades validadas entre 0,85 y 0,95 las cuales indicaron que

Dtotal, Dmig y Dcarril identificaron correctamente la mayoría de los PPB distorsionados.

De los resultados presentados se establecieron los siguientes algoritmos de clasificación:

Con anterioridad no hay reportes de descriptores que cuantifiquen la distorsión de los PPBs obtenidos

en ECP ni han sido propuestos otros criterios sobre la desviación de los patrones que permitan decidir

su inclusión (o exclusión) en estudios epidemiológicos.

Causas eléctricas y mecánicas de la calidad de los PPBs en las minicámaras.

Un circuito para generar los potenciales eléctricos en los electrodos del miniCHEF.

El circuito diseñado (VCUII) incluye dos partes idénticas pero solo una de ellas actúa a la vez. Cada

parte está formada por un divisor de voltaje a cuyos nodos se conectan las bases de transistores en

desviado por carril

Dtotal ≤ Dtotal-Tf ≡2,4% ‘no distorsionado’

Dtotal > Dtotal-Tf ≡2,4% Dcarril > Dcarril-Tf ≡0,9%

Dmig > Dmig-Tf ≡1,7% desviado por migración

PPB de miniTAFE

Ec 5

Dcarril >Dcarril-Ch ≡1,7% desviado por carril Dtotal ≤ Dtotal-Ch ≡3,4% ‘no distorsionado’

Dtotal > Dtotal-Ch ≡3,4% Dmig > Dmig-Ch ≡1,9% desviado por migración

PPB de miniCHEF

Ec 4

configuración de seguidor de emisor y los emisores de estos a los pares equipotenciales a través de

diodos. Al aplicar 120 V entre A+A- o entre B+B- del miniCHEF, el circuito VCUI impuso igual

potencial en ambos electrodos del 50% de los pares equipotenciales y el promedio de las diferencias

|Vmei-Vtei| o AVD fue 0,44 V. Cuando se usó VCUII, se impuso potenciales idénticos en ambos

electrodos del 84% de los pares equipotenciales y AVD fue 0,06 V. Los PPBs de los cromosomas de S.

cerevisiae obtenidos en el miniCHEF conectado al circuito VCUI o VCUII (Figura 3 a y b) fueron ‘no

distorsionados’. Dtotal fue 1,8% y Dcarril fue 1,1% en el obtenido con VCUI mientras que

Dtotal=1,4% y Dcarril=0,7% en el obtenido con VCUII y Dmig fue 0,7% en ambos.

Figura 3. PPBs de los cromosomas de S. cerevisiae resueltos con el circuito VCUI (a) o el VCUII (b). Condiciones de ECP: E = 10 V/cm, Np = 137, tp = 40 s, T = 20 °C. cz: zona de compresión, mt: banda correspondiente al ADN mitocondrial. El medio conductor en las minicámaras.

Las escuadras interpuestas en el camino de las líneas de fuerza del campo eléctrico deben distorsionar

los PPBs obtenidos en el miniCHEF. Pero al eliminarlas se obtuvieron PPBs desviados por carril. La

única explicación posible era falta de homogeneidad del medio conductor. La ecuación que describe la

migración de moléculas de ADN en CHEF (López-Cánovas y cols., 1998) asume que el campo

eléctrico aplicado en las direcciones A y B es igual. Sin embargo cuando las esquinas del gel enfrentan

el ánodo o el cátodo, sobre las muestras inciden líneas de fuerza que enfrentan diferentes áreas de

sección transversal en el gel y diferentes fracciones ‘recorrido-gel/recorrido-tampón’.

En este trabajo se propuso que el campo eléctrico base (Ebase) que impone el circuito de imposición de

voltaje sería modificado según:

Donde: I, Intensidad de la corriente eléctrica; σ, la conductancia específica del agua; Sx,y y hgel, el

ancho y la altura del gel en los planos paralelos al ánodo; sep, separación entre electrodos; lx,y, la

longitud del gel en la dirección del E y coef modula la influencia de Zx,y sobre |Ex,y| tomando valores

entre -1,0 y 1,0. La dirección y el sentido de Ex,y coinciden con las de Ebasey los valores de Sx,y y lx,y

varían en los diferentes punto del gel, entonces

Zx,y = σ • Sx,y• hgel • sep

I • lx,y Ec 6|Ex,y| = |Ebase|+coef•Zx,y

kb

cz

577230

mt

cz

577230

mt

kb a b kb

I-2

577

230

kb

Ch-12

( )ii yxfEaii yx ,, = y ( )

iiii yxyxk EaTkfdA ,,,,, = Ec 7

( )ii yxfEbii yx ,, = y ( )

iiii yxyxk EbTkfdB ,,,,, = Ec 8

donde T es la temperatura del tampón y k el tamaño de la molécula. El cálculo de `,, ii yxkdA y

ii yxkdB,,

se realiza sustituyendo E por ii yxEa , en la ecuación de la migración de ADN en CHEF (López-

Cánovas y cols., 1998) y la migración total se calcula como

∑=

=Np

ik iik yxdD

1,, donde

iikiikiik yxyxyx dBdAd ,,,,,, += Ec 9

Los descriptores medidos en tres PPBs resueltos en miniCHEF en ausencia de escuadras fueron,

respectivamente, Dtotal: 7,4, 6,6 y 5,5%; Dcarril: 5,9 5,2 y 4,6%; y Dmig: 1,5, 1,4 y 0,9%. Los rangos

(mediana ± S) fueron: (5,5%-7,7%) para Dtotal, (4,6%-5,8%) para Dcarril y (1,1%-1,7%) para Dmig.

Valores de coef=0,06 y ángulo=0° brindaron el PPB I-2 (Figura 4) cuyos descriptores de la calidad

fueron Dtotal = 7,1%, Dcarril = 5,8% y Dmig = 1,3% y se encuentran dentro de los rangos calculados.

Figura 4. PPBs de los cromosomas de S. cerevisiae, resueltos en miniCHEF (Ch-12) y simulado a partir de las ecuaciones 6-9 (I-2). coef = 0,05, ángulo = 0°, Np = 315, Ebase = 10 V/cm, tp = 40 s, T = 20 °C.

Tabla 1. Estadígrafos y comparaciones de las distancias migradas por las moléculas de 230 ó 577 kb en los PPBs Ch-12 e I-2.

cromosoma Ch-12 I-2 (kb) D (cm) EEM (cm) D (cm) EEM (cm) t prob(t) 230 3,29 3,7•10-3 3,29 4,3•10-3 -0,28 0,79 577 2,21 7,5•10-3 2,20 4,6•10-3 0,65 0,52

EEM: Error estándar de la media. t: estadígrafo de t-student. Prob(t): probabilidad de t. n= 24.

Las distancias que las moléculas de ADN de un tamaño dado migraron en los minigeles y las predichas

por Ec 6 – Ec 9 no difirieron significativamente (α = 0,05) (Tabla 1). Entonces, las distancias migradas

por las moléculas de ADN en miniCHEF dependen del área de los planos que deben atravesar los iones

y las longitudes de los trayectos de migración al atravesar el gel. De lo anterior se deduce que las

irregularidades del área de sección transversal deben ser críticas al miniaturizar las cámaras de ECP y

se requieren soluciones constructivas que resuelvan estos problemas.

El área de sección transversal y el medio conductor en el miniCHEF y el miniTAFE.

Meniscos en el gel y accesorios para evitarlos.

tapa trasera

marco del miniCHEF

ranura

tapa delantera

muestra

minigel

base

dien

tes

peine

Ch-79

Ch-24

poci

llos d

e ap

licac

ión

a b

paredes laterales del marco

caras internas

F F

B+

A-

A+

B-

pare

d la

tera

l de

la c

ámar

a

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 carrilesTf-24

paredes paralelas

a los electrodos

Las electroforesis realizadas en minigeles formados en moldes abiertos brindaron PPBs como Ch-24

(Figura 5) con ambos tipos de desviación (Dtotal = 6,1%, Dcarril = 2,3 y Dmig 3,8%). Estos minigeles

poseían meniscos en la superficie. El juego de accesorios para preparar los geles sin meniscos se

muestra en la Figura 5 y brindaron PPBs ‘no distorsionados’ como Ch-79.

Figura 5. Vista explotada de los accesorios para formar minigeles del miniCHEF. (Modelo industrial definitivo: Arencibia y cols., 2002b). Ch-24: PPB resuelto en un minigel con meniscos. Ch-48: PPB resuelto en un minigel sin meniscos. T =20°C, E=10 V/cm, Np = 225, tp = 40 s. Muestras: moléculas de ADN de S. cerevisiae.

El área de sección transversal del miniTAFE y el ancho de los minigeles.

Si las paredes del marco sobresalen de las paredes del miniTAFE, se altera el ancho del área de sección

transversal.

Figura 6. Posicionamiento incorrecto (a) de las paredes del marco (b) en una cámara miniTAFE (vista superior). a) Rectángulo cuadriculado: minigel. Rectángulos negros: paredes laterales del marco. Líneas discontinuas A+, A-, B+ y B-: electrodos. F: líneas de fuerza del campo A. b) Marco del miniTAFE. Tf-24: PPB de los cromosomas de S. cerevisiae obtenidos con posicionamiento incorrecto de las paredes del marco. T = 20 °C, E = 10 V/cm, Np = 216 y tp = 50 s.

Entonces, las líneas de fuerza del campo aumentan localmente cerca de dichas paredes (Figura 6 a). Así

se genera desviación de migración (Figura 6 Tf-24) con Dtotal = 4,1%. Lo anterior implica que las

soluciones cosntructivas deben evitar esta irregularidad.

Ch-111

230 577

kb

577 230

kb Tf-75

194 240

339,5

48

97

kb

81

638

80

569B

*

C72

58

Reproducibilidad de PPBs en cámaras miniCHEF y miniTAFE.

Identificar las causas de distorsión en el miniCHEF y miniTAFE permitió incrementar la calidad de los

PPBs (Figura 7). En ellos, los valores de los descriptores siempre fueron inferiores a los cortes

respectivos. Los coeficientes de variación (CV) de las distancias migradas por las moléculas de 230 ó

577 kb entre todos los carriles de cada PPB o entre todos los PPBs siempre fueron inferiores a 4% y es

aceptado que CV < 4% indica alto grado de reproducibilidad (Hardwick y cols., 2002).

Figura 7. PPBs ‘no distorsionados’ de los cromosomas de S. cerevisiae. Ch-111: PPB de miniCHEF. Condiciones de ECP: E = 10 V/cm, Np = 225y tp= 40 s. Tf-75: de miniTAFE, E= 13,5 V/cm, Np = 420 y tp = 30s. T = 20 °C en ambos.

El miniCHEF para diferenciar microorganismos del mismo género y especie.

Para conocer si los patrones de bandas resueltos en el miniCHEF con los circuitos y accesorios

propuestos contienen la información que permita discriminar microorganismos de la misma especie, se

seleccionaron cuatro cepas de Vibrio cholerae: La cepa 81 que se deriva de la C7258, la 638 construida

a partir de la 81 (Campos y cols., 1998), todas del biotipo El Tor y la 569B del biotipo Clásico. A partir

los tr calculados con la ecuación de la migración de ADN en CHEF (López-Cánovas y cols., 1998)

para 1,5% de agarosa (TBE 0,5X), 10 V/cm y 20 °C y las tallas de los restrictos para NotI de los

cromosomas de una cepa de V. cholerae secuenciada (cepa N16961, Heidelberg y cols., 2000), se

aplicó una rampa entre 25 y 3 s.

Figura 8. Pulsotipos obtenidos en miniCHEF de los fragmentos de restricción con Not I de las moléculas de ADN de varias cepas de V. cholerae. ‘•’ y ‘*’ indican bandas distintas entre las cepas C7258 y 638. Condiciones de separación: agarosa 1,5% TBE 0,5X, 10 V/cm, 20 °C. Rampa de pulsos: 30- 25 s, 35- 20 s, 44- 15 s, 130- 10 s, 1000- 5 s y 200- 3 s (Np- tp, respectivamente). La comparación de los patrones (Figura 8) reveló 100% de similitud entre

las cepas C7258 y 81 (13 bandas comunes). El patrón de la 638 (14 bandas) se diferenció en tres

bandas de los patrones de la C7258 y 81, la similitud entre ellas fue 89% (12 bandas comunes). El

patrón de la 569B mostró 13 bandas, seis comunes con las del patrón de las cepas C7258 y 81, la

muestra

tapa

marco

altocátodos

muesca

ánodos

cámara

ranuras

tabique

a

b

c

ranura lateral

similitud entre ellas fue 43%. Las similitudes encontradas concuerdan con lo esperado e indican que el

gel de 5 cm del miniCHEF brindó patrones de bandas que permitieron discriminar entre cepas con

diferente grado de cercanía genética.

Cámara de ancho interno modificable para acomodar múltiples muestras en una cantidad

variable de minigeles.

El gel de TAFE se coloca verticalmente entre los electrodos, entonces debe ser posible diseñar cámaras

miniTAFE con electrodos tan largos como se desee. Sin embargo el aumento del ancho de la cámara

‘w’ incrementa el área de sección transversal al paso de la corriente y limita el campo eléctrico (E) que

puede ser aplicado en ella. La longitud óptima ‘wth’ de los electrodos se puede calcular a partir de

Donde ĥm es promedio de ĥ = Iini / (σ •w • E) calculado para tres valores de E, Ith es el 75% de la

capacidad máxima de corriente de la fuente de poder. La ecuación 10 dio wth=30,6cm, para Ith=0,375A,

E=8,3V/cm y TBE 0,5X a 25°C (σ = 671,6 •10-6 Ω-1•cm-1).

Figura 9. Esquema de una vista isométrica explotada de la cámara MultiminiTAFE. (a) cámara de electroforesis, se muestran las paredes de la cámara, el piso con una excavación, el arreglo de electrodos y las ranuras laterales. (b) Marco múltiple, se indican las muescas para insertar el peine múltiple y los cuatro minigeles separados por tabiques. (c) tapa de la cámara, aparecen suspendidos de la tapa un ‘bloque B’ que ocluye el compartimento c4 y dos ‘láminas A’ que separan los compartimentos c1–c2 y c2–c3.

La cámara fue construida según las pautas establecidas para el miniTAFE pero fue dividida en cuatro

compartimentos más pequeños (Figura 9 c, c1-c4) de tamaños similares al miniTAFE. Cada

compartimiento contenía uno de los minigeles del marco múltiple, y cada minigel era de 3,85 x 7,1 cm

(largo x ancho) (Figura 9 b). Los compartimentos podían ser ocluidos o no mediante los ‘bloques B’ y

los compartimentos activos se separaron mediante la inserción de las ‘láminas A’ entre ellos. Estas

garantizaban áreas de sección transversal iguales en cada compartimento energizado. Cada ‘bloque B’

8,1 ≤ wth ≤ σ • E • ĥm

Ec 10 Ιth

era desmontable y tenía la forma y tamaño de un compartimento. En la Figura 9 c un ‘bloque B’

desplaza el tampón de c4 y lo ocluye completamente. Las ‘láminas A’ eran desmontables y en el

ejemplo separan los compartimentos c1-c2 y c2-c3. En esta cámara llamada MultiminiTAFE se podían

energizar uno, dos, tres o todos los compartimentos simultáneamente y ocluir el resto con ‘bloques B’.

Después de 12 h de electroforesis los patrones de bandas de ADN de S. cerevisiae mostraron igual

cantidad de bandas y similar resolución en todos los carriles de los minigeles con formatos de 22 ó 13

muestras (Figura 10). No existieron diferencias significativas entre las medias de las distancias

migradas por las moléculas de 230 kb en estos minigeles (t(59) = 1,65, p = 0,10) o por las de 577 kb

(t(59) = 1,89, p = 0,06).

Tabla 2. Estadígrafos que describen la distancia migrada por las moléculas de 230 kb en los minigeles de los compartimentos del MultiminiTAFE energizados simultáneamente C. E. c1 c1 – c2 c1 – c2 – c3 c1 – c2 – c3 – c4 Media (cm) 1,92 1,91 1,91 1,91 1,92 1,91 1,90 1,92 1,92 1,91 EEM(10-3cm) 2,14 3,94 8,22 5,33 4,29 4,07 4,03 3,80 6,22 6,15

C. E.: Compartimentos energizados. EEM: Error estándar de la media.

Los PPBs de muestras de S. cerevisiae resueltos en los minigeles de la cámara sin oclusiones, o

después de haber ocluido uno, dos o tres compartimentos fueron similares. Las diferencias entre las

medias de las distancias migradas por las moléculas de 230 kb en estos geles no difirieron

significativamente de cero (Tabla 2, F(9,100)=0,81, p= 0,61), por lo que la oclusión de compartimentos

no afectaba la migración de las moléculas de ADN.

Figura 10. PPBs de ADN de S. cerevisiae separados en los minigeles de los compartimentos c1 – c4 del MultiminiTAFE. Formatos de muestra: c1 – c3, 13 muestras/minigel, c4: 22 muestras. E = 10 V/cm, Np = 309, tp = 70 s, T = 20 °C. cz: zona de compresión, mt: banda correspondiente al ADN mitocondrial. Los resultados anteriores indicaron que el MultiminiTAFE posibilitaba realizar co-electroforesis

rápidas de: 1) 22 x 1 (ó x 2, ó x 3, ó x 4) muestras, o ii) 13 x 1 (ó x 2, ó x 3, ó x 4) muestras,o iii) 11 x 1

(ó x 2, ó x 3, ó x 4) muestras, o iv) todas las combinaciones de 22, 13 y 11 muestras en dos, tres o

cuatro minigeles. Un miniTAFE con 22 muestras necesitaría cuatro electroforesis de 7h a 10 V/cm para

separar las 88 muestras que el MultiminiTAFE separaría en 12 h (Figura 10, 61 muestras en el

ejemplo). El CHEF Mapper, (Biorad, 2005) con 45 muestras, requeriría dos electroforesis de 24 h para

lograrlo. Entonces el MultiminiTAFE fue más eficiente en cuanto a tiempo y cantidad de muestras que

c1 c2 c3 c4 carriles 1 13 1 13 1 13 1 22

los anteriores. El MultiminiTAFE mantuvo la rapidez del miniTAFE, pero permitió analizar mayor

cantidad de muestras.

La eficiencia de la cámara fue medida en base al exceso de reactivos en cada ECP (ER, %) según

senergizado ntoscompartime losen pocillos los de total

senergizado ntoscompartime losen cargados no pocillos de cantidadNcNce

100ER ••= Ec 11

donde ‘Nc’: cantidad de compartimentos de la cámara. Si se depositara una muestra en uno de los 52

pocillos de un minigel único con 30,4 cm de ancho (Nc y Nce = 1), ER = 98%, lo que indica baja

eficiencia (100 - ER) de empleo de reactivos. Si las muestras se distribuyeran óptimamente en el

MultiminiTAFE (Nc = 4) y se ocluyeran los compartimentos no utilizados, ER nunca alcanzaría 25%

aun cuando se analizara una sola muestra. Entonces, el marco múltiple, las ‘láminas A’ y los ‘bloques

B’ (Figura 9) constituyeron un juego de accesorios que modificaron a voluntad del usuario el ancho

interior de la cámara MultiminiTAFE, y posibilitaron realizar co-electroforesis a una cantidad variable

de muestras en la menor cantidad de geles posible y con un volumen mínimo de tampón.

El ancho que pueden alcanzar las cámaras MultiminiTAFE es relevante en el desarrollo de aplicaciones

que demandan formato elevado de muestra (88 en nuestro caso). La flexibilidad que introducen los

bloques y la división en compartimentos de estas cámaras muy anchas hacen que las mismas sean

eficientes aunque analicen cantidades distintas de aislados en cada electroforesis, requisito de gran

importancia al caracterizar brotes infecciosos. Por último las ventajas de las minicámaras en relación

con rapidez de separación y ahorro de muestras y reactivos, se mantienen en el MultiminiTAFE, así

como la obtención de trayectos rectos de migración que no se desvían del patrón ideal. La

reproducibilidad y comparabilidad de los patrones obtenidos convierten a las cámaras MultiminiTAFE

en una promesa para la caracterización de microorganismos en estudios de epidemiología molecular.

Conclusiones

1- El grado de distorsión de un patrón de bandas del miniCHEF o miniTAFE se describe como el

cociente entre el área en que el patrón se desvía del patrón ideal esperado y el área del ideal.

2- Los patrones de bandas del miniCHEF o el miniTAFE se asignan a las clases ‘distorsionado’ o ‘no

distorsionado’ a partir de los valores de los descriptores de la desviación de carril, de migración, o la

suma de ambos, con probabilidad de clasificación correcta mayor o igual a 0,93.

3- Dos divisores de voltaje idénticos, formados por resistores y diodos, cuyos nodos se conectan a

transistores en configuración de seguidor de emisor y estos, a través de diodos, a los pares de

electrodos equipotenciales, homogenizan el campo eléctrico en la minicámara CHEF.

4- En las cámaras miniCHEF y miniTAFE hay que mantener constante el área de sección transversal

del medio conductor para lograr patrones de bandas comparables y reproducibles en todos los carriles y

minigeles.

5- La ecuación de la migración por pulso predice las distancias migradas por las moléculas lineales de

ADN en el miniCHEF si se consideran en cada punto del minigel los cambios de intensidad de campo

eléctrico ocasionados por la ubicación del gel en el interior del arreglo de electrodos.

6- Los pulsotipos ‘no distorsionados’ resueltos en el minigel de 5 cm de largo del miniCHEF revelan

las diferencias en las longitudes de los fragmentos de restricción del genoma de cepas de V. cholerae.

7- Una cámara miniTAFE con ánodos y cátodos separados 7,8 cm, 30 cm de ancho y dividida en

compartimentos ocluibles resuelve simultáneamente en 12 horas hasta 88 muestras de moléculas de

ADN con más del 75% de eficiencia en el uso de los reactivos.

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