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Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Agrobiotecnología Curso 2011
Resistencia a bacterias fitopatógenas mediante ingeniería genética
Alejandro Mentaberry
Sumario
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Bacterias fitopatógenas
Interacciones planta-bacteria
Defensas inducibles en las plantas
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias mediante ingeniería genética
- Péptidos antimicrobianos - Lisozimas- Tioninas- Genes de resistencia- Glucosa oxidasa- Ornitil carbamoil transferasa
Inhibición de la regulación de factores de virulencia
Referencias
Bacterias fitopatógenas
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Génerosy especies de bacterias fitopatógenas
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
iranicus, rathayi, tritici, michiganensis (subsp.michiganensis, insidiosus, nebraskensis, sepedonicus, tessellarius)
xyli (subsp. xyli, cynodontis)
ilicisArthrobacter
División Firmicutes(gram positivos)
División Gracillicutes(gram negativos)
Clase ProteobacteriaSubclase alfa
Familia Rhizobiaceae
fasciansRhodococcus
flaccumfaciensCurtobacterium
suberifaciensRhizomas
Familia (sin nombre)
rhizogenes, rubi, tumefaciens, vitis
Agrobacterium
ampelinusXylophilus
avenae (subsp. avenae, citrulli)
Acidovorax
Subclase betaFamilia Comamonadaceae
Especies Géneros
Clavibacter
Génerosy especies de bacterias fitopatógenas
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Familia (sin nombre)
fastidiosaXylella
Familia (sin nombre)
albilineans , campestris, fragariae, graminis, oryzae, populi
Xanthomonas
Subclase gamma
Familia Enterobacteriaceae
1) fuscovaginae, marginalis, tolaasii
2) amygdali
3) syringae, viridiflava
4) chicorii
5) corrugata
Pseudomonas
Familia Pseudomonadaceae
amylovora, nigrifluens, quercina, rubrifaciens, stewartii, tracheiphila, herbicola, ananas, carotovora (subsp. carotovora, atroseptica, betavasculorum), chrysanthemi, rhapontici
Erwinia
Spp.Streptomyces
Géneros de afiliaciónincierta
EspeciesGéneros
Familia (sin nombre)
fastidiosaXylella
Familia (sin nombre)
albilineans , campestris, fragariae, graminis, oryzae, populi
Xanthomonas
Subclase Gamma
Familia Enterobacteriaceae
fuscovaginae, marginalis, tolaasii
amygdali
syringae, viridiflava
chicorii
corrugata
Pseudomonas
Familia Pseudomonadaceae
amylovora, nigrifluens, quercina, rubrifaciens, stewartii, tracheiphila, herbicola, ananas, carotovora (subsp. carotovora, atroseptica, betavasculorum), chrysanthemi, rhapontici
Erwinia
Spp.Streptomyces
Géneros de afiliaciónincierta
EspeciesGéneros
Principales componentes de la ultraestructura de una bacteria fitopatógena típica
Esquema deuna bacteria fitopatógena
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Adaptado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
β
Microscopía electrónica de Erwinia pyrifoliae, patógeno del peral. Pueden observarse el glicocálix y varios pili.
Microscopía electrónica de barrido de células de Pseudomas syringae.
Microscopía electrónica de células de Xhantomonascon un flagelo polar (arriba) y de Peudomonas con flagelos lofotricos (abajo)
Bacterias fitopatógenas Gram negativas y Gram positivas
Tom
ado
de: L
lace
ret
al.,
Pat
olog
ía V
eget
al, 1
996.
Filamentos ramificados, micelios aereos y cadenas de esporas características
de Streptomyces spp.
500 nm
La mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen forma de bastones cortos de 0,6-3,5 µm
de longitud y 0,5-1 µm de diámetro
Ciclo biológico de una bacteria fitopatógena con fase epifita
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Pseudomonas syringae pv. morsprunorum exudandode los estomatas de hojas de cerezo infectadas
Microscopía de barrido de la superficiedel envés de una hoja de cítrico.
Se observan células de Xanthomonas citricolonizando la cavidad subestomática
Ingreso y dispersión de fitobacterias por aperturas naturales
Las bacterias fitopatógenas utilizan a los estomas y lenticelas como vías naturales de ingreso a la planta
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.
Microscopía electrónica de una sección longitudinal (A)y transversal (B) de Pseudomonas syringae pv tabaci
en el espacio intercelular del mesófilode hojas de tabaco.
Microscopía electrónica de Xanthomonascampestris colonizando una hojade Brassica. Las bacterias están
generalmente rodeadas de un polisacárido extracelular (EPS) y proliferan en estrecho contacto con las paredes celulares (CW)
La mayor parte de las bacterias fitopatógenas se ac umula en el espacio extracelular o en el tejido vascular y utiliza esta vía y los tejidos conductivo
para colonizar diferentes órganos de la planta
A B A B
Muchas bacterias fitopatógenas se localizan en el apoplasma
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.
Principales tipos de enfermedades bacterianas y síntomas que producen en el huésped
Clavibacter y Curtobacterium
P. solanacearumAlgunas Erwinias y Xanthomonas
Invasión del floema y xilema
MarchitamientoEnanismoPodredumbre en anilloManchas en ojo de pájaro
Marchitamientos en plantas herbáceas
Pseudomonassyringae pv. syringaeErwinia amylovora
Invasión del floema y xilema a través de heridas, yemas, cicatrices foliares, hojas jóvenes y flores
Necrosis de la cortezaMarchitamiento o desecamiento de brotes jóvenes y corimbos florales Necrosis de yemas Gomosis
Chancros y marchitamietoen plantas leñosas
Principales especies fitopatógenas de Pseudomonas y Xanthomonas
Espacios intercelulares y necrosis delparénquima
Necrosis con hidrocelesManchas angulares o alargadasManchas necróticas con haloPerdigonado de hojasClorosis de hojas jóvenesDesecamiento foliarManchas en frutosExudados
Manchas foliares y en frutos
PatógenosTejidos afectadosSíntomas Tipo de enfermedad
ClavibacterCurtobacterium
P. solanacearumAlgunas ErwiniasXanthomonas
Invasión del floema xilema
MarchitamientoEnanismoPodredumbre en anilloManchas en ojo de pájaro
Marchitamientos en plantas herbáceas
syringae pv. syringaeInvasión del floema xilema a través de heridas, yemas, cicatrices foliares, hojas jóvenes y flores
Necrosis de la cortezaMarchitamiento o de brotes jóvenes corimbos florales Necrosis de yemas Gomosis
Chancros marchitamietoen plantas leñosas
Principales especies fitopatógenas de PseudomonasXanthomonas
y necrosis delparénquima
Necrosis con hidrocelesalargadas
con haloPerdigonadoClorosis de hojas jóvenesDesecamientoManchas en frutosExudados
y en frutos
PatógenosTejidos afectadosSíntomas Tipo de enfermedad
Xanthomonas axonopodis
Principales tipos de enfermedades bacterianas y síntomas que producen en el huésped
Microscopía electrónica de barrido de la
lesión del cancro
StreptomycesTejidos más externos epidérmicos, subepidérmicos y parenquimáticos
Necrosis eruptivas rugosas, con costras o pústulas y suberificadas
Roñas o costras
AgrobacteriumRhodococcus fasciansP. syringae pv. savastanoi
Estimulación anormal de la división celular y delcrecimiento de tejidos meristemáticos
Tumores en cuello y raízTumores en ramasHiperproliferación radicular
Hiperplasia y proliferación
Erwinias pectinolíticas y algunas Pseudomonas
Maceración de la lámina media y pared primaria celular
Pudrición blanda de tubérculos, bulbos o rizomasPie negro
Podredumbres blandas
PatógenosTejidos afectadosSíntomas Tipo de enfermedad
StreptomycesTejidos más externos epidérmicos, subepidérmicos y parenquimáticos
Necrosis eruptivas rugosas, con costras o pústulas y suberificadas
Roñas o costras
Agrobacterium
P. syringae pv. savastanoi
Estimulación anormal de la división celular y delcrecimiento de tejidos meristemáticos
Tumores en cuello y raízTumores en ramasHiperproliferación radicular
Hiperplasia y proliferación
Erwinias pectinolíticas y algunas Pseudomonas
Maceración de la lámina media y pared primaria celular
Pudrición blanda de tubérculos, bulbos o rizomasPie negro
Podredumbres blandas
PatógenosTejidos afectadosSíntomas Tipo de enfermedad
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Infección de geranio por Xhantomonas hortorum pv pelargonii
(clorosis y necrosis foliar)
Infecciones de caña de azúcar porPseudomonas rubrilineas (bandas
necróticas; arriba derecha) y de Platycerium bifurcatum por
Pseudomonas gladioli (lesiones necróticas; derecha )
Infección por Xanthomonasaxonopodis(cancro de los cítricos)
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.
Síntomas de cancrosis en frutos, hojas y ramas de Citrus.
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Infección de peral (arriba) y de manzano (derecha) por Erwinia amylovora (tizones)
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Tomado de: Scnaad et al. APS Press, 2001.
Arriba izquierda:Infección de tubérculos de papapor Streptomycesscabies (escaras)
Abajo izquierda:Infección de fruto de tomate porClavibactermichiganensis(cancros)
Derecha: Infección de tubérculos de papa por Erwinia carotovora subsp. atroséptica(podredumbre blanda)
Infección de una cucurbitácea por Erwinia tracheiphila(invasión del xilema con goma bacteriana)
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
• No existe control químico eficiente• Pulverizaciones a base de cobre
Métodos de control de bacteriosis en cultivos
Pulverización de citrus con un preparado a base de sulfato de cobre de para el control de cancrosis
• Erradicación y quema de las plantas infectadas
Métodos de control de bacteriosis en cultivos
Quema de citrus infectados con cancrosis
Interacciones planta-bacteria
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
- La planta posee defensas preformadas o su sistema . defensivo reconoce moléculas presentes en la . superficie del patógeno (PAMPs; patrones moleculares . asociados al patógeno) desencadenando una respuesta . de protección general (resistencia de no específica).
- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la . . planta (Respuesta Hipersensible, Resistencia Sistémica . Adquirida) y el patógeno resulta restringido en la zona inicial . de la infección. (resistencia específica).
- Las condiciones ambientales externas cambian y el . patógeno muere antes de llegar a una etapa en que la . infección es irreversible.
- Las defensas preformadas son inadecuadas
- El patógeno es capaz de neutralizar las respuestas . defensivas de la planta y/o de retardar el inicio de las mismas
- Las condiciones externas son favorables para la infección
• Se produce enfermedad cuando:
La enfermedad resulta de la interacción entre el hospedante, el patógeno y el medio ambiente
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
• No se produce enfermedad cuando:
La especificidad del patógeno bacteriano y de los genes de resistencia de la planta determinan diferentes tipos de interacción
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.
(variedades) (variedades)
Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.
Interacciones planta-bacteria
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Eventos de señalizació n que regulan la interacción planta-bacteria
Factores que intervienen en la interacción planta-patógeno
Factores de patogenicidad: imprescindibles para general la enfermedad; no determinanlos síntomas en forma directa (ejemplo, proteínas hrp; proteínas vir)
Factores devirulencia:
Factores de virulencia: responsables de la sintomatología; modulan la gravedad de laenfermedad (ejemplo, toxinas, enzimas degradadoras, fitohormonas)
Factores de Requeridos para el reconocimiento delavirulencia: patógeno por parte de la planta
Factores de patogenicidad: imprescindibles para general la enfermedad; no determinanlos síntomas en forma directa (ejemplo, proteínas hrp; proteínas vir)
Factores devirulencia:
Factores de virulencia: responsables de la sintomatología; modulan la gravedad de laenfermedad (ejemplo, toxinas, enzimas degradadoras, fitohormonas)
Factores de Requeridos para el reconocimiento delavirulencia: patógeno por parte de la planta
Algunos factores bioquímicos producidos por las bacterias fitopatógenas que tienen una función en la virulencia y en la colonización de la planta huésped
SIDEROFOROS
EXOPOLISACARIDOS
EXOENZIMAS
BACTERIOCINAS
FITOHORMONAS
PROTEINAS NUCLEADORAS
FITOTOXINAS
BACTERIA
SIDEROFOROS
EXOPOLISACARIDOS
EXOENZIMAS
BACTERIOCINAS
FITOHORMONAS
PROTEINAS NUCLEADORAS
FITOTOXINAS
BACTERIA
Factores secretados por bacterias fitopatógenas
Sistemas de secresión en bacterias Gram negativas
Tomado de: Nature Reviews Microbiology, 2009.
Modelo de patogenia bacteriana que involucra la lib eración mediada por el sistema Hrp de factores de patogenicidad y factores de avirulencia d entro de la célula vegetal
Factores de compatibilidad (virulencia)- Las proteínas secretadas por el sistema Hrp (símbolos rojos/verdes) interactúan con la proteínas o ácidos nucleicos del hospedante (símbolos negros) - Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran) - Las mutantes bacterianas poseen fenotipos de virulencia débil (parte verde de los símbolos rojos/verdes) - Estas proteínas promueven colectivamente el parasitismo vía: . Supresión de las defensas? . Promoviendo la síntesis o liberación de nutrientes
Factores de incompatibilidad (avirulencia) - Un amplio espectro de proteínas del hospedante codificadas por genes R (símbolos negros) acopladas a las rutas de señalización de las respuestas defensivas (flechas en zig-zag) conforman el sistema de vigilancia - Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran) - La Respuesta Hipersensible (HR) es gatillada por la interacción de cualquier par correspondiente de proteínas R y Avr (parte roja de los símbolos rojos/verdes) o de proteínas R y productos enzimáticos Avr (no se muestran) - Las interacciones avirulentes son epistáticos sobre las interacciones virulentas (compatibles)
Pared celular
Parasitismo
HR y defensa
Nutrientes
Agua
Incremento de pH
Secresión de proteínas mediada por el sistema Hrp
La región de patogenicidad Hrp contiene:
- El agrupamiento conservado de genes hrp(subconjunto hrc en púrpura)
- El gen hrpZ que codifica a la harpina HrpZ (Z amarilla)
- Multiples genes avr (cruzado) en regiones flanquentes variables
El sistema Hrp (tipo III) secreta:
-HrpZ al medio (parte del aparato de secresión extracelular?)
- Proteínas Avr directamente dentro de la célula vegetal (transferencia gatillada por contacto con el hospedante?)
Factores de compatibilidad (virulencia)- Las proteínas secretadas por el sistema Hrp (símbolos rojos/verdes) interactúan con la proteínas o ácidos nucleicos del hospedante (símbolos negros) - Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran) - Las mutantes bacterianas poseen fenotipos de virulencia débil (parte verde de los símbolos rojos/verdes) - Estas proteínas promueven colectivamente el parasitismo vía: . Supresión de las defensas? . Promoviendo la síntesis o liberación de nutrientes
Factores de incompatibilidad (avirulencia) - Un amplio espectro de proteínas del hospedante codificadas por genes R (símbolos negros) acopladas a las rutas de señalización de las respuestas defensivas (flechas en zig-zag) conforman el sistema de vigilancia - Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran) - La Respuesta Hipersensible (HR) es gatillada por la interacción de cualquier par correspondiente de proteínas R y Avr (parte roja de los símbolos rojos/verdes) o de proteínas R y productos enzimáticos Avr (no se muestran) - Las interacciones avirulentes son epistáticos sobre las interacciones virulentas (compatibles)
Pared celular
Parasitismo
HR y defensa
Nutrientes
Agua
Incremento de pH
Nutrientes
Agua
Incremento de pH
Secresión de proteínas mediada por el sistema Hrp
La región de patogenicidad Hrp contiene:
- El agrupamiento conservado de genes hrp(subconjunto hrc en púrpura)
- El gen hrpZ que codifica a la harpina HrpZ (Z amarilla)
- Multiples genes avr (cruzado) en regiones flanquentes variables
El sistema Hrp (tipo III) secreta:
-HrpZ al medio (parte del aparato de secresión extracelular?)
- Proteínas Avr directamente dentro de la célula vegetal (transferencia gatillada por contacto con el hospedante?)
Secresión de proteínas mediada por el sistema Hrp
La región de patogenicidad Hrp contiene:
- El agrupamiento conservado de genes hrp(subconjunto hrc en púrpura)
- El gen hrpZ que codifica a la harpina HrpZ (Z amarilla)
- Multiples genes avr (cruzado) en regiones flanquentes variables
El sistema Hrp (tipo III) secreta:
-HrpZ al medio (parte del aparato de secresión extracelular?)
- Proteínas Avr directamente dentro de la célula vegetal (transferencia gatillada por contacto con el hospedante?)
El sistema de secreción de tipo III
Defensas inducibles en las plantas
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistémic a Adquirida (SAR) en el sistema de genes RPS2-avrRPt2 /RPM1-avrRPM1
La planta y su sistema defensivo
Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003.
A
RPS2 (Resistance to P. syringae 2) confiere resistencia a cepas que expresa el factor de avirulencia avrRpt2 . RPM1 de A. thaliana(Resistance to P. syringae pv maculicola 1) confiere resistencia a cepas que que expresan el gen de avirulencia avrRPM1 .
.
A
RPS2 (Resistance to P. syringae 2) confiere resistencia a cepas que expresa el factor de avirulencia avrRpt2 . RPM1 de A. thaliana(Resistance to P. syringae pv maculicola 1) confiere resistencia a cepas que que expresan el gen de avirulencia avrRPM1 .
Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avrdel patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia
de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)
El modelo de resistencia “gen por gen” (Flor, ca. 19 40)El modelo gen por gen explica los casos de compatibilidad de incompatibilidad planta-patógeno
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.
Localizaciónde proteínas de resistenciay esquema de sus dominios funcionales
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
BS2: gen de resistencia de pimiento que confiere resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria; Cf-2,4,5 y 9: genes de resistencia a las razas 2, 4, 5 y 9 de Cladosporium fulvum; FLS2: gen de resistencia a bacterias de Arabidopsis thaliana; L6: gen
de resistencia a la roya del lino 6; PBS1: gen de A. thaliana que confiere resistencia a Pseudomonas syringae; Pto: gen de resistencia a P. syringae pv. tomato; RPG1: gen de resistancia a Puccinia graminis sp. tritici 1; RPM1: gen de resistencia a P.
syringae pv. maculicola; RPP5: gen de resistencia a Peronospora parasitica; RPW8: gen de resistencia de A. thaliana que confiere resistencia a Erysiphe orontii, E. cichoracearum y Oidium lycopersici; RRS1: gen de resistencia a Ralstonia
solanacearum 1; Xa21: gen de resistencia a X. oryzae pv. Oryzae; Va1 y Va2: genes de resistencia de tomate que confieren resistencia a Verticillium alboatrum. ECS: señal de endocitosis; NLS: secuencia de localización nuclear; PEST: secuencia Pro-
Glu-Ser-Thr-like; CC: dominio coiled-coil; NB: dominio de unión a nucleótidos; TIR: domino similar a Toll/receptor de interleuquina; LRR: leucine rich repeat; WRKY: dominio de “dedos de zinc” . Dominios 1-4: sin homología conocida.
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
Modelo de interacción proteína R/factor de avirulencia: hipótesis de la “proteína guardiana”
Adaptado de: Loh et al., Curr. Opin. in Biotechnol., 2002.
Interacción
R2
proteína “guardiana”
Procesos defensivos inmediatos, locales y sistémico scomprendidos en una respuesta inducible
Respuesta defensiva
- Engrosamiento de la pared celular- Inducción de genes involucrados en la síntesisde metabolitos secundarios. Síntesis de fitoalexinas
- Síntesis de tioninas- Síntesis de proteínas relacionadas con la defensa (PRs)a patógenos
- Síntesis de ácido salicílico Inducción de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Las respuestas defensivas inducibles por patógenos comprenden diversos mecanismos moleculares
Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.
Cl -
BA
Genes involucrados en resistencia local a patógenos
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
CET1/CET3: constitutive expression of thionin 1/3; COI1: coronatine insensitive 1; EDR1: enhanced disease resistance 1; EN2: ethylene-insensitive 2; NRD1: non-race specific disease resistance 1; PAD4: phytoalexin-deficient 4; PDF1.2: plant defensin 1.2; Pti4/5/6: factores de
transcripción Pto-interacting 4, 5 and 6; SID2: SA induction deficient 2; SS2: suppressor of salicylate insensitivity of NPR1-5. TGAs: factores de transcripción de unión a TGACG
COL1
EIN2
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
Genes involucrados en resistencia local a patógenos
Independiente de SAR
SIR ISRSAR
Dth9: detachment 9; ISR1: induced systemicresistance 1; JAR1: JA resistance 1; NPR1-1 inducible; SNI1: suppressor of SAR SON1: suppressor of nim1-1; SAG: salicylic acid glucoside.
Dir1?
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias mediante ingeniería genética
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
TotalPseudomonas syringae pv. phaseolicola
HabaPseudomonassyringae pv. phaseolicola
OCTasainsensible a faseolotoxina
TotalPseudomonas syringaeTabacoPseudomonassyringae pv. tabaci
Proteína de resistencia a tabtoxina
Inhibición de la patogenicidad o de factores de viru lencia bacterianos
Erwinia carotovora
Ralstonia solanacearum
Pseudomonas syringae pv. tabaci
Erwinia carotovora
Erwinia amylovora
Pseudomonas syringae pv. tabaci
Ralstonia solanacearum
Resistencia a
ParcialTabacoGusano de sedaMB39
ParcialTabacoGusano de sedaShiva-1
ParcialManzanoGusano de sedaAtacina E
ParcialTabacoHumanoLisozima
ParcialPapaBacteriofago T4Lisozima
ParcialTabacoHumanoLactoferrina
ParcialPapaCangrejo herraduraTaquiplesina
Producción de compuestos antibacterianos no vegetal es
Nivel de resistencia
Especie transgénica
OrigenProteína
Estrategias para desarrollar resistencia a bacteriaspor medio de ingeniería genética
Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.
ParcialErwinia carotovoraTabacoErwinia carotovoraExpR
ParcialErwinia carotovoraTabacoBacillus spp.aiiA
Interferencia con el mecanismo de quorum sensing
Total Pseudomonas syringae pv. tabaci
TabacoHalobacteriumhalobium
Bacterio-opsina
Muerte celular inducida artificialmente en el sitio de infección
Pseudomonas syringae pv. tabaci
Erwinia carotovora
Xanthomonas oryzae
Erwinia carotovora
Resistencia a
TotalArrozCultivares resistentesProteína Xa21
ParcialPapaErwinia carotovoraPectato liasa
ParcialPapaAspergillus nigerGlucosa oxidasa
ParcialTabacoCebadaTionina
Incremento de los sistemas de defensa naturales
Nivel de resistencia
Especie transgénica
OrigenProteína
Estrategias para desarrollar resistencia a bacteriaspor medio de ingeniería genética
Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.
Péptidosantimicrobianos
Estructuras de algunos péptidos antimicrobianos
En rojo: aminoácidos básicos (cargados positivamente) En verde: aminoácidos hidrofobitos
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Mecanismos de acció n postulados para péptidos antimicrobianos
La estructura anfipática de los péptidos antimicrobianos determina su especificidad y mecanismo de acción
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
Mecanismos de acción postulados para péptidos antimicrobianos
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
Modelo de Shai-Matzusaki-Huang para el mecanismo de acción de péptidos líticos
A: reconocimiento de la membrana bacteriana.
B: inserción a la membrana mediada por la atracción electrostática
C: formación de poros en la membrana.
D: transporte de péptidos y lípidos a la capa interna de la membrana.
E: acción de los péptidos sobre “blancos” intracelulares
F: colapso de la membrana bacteriana y ruptura de la célula.
Llípidos en amarillo: carga negativa. Lípidos en negro: sin carga neta
Transformación de cloroplastos de tabaco con el gen del análogo de magainina MSI-99
Bioensayos en plantas de tabaco transformadas con el gen MSI-99. Se trataron áreas de 5-7 mm de hojas de plantas transformadas R0 y de plantas control con un papel de lija fino y se inocularon en las mismas 10 µl de 8x105, 8x104, 8x103
y 8x102 células de Pseudomonas syringae pv tabaci.
Expresión en plantas de un péptido líticoantimicrobianoanálogo demagainina
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de: Chakrabarti, Planta, 2003.
Transgénica
Transgénica
Wild type
Wild type
8.105 8.105
8.105 8.1058.104
8.102 8.103
8.103
8.102
Resistencia a bacterias mediada por sarcotoxina, un péptido aislado de Sarcophagaperegrina
Hojas de plantas de naranja inoculadas con Xanthomonas axonopodispv. Citri (104 ufc/mL), bacteria causante de la cancrosis en cítricos.
Izquierda: planta control no transgénica; derecha: planta transgénica que expresa el gen de sarcotoxina. Fotos obtenidas a los 26 d post-infección.
Expresión de sarcotoxina en plantas transgénicas de cítricos
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de: Ohshima et al. J. Biochem., 1999.
La lisozima esuna enzima de reconocida acción bacteriolítica
Estructura del vector pSR-2 conteniendo el gen quimérico de la lisozima del fago T4 fusionado a la secuencia codificante del péptido señal de
α-amilasa de cebada. El gen es dirigido por el promotor de 35S del CaMV
Resistencia antibacteriana en plantas de papa transformadas con el gen de lisozima del fago T4
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de : Düring et al. The Plant Journal, 1993.
Ensayos de maceración con distintas densidades de inóculo
La resistencia fue clasificada determinando la superficie macerada sobre el total de la superficie de cada disco. En a) se muestra el promedio de 5 experimentos; en b) se muestra el promedio de 4 experimentos. La edad de los tubérculos fue de 2-3 meses
Ensayos de maceración con Erwinia carotevora pv atroséptica a lo largo de 1-12 días. Se presentan los resultados correspondientes a los controles, el mejor transformante
y el valor promedio de todos los transformantes
Evaluación de resistencia mediante ensayos de maceración en plantas de papa transformadas con lisozima del fago T4
Cuantificación de los resultados de un bioensayo de brotacion de tuberculos en invernadero luego de la infección con Erwinia carotovora pv. atroséptica
Comparación de la brotación en plantas de papa control y transformadas con la lisozima del fago T4 en condiciones de invernadero. Se plantaron trozos de tubérculo infectados con Erwinia carotovora pv atroséptica. Izquierda: plantas transgénicas T424; derecha: plantas control Z2
Ensayos de brotación de tubé rculos en plantas de papa transformadas con lisozima del fago T4
Plantas transgénicasde papa que expresan elgen de la lisozima
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas Tomado de: Düring et al. The Plant Journal, 1993.
Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genes de osmotina AP24, lisozima y dermaseptina
Plantas control Plantas transgénicas
Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genes de osmotina AP24, lisozima y dermaseptina
controles transgénicas controles transgénicas
Ensayos de infección con Erwinia carotovorade plantas transgénicas (derecha) y controles (izquierda) de Solanumtuberosumque expresan combinaciones de uno, dos y tres genes antimicrobianos
Ensayos de maceración en tubérculos de plantas transgénicas
Ensayos de maceración en tubérculos de Solanumtuberosuminoculados con Erwinia carotovora
Las tioninas son proteínas ricas en cisteína tóxicas para las bacterias
Desarrollo de plantas de tabaco que expresan tioninas de trigo y de cebada
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal, 1993.
Lesiones causadas por las bacterias 6 días después de la inoculación en plantas transformadas con la tionina de cebada (UP1) y no transformadas (WT)
Datos de infección. El porcentaje de infección fue medido 90 h después de la inoculación y representa la proporción de puntos de inoculación que formaron lesiones necróticos.
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas con Pseudomonas syringae pv tabaci
Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal. 1993.
SNN: N. tabacum Sansum NN no transformada SNN+CS: plantas de N. tabacum Samsun NN transformadas con un vector vacío UP1 hz y UP2 hz: plantas homocigotas transformadas con la tionina de cebada UP6 pg y UP7 pg: progenies heterocigotas de UP1 y UP2 UP3 hz y UP4 hz: plantas homocigotas transformadas con la tionina de trigo.
WTUP1
El desarrollo de la infección se midió titulando el número de bacterias. Los títulos en las plantas UP1 a las 34 y 48 h fueron significativamente diferentes de los de las plantas UP3 y controles. Los títulos en UP3 no son significativamente diferentes de los de los controles
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas con Pseudomonas syringae pv tabaci
(trigo)
(cebada)
A: lesiones causadas por el patógeno en plantas transgénicas (UP1) y control (WT)
a los 4 días de la infección
B: Datos de infección. Se midió el área necrótica a los 4 días de la infección en el
Experimento 1 y a los 3 días de la infecció n en el Experimento 2.
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas con Pseudomonas syringae pv tabaci
La OCTasa de Pseudomonas es
insensible a su propia toxina.
Se la expresó la secuencia de la la OCTasa en plantas para proteger de la acción
de la faseolotoxina.
A la secuencia de la OCTasa se le agregó una
señal de transporte al cloroplasto (en plantas, ruta de síntesis cloroplastídica).
Modo de acción de la faseolotoxina
faseolotoxina
19,80 ± 0,4019,90 ± 0,1522,90 ± 0,66SSO-T16
10,30 ± 0,3010,70 ± 0,1414,20 ± 0,26SSO-T13
2,10 ± 0,302,10 ± 0,155,50 ± 0,10SSO-T1
N.D.59,80 ± 2,4068,00 ± 6,10SSO-T3 (cloroplastos)
N.D.0,90 ± 0,036,0 ± 0,05Control (cloroplastos)
N.D.0,10 ± 0,022,50 ± 0,02Control
Toxina (375 ng/ml)Toxina (37 ng/ml)Sin toxina
Actividad OCTasaPlanta
Efecto de faseolotoxina en la actividad de ornitil ca rbamoil transferasa (OCTasa) de plantas transgénicas SSU-OCTasa y planta s control.
La actividad de OCTasa está expresada como mmoles de citrulina formados por min/mg de proteína, con la excepción de extractos de cloroplastos, que fueron
reportados por mg de clorofila. Las actividades mostradas representan un promedio de tres experimentos independientes. N.D. = no determinado.
Ensayos con faseolotoxinaen plantas transgénicas SSU-OCTasa
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.
Ensayos con faseolotoxinacon plantas transgénicas SSU-OCTasa
A: Clorosis típica inducida en hojas de Phaseolus tratadas con faseolotoxina.B y D: Plantas control independientes no transformadas tratadas con faseolotoxina. C y E: Plantas transgénicas independientes tratadas con faseolotoxina. Todos los
tratamientos en las hojas fueron con 2 µl de una solucion de 3 µg/ml de toxina.Las flechas señalan los sitios de inoculación de la toxina
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.
Efecto de la inoculación con Pseudomonas syringae pvphaseolitica sobre las plantas transgénicas OCTasa
A y C: Plantas control no transformadas a los 7 días de la inoculación con PseudomonasB y D: Plantas transgénicas SSU-OCTasa a los 7 días de la inoculación con Pseudomonas
A B
C D
Ensayos con Pseudomonassyringae en plantas transgénicas SSU-OCTasa
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.
Transformación de arrozcon el gende resistenciaXa21
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.
CC
Plantas controlPlantas transgénicas
Plantas controlPlantas transgénicas
Plantas controlPlantas transgénicas
Plantas controlPlantas transgénicas
Resistencia a la infección con Xanthomonas oryzaepv. oryzae en cultivares susceptibles transformados con el gen Xa21
A: cultivar Minghui 63-12
B: cultivar IR7 2-82
C: Síntomas en plantas transgénicas (izquierda) y control (derecha) en ensayos de campo.
Transformación de arroz con el gen de resistencia Xa21
Segregación de la expresión de Xa21 en la generación R1 de las líneas transgénicas IR72-82, Minghui 63-12, Minghui 63-22 y BG90-2-27
Transformación de arrozcon el gende resistenciaXa26
Resistencia a la infección de Xanthomonas oryzae pv. oryzaeen plantas transformadas con el gen Xa26, aislado del cultivar MH63
MH63: Minghui 63 (con moderada resistencia)MDJ8: Mudanjiang 8 (susceptible)RB22: MDJ8 transformado con Xa26
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Lesiones producidas por Xanthomonas orizae pv. orizaesobre hojas de plantas de arroz.
IR24: planta susceptiblesRb17-18: Líneas transgenicas que expresan el gen Xa26.
Controles de la PCR para Xa26:Positivos: MH63 y IRBB3, líneas moderadamente resistentes y resistentes, respectivamente.Negativo: MDJ8, línea susceptible.
Tomado de: Sun et al., Plant Journal, 2004.
Crecimiento de Pseudomonas syringae pv tabaci en plantas de tabaco transformadas con el gen de resistencia Pto (líneas sólidas) y en plantas control no transformadas
(líneas discontínuas). Las plantas fueron inoculadas con bacterias que expresan el gen avr/Pto (cuadrados) o que no poseen el gen (triángulos). Los tipos de interacciones que se indican son: [1]: incompatibilidad (presencia de gen R y gen avr; [2]: compatibilidad (ausencia del gen R y presencia del gen avr; [3]: compatibilidad (presencia del gen R
y ausencia del gen avr); [4]: compatibilidad (ausencia del gen R y del gen avr)
Transformación de tabaco con el gen de resistencia Pto de tomate
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Tomado de: Thilmony et al. The Plant Cell. 1995.
Planta transgénica
Planta controlCre
cim
ient
o ba
cter
iano
[lo
g(c
fu/c
m2 )
]
Detección de H2O2 en plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger
A: raíces de planta de papa no transgénica (izquierda) y transgénica
(derecha)
B: discos de hoja de papa no transgénica (arriba) y transgénica (abajo) puestos en
medio KI/almidón por 30 minutos
C: Idem que B, pero durante 5 horas
D: discos de tubérculos de papa de plantas no transgénicas (arriba) y
transgénicas (abajo) puestos en medio KI/almidón por 30 minutos
E: Idem que D, pero por 5 horas
ββββ-D-glucosa + O 2. ácido glucónico + H 2O2
glucosa oxidasa
Incremento del nivel de H 2O2 en hojas de papa transgénicas que expresan el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger . Controles: Russet Burbak no transformada y planta transformada con el vector vacío (17227-1). Líneas transgénicas: 22587-3, 22587-12 y 22587-33
Detección de H2O2 en plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger
Ensayos de infección in vitro con Erwinia carotovorade plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa
Inhibición del crecimiento Erwinia carotovora en discos de tubérculos de plantas transgénicas
Se midió el número de bacterias entre 1 y 5 días luego de la inoculación. Los símbolos vacíos corresponden a los controles de plantas no transformadas o transformadas con el vector vacío. Los símbolos llenos corresponden a dos líneas transgénicas que expresan el gen de glucosa oxidasa
A: discos de tubérculo de papa inoculados a 23-24 oC bajo condiciones aeró bicas B: discos de tubérculo de papa inoculados a 23-24 oC bajo condiciones anaeróbicas
Los minituberculos de papa de plantas no transgénic as (RB) o de las líneas transformadas con glucosa oxidasa 22587-3 (3) y 22587-34 (34) se inoc ularon con 2x10 5 cfu de Erwinia carotovora
por disco de tubérculo. Los síntomas se evaluaron a los tres días de la inoculación
Ensayos de infección in vitro con Erwinia carotovorade plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa
Inhibición de la regulación de factores de virulencia
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Quorum sensing
• Mecanismo de comunicación comunitario presente en . diversas especies de bacterias. Fue detectado por . primera vez en Vibrio fischeri
• Capacidad de los microorganismos de percibir y . responder a la densidad poblacional a través de la . producción de moléculas difusibles de reducido peso . molecular
Moléculas señal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)
Un gran número de bacterias Gram – se comunican sintetizando, secretando y respondiendo a compuestos difusibles
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Regulación génica dependiente de la densidad poblac ional
El incremento de una población bacteriana determina una elevada concentración de factores difusibles
Modificado de: Fuqua et al., Curr. Opin. in Microbiol. 1998.
Modelo simplificado de la transducción de señales en quorum sensing
Célula bacteriana: proteína I (azul), responsable de la síntesis de las señales difusibles de acil-homoserin lactona (A-HSL; óvalos verdes). La proteína R (rojo), sufre un cambio conformacional cuando se une a la señal A-HSL; actúa entonces
como regulador transcripcional, aumentando su afinidad por secuencias promotoras específicas de los genes regulados por HSLs (“lux” box) .
El mecanismo de quorumsensing es mediado por moléculas difusibles como las acil-homoserinlactonas
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Proteína R activada
El sistema rpf en Xanthomonas campestris
Otros sistemas de regulación de virulencia en bacterias
Gentileza de J. Maxwell Dow
endoglucanasas ,proteasas y polisacáridos
rpf : Regulation of Pathogenicity Factors
Estructura de moleculas señalizadoras de quorum sensing
La interferencia de la comunicaciónentre bacterias es una posible estrategiade resistenciaantimicrobiana
Posibles blancos y estrategias para interferir en l a comunicación entre bacterias ( quorum quenching )
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
HSL
sintetasa
R
Mecanismos que afectan la regulación mediada por homoserin lactonas
Reconocen las A-HSLsproducidas por otros organismos
Homólogos de proteínaLux-RNo producen A-HSLs
Salmonella enterica(patógenohumano)
Organismos A-HSLs oportunistas
Afectan sistema de quorumsensing
Diferentes compuestosPlantas superiores( arroz, arveja, etc)
Se unen a receptores de A-HSLsInhiben quorum sensing
Furanonas halogenadasDelisea pulchra
Moléculas imitadoras de las A-HSLs
Degrada A-HSLsA-HSLs lactonasaGen aiiA
Bacillus sp. 240B1
Degrada A-HSLsActividad aminoacilasaVariovax paradoxus
FunciónMoléculaOrganismo
Enzimas degradadoras de A-- HSLs
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol., 2002.
Tomado de: Dong et al., Nature, 2001.
Transformación de plantas de papa con el gen de acil homoserin lactonasa (aiiA) de Bacillus spp.
Cortes transversales de tubérculos de papa inoculados con Erwinia carotovora.
A la izquierda: tubérculo de planta no transformada.A la derecha: tubérculo de planta transformada con el
gen aiiA.
Inoculación de hojas con Erwinia carotovora SCG1. Arriba: hojas de plantas de tabaco transformadas con el gen aiiAAbajo: hojas de plantas de tabaco control no transformadas
Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.
Las plantas que expresan genes deN-acil-homoserinlactona sintasasexhiben mayor resistencia a Erwinia carotovora
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas
A BA B
A: detalle de una hoja de una planta transgénica infectada con Erwinia carotovoraB: hoja de una planta control luego de la infección
Porcentajes de infección observados para dos líneas transgénicas (barras verde y anaranjada) y de una planta control, no transgénica (barra violeta).
Transformación de plantas de tabaco con el gen de la N-acil-homoserinlactona sintasade E. carotovora(gen expI )
transgénica control
1. Carmona, M.J., Molina, A., Fernández, J.A., López-Fando, J. J. and García Olmedo, F. Expression of the thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens. The Plant Journal, 3:457-462, 1993.
2. De Gray, G., Rajasekaran, K., Smith, F., Sanford, J. and Daniell, H. Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome tocontrol phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiology, 127:852-862, 2001.
3. Dong, Y.H., Wang, L.H., Xu, J.L., Zhang, H.B. and Zhang, L.H. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial Infection by an N-acylhomoserine lactonase. Nature, 411:813-817, 2001.
4. Fray, R.G. Altering Plant-Microbe interactions through artificially manipulating bacterial Quorum-sensing. Annals of Botany, 89:245-248, 2002.
5. Loh, J., Pierson, E.A., Pierson, L.S., Stacey, G. and Chatterjee, A. Quorum sensing in plant-associated bacteria. Current Opinion in Plant Biology, 5:1369-1375, 2002.
6. Mae, A., Montesano, M., Koiv, M. and Palva, E.T. Transgenic Plantsproducing the bacterial pheromone N-acyl-homoserine lactone exhibitenhanced resistance to the bacterial phytopathogen Erwinia carotovora. Molecular Plant-Microbe Interactions, 14:1035-1042, 2001.
7. Tai, T.H., Dahlbeck, D., Clark, E.T., Gajiwala, P., Pasion, R., Whalen, M.C., Stall, R.E. and Staskawicz, B.J. Expression of the Bs2 pepper gene confers resistance to bacterial spot disease in tomato. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A., 96:14153-14158, 1999.
Referencias
Agrobiotecnología
Resistencia a bacterias fitopatógenas