Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC

Resolución de Problemas en HPLC:TroubleshootingHPLC:Troubleshooting Técnicas, Consejos , y Trucos

Agilent Technologies

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Pasos en la Resolución de ProblemasUna vez que has detectado que hay un problema!Una vez que has detectado que hay un problema!

¿Cómo lo solucionas?•1st ¿Falló el sistema o la calibración de la muestra?

Hacer Blancos2 d R i l li i d l é d•2nd Revisar el cumplimiento del método– ¿ Se ha seguido el procedimiento adecuadamente?– ¿ Son correctos los parámetros en el instrumento?

•3rd Hágase más preguntas!– ¿Cuándo funcionó correctamente el sistema por última vez?– ¿ Se ha cambiado alguna cosa?

•4th Revise TODOS los parámetros!•4 Revise TODOS los parámetros!– Lo obvio no es siempre la causa– ¿Hubo más de un cambio?

Page 2

¿

Componentes del Sistema HPLCComponentes del Sistema HPLC

BombaInyector /Automuestreadoryecto / uto uest eadoColumnaDetectorDetectorSistema de datos/Integrador

Los problemas pueden estar relacionados con todos los p pcomponentes del sistema

Page 3

Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas

Column Problem Percentage of RespondentsColumn Problem Percentage of Respondents

Alta presión, fritas obstruidas 24%Pobre reproducibilidad (formas de pico, retención)

16%

Recuperación de muestra 14%Recuperación de muestra 14%

Perdida de resolución 13%

Inestabilidad 11%

Volumenes muertos 8.1%

Fugas, conexiones 4.8%

%Rango de pH 2.0%

Bajo numero de platos 2.0%

Saturación de la columna 2 0%Saturación de la columna 2.0%

Cost 1.7%

Miscellaneous 15%

Page 4

Tipos de problemas del Sistema y la Columna

A. PresiónA. Presión

B. Forma del PicoB. Forma del Pico

C. RetenciónC. Retención

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Problemas de Presión

Sintomas de la columna Posibles causas

Alta - Frita obstruidaAlta Frita obstruida

- Contaminación de la columnacolumna

- Obstrucción en el empaquetamientoempaquetamiento

Baja presión - Fuga

- Flujo incorrecto

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Corrección de la sobrepresiónDeterminación de la causa y corrección de una presión alta

Muchos problemas de presión están relacionados con obstrucciones en el sistemaMuchos problemas de presión están relacionados con obstrucciones en el sistema.Comprobar la presión del sistema con y sin columna.

Si la presión con columna es alta:Si la presión con columna es alta:• Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro)• Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)• Lavar la columnaLavar la columna

Eliminar la contaminación en la column y limpiar el empaquetado bloqueadoRetirar compuestos adsorbidos de alto peso molecularLimpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampónLimpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampón

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Obstrucción del empaquetado

Tamaño de partícula

Area(um2)

Diam intersticial medio (um)

Porosidad de la frita(um)

5.0 2.7 0.9 2.0

3.5 1.3 0.6 2.0

3 0 1 0 0 6 2 03.0 1.0 0.6 2.0

2.7 0.7 0.5 2.0

1.8 0 4 0.4 0 51.8 0.4 0.4 0.5

1.7 0.3 0.3 0.5

C id d l f ó il t dCuidado con las fases móviles tamponadasLos tampones contienen material insoluble– filtrarLa solubilidad del tampón decrece con el aumento del %La solubilidad del tampón decrece con el aumento del % de orgánico* - evitar 100%B con tampones salinos*Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)

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Solubilidad del tampón

La Tabla I presenta una estimación de la concentration a ab a p ese ta u a est ac ó de a co ce t at osoluble del tampón menos soluble (fosfato potásico a pH 7.0) en tres solventes orgánicos

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Solubilidad de 5 tampones en mezclas con(a) metanol (b) acetonitrilo y (c) tetrahidrofurano(a) metanol, (b) acetonitrilo, y (c) tetrahidrofurano

metanolmetanolacetonitrilo THF

El trazo — representa acetato amónico a pH 5.0, •••• representa fosfato amónico a pH 3 0 --- representa fosfato potásico a pH 3 0 –••– representa fosfatoa pH 3.0, --- representa fosfato potásico a pH 3.0, –••– representa fosfato amónico a pH 7.0, y – – representa fosfato potásico a pH 7.0.

Page 10

Cambiar la frita puede no ser buena ideaPuede que no sea posible con columnas de nueva generaciónPuede que no sea posible con columnas de nueva generación

Puede dañar columnas de alto rendimiento

CompressionColumnInlet Frit

Ferrule

Wear glovesDo not allow bed to dry

Column Body

yDo not touch the column - body heat will extrude packingDo not overtighten

Female End Fitting

Male End Fittingg

Consejo: Prevenir es mucho mejor!

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El Truco:El Truco: Tecnicas de Prevención- La mejor elección!

• Usar protección de la columna- Filtros en linea- Salva columnas

• Filtrar las muestrasFácil

• Filtrar fases móviles tamponadas

• Extracción de la muestra(i.e. SPE) No tan fácil

• Lavado apropiado de la columna

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Limpieza de la columnaLimpiar con solventes más fuertes que la fase

móvil

Opciones de Solventes de Fase Reversaen orden de fuerza creciente

Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analíticas

• Fase Móvil sin sales de tampónp• 100% Metanol• 100% Acetonitrilo• 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol

Debe revertirse para

Esto lleva tiempo, amenudo se realiza 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol

• 100% Isopropanol• 100% Cloruro de Metileno* • 100% Hexano*

revertirse para

Re-Equilibrar

amenudo se realiza Offline

• 100% Hexano

*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna conIsopropanol antes de volver a la fase móvil de fase reversa

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Isopropanol antes de volver a la fase móvil de fase reversa.

Li i d l l f l

Use al menos 50mL o 20 30 volumenes de columna para las columnas analíticas

Limpieza de la columna– fase normal

Use al menos 50mL o 20−30 volumenes de columna para las columnas analíticas• Opciones típicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente:

Solvent Composition

Methanol:Chloroform 50:50% Methanol:Chloroform 50:50%

Ethyl Acetate 100%

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¿Cuáles son los problemas más comunes de la forma de pico?de la forma de pico?

1. Picos dividos

2. Colas en los picos (simetría <1 )

3 Picos anchos (mala resolución Rs<2)3. Picos anchos (mala resolución. Rs<2)

• Muchos problemas de formas de pico son combinaciones- i eMuchos problemas de formas de pico son combinaciones i.e. ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retención.

•Los Síntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el•Los Síntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el cromátograma.

C d d t bl d t últi l

Page 15

•Cada uno de estos problemas pueden tener múltiples causas.

Picos dobles por perturbacion en el flujo

•Perturbación en el flujo por un volumen muerto

L t fl dif t i t é d•La muestra fluye por diferentes vias a través de la columna

•Pobre empaquetamiento de las partículasp q p

•El pH alto disuelva la Silice

Picos dobles o partidos

Normal Picos dobles

Consejo: Un efecto similar se produce con una frita parcialmente obstruida

Page 16

parcialmente obstruida

Picos divididos por efectos del solvente de inyecciónde inyección

Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 μm Fase móvil: 82% H2O : 18% ACNVolumen de inyección: 30 μL Muestra: 1. Cafeina 2. Salicilamida

A Solvente de inyección B Solvente de inyección

1

A. Solvente de inyección100% Acetonitrilo

B. Solvente de inyecciónFase Móvil

1

22

0 10Time (min)

0 10Time (min)

Consejo: Inyectar un solvente más fuerte que la fase móvil puede provocar problemas en los picos tales como picos divididos o ensanchamientoTruco: Mantener la concentración de orgánico en el solvente de muestra < Fase móvil

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C l h i tColas, ensanchamientoy perdida de eficacia

Pueden ser causadas por:

• “Interacciones secundarias” en la Columnala Columna

• Contaminación en la ColumnaE j i i t d l l• Envejecimiento de la columna

• Saturación de la columna• Efectos extra columna

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Forma del pico: Colas en los picos

Simetría > 1.2CausasAlgunos picos con cola:

Interacciones secundarias – Efectos de RetenciónInteracciones con silanoles residuales

Normal Cola

Interacciones con silanoles residuales.Pico pequeño eluyendo en la cola de un pico mayor.

Todos los picos con colas:

Efectos extra-columna.Acumulación de contaminación en la

Normal Colas

entrada de la columna.Metales pesados.Mala columna.

Normal Colas

Page 19

Colas en los picos- Contaminación en la Columna

Consejo: Test Rápido para Determinar si la Columna está Sucia o está Dañada

Truco: Revetir la columna y analizar–Si hay mejora, una limpieza puede ayudar-No hay mejora-Columna Dañada y necesita ser reemplazada

Test QC dirección Test QC dirección inversaTest QC despues lavado

100% IPA 35°C

ayudar No hay mejora Columna Dañada y necesita ser reemplazada

3

3

3Platos TF

1. 7629 2.082 12043 1 64

Platos TF

1. 7906 1.43

Platos TF

1. 7448 1.062 12237 1 21

correctaQ 100% IPA, 35 C

2

2

2

2. 12043 1.643. 13727 1.694 13355 1.32

2. 12443 1.213. 17999 1.194 17098 1.25

2. 12237 1.213. 15366 1.114 19067 1.17

41

41 41

0.0 2.5 5.0Time (min)

0.0 2.5 5.0Time (min)

0.0 2.5 5.0Time (min)

Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5μm Fase Móvil: 20% H2O : 80% MeOH Flujo: 1.0 mL/min

Page 20

Temperatura: R.T. Detección: UV 254 nm Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno

Forma de Picos: Picos con Frente (Fronting)

2000

1500

1000

mAU

500

0

0 5 10 15 20 25

Ti ( i )

Normal FrontingSimetría < 0.9

Tiempo(min)

Causas:

Saturación de columna

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Colas en los picos/EnsanchamientoEfectos de carga de muestra

Columnas: 4.6 x 150 mm, 5μm Fase Móvil: 40% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 60% ACN Flujo: 1.5 mL/minT t 40°C M t 1 D i i 2 N t i tili 3 D i 4 I i i 5 A it i tili 6 T i i iTemperatura: 40°C Muestra: 1. Desipramina 2. Nortriptilina 3. Doxepina 4. Imipramina 5. Amitriptilina 6. Trimipramina

Ensanchamiento A. CAlta CargaFactor de ColaPlatos de una C8

A. C.gx10

C D

Factor de Cola Eclipse XDB-C8USP TF (5%) i

A B

B

1. 850 59412. 815 78423. 2776 62314. 2539 8359

A B1. 1.60 1.702. 2.00 1.903. 1.56 1.564. 2.13 1.70

0 5 10Time (min)

0 5 10Time (min)

B. D.Baja Carga5. 2735 100226. 5189 10725

5. 2.15 1.866. 1.25 1.25

0 5Time (min)0 5

Time (min)

Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada

Page 22

Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada

Forma de Picos: Picos Anchos

Todos los picos ensanchan:

• Pérdida de Eficacia de la columna.• Volumen muerto.• Gran Volumen de Inyección• Gran Volumen de Inyección.

Algunos picos ensanchan:

• Elución tardía de una muestra previa (Pico fantasma)(Pico fantasma).– Alto Peso Molecular.– Muestra - Proteina o Polímero.

Page 23

Dispersión Extra-Columna

Aumentando el Volumen Extra-Columna

n Use tubos cortos de pequeño diámetro interno entre el inyector y la columna y entre la columna y el detector.

n Asegúrese de que todas las conexiones de los tubos están hechas con los fittings adecuados.

n Use una celda de detector de bajo volumen.

n Inyecte pequeños volumenes de muestra.

Page 24

Consejo: Malas Conexiones en el HPLC d C E h i t d Pipueden Causar Ensanchamiento de Picos

El Sistema se ha optimizado y :El Sistema se ha optimizado y :– Todas las longitudes de los Tubos son Mínimas

S ó l di t á ñ d t b– Se usó el diametro más pequeño de tubo– Una celda de flujo de volumen adecuado

Los Síntomas parecen mostrar que todavía hay demasiadoLos Síntomas parecen mostrar que todavía hay demasiado Volumen Extra-Columna

Q é tá l?¿Qué está mal?

¿ha hecho las conexiones adecuadamente?

Page 25

Conectores de Columna Usados en HPLC

Troubleshooting LC Fittings Part II J W Dolan and P Upchurch LC/GC Magazine 6:788 (1988)

Swagelok Waters

Troubleshooting LC Fittings, Part II. J. W. Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6:788 (1988)

0.090 in.

0.130 in.

g

0.090 in.

0.170 in.

Parker Rheodyne

in.

Valco Uptight0.090 in.

0.080 in.

Page 26

¿Qué Ocurre si las conexiones no son correctas?

Incorrecto … demasiado largo

La Férrula no asienta adecuadamente

Incorrecto … demasiado corto

Si la distancia X es muy larga, habrá fugaCámara de mezclaX

X

Si la distancia X es demasiado corta, se generará un volumen muerto o cámara de mezcla

X

Page 27

Los cambio en Retención puedes ser Químicos o Físicos

P d t dPueden estar causados por:

• Envejecimiento de la columnaj• Contaminación de la columna• Equilibración insuficienteEquilibración insuficiente• Pobre combinación columna/fase móvil• Cambio en la fase móvil• Cambio en la fase móvil• Cambio en el flujo.

Diferentes volumenes de retraso del gradiente• Diferentes volumenes de retraso del gradiente

Page 28

Envejecimiento de la fase móvil/Equilibración j qCausan Cambios en la Retención/Selectividad

Columna 1 – Tras lavado con C l 1 Di i i t 1% H3PO4 /EquilibraciónColumna 1 – Dia siguienteColumna 1 - Inicial

1 1

2

1

2

1

0 3 5 9 12 15Time (min)

0 3 5 9 12 15Time (min)

• El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase movil/ acondicionamiento de la columna o / aco d c o a e to de a co u a

• La forma de pico fue un asunto secundario (compuesto quelante de metal)resuelto por “des-activación” de la

contaminación activa del metal

Page 29

contaminación activa del metal

Los compuestos sensibles a los metales d Q lpueden Quelarse

Pista: Busca un par solitario de Electrones en :

C OHO

:

CH

:O: o N que pueda formar anillos de 5 or 6 miembros con un Metal

C O

OH

HM +2O

OH + M +2

CH ::

:Salicilaldehido Complejo Anillo de 6-miembros

OH

::

M +2C O

OHC N

N: M +2 ::

:

8-hidroxiquinolinaComplejo Anillo de 5-

miembros

a-benzoinoxominaComplejo Anillo de 5-

miembros

Page 30

miembros miembros

Un lavado Acido puede mejorar la forma de ipico

Antes del lavado id

Después del lavado ácido50 100 L 1% H PO

OH

OH

OHHOOHHO OH

OH1. 2. 1. 2.

acido 50 – 100 mLs 1% H3PO4

M+2--

Columnas:ZORBAX SB-Phenyl4.6 x 150 mm1

2Fase Móvil: 75% 25 mM tampón fosfato amónico / 25% CAN

Flujo: 1.0 mL/min.Temperatura: RT

1

2

2

Temperatura: RTTamaño muestra: 5 mL

2

Tf: 1.2Tf: 3.7Tf: 3.7

• Se usó una solución del 1% H3PO4 en columnas SB; en columnas desactivadas puede usarse

Page 31

un 0.5 % .

pH de la Fase Móvil y pH de tampones¿Porqué son tan importantes en HPLC?¿Porqué son tan importantes en HPLC?•El pH afecta la Ionización

– Superficie de la Silica de la Columna– Componentes de Interés de Muestra

• TamponesResisten Cambios de pH y Mantienen la Retención– Resisten Cambios de pH y Mantienen la Retención

– Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables

• Efectos en el tiempo de Vida de la Columna– pHs bajos liberan las cadenas alquilicas de la Fase estacionariap s bajos be a as cade as a qu cas de a ase es ac o a a– pHs altos Disuelven la Silica

Los cambios de pH tienen un gran efecto en la forma de pico, la retención y la reproducibilidad lote a lote

Page 32

Los cambios de pH tienen un gran efecto en la forma de pico, la retención y la reproducibilidad lote a lote

¿Porqué preocuparse del pH?pH pKa y Ácidos DébilespH, pKa y Ácidos Débiles

RCOOH RCOO- + H+ Ka =[[RCOO-][H+]

[RCOOH]RCOOH RCOO + H

Ka = 6.4 x 10-5

a [RCOOH]COOH COO

_

Ka 6.4 x 10pKa = 4.2+ H+

A pH 4.2 – la muestra contiene ácido benzoico e ión benzoato en proporciónde 1:1. La forma de Pico puede ser pobre

A pH 5.2 – el 91% de la muestra es ión benzoato. La retencion RP disminuye.A pH 3.2 – el 91% de la muestra es ácido benzoico. La retencion RP aumenta.

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Efecto del pH en la Forma de Pico a o cerca del pK de la Muestraa o cerca del pKa de la Muestra

Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN /Flujo: 1.0 mL/min. Temperatura: RT

pH 4 4 pH 3 0

CH3CHCOOH

pH 4.4 pH 3.0

CH2CH(CH3)2

IbuprofenopKa = 4.4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Time (min) Time (min)

• Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto debe evitarse

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debe evitarse.

¿Porqué preocuparse del pH?pH, pKa y Bases DébilespH, pKa y Bases Débiles

[R3N][H+]R3NH+ R3N + H+Ka =

[R3N][H ][R3NH+]

K = 1 x 10-9

3 3

+ Ka = 1 x 10 9

pKa = 9CHOCH CH N

2 2

CH3

CH

∅

∅

+H

CH3

CH

∅

∅

CHOCH CH N2 2 + H+

CH3

∅ CH3

∅

A pH 9 – la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadasen relación 1:1. La forma de pico puede ser pobre

A H 10 91% d l t dif hid i d t dA pH 10 – 91% de la muestra es difenhidramina desprotonada.A pH 8 – 91% de la muestra es difenhidramina protonada.

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pH vs. Selectivdad para Acidos y Bases

5

Columna: Nucleosil-C18Fase Móvil: 45% ACN/55% tampón fostatoMuestra: Acidos Biliares

Columna: mBondapak-C18Fase Móvil: 60% 25 mM tampón fostato

40% Metanol1 Ácido Salicílico

SCD1.5

540

6

1. Ácido Salicílico2. Fenobarbital3. Fenacetin4. Nicotina5. Metamfetamina

5

1.0

g k«

30

on

UDCSOC4

2 +0.5

log

4

20

Reten

tio

+++

3

1 7,12 - OC

C12-OC J.C. 111(1975) 149

++

1

0.0

2

310J.C. 268(1983) 1

-0.53 4 5 6 7 8 pH

A B C

23 5 7 9

ELUENT pH

10

•La Retención y la selectividad puede cambiar dramáticamente cuando se cambia el pH

Page 36

•La Retención y la selectividad puede cambiar dramáticamente cuando se cambia el pH.

Importancia del pH y los Tampones Un Ejemplo PrácticoUn Ejemplo Práctico

•Por qué la Muestra impone las condiciones de uso

•Qué pasa cuando el tampón se usa con efectividad

Q é d i l t ó•Qué pasa cuando se ignora el tampón o se usa inadecuadamente

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Tampones más usados en Fase Reversa HPLC

Buffer pKa Buffer Range UV Cutoff (nm)Phosphate 2.1 1.1-3.1 200

7.2 6.2-8.212.3 11.3-13.3

Formic acid* 3.8 2.8-4.8 210 Acetic acid* 4.8 3.8-5.8 210Citrate 3.1 2.1-4.1 230

4.7 3.7-5.75.4 4.4-6.4

Tris 8.3 7.3-9.3 205Triethylamine* 11.0 10.0-12.0 200Pyrrolidine 11.3 10.3-12.3 200* Volatile buffers for LC/MS applications

La capacidad de tamponamiento óptima se dá a un pH igual al pKa del tampon. La mayoría de l i id d d d d i l l H d l flos tampones tienen una capacidad adecuada de tamponamiento para controlar el pH de la fase movil solo en ±1 unidades de su pKa

Page 38

Importancia del pH y Tampones - Un Ejemplo Práctico Condiciones Isocráticas Optimizadas para Fármacos CardíacosCondiciones Isocráticas Optimizadas para Fármacos Cardíacos

1

Columna: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mmFase Móvil: 45% 25 mM NaH2PO4 pH 3 0 (1 1-3 1)Fase Móvil: 45% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 (1.1-3.1)

55% MeOHFlujo: 2.0 mL/min.Temperatura:35°CDetección: UV 254 nmMuestra: Fármacos Cardíacos

1. Diltiazem2. Dipyridamol3. Nifedipina4 Lidoflazina

5

4

32

4. Lidoflazina5. Flunarizina

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time (min)

Page 39

No Tengo Tiempo de Hacer Tampones o Ajustar el pHpH …

Columna: StableBond SB-C184.6 x 150 mm, 5 mm

Fase Móvil: A: 20% H2OFase Móvil: A: 20% H2OB: 80% MeOH

Flujo: 1.0 mL/min.Temperatura:35°CDetección UV:254 nmFuertesMuestra: Fármacos Cardíacos

Incluso a muy alto % MeOH La mayóría de

Fuertes interacciones secundarias d l t

y ycomponentes fuertemente retenidos muestran pobre forma de pico debido al IEX en la superficie

de la muestra (aminas) con la superficie de la columna

0 5 10 15 20 25Time (min)

• Los Tampones son críticos para una buena retención y forma de pico en muchas separaciones

Page 40

• Los Tampones son críticos para una buena retención y forma de pico en muchas separaciones.

¿Qué pasa si trabajas fuera del rango del tampón?

2

Columna: StableBond SB-C184.6 x 150 mm, 5 mm

Fase Móvil: A: 30% 25 mM NaH2PO4, pH 4.8 no tamponadoB: 70% MeOH

Flujo: 1 0 mL/minSe añadió t ó

1

Flujo: 1.0 mL/min.Temperatura:35°CDetección UV:254 nmMuestra: Fármacos Cardíacos

1 Diltiazem

tampón, pero no controla el 1. Diltiazem

2. Dipyridamol3. Nifedipina4. Lidoflazina5. Flunarizina

Forma de Pico Inadecuada

controla el pH a 4.8

5

34

0 5 10 15 20 25Time (min)

Page 41

No olvidar- Elegir la columna adecuada al pH de la Fase Móvil para el Máximo Tiempo de VidaFase Móvil para el Máximo Tiempo de Vida pH Alto y Temperatura Ambiente (pH 11 RT)

Fase Móvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA(~ pH 11, disolución de la sílica)

InicialInicial

Después de 30 inyecciones

Consejo: Usar las columnas diseñadas para el pH elegido

Page 42

Consejo: Usar las columnas diseñadas para el pH elegido

Efecto del Tiempo de Respuesta del DetectorEl Sistema está operando bien- los ajustes se hicieron mal!El Sistema está operando bien- los ajustes se hicieron mal!

Bajas Velocidades de Adquisición Pueden Dificultar la Detección de Impurezas y Reducir la Sensibilidad

0.1 segTiempo de Respuesta

Agilent 1100 DADAgilent 1100 WPS with ADVR

Columna: Poroshell 300SB-C182 1 x 75 mm 5 um

0.2 seg1er pico = 1.2 segA 20 pts/seg = 24 pts

2.1 x 75 mm, 5 umFase Móvil:A: 95% H2O, 5% CAN con 0.1% TFAB: 5% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA

Flujo: 2 mL/min

0.5 seg

1 0 seg1er pico = 1.2 segTemperatura:70°C

Detector: UV 215 nm

Embolada de Piston : 20

1.0 seg

2.0 seg

p gA 5 pts/seg = 6 pts

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9Time (min)

1.0

Muestra:1. Neurotensina 3. Lisozima2. RNasaA 4. Mioglobina

2.0 seg

• Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor detección de picos

Page 43

Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor detección de picos.

Conclusiones

Los problemas en Columnas HPLC más comunes son:

• Alta Presión (Prevenir mejor que curar)( j q )• Malas Formas de Pico• Cambio en la Retención/Selectividad

A menudo estos problemas no están asociados con la columna y pueden ser causados por el instrumento o por problemas químicos:• pH de la Fase MóvilpH de la Fase Móvil• Conexiones del Instrumento• Parámetros del Detector• Contaminación por Metales

Comenzar con las pregunta correctasEncontrar las resp esta• Encontrar las respuesta

• Las respuestas conducirán a soluciones

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