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RESPUESTA INMUNE HUMORAL DE PACIENTES CHAGASICOS FRENTE A LISADOS COLOMBIANOS DE Trypanosoma cruzi.
CLARA INES ENCISO CAMACHO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el título de
BACTERIOLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santa Fe de Bogotá, D.C.
RESPUESTA INMUNE HUMORAL DE PACIENTES CHAGASICOS FRENTE A LISADOS COLOMBIANOS DE Trypanosoma cruzi.
CLARA INES ENCISO CAMACHO
___________________________
Concepción Puerta B., Ph.D
Directora
__________________________
Marleny Montilla., MSc.
Codirectora
______________________ ______________________ Adriana Rodriguez., MSc. Santiago Nicholls.,MD MSc. Jurado Jurado ____________________ ____________________ Aura Rosa Manacero. MSc. Carlos Corredor, PhD. Directora de Carrera Decano académico Bacteriología Facultad de Ciencias
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1.946 “ La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”.
DEDICATORIA
A Ti Señor, por iluminarme en este largo camino y la luz que me brindaste para
afianzar mi fe en ti.
A mis queridos padres Vicente y Miriam por la fe y la confianza que siempre
depositaron en mí y la constante ayuda que me brindaron durante toda mi carrera.
A mi hermano Luis Carlos por ser el punto de apoyo en mi vida.
A mis tías Isabel y Gilma por estar siempre a mi lado brindándome su apoyo
incondicional y la fortaleza necesaria para seguir siempre adelante.
Clarita
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Concepción Puerta Bula por ser mi guía a lo largo de este trabajo. A la Dra. Marleny Montilla por ser mi punto de apoyo, mi amiga y mi consejera durante esta investigación. A la Dra. Adriana Rodríguez por la orientación y la colaboración que me brindo en desarrollo de este trabajo. A la Dra. Marcela Mercado por la ayuda que me proporciono durante el desarrollo de mi trabajo de grado. Al Dr. Hugo Diez por haber creído en mi y ser una ayuda incondicional durante este trabajo. Al Dr. José Joaquín Cantor de la Cruz Roja Colombiana por su colaboración en este trabajo de investigación.
TABLA DE CONTENIDO
Pág 1. INTRODUCCION 1 2. MARCO TEORICO 4 2.1 Trypanosoma cruzi 4 2.1.1 Taxonomía 4 2.1.2 Morfología de T. cruzi 5 2.1.3 Ciclo de Vida de T.cruzi 7 2.2 Enfermedad de Chagas 10 2.2.1 Transmisión 12 2.2.2 Ciclo de transmisión 14 2.2.3 Reservorios 15 2.2.4 Diagnóstico 16 2.2.4.1 Métodos parasitológicos directos 16 2.2.4.2 Métodos parasitológicos indirectos 17 2.2.4.3 Procedimientos serológicos 18 2.2.5 Perfil de la respuesta inmune 22 3. JUSTIFICACION 29 4. OBJETIVOS 32 5. MATERIALES Y METODOS 33 5.1 Pacientes 33
5.1.1 Procedimientos para garantizar aspectos éticos de los
pacientes involucrados en el estudio 34
5.2 PARÁSITOS 34 5.2.1 Lisados de T. cruzi 35 5.2.2 PAGE SDS 36 5.3 Prueba de ELISA 36 5.4 Análisis de resultados 38 6. RESULTADOS Y DISCUSION 39 6.1 Análisis de los lisados del parásito 39 6.1.1 Análisis PAGE-SDS 41 6.2 Análisis de la población de estudio 46 6.2.1 Donantes positivos 46 6.2.2 Pacientes crónicos 49 6.2.3 Donantes negativos 51 6.3 Estandarización de la prueba de ELISA 53 6.4 Determinación de la reactividad de pacientes chagásicos
frente a un “Pool” de lisados de las tres cepas colombianas de Trypanosoma cruzi 54
6.4.1 Reactividad de los donantes positivos 58 6.4.2 Reactividad de los donantes crónicos 60 6.4.3 Reactividad de los donantes negativos 61 6.4.4 Comparación de la reactividad frente a lisados de cepas
colombianas de Trypanosoma cruzi entre los diferentes grupos de estudio 65
6.4.5 Comparación de las pruebas de CHAGATEK, IFI y ELISA 71
6.4.5.1 Determinación de la sensibilidad y especificidad de la prueba de ELISA usando cepas colombianas 71 6.4.5.2 Correlación de las pruebas ELISA, CHAGATEK e IFI 74 7. CONCLUSIONES 78 8. RECOMENDACIONES 80 9. ANEXOS 81 10. BIBLIOGRAFÍA 90
1. INTRODUCCION
Los protozoos parásitos pertenecientes a la familia Tripanosomatidae son
responsables de un grupo de enfermedades que afectan al hombre y a varias
especies animales salvajes y domésticas. Dentro de esta familia se
encuentra el Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de
Chagas. (Tanowltz y col., 1992)
La enfermedad de Chagas, involucra tres fases distintas: (i) una fase aguda,
que ocasiona la muerte en aproximadamente el 10% de los casos, en su
mayoría niños, (ii) una fase indeterminada o crónica asintomática, la cual
compromete cerca del 40% de los casos serológicamente positivos, y (iii) una
fase crónica, la cual se caracteriza por la existencia de cardiomagelia o
megasindromes intestinales (WHO., 1991; Tanowltz y col.,1992)
Desafortunadamente, la mayoría de las infecciones por T. cruzi son
detectadas en la fase crónica de la enfermedad, fase en la cual el
tratamiento directo contra el parásito es muy controvertido y por lo general,
se limita a un tratamiento de tipo sintomático.
Por el contrario, para los pacientes que se encuentran en la fase aguda de
la enfermedad, se recomienda el tratamiento específico contra el parásito con
drogas derivadas de los nitrofuranos, las cuales tienen el inconveniente de
ser tóxicas y producir efectos secundarios severos (WHO., 1991;Galvao y
col., 1993).
Por su parte los pacientes infectados asintomáticos, revisten un gran
problema no solo a nivel de banco de sangre, sino a nivel clínico ya que se
desconoce el momento en el cual el paciente inicia la fase crónica y por lo
tanto debe empezar a ser revisado y tratado médicamente.
Dado que algunos estudios evidencian la existencia de antígenos del
parásito, diferencialmente expresados y/o reconocidos en cada una de las
fases de la enfermedad (Frash y col., 1989; Brodskyn y col., 1996); en el
presente trabajo se pretendió comparar mediante ensayos
immunoenzimáticos (ELISA) la reactividad frente a lisados de cepas
colombianas del parásito entre pacientes chagásicos asintomáticos y
sintomáticos; como un primer paso hacía la búsqueda de moléculas que
puedan constituir marcadores potenciales de la enfermedad.
2. MARCO TEORICO
2.1. Trypanosoma cruzi
Se considera que la especie T.cruzi es un conjunto de poblaciones de
parásitos que circulan entre reservorios animales, humanos y vectores
intradomiciliarios y silvestres. Ampliamente definidos, los microorganismos
que pertenecen a este género son protozoarios flagelados de la familia
Trypanosomatidae que pasan a través de diferentes estadios morfológicos
(amastigota, epimastigota y tripomastigota) en sus huéspedes vertebrados e
invertebrados. (Kirchhoff y col., 1992)
2.1.1 Taxonomía
El agente causal de la enfermedad de Chagas es el T.cruzi cuya ubicación
sistémica es la siguiente: ( Levine y col.,1980)
Reino: Protista.
Phylum: Sacaromastigophora.
Sub-phylum: Mastigophora.
Clase: Zoomastigophora.
Orden: Kinetoplastida.
Suborden: Trypanosomatina.
Familia: Trypanosomatidae.
Género: Trypanosoma.
Subgénero: Schizotrypanum.
Especie: cruzi.
2.1.2 Morfología del T.cruzi
Los tripanosomas son protozoarios que presentan tres estadios morfológicos
principales a través de su Ciclo de Vida: Tripomastigotes, amastigotes y
epimastigotes. Los tripomastigotes son: fusiformes, pequeños, muy móviles
y aplanados lateralmente (Baker., 1982). Su cuerpo largo y sinuoso tiene un
extremo anterior puntiagudo y un extremo posterior romo, este se caracteriza
por tener un flagelo que se origina en el cinetoplasto y corre a lo largo del
cuerpo del parásito, el cual se encuentra envuelto en una membrana
ondulante. (Figura 1). Se extiende más allá del cuerpo en la forma de una
estructura libre como un filamento. La membrana ondulante y la parte libre
del flagelo confieren considerable motilidad al microorganismo. (WHO., 1991;
Kirchhoff y col., 1992)
Figura 1. Coloración de Giemsa de Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi.
El tripomastigote sanguíneo, en el huésped vertebrado, tiene predilección por
los macrófagos, células del sistema retículo endotelial, tejido muscular
cardíaco, muscular estriado, muscular liso y menos frecuente por tejido
nervioso (Brener., 1973). Dentro de estas células el tripomastigote
sanguíneo se transforma en amastigote, el cual se caracteriza por ser
redondeado u oval, multiplicarse por división binaria, medir aproximadamente
de 1.5 a 4 micras de diámetro y no poseer flagelo. Los amastigotes se
aglomeran dentro de las células formando nidos (Figura 2). En el ciclo
celular, el parásito también adopta una forma intermedia de tamaño un poco
menor que el tripomastigote, llamada epimastigote, de aspecto fusiforme, con
cinetoplasto y flagelo anteriores al núcleo. (WHO., 1991)
Figura 2. Coloración de Giemsa de células epiteliales infectadas con amastigotes de
Trypanosoma cruzi
2.1.3 Ciclo de vida del Trypanosoma cruzi
Esta enfermedad es transmitida al hombre a través de las heces de insectos
hematofagos infectados de la familia Reduviidae, subfamilia Triatominae y
géneros Rhodnius, Triatoma y Panstrongylus, conocidos popularmente en
nuestro país como "pitos". (Figura 3) (WHO., 1991; Tanowltz y col., 1992).
Figura 3. Rhodnius prolixus insecto vector de la enfermedad de Chagas.
Estos vectores colonizan las grietas de las paredes de las viviendas
construidas principalmente con bahareque, y emergen durante la noche para
alimentarse de la sangre de los habitantes de las mismas. Las especies
predominantes de los vectores varían entre los diferentes países, es así
como en Colombia y Venezuela, por ejemplo predomina el Rhodnius prolixus,
mientras que en Brasil, Argentina, Perú Bolivia, Uruguay y Chile, predomina
la especie Triatoma infenstans (Corredor y col., 1990).
Las formas epimastigotas flageladas se multiplican en el tracto digestivo del
intestino, con posterior diferenciación en la forma infectiva, el tripomastigote
metaciclíco, el cual es depositado con las heces en el momento de la
picadura del triatomineo vector. Estas formas metaciclícas, tienen la
capacidad de internarse in vivo en las células del huésped, dentro de las
cuales se diferencian en su estadio no flagelado, el amastigote. Las formas
intracelulares amastigotas, tras varias rondas de replicación se diferencian en
tripomastigotes, los cuales son liberados al torrente sanguíneo por ruptura de
la célula infectada. El ciclo de T. cruzi se completa cuando el insecto vector
ingiere durante su comida las formas tripomastigotas sanguíneas y estas se
diferencian dentro del mismo en epimastigotes. (Figura 4) (WHO., 1991;
Tanowltz y col., 1992)
Figura 4. Ciclo de Vida del Trypanosoma cruzi.
2.2 Enfermedad de Chagas
La infección de T. cruzi en humanos se caracteriza por involucrar tres
fases: aguda, indeterminada o asintomática y crónica.
La enfermedad aguda se caracteriza por malestar general con una variedad
de manifestaciones clínicas. Los síntomas por lo general son moderados y
atípicos, razón por la cual la enfermedad es tan solo reconocida en 1 a 2%
de los pacientes con infección aguda. Aún cuando la fase aguda se puede
desarrollar a cualquier edad, en las áreas endémicas se ha visto que los
niños menores de diez años son los más propensos a padecerla.
Presentándose la sintomatología más severa en niños menores de dos años,
los cuales pueden desarrollar miocarditis o meningoencefalitis fatales.
(WHO., 1991; Tanowltz y col., 1992). En el sitio de entrada del parásito, se
puede desarrollar una lesión inflamatoria, conocida como chagoma. El
proceso inflamatorio se dispersa regionalmente, ocurriendo también
linfadenopatías a nivel local. Los parásitos se replican asincrónicamente
dentro de las células del sistema reticuloendotelial, destruyéndolas y
reinfectando nuevas células. Posteriormente, los tripanosomas se replican
intracelularmente como amastigotes, para luego diseminarse a través del
torrente sanguíneo, como tripomastigotes principalmente, alcanzándose el
pico de parasitemia alrededor del décimo día después de la infección. Los
síntomas generales del período agudo son: fiebre, hepatoesplenomegalia,
edema generalizado y linfadenopatías. Algunas veces también se presentan
náuseas, vómitos, diarrea, anorexia y exantema generalizado. La muerte
puede sobrevenir o meningoencefalitis, o, la enfermedad puede pasar a
estado crónico (WHO., 1991; Tanowltz y col., 1992).
Una vez establecida la infección de T. cruzi dura toda la vida del individuo.
Sin embargo, la mayoría de las personas crónicamente infectadas, no
desarrollan síntomas de la enfermedad, encontrándose entonces en la etapa
indeterminada o asintomática (WHO, 1991; Tanowltz y col., 1992). Durante
esta fase, las personas se sienten saludables y muestran tanto
electrocardiogramas como radiografías de pecho normales. Sin embargo, las
pruebas serológicas permanecen positivas y en un 20-60% de los casos se
puede evidenciar el parásito mediante xenodiagnóstico. Adicionalmente, los
pacientes durante esta etapa son ignorantes respecto a la infección que
padecen y constituyen un reservorio importante de la infección,
contribuyendo a mantener ciclo del parásito. (WHO., 1991).
Alrededor de la cuarta década de la vida, del 10-30% de las personas
crónicamente infectadas, comienzan a dar muestras clínicas de la
enfermedad. Este periodo se caracteriza principalmente por las lesiones
cardíacas, con hipertrofias del corazón y arritmias, que terminan en bloques
aurículo-ventriculares y de la rama derecha del haz His, que conducen a una
insuficiencia miocardiaca crónica, la que con frecuencia es causa de la
muerte. Se han descrito los tipos cardiacos, meningoencefálico,
mixedematoso, seudomixedematoso y supracraneal de la enfermedad.
Adicionalmente, dependiendo del tropismo de la cepa, se puede presentar
daño neurológico u otros megasindromes tales como: dilatación del esófago
(Megaesófago) y del colón (Megacolón). Los cuales son debidos al
peristaltismo desordenado que se manifiesta como resultado de la
destrucción de los ganglios autónomos que están dentro de las paredes
viscerales (WHO., 1991; Tanowltz y col., 1992).
2.2.1 Transmisión
a. Por vectores. Este es el principal mecanismo de transmisión en
condiciones naturales, es transmitido por varias especies de insectos
triatomideos hematofagos o insectos redúvideos de los géneros:
Pastrongylus, Rhodnius y Triatoma; pero los principales transmisores
son: T. infestans, F. Sordida, P. megistus y R. prolixus. Los redúvideos
(chinches hociconas) pueden conservar la infección más de dos años, tal
vez toda sus vida (Brener Z., 1973).
Este parásito pasa del triatomineo a través de las deyecciones que
deposita
en la piel o mucosas durante o después de la picadura del huésped.
(WHO.,
1991)
b. Transfusión sanguínea. Esta forma de transmisión se presenta en
aquellas zonas endémicas, en donde los donadores de sangre tienen
parásitos circulantes. En sangre almacenada a 4º C, los parásitos pierden
su viabilidad después de 3 semanas. Debido a la importancia de este
modo de transmisión en estas zonas, se deben hacer de rutina estudios
serológicos en los bancos de sangre. (WHO., 1991)
c. Transplantes de órganos. Lo mismo que con la transfusión, los
transplantes de órganos de donantes procedentes de zonas endémicas
pueden llevar los parásitos, que al llegar a un huésped inmunosuprimido
diseminan la parasitosis. En estos casos se presentan infecciones agudas
y en algunos se han informado casos fatales. Los pacientes chagásicos
crónicos se agravan con la inmunosupresión. (WHO., 1991; Cortés y
col., 1995).
d. Placentaria. Este modo de transmisión ha sido plenamente demostrado
en algunas zonas endémicas de diferentes países, por lo tanto se deben
estudiar las madres embarazadas y los recién nacidos. La mayoría de las
mujeres que han tenido niños con infección congénita, no presentaron
síntomas de la enfermedad. (WHO., 1991)
e. Accidental. Entre el personal que trabaja en el laboratorio con parásitos
vivos, existe la posibilidad de inoculación accidental. (WHO., 1991).
f. Vía digestiva. La ingestión de carne cruda o sangre de animales
infectados,
permite la entrada del parásito por las mucosas. Esta demostración se
ha
realizado en animales pero no se han documentado casos en el ser
humano.
(WHO., 1991)
2.2.2 Ciclo de transmisión
a. Ciclo doméstico: Responsable de mantener la infección en el humano,
ocurre principalmente en casas de áreas rurales y suburbanas, de
construcciones de paredes de bareque, adobe y techo de paja.
(Shumunis G.A., 1991)
b. Ciclo selvático: Involucran triatomineos selváticos que infectan roedores,
marsupiales y otros animales selváticos. (Shumunis G.A., 1991)
c. Ciclo Peridoméstico: Mamíferos (roedores domésticos, marsupiales,
gatos y perros) y vectores selváticos intervienen en este ciclo, los
mamíferos se desplazan libremente cerca de las casas donde viven los
humanos, donde los vectores son atraídos por la luz de las casas y el
alimento. Este ciclo actúa como eslabón del ciclo doméstico y salvaje.
(Shumunis G.A., 1991)
2.2.3 Reservorios
Los animales reservorios constituyen una gran fuente de infección para los
vectores, por su parasitemia prolongada y el alto número de tripanosomas en
sangre. El perro y en ciertas regiones la zarigüeya y los roedores son
probablemente los huéspedes reservorios más importantes dentro del ciclo
peridomiciliario y destacándose en el ciclo salvaje la zarigüeya (Didelphis).
T.cruzi también ha sido encontrado en monos y murciélagos en Colombia.
(Marinkelle C.J., 1982; Shumunis G.A., 1991).
2.2.4 Diagnóstico
El diagnóstico diferencial de la enfermedad varía de acuerdo a la forma
clínica en que se encuentre el paciente. En la fase aguda puede confundirse
con varias enfermedades infecciosas febriles; sin embargo, la presencia del
chagoma o el signo de Romaña, son características que contribuyen al
diagnóstico. En la forma crónica es más difícil de orientar el diagnóstico.
La sospecha clínica de la enfermedad se debe confirmar por el laboratorio,
los procedimientos disponibles por el laboratorio se dividen en
parasitológicos directos, parasitológicos indirectos y serológicos. (WHO.,
1991; Kirchhoff., 1992)
2.2.4.1 Métodos parasitológicos directos:
Examen en fresco: Tiene por objeto visualizar el tripomastigote en una gota
de sangre entre lámina y laminilla. La búsqueda se facilita con el
microscopio de contraste de fase. El movimiento de los parásitos ayuda a su
detección. (WHO., 1991; Kirchhoff., 1992)
Extendido coloreado: Los extendidos de sangre o frotis de sangre o
plasma, en lámina o laminillas, se pueden colorear con los derivados de
Romanowsky, especialmente Giemsa, lo cual es importante para la
identificación morfológica.
(WHO, 1991; Kirchhoff, 1992)
Gota gruesa: este método permite estudiar un mayor volumen de sangre y
es más que el extendido cuando la parasitemia es baja. (WHO.,1991;
Kirchhoff., 1992)
Biopsia: Este método se utiliza para comprobar las formas tisulares de T.
cruzi. Se pueden ver en los tejidos los llamados nidos de amastigotes en su
interior. (WHO, 1991; Kirchhoff, 1992)
2.2.4.2 Métodos parasitologicos indirectos
Son el método de elección para establecer que un individuo esta infectado y
tiene un riesgo de desarrollar síntomas asociados con una infección crónica
con T. cruzi. (Kirchhoff., 1992)
Xenodiagnóstico: Esta técnica consiste en permitir que de 10 a 30 insectos
redúvideos criados en el laboratorio y no infectados se alimenten con la
sangre del paciente, en forma directa o a través de una membrana delgada
que cubre un frasco-ampolla que contiene sangre anticoagulada con
heparina sin conservadores. ( Kirchhoff., 1992)
Cultivo: El más utilizado en la actualidad es el medio LIT (Liver-Infusion-
Trytose), debido a que se puede obtener una positividad relativamente alta,
tanto en la fase aguda como en la crónica. Otros medios utilizados son: NNN
(Novy-MacNeal-Nicolle), Noeller, Packchanian, Davis, etc. (WHO., 1991)
2.2.4.3 Procedimientos serológicos
Son el método de elección para establecer la presencia de anticuerpos que
nos indican la existencia, presente o pasada, del parásito en el organismo.
Estas pruebas se utilizan especialmente en las etapas latente y crónica de la
infección, cuando es difícil encontrar los parásitos. Por lo general se utiliza la
prueba de ELISA como un "Screening" y luego una prueba confirmatoria
como la técnica de inmunofluorescencia indirecta, (IFI). (WHO., 1991)
ELISA (Enzime Linked Inmunoabsorbent Assay)
La unión covalente de enzimas a las moléculas de anticuerpos produce una
herramienta inmunológica que posee alta especificidad y alta sensibilidad.
Esta técnica utiliza los anticuerpos a los que se han enlazado
covalentemente las enzimas, de modo que quedan sin alteración las
propiedades catalíticas de la enzima y la especificidad del anticuerpo. Es por
ello que utiliza como antígeno extractos del parásito o sus fracciones,
absorbidas en microplatos. Además conjuga dos marcadores con peroxidasa
o fosfatasa. Es una prueba muy sensible para detectar anticuerpos Ig G o Ig
M. (Hornebeck P., 1991; Controy A., 1991)
La técnica se desarrolla siguiendo estos pasos fundamentales:
1. Sensibilización de los pozos de la microplaca utilizada para desarrollarla
técnica con el antígeno diluido.
2. Lavados para retirar el antígeno que no fue adsorbido en la placa.
3. Incubación con las muestras de sueros a analizar, en donde se espera
que encuentren los anticuerpos específicos para reaccionar con el
antígeno adsorbido formando el complejo Ag-Ac.
4. Lavados para retirar los anticuerpos que no se unieron al antígeno.
5. Incubación con una anti-Inmunoglobulina marcada enzimáticamente
(comúnmente con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano), de modo
que el conjugado reacciona con los anticuerpos capturados por el
antígeno adsorbido al pozo de la microplaca.
6. Lavados para remover el exceso de conjugado.
7. Adición del sustrato enzimático y medición de la absorbancia a la longitud
de onda adecuada. De tal forma que la intensidad del color desarrollado
sea proporcional a la concentración de anticuerpos en la muestra.
Como prueba de tan amplia aplicación clínica y tan universalmente empleada
ello ha motivado que cientos de casas comerciales se hayan lanzado a la
producción de los reactivos en estuches que contienen todo lo necesario
para realizar las pruebas con un estricto control de calidad interno
asegurando un grado de confiabilidad. ( Controy., 1991)
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)
Es un procedimiento inmunológico que utiliza anticuerpos fluorescentes. Las
moléculas de anticuerpos pueden volverse fluorescentes agregándoles
químicamente un compuesto orgánico fluorescente, como Isotiocianato de
fluoresceína ó Tetrametil rodamina. Esto no modifica la especificidad de los
anticuerpos de manera importante, pero hace posible detectar los
anticuerpos adsorbidos por las células o tejidos mediante el empleo de
microscopio de fluorescencia. (Nicholls y col., 2001)
Se emplean dos procedimientos de tinción diferentes: El Directo y el
Indirecto. En el método indirecto, la presencia de un anticuerpo sobre la
superficie de la célula queda detectado por el empleo de otro anticuerpo
fluorescente dirigido contra el mismo anticuerpo específico. Una de las
ventajas del método de tinción indirecto es que elimina la necesidad de hacer
anticuerpos fluorescentes para cada organismo de interés. (Nicholls y col.,
2001)
2.2.5 Perfil de la respuesta inmune en las diferentes fases de la
enfermedad
La respuesta inmune en la enfermedad de Chagas juega un papel dual: por
una parte confiere resistencia parcial contra la infección y por otra parte está
implicada en la patogenesis de la enfermedad debido a respuestas
autoinmunes desarrolladas en los pacientes crónicos.
Tanto la respuesta humoral como la celular se han visto comprometidas en
la inducción de la respuesta inmune en los estados agudo y crónico de la
enfermedad. Dadas las características propias de cada una de las fases de
la enfermedad de Chagas, es lógico suponer que los determinantes
antigénicos expresados por el parásito y reconocidos por el huésped, en
cada una de las fases de la enfermedad difieran al menos, parcialmente.
Es así como estudios realizados por Frasch y col., 1989, muestran como
diez clones del parásito aislados a partir del "screening" de una librería de
expresión, presentan diferente perfil de reconocimiento por sueros de
pacientes en la fase aguda y crónica de la enfermedad: (i) 26 de los 28
sueros correspondientes a pacientes en la fase aguda de la enfermedad,
reaccionan preferencialmente con el antígeno expresado por el clon 7 y en
menor extensión con los antígenos de los clones 13 (11 sueros positivos)
y 36 (10 sueros positivos). (ii) La mayoría de los 37 sueros de pacientes
en la fase crónica detectan el antígeno 1 (27 sueros positivos) y 2 (25
sueros positivos) y solamente tres de ellos reconocen el antígeno del clon
7. Estos resultados muestran como el clon 7 codifica para una proteína
que es altamente antigénica durante la fase aguda de la enfermedad,
mientras que los clones 1 y 2 codifican para proteínas antigénicas durante
la fase crónica de la enfermedad.
De otra parte, Levin y col., 1989, realizaron el "screening" de una librería
de cDNA del parásito, con el suero de un paciente (JL) con miocarditis
chagásica severa. En dicho "screening" aislaron el clon JL5, el cual
reacciona predominantemente con sueros de pacientes chagásicos
cardíacos y no contra, sueros de individuos infectados sin compromiso a
nivel de corazón.
Por su parte, Cerban y col., 1993, estudiaron la reactividad de los isotipos
de IgG presentes en pacientes infectados con T.cruzi, frente a epimastigotes
y a una fracción citosólica acídica del parásito (F IV). Los pacientes
estudiados eran seropositivos para el parásito y fueron divididos en los
siguientes grupos: I, pacientes con electrocardiogramas normales; grupo II,
pacientes con electrocardiogramas anormales, pero sin cardiomagalia, III,
pacientes con electrocardiogramas anormales y presencia de cardiomegalia.
Se encontró que la IgG 1 era el principal isotipo de anticuerpo encontrado en
todos los grupos de los pacientes. Además, el patrón de reconocimiento
antigénico de la Ig G1 mediante "Wester blot" entre los grupos de pacientes
presentaba diferencias significativas: Los pacientes del grupo I reconocían
los antígenos de 80, 53 y 43 Kd de F IV. Mientras que los sueros del grupo
III reconocían principalmente la banda correspondiente a 43 Kd.
Otro estudio realizado por Guevara y col., 1995, muestra como la proteína
recombinante de 24 Kd de T.cruzi, puede ser empleada para monitorear la
cura de los pacientes chágasicos agudos, en base a la desaparición de la
reactividad contra esta proteína, una vez la etapa aguda ha sido superada.
Es decir la Tc 24 es reconocida solamente por los pacientes agudos.
Umezawa y col., 1996, realizaron ensayos de inmunoblot con el fin de
analizar la reactividad de pacientes chagásicos crónicos, agudos y con
Chagas congénito, frente a los antígenos secretados y excretados del
parásito. Encontrando que los sueros de pacientes con Chagas congénito y
agudo reconocen una escalera de fracciones de 130-200 Kd. Mientras que
los sueros de pacientes crónicos reaccionan frente a una amplia banda de
150 a 160 Kd.
Por su parte, Breniere y col., 1997, estudiaron la respuesta humoral frente
al antígeno SAPA (" Shed acute phase antigen”) en dos grupos de niños de
una región endémica de Bolivia. Es así como los análisis de ELISA
revelaron que en los niños que recién habían adquirido la infección así como
también en los niños con Chagas asintomáticos, se encontraron niveles
elevados de respuesta con alrededor del 80% de los pacientes positivos; en
contra posición a los niveles bajos de reactividad de los pacientes crónicos
enfermos observados en estudios anteriores. (Breniere y col., 1997).
Morgan y col., estudiando el perfil de inmunoglobulinas y sus isotipos
respectivos frente a lisados del parásito mediante ELISA (1996) y "Western
blot" (1998) en pacientes con diferentes manifestaciones clínicas de la
enfermedad de Chagas (manifestaciones cardiacas, manifestaciones
digestivas y asintomáticos), encontraron que: (1) los niveles de isotipos
varían según el estadio de la enfermedad, por ejemplo: los pacientes con
sintomatología a nivel gastrointestinal presentan los niveles más elevados de
Ig A. (2) La unión de ciertos antígenos con algún isotipo es más frecuente en
algunos grupos que en otros. Es así como la Ig G3 de 13 de 19 (68%)
individuos con manifestaciones digestivas se unían a una molécula de 68
Kd, mientras tan solo en 3 de 31 (9%) de los individuos con
manifestaciones cardiacas se presentó este reconocimiento.
Más adelante Zuñiga y col., (1999) estudiaron la respuesta de pacientes
chagásicos agudos y crónicos frente a fracciones alcalinas y ácidicas del
parásito; los cuales estaban compuestos principalmente por la enzima
Glutamato deshidrogenasa (GluDH) y la cisteín proteasa (cruzipain)
respectivamente. Es así como los estudios de ELISA e inmunoblot
mostraron que mientras anticuerpos Ac anti- cruzipain son detectados
durante todas las fases de la infección, los anticuerpos contra GluDH (47 Kd)
solo fueron detectados en pacientes agudos, siendo la Ig M el principal
isotipo producido.
A nivel celular, la respuesta inmune también parece discriminar los
determinantes expresados y/o reconocidos en las diferentes etapas de la
enfermedad. Es así como en un estudio de "T-cell Western blotting"
realizado con extractos de epimastigotes del parásito, se encontró que las
moléculas ubicadas en el rango de 100 a 150 Kd, son preferencialmente
reconocidas por las células mononucleares de sangre periférica de
pacientes asintomáticos (5 de 8) que de pacientes crónicos con
sintomatología cardíaca (1 de 7). Adicionalmente, el análisis por "Western
blotting" de la reactividad de los sueros de ambos grupos de pacientes,
arrojó resultados similares (Gazzinelli y col., 1990).
Así mismo, estudios realizados por Kahn y col., 1993, demuestran como la
respuesta blastogénica de las células mononucleares de sangre periférica
frente a lisados de tripomastigotes del parásito difieren entre pacientes
asintomáticos y sintomáticos. Encontrándose la respuesta celular
significativamente disminuida en los pacientes sintomáticos en comparación
a los asintomáticos.
Brodskyn y col., 1996, estudiando la citotoxicidad en pacientes
asintomáticos con cardiomiopatía encontraron que estos presentan una
respuesta más elevada en comparación a los pacientes en la fase
indeterminada y a los pacientes crónicos con cardiomiopatía.
El perfil de las citokinas en las diferentes fases de la enfermedad de Chagas
también ha sido estudiado. Es así como los estudios de Samudio y col.,
(1998) demuestran como mientras dos niños con Chagas agudo de una
región endémica del Paraguay presentan un perfil Th 1, (INFα , INFγ), 25
niños con Chagas asintomático de la misma región presentan un perfil ThO
(expresión de IFNγ e interleukina 4, IL 4). Posteriormente, Oliveira y col.,
(1999) encontraron que el INFγ estaba significativamente aumentado en
pacientes con manifestaciones cardiacas, (83%) en comparación con
pacientes asintomáticos (59%).
Finalmente, estudios realizados por Zuñiga y col., (2000) muestran como
los linfocitos B de ratones chagásicos que se encuentran en el estado agudo
de la enfermedad, sufren de procesos apoptósicos espontáneos que con
llevan a la inmunosupresión característica de esta fase de la enfermedad.
3. JUSTIFICACION
Dada las alarmantes cifras de 100 millones de personas expuestas a la
enfermedad de Chagas y de 17 millones de personas infectadas con
Trypanosoma cruzi en Latino América (WHO., 1991); Colombia no escapa a
este grave problema de salud pública, presentando según la Organización
Panamericana de la Salud, alrededor de 900.000 personas infectadas, con
un 23% de la población en riesgo de contraer la enfermedad y entre 30 y 40
mil nuevos casos anualmente (Panamerican Health Organization., 1994).
Adicionalmente, estudios de la prevalencia de sangre infectada con T.cruzi
en bancos de sangre en el territorio nacional, revelan como el riesgo de
infectarse con sangre contaminada con dicho parásito es 20 veces más
grande que el riesgo de adquirir HIV y 10 veces más elevado que de
contagiarse con hepatitis B (TDR., 1996)
La infección de T.cruzi en humanos sigue tres fases con manifestaciones
clínicas que varían ampliamente. La fase inicial aguda, con parasitemias
que suben hasta niveles evidentes, dura generalmente 6 u 8 semanas.
Durante este período, la respuesta inmune del huésped generalmente logra
eliminar solamente los parásitos del torrente sanguíneo, de manera que el
paciente pasa a la fase asintomática de la infección con los parásitos
multiplicándose dentro de las células de casi todos los órganos vitales, pero
esencialmente del corazón. La infección crónica dura toda la vida, y
generalmente es asintomática. Pero la destrucción progresiva de los tejidos
puede conducir a lesiones severas, especialmente del corazón, vísceras y
nervios. (WHO., 1991;Tanowltz y col., 1992)
Durante la fase asintomática o indeterminada de la enfermedad, las personas
se sienten saludables y muestran tanto electrocardiogramas como
radiografías de pecho normales. Sin embargo, las pruebas serológicas
permanecen positivas y en un 20-60% de los casos se puede evidenciar el
parásito mediante xenodiagnóstico. Adicionalmente, los pacientes durante
esta etapa son ignorantes respecto a la infección que padecen y constituyen
un reservorio importante de la infección, contribuyendo a mantener el ciclo de
vida del parásito. (WHO., 1991)
Por lo tanto, los pacientes infectados, asintomáticos, revisten un gran
problema no solo a nivel de banco de sangre, como transmisores del Chagas
transfusional, sino a nivel clínico y epidemiológico, ya que se desconoce el
momento en el cual el paciente inicia la fase crónica y por lo tanto debe
empezar a ser revisado y tratado médicamente.
Dado que algunos estudios evidencian la existencia de antígenos del
parásito, diferencialmente expresados y/o reconocidos en cada una de las
fases de la enfermedad (Frash y col., 1989; Brodskyn y col., 1996), en el
presente trabajo comparar mediante ensayos immunoenzimáticos (ELISA)
la reactividad frente a lisados de cepas del parásito entre pacientes
chagásicos asintomáticos y sintomáticos.
4. OBJETIVOS
GENERAL
Comparar mediante ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) la reactividad de
pacientes chagásicos frente a lisados de cepas colombianas de
Trypanosoma cruzi.
ESPECIFICOS
1. Obtención y análisis de lisados de tres cepas colombianas de
Trypanosoma
cruzi.
2. Estandarización de la Prueba de ELISA.
3. Determinar la respuesta humoral de pacientes infectados con
Trypanosoma
cruzi (sintomáticos y asintomáticos) y no infectados frente a lisados
totales
de cepas colombianas del parásito mediante ensayo de ELISA.
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Pacientes:
Se trabajó con el suero de 59 individuos agrupados en primera instancia de
la siguiente manera: (I) 14 donantes de la Cruz Roja Colombiana, positivos
para la infección por Trypanosoma cruzi por las pruebas de CHAGATEK
(ELISA Organon) e IFI (Laboratorio Centro de Investigaciones en
Microbiología y Parasitología Tropical (CIMPAT), U. Andes), (II) 18 pacientes
de la Clínica Shaio Bogotá (Colombia) con sintomatología compatible de
Miocarditis chagásica y positivos a la infección por Trypanosoma cruzi por
las pruebas de EIA (ELISA Abbot) e IFI (CIMPAT-U. Andes) y (III) 27
donantes saludables de la Cruz Roja Colombiana, catalogados como
negativos en dicha institución para la infección por Trypanosoma cruzi,
debido a que presentaron uno de los siguientes perfiles: (a) Prueba
CHAGATEK negativa, ó (b) prueba CHAGATEK positiva e IFI negativa.
Adicionalmente, se recolectaron 20 muestras de sangre provenientes de
personas sanas de alrededor de 20 años de edad, las cuales no han vivido
en zonas endémicas. A partir de dichas muestras se obtuvo el punto de
corte de las pruebas de ELISA.
5.1.1 Procedimientos para garantizar aspectos éticos de los pacientes
involucrados en el estudio
Este proyecto se rigió de acuerdo a las normas técnicas, científicas y
administrativas para la investigación en salud, del Ministerio de Salud de
Colombia resolución número 008430 del 4 de octubre de 1993. El estudio
protegió en todo momento la privacidad e intimidad del individuo
identificándolo con un número interno. Adicionalmente se anexa el formato
de aceptación de participación en el estudio. (Anexo 1)
5.2 Parásitos
Se trabajó con 3 cepas de T.cruzi aisladas de R. prolixus, D. marsupialis y
humano, representando ambos ciclos de transmisión: doméstico y silvestre,
(Tabla 1) procedentes de distintas regiones geográficas del país.
Tabla 1. Características de las cepas de Trypanosoma cruzi.
CEPA CODIGO HUÉSPED PROCEDENCIA CICLO DE
TRANSMISION
Munantá IRHO/CO/98
R. prolixus Boyacá Domiciliaria
S. P. R MHOM/CO/87 Humano Casanare Domiciliaria
MDID
MDID/CO/87/
No.3
Didelphis
marsupialis
N. Santander Silvestre
Los parásitos se cultivaron en medio REI modificado (Anexo 2),
suplementado con 2% SFB (suero fetal bovino) y gentamicina 100 µg/ml a
24º C. (Duque y col., 1993).
5.2.1 Lisados de T.cruzi
Los parásitos fueron recolectados por centrifugación a 900 g a 4º C y lavados
con PBS. Posteriormente, éstos fueron contados en cámara de Neubauer y
resuspendidos en solución de lisis (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Bisulfito de
sodio 380 ng/mL, NP40 1%, SDS 1%, PMSF 1 mM, aprontinina 0.5 mg/mL) a
una concentración de 5 x 105 parásitos/µL. (Santana y col., 1998)
Una vez resuspendidos, los parásitos se sometieron a diez ciclos de
congelación y descongelación en nitrógeno líquido y baño serológico a 37ºC,
respectivamente. Pasado este proceso, se centrifugaron a 7.000 g y a 4ºC,
se extrajo la fracción proteica de cada lisado y se hicieron alícuotas que se
almacenaron a -70º C. Posteriormente, la concentración de proteínas fue
medida según el método de Bradford. (Bradford, MM., 1976). (Anexo3)
5.2.2 PAGE- SDS
La fracción proteica de los lisados fue separada electroforéticamente en un
gel de poliacridamida - sodio dodecil sulfato (PAGE-SDS) al 10% (Anexo 4),
utilizando una concentración de 200-300 µg lisado/ pozo de corrido.
(Sambroock y col., 1989). Las bandas resultantes fueron visualizadas
mediante la tinción con Azul de Coomasie. (Sambroock y col., 1989).
(Anexo 5).
5.3 Prueba de ELISA
Placas de 96 pozos de poliestireno (Nuclon TM surface, Nalge Nunc,
International) fueron cubiertas con 100 µl del antígeno (pool de lisados de las
3 cepas del parásito) en buffer bicarbonato de sodio 0.05 M pH 9.6, a una
concentración final de 10 µg/pozo. Los microplatos luego de ser incubados
a 37 º C durante 3 h y a 4 º C durante toda la noche, fueron lavados con
TBS-T (TBS-Tween 20 0.1%, v/v). A continuación, los sitios de unión del
pozo no saturados fueron bloqueados con TBS-T y leche descremada al 5%
(w/v) durante 1h a 37º C. Después de lavar los microplatos tres veces con
TBS-T se adicionaron las muestras de suero diluidas en solución de
bloqueo. Cada una de las muestras fueron analizadas por triplicado.
Posteriormente las placas fueron incubadas 1h a 37 º C y lavadas cuatro
veces con TBS-T. 100 µl del conjugado anti Ig G humana acoplado a
fosfatasa alcalina (Sigma) diluido en solución de bloqueo, fueron
adicionados a cada pozo, seguido de la incubación de las placas a 37 º C por
1h. Después de lavar tres veces con TBS-T, se adicionaron 100µl del
sustrato (p-nitrofenilfosfato, Sigma). Pasados 30 min., se detuvo la reacción
con NaOH 1N, determinándose la densidad óptica a 405 nm, en un lector de
ELISA automático (Labsystems multiskan MCC/340). En cada microplato se
montaron un control positivo alto, un control positivo bajo (cercano al punto
de corte) y un control negativo. Adicionalmente, los niveles de "backgrouwnd"
de la absorbancia con TBS-T fueron sustraídos de cada una de las muestras
de suero. Las diluciones optimas de las muestras de suero y conjugado, así
como la concentración del antígeno/pozo, fueron establecidas mediante
estandarización de la prueba, de manera que las mismas permitirán la
máxima diferenciación entre sueros positivos y negativos. El punto de corte
de la prueba se estableció como la media del valor de los sueros controles
normales (20 sueros de personas sanas no infectadas), más o menos 2
desviaciones estándar. La positividad o negatividad de las muestras frente a
cada antígeno fue determinada aplicando la siguiente formula:
Indice de Reactividad = Absorbancia de la muestra/ Absorbancia del control
positivo bajo
Si la absorbancia de la muestra fue mayor de 1.1, la muestra se consideró
positiva, y menor de 0.90 negativa. Las muestras ubicadas entre 0.90 y 1.1
se sitúan en la zona gris de la prueba, considerándose dudosas.
5.4 Análisis de resultados
La diferenciación de la respuesta inmune frente a antígenos totales del
parásito entre los tres grupos de estudio se estableció mediante pruebas de
hipótesis estadística.
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Análisis de los lisados del parásito
Se trabajó con tres cepas colombianas de Trypanosoma cruzi aisladas de
diferentes regiones geográficas del país y diferentes huéspedes. (Tabla 1).
Una vez obtenido el cultivo en masa de cada una de las cepas, estas fueron
lisadas según lo descrito en materiales y métodos (No. 5.2.1) y cada uno de
los lisados obtenidos fueron analizados mediante determinación de la
concentración de proteínas y análisis de las fracciones proteícas mediante
“PAGE-SDS” al 10%.
La concentración de proteínas fue determinada según el método de Bradford,
utilizando albúmina sérica bovina (BSA) como patrón. Tal como se
esperaba, la concentración total de proteínas fue bastante similar en los tres
lisados. (Figura 5,Tabla 2).
Figura 5. Curva de Calibración de la concentración proteíca, según el método de Bradford.
0,492
0,504
0,558
0,48
0,49
0,5
0,51
0,52
0,53
0,54
0,55
0,56
0,57
0,61 0,62 0,63 0,64 0,65 0,66 0,67 0,68 0,69 0,7 0,71
Concentraciónde BSA( mg/ml)
Ab
sorb
anci
as (
540
nm
)
Munanta 12,4mg/ml
S.P.R 12,6 mg/ml.
MDID 14 mg/ml
Tabla 2. Concentración de proteínas de los lisados. Cepa Dilución del lisado Absorbancia
D.O (540 nm) Concentración
Munantá 1/20 0.492 12.4 mg/ml S.P.R 1/20 0.504 12.6 mg/ml MDID 1/20 0.558 14 mg/ml
6.1.1 Análisis PAGE-SDS
15 -25 µL de cada uno de los lisados fue analizado mediante PAGE-SDS al
10% según lo descrito en el Anexo 4. Tal como se muestra en la Figura 6, se
obtuvieron alrededor de 20 fracciones proteicas bien definidas situadas en un
rango de 26 a 138 Kd, en cada uno de los lisados, destacándose una banda
de alrededor de 57-58 Kd. Probablemente, esta banda coincida con la
cisteinil proteinasa, proteína abundante en la forma epismastigote del
parásito con un alto grado de inmunogenicidad. (Martínez y col., 1991).
Figura 6. PAGE-SDS al 10% de los lisados de Trypanosoma cruzi, teñidos con Azul de Coomasie. 1: 10µl del patrón (HWN Pharmacia Biotech), 2:15µl de la cepa S.P.R, 4: 25µl de la cepa de Munantá, 5: 25µl de la cepa MDID y 6: 75µl del “Pool” de las tres cepas (25µl de cada una).
Un análisis detallado de cada una de las fracciones obtenidas revela como
los lisados difieren en el número de fracciones proteicas que contienen. Es
así como en la Figura 7 se muestra un gráfico que resume el perfil proteico
de cada lisado; observándose como si bien existen fracciones compartidas
por los tres lisados (1, 3, 8, 11,12 y 13), existen otras presentes solo en
dos (2, 4, 6, 9, 10, 16, 17 y 19) o incluso solo en uno de los lisados, (5, 7, 14,
15, 18 y 20).
Figura 7. Perfil de las fracciones proteícas de los lisados de las cepas de Trypanosoma cruzi.
0
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
140.000
160.000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Fracciones Proteicas
Pe
sos
Mo
lecu
lare
s
S.P.R
MUNANTA
MDID
Un análisis porcentual de este perfil (Tabla 3) revela como por ejemplo para la cepa Munantá, el 46% de sus fracciones proteícas son comunes a las tres cepas y el 54% restantes están presentes en una cualquiera de las otras dos cepas de estudio. Para el caso de la cepa MDID, vemos como un 13.6% de las fracciones proteícas son exclusivas de esta cepa, un 46.3% son compartidas con una de las dos cepas restantes y el 40% son comunes a las tres cepas. Por su parte, la cepa S.P.R presenta el porcentaje más alto de fracciones proteícas exclusivas (33.3%) y el más bajo de fracciones compartidas con Munantá o MDID (16.6%). Tabla 3. Porcentaje de bandas comunes entre los diferentes lisados de Trypanosoma
cruzi.
CEPA (%) Compartido por
tres Cepas
(%) Compartido por
dos Cepas
(%) Correspondiente
a una Cepa
Munantá 46 54 0
MDID 40 46.3 13.6
S.P.R 50 16.6 33.3
POOL DE LAS TRES
CEPAS
30 40 30
Ahora bien, si se analiza el porcentaje de bandas comunes presentes en la
reunión de los tres lisados (“Pool”), se observa como este porcentaje cambia
a un 30% de fracciones comunes a los tres lisados, 40% comunes a
cualquiera de dos cepas y 30% específico de una cepa dada. Estos
resultados claramente indican las ventajas de utilizar más de una cepa en la
preparación de los lisados, ya que se aumenta el número de bandas
potenciales a ser reconocidas por los sueros de los pacientes.
La variación observada en las fracciones proteicas entre diferentes cepas del
parásito se explican por la naturaleza polimórfica del Trypanosoma cruzi, el
cual varía biológica, bioquímica y genéticamente entre poblaciones de
diferentes regiones geográficas. (De Lucardo y col., 1993). Recordemos
cómo en este estudio, se utilizaron cepas colombianas de distintas áreas
geográficas, huésped y ciclo de transmisión (Tabla 1).
Estudios recientes de Souto y col., 1996; Bastrenta y col., 1999 y Dos
Santos y col., 1999 indican como las poblaciones de Trypanosoma cruzi se
dividen principalmente en dos subpoblaciones: Grupo 1, correspondientes al
Zimodema ZI y Grupo 2, correspondiente al Zimodema Z2. Aún cuando las
cepas tres colombianas del Trypanosoma cruzi utilizadas en este estudio
pertenecen al Grupo 1 o Zimodema ZI, estas presentan patrones polimorfos
para algunas isoenzimas. Concretamente para las isoenzimas peptidasas I y
II (PEP I y PEP II), Glutamato deshidrogenasa (GdNad), fosfoglucomutasa
(PGM) y Glucosa fosfato isomerasa (GPI). (Tabla 4). (Rodríguez P y col.,
1998). Es decir, a pesar de pertenecer a un mismo grupo, estas cepas
difieren bioquímica y genéticamente.
Tabla 4. Análisis de los genotipos de cepas colombianas identificadas por 5
sistemas isoenzimáticos.
CEPA PEP I PEP II GDNad PGM
GPI Munantá 4/4 1/1 Ausente Ausente 4/4
MDID 2/2 Ausente 4/4 5/8 7/7
S.P.R 4/4 Ausente 2/2 5/8 7/7
• Para cada locus, el alelo 1 codifica para el electrofenotipo más rápido.
Adicionalmente, análisis del polimorfismo genético entre estas cepas usando
como marcador el gen que codifica para la histona H2A, también muestra
como dos de estas cepas difieren en su patrón de digestión con
endonucleasas, número de unidades de repetición, cromosoma portador y
niveles de expresión (Thomas M y col., 2000).
6.2 Análisis de la población de estudio
El suero de los individuos incluidos en este estudio fueron analizados
siguiendo los procedimientos éticos establecidos en materiales y métodos.
Los individuos fueron clasificados en tres grupos dependiendo de la
presencia de la infección por Trypanosoma cruzi y de la presentación de
síntomas de la enfermedad. Cada uno de los grupos fue analizado según
sexo, edad y la procedencia geográfica.
6.2.1 Donantes positivos
Este grupo se encuentra constituido por individuos infectados que no
presentan ninguna sintomatología asociada a la enfermedad de Chagas,
personas que acudieron a la Cruz Roja Colombiana, con el propósito de
donar sangre. Estas personas presentan positividad tanto en la prueba de
ELISA como de IFI. Tal como se muestra en la Figura 8 este grupo esta
conformado por un 36% de mujeres y 64% de hombres, con un rango de
edad de menores de 30 años a 60 años, procedentes la mayoría de la ciudad
de Bogotá (79%) y una minoría (7%) de áreas rurales de Cundinamarca.
Este perfil concuerda con los pacientes seropositivos encontrados en un
estudio a nivel nacional, en el cual el rango de edad de estos individuos
comprende de 21 a 52 años con una edad promedio de 33 años. (Cortés y
col., 1995).
Adicionalmente, un estudio realizado por Ja uregui (2000), con donantes de
la Clínica San Pedro Claver de la ciudad de Bogotá, incluye 35 donantes
seropositivos procedentes de Bogotá. Es decir, el criterio de exclusión de
donantes de procedencia de zonas endémicas para la enfermedad de
Chagas, no es suficiente, puesto que residentes bogotanos pueden adquirir
también el parásito durante viajes a zonas endémicas. Situación que las
personas pueden no referenciar durante su historial clínico.
A.
Sexo femenino36%
Sexo masculino64%
Sexo femenino
Sexo masculino
B.
Menores de 3014%
Edad entre 40-5021%
Edad entre 50-6029%
Edad entre 30-4036%
Menores de 30
Edad entre 30-40
Edad entre 40-50
Edad entre 50-60
Figura 8. Características de los donantes positivos de estudio. A: clasificación
según género. B: clasificación según edad. C: clasificación según lugar de
procedencia.
6.2.2 Pacientes crónicos
Corresponde a los individuos con sintomatología compatible con miocarditis
chagásica y ambas pruebas serológicas positivas para Trypanosoma cruzi,
estudiados en la Clínica Shaio de Bogotá. Como se observa en la Figura 9 el
50% de estos pacientes pertenecen al sexo masculino y el 50% al sexo
femenino; abarcando rangos de edades de 35 hasta 85 años, siendo
predominante en un 50% el rango de 55-65 años. Llamativamente, la
totalidad de este grupo incluye personas procedentes de áreas rurales de
departamentos considerados zonas endémicas para Chagas.
C.
Cundinamarca7%
Indeterminados14%
Bogotá79%
Bogotá
Cundinamarca
Indeterminados
Figura 9. Características de los pacientes crónicos. A: clasificación según el género. B:
clasificación según la edad. C: clasificación según la procedencia. 6.2.3 Donantes negativos
Conformado por individuos sanos voluntarios que acudieron a la Cruz Roja
para donar sangre. En este grupo se incluyen dos tipos de donantes: 9
A.
Sexo masculino %
50%
Sexo femenino %50%
Sexo femenino %
Sexo masculino %
B. Edad entre 75-85
5%
Edad entre 55-6550%
Edad entre 65-7511%
Edad entre 45-5517%
Edad entre 35-4517%
Edad entre 35-45
Edad entre 45-55
Edad entre 55-65
Edad entre 65-75
Edad entre 75-85
C. Arauca
5% Santander17%
Meta11%
Bolivar5%
Norte de Santander11%
Boyacá33%
Indeterminados17%
Arauca
Santander
Norte de Santander
Boyacá
Meta
Bolivar
Indeterminados
donantes cuya prueba de CHAGATEK dio negativa y por lo tanto no fueron
confirmados por IFI y 18 donantes que ante la prueba de CHAGATEK
positiva, fueron confirmados por IFI, test que proporcionó un resultado
negativo.
A semejanza del anterior grupo, hay un porcentaje mayor de hombres (55%)
que de mujeres (41%), Las edades de este grupo oscilan entre 20 años
hasta los 70 años, con un predominio de menores de 30 años (52%),
seguidos por el grupo entre 30-40 años (25%). Estas observaciones apoyan
la tendencia de asociación entre el desarrollo de sintomatología con edades
maduras mayores de 30-40 años. Hecho que se soporta en los períodos
largos de 10-40 años que comprende la fase intermedia de la enfermedad.
(Figura 10)(WHO.,1991) Finalmente, dada la localización de la Cruz Roja
Colombiana en la ciudad de Bogotá, la mayoría de donantes (92%) son
procedentes de esta ciudad.
A. Personas del sexo
Femenino41%No. Personas sexo
masculino55%
Indeterminados4%
Personas del sexoFemenino
No. Personas sexomasculino
Indeterminados
Figura 10. Características de los donantes negativos. A: clasificación según el género. B:
clasificación según la edad. C: clasificación según la procedencia.
6.3 Estandarización de la prueba de ELISA
Las condiciones de la prueba de ELISA referentes a la concentración de
antígeno, dilución de la enzima (conjugado), tiempos de incubación y el
porcentaje de la leche descremada en la solución de bloqueo; fueron
determinadas mediante múltiples ensayos de ELISA utilizando sueros
chagásicos francamente positivos y negativos. Las condiciones finalmente
establecidas se encuentran consignadas en la tabla 5.
B.
Edad entre 40-5011%
Edad entre 50-604%
Edad entre 60-704% Indeterminados
4%Edad entre 20-30
52%
Edad entre 30-4025%
Edad entre 20-30
Edad entre 30-40
Edad entre 40-50
Edad entre 50-60
Edad entre 60-70
Indeterminados
C. Indeterminados8%
Bogota92%
Bogota
Indeterminados
Tabla 5. Estandarización de la prueba de ELISA para la detección de anticuerpos anti- Ig G
humana en sueros de pacientes chagásicos.
CONCENTRACION VOLUMEN TIEMPO INCUBACION TEMPERATURA
INCUBACION
ANTIGENO TOTAL
(0.33 µµg cada lisado)
1 µµg/ pozo 100µµl 3 horas 37ºC
SOLUCION BLOQUEO
(TBS) Tween 0.1%
Leche descremada al
5%
100µµl 1 hora 37ºC
SUERO PACIENTE 1/10 100µµl 1 hora 37ºC
CONJUGADO
Anti Ig G humana
acoplada a fosfatasa
alcalina
1/30000 100µµl 1 hora 37ºC
SUSTRATO
(p-nitrofenilfosfato)
1 mg/ml 100µµl 1/2 Ambiente
A partir de un grupo de estudiantes jóvenes, de la ciudad de Bogotá, que no
hubieran vivido en zonas endémicas, o viajado a las mismas, se estableció el
punto de corte, igual al promedio de la absorbancia más dos desviaciones
estándar. Con base en este punto de corte, se seleccionaron los sueros
control positivo bajo y el control negativo, los cuales fueron incluidos por
triplicado en cada una de las microplacas.
6.4 Determinación de la reactividad de pacientes Chagásicos frente a un
“Pool” de lisados de las tres cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.
Una vez determinadas las condiciones del ensayo, se procedió a realizar el
ELISA analizado por triplicado cada una de las muestras de estudio. La
positividad de cada una de las muestras fue determinada según el índice de
reactividad (Apartado 5.3) con el fin de eliminar las variaciones de la
absorbancia entre placas. (Tablas 6,7,8)
Tabla 6. Reactividad de los donantes positivos frente a los lisados de cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.
CODIGO
ABSORBANCIA
INDICE DE REACTIVIDAD
68 0.495 9.1
69 0.427 7.9
70 0.299 5.53
72 0.013 0.24
74 0.455 8.4
75 0.363 6.7
76 0.059 1.09
78 0.474 8.7
79 0.318 5.8
80 0.393 7.2
83 0.381 7.05
84 0.516 9.5
86 0.393 7.27
120 1.54 7.58
Tabla 7. Reactividad de los pacientes crónicos frente a los lisados de cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.
CODIGO
ABSORBANCIA
INDICE DE REACTIVIDAD
30 0.594 9.9
31 0.723 12.05
32 0.447 7.45
33 0.485 8.9
35 0.498 8.3
36 0.367 6.1
37 0.707 11.78
40 0.272 4.5
41 0.645 10.7
42 0.503 8.3
43 0.596 9.9
44 0.453 7.55
45 0.733 12.2
46 0.714 11.9
48 0.518 8.6
49 0.318 5.3
50 0.592 9.8
51 0.577 9.6
Tabla 8. Reactividad de los donantes negativos frente a los lisados de cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.
CODIGO ABSORBANCIA INDICE DE REACTIVIDAD
71 0.051 0.94
73 0.438 8.1
77 0.043 0.7
81 0.41 7.5
82 0.051 0.94
85 0.039 0.72
105 0.03 0.16
109 0.21 1.03
111 1.2 5.9
113 0.06 0.3
114 0.195 0.96
115 0.07 0.37
116 0.11 0.54
117 1.36 6.69
118 0.102 0.5
119 0.17 0.83
121 0.11 0.56
123 1.305 6.42
124 0.102 0.5
129 0.125 0.61
132 0.045 0.22
135 0.021 0.1
136 0.078 0.38
138 0.033 0.16
150 0.182 0.89
143 0.12 0.54
149 0.048 0.23
6.4.1 Reactividad de los donantes positivos
Dado que la reactividad se considera positiva por encima de un índice de 1.1,
en primer lugar se determinó si el índice promedio de este grupo era mayor
1.1. Para ello, se realizó una prueba estadística de hipótesis para la media
con un α de 0.05, encontrándose que el índice promedio era mayor de 1.1
con un p= 2.4 x 10-6. Posteriormente, se determinó la distribución de los
índices de reactividad en este grupo. Tal como se muestra en la figura 11, la
mayoría de los sueros se ubicaron por encima del índice promedio de
reactividad de 6.57 (DS=2.75). Mientras que tan solo un suero se ubica en la
zona gris en el límite superior, y otro, es francamente negativo. Estos
resultados indican por una parte como 12 de los 14 pacientes (86%)
reconocen ampliamente los determinantes antígénicos de las tres cepas
colombianas utilizadas en este estudio; en tanto que un 7% (1/14) los
reconoce parcialmente y el otro 7% (10/14) restante tiene una respuesta
francamente negativa. Así mismo, la falta de reactividad de estos 2 sueros,
catalogados anteriormente por dos pruebas de principio serológico diferente
como positivos, sugiere que el reconocimiento inmune esta dado tanto por la
presencia de determinantes antigénicos en los lisados de parásitos [los
cuales difieren dependiendo de la cepa y del procedimiento de lisis
empleados (Mendes y col., 1997) ] como por un backgrouwnd genético
apropiado del individuo que le permita responder a los mismos.
Figura 11. Indice de reactividad de los donantes positivos.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Pacientes
Ind
ice
de
Rea
ctiv
idad
X = 6,57 DS= 2,75Reactivo IR >= 1,1Zona Gris IR (0.90 - 1.1)
6.4.2 Reactividad de los pacientes crónicos En cuanto a la reactividad del grupo II se encontró como todos los pacientes
presentaban índices de reactividad mayor a 1.1 con un p=2.108 x 10-11,con
un promedio de índice de reactividad de 9.046 (DS 2.29). Indicando estos
resultados la alta reactividad de estos sueros frente al antígeno,
localizándose la respuesta dentro de un rango inferior de 5.3 de índice de
reactividad hasta uno superior de 12.2 reactividad. (Figura 12).
Figura 12. Índice de reactividad de los pacientes crónicos.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Pacientes
Ind
ice
de
Rea
ctiv
idad
X=9.046 DS 2.29Reactivo IR >= 1,1Zona Gris IR (0.9 - 1.1)No Reactivo IR < 0,9
Adicionalmente, es importante destacar como el 100% de estos pacientes
(18/18) coinciden en su respuesta de carácter positivo con las pruebas de
EIA e IFI, anteriormente empleadas. Estos resultados concuerdan con lo
reportado por Salles y col., 1996, quienes encontraron que pruebas
serológicas de principios diferentes, muestran concordancia en poblaciones
con elevados niveles de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.
6.4.3 Reactividad de los donantes negativos
El análisis de la reactividad de los donantes negativos muestra como el
promedio del índice de reactividad se localiza en 1.73 (DS 2.56) es decir es
mayor a 1.1, lo cual sugiere que no todos los pacientes son negativos; tal
como lo demuestra la distribución del índice de reactividad de estos
pacientes (Figura 13), donde el 66.7% de estos pacientes (18/27) son
francamente negativos, el 14.8% (4/27) se ubica en la zona gris y el 18.5%
restante (5/27), son francamente positivos.
Figura 13. Indice de los donantes negativos.
0,1
1,1
2,1
3,1
4,1
5,1
6,1
7,1
8,1
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
Pacientes
Ind
ice
de
Rea
ctiv
idad
X=1.73 DS= 2.56No Reactivo IR < 0,9Zona Gris IR (0.90 - 1.1)
Cuando se analiza la respuesta entre los pacientes negativos a una sola
prueba (CHAGATEK negativos) y los dudosos (CHAGATEK positivos e IFI
negativo) se encuentra que de los nueve pacientes negativos por
CHAGATEK solo uno presentó una alta reactividad frente a los lisados de las
tres cepas colombianas (Tabla 9). Mientras que de los 18 pacientes que
presentaron CHAGATEK positivo e IFI negativo, cuatro individuos presentan
índices altos de reactividad frente a las cepas colombianas y tres se sitúan
en la zona gris de reactividad. (Tabla 10). Estos resultados son muy
llamativos, no solo a la luz de la discrepancia entre las diferentes técnicas,
sino también en la conducta a seguir en banco de sangre; aspectos que
serán discutidos más adelante.
Tabla 9. Reactividad de los donantes negativos con una prueba serológica frente a
los lisados de cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.
CODIGO ABSORBANCIA
INDICE DE
REACTIVIDAD
85 0.039 0.72
123 1.305 6.42*
132 0.045 0.22
135 0.021 0.1
136 0.078 0.38
138 0.033 0.16
150 0.182 0.89
143 0.12 0.54
149 0.048 0.23
Tabla 10. Reactividad de los donantes negativos, positivos frente a los lisados de
cepas colombianas de Trypanosoma cruzi.
CODI
GO
ABSORBANCIA INDICE DE REACTIVIDAD
71 0.051 0.94*
73 0.438 8.1*
77 0.043 0.7
81 0.41 7.5*
82 0.051 0.94*
124 0.102 0.5
121 0.11 0.56
119 0.17 0.83
118 0.102 0.5
117 1.36 6.69*
116 0.11 0.54
115 0.07 0.37
111 1.2 5.9*
109 0.21 1.03*
113 0.06 0.3
114 0.195 0.96*
105 0.03 0.16
129 0.125 0.61
6.4.4 Comparación de la reactividad frente a lisados de cepas
colombianas de Trypanosoma cruzi entre los diferentes grupos de
estudio
El siguiente aspecto a analizar según los objetivos planteados fue el análisis
de la diferencia de medias entre grupos con un α 0.05, mediante la prueba
de hipótesis estadística. No obstante, antes de realizar este estudio, se
decidió en acuerdo a la norma establecida por la OMS (Organización
Mundial de la Salud) redefinir los pacientes donantes negativos. La OMS
establece que para un paciente sospechoso de estar en la fase latente o
crónica de la infección, sea considerado positivo para la infección de
Trypanosoma cruzi se requieren dos pruebas serológicas de principios
diferentes positivas. Si bien estos requisitos eran cumplidos a cabalidad por
el grupo I (donantes positivos asintomáticos) y el grupo II (pacientes
chagásicos crónicos), el grupo de donantes negativos tenía: 1). Una sola
prueba negativa (CHAGATEK) o, 2). Una prueba positiva (CHAGATEK) y
otra negativa (IFI). Para el primer caso la OMS recomienda realizar una
segunda prueba serológica. Para el segundo caso, la OMS recomienda
realizar una tercera prueba, la cual en caso de ser positiva confirma la
presencia de la infección y en caso de resultar negativa, dicha muestra se
considera negativa.
De manera que teniendo en cuenta lo anterior, se asignó la prueba de ELISA
realizada en este estudio como la prueba serológica adicional, que si bien
tiene el mismo principio de ELISA de CHAGATEK, difiere de este, en el
número y procedencia del antígeno, así como también en el procedimiento
en general. De acuerdo a los resultados del ELISA los sueros negativos ante
dos pruebas (Tabla 11) conformaron el nuevo grupo III. Mientras que los
sueros positivos ante dos pruebas fueron reconsiderados en el grupo I de
pacientes asintomáticos. (Tabla 12)
Es así como en las figuras 14 y 15 se muestran las distribuciones de los
índices de reactividad de los nuevos grupos I y III. Cuando se compara la
reactividad frente a los lisados del parásito entre los diferentes grupos
redefinidos, se observa como en primer lugar existen diferencias
estadísticamente significativas entre pacientes infectados (Grupo I y Grupo II)
y los no infectados (Grupo III) con un p< 0.05. Es decir que esta prueba de
ELISA sirve para diferenciar entre pacientes infectados y no infectados.
Así mismo, si se compara el grupo I con el grupo III se observan diferencias
estadísticamente significativas (p=1.912 x 10-12), que indican que esta prueba
permite diferenciar entre pacientes infectados asintomáticos y no infectados.
Tabla 11. Listado de sueros de donantes negativos en dos pruebas serológicas.
(Grupo III)
CODIGO ELISA (CHAGATEK) ELISA
(Indice de Reactividad)
85 No reactivo 0.72
124 Reactivo 0.5
121 Reactivo 0.56
119 Reactivo 0.83
118 Reactivo 0.5
116 Reactivo 0.54
115 Reactivo 0.37
113 Reactivo 0.3
132 No reactivo 0.22
135 No reactivo 0.1
136 No reactivo 0.38
138 No reactivo 0.16
150 No reactivo 0.89
143 No reactivo 0.54
149 No reactivo 0.23
77 Reactivo 0.7
105 Reactivo 0.162
129 Reactivo 0.61
Tabla 12. Listado de sueros donantes positivos con dos pruebas serológicas
positivas (Grupo I).
CODIGO ELISA (CHAGATEK) IFI ELISA
(Indice de Reactividad)
68 Reactivo Reactivo 9.1
69 Reactivo Reactivo 7.9
70 Reactivo Reactivo 5.53
72 Reactivo Reactivo 0.24
74 Reactivo Reactivo 8.4
75 Reactivo Reactivo 6.7
76 Reactivo Reactivo 1.09
78 Reactivo Reactivo 8.7
79 Reactivo Reactivo 5.8
80 Reactivo Reactivo 7.2
83 Reactivo Reactivo 7.5
84 Reactivo reactivo 9.5
86 Reactivo Reactivo 7.27
120 Reactivo Reactivo 7.58
73 Reactivo No reactivo 8.1
81 Reactivo No reactivo 7.5
117 Reactivo No reactivo 6.69
111 Reactivo No reactivo 5.9
Figura 14. Distribución de los indices de reactividad en los pacientes asintomáticos
del grupo I
0 ,11 ,12 ,13 ,14 ,15 ,16 ,17 ,18 ,19 ,1
1 3 5 7 9
11
13
15
17
Pac ientes
Ind
ice
de
Rea
ctiv
idad
Reactivo IR >= 1,1Zona Gris IR 0.99 - 1.1X=6,68 DS=2,45
Figura 15. Distribución de los indices de reactividad en los pacientes negativos
grupo III
Igualmente, cuando se compara la respuesta de los pacientes crónicos, con
la del grupo III, también se observan diferencias estadísticamente
significativas con un p< 0.05. Es decir que esta prueba discrimina pacientes
infectados sintomáticos de pacientes no infectados.
Finalmente, cuando se comparan los grupos I y II se observa como estos
grupos se diferencian estadísticamente con un p=0.0051. Es decir esta
prueba también discrimina entre pacientes infectados asintomáticos e
infectados sintomáticos.
0,1
0 ,2
0 ,3
0 ,4
0 ,50 ,6
0 ,7
0 ,8
0 ,91
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8
P a c i e n t e s
Ind
ice
de
Rea
ctiv
idad
N o R e a c t i v o I R < = 0 . 9 0Z o n a G r i s I R 0 . 9 0 - 1 . 1X = 0 , 4 6 2 D S = 0 , 2 3 7
Los resultados anteriores indican como la respuesta inmune humoral de los
pacientes colombianos varían según el estadio de la enfermedad en que se
encuentre el paciente; hecho demostrado en diferentes estudios en pacientes
de otros países Latinoamericanos (Levin y col., 1989; Avila y col., 1993;
Lorca y col., 1992; Krautz y col., 1995). Por lo tanto, la existencia de
determinantes antígenicos específicamente reconocidos según el estadío de
la enfermedad del paciente, pueden constituir marcadores potenciales de
transición de un estadío a otro de la enfermedad en pacientes colombianos.
6.4.5 Comparación de las pruebas de CHAGATEK, IFI, y ELISA.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se decidió comparar la prueba
de ELISA desarrollada en este estudio con las pruebas CHAGATEK e IFI en
primer lugar en cuanto a sensibilidad y especificidad, y en segundo lugar
determinando la correlación entre estos métodos.
6.4.5.1 Determinación de la sensibilidad y especificidad de la prueba
de ELISA usando cepas colombianas
Para realizar estos estudios se tuvieron en cuenta los sueros de los
pacientes de los grupos I y III. El grupo II se descartó por cuanto no tenía la
prueba de CHAGATEK. Así mismo, en las determinaciones de sensibilidad y
especificidad se consideraron la prueba CHAGATEK e IFI como patrones de
oro. No obstante hay que aclarar que dado que a los pacientes no reactivos
por CHAGATEK no se les realizó IFI, cada prueba (IFI o CHAGATEK) fue
considerada como patrón de oro por separado. (Tabla 13)
Es así como de 32 muestras analizadas por IFI, 14 fueron positivas y 18
negativas. De estas muestras, 16 dieron positivas por ELISA y 16 negativas
(Tabla 14); para una sensibilidad de 85% y especificidad de 77% (Ver en el
anexo 6 las fórmulas pertinentes).
Tabla 13. Sueros incluidos en la comparación de ELISA, CHAGATEK e IFI.
CODIGO CHAGATEK IFI ELISA (Indice de Reactividad)
68 Reactivo Reactivo 9.1 69 Reactivo Reactivo 7.9 70 Reactivo Reactivo 5.53 72 Reactivo Reactivo 0.24* 74 Reactivo Reactivo 8.4 75 Reactivo Reactivo 6.7 76 Reactivo Reactivo 1.09* 78 Reactivo Reactivo 8.7 79 Reactivo Reactivo 5.8 80 Reactivo Reactivo 7.2 83 Reactivo Reactivo 7.05 84 Reactivo Reactivo 9.5 86 Reactivo Reactivo 7.27 120 Reactivo Reactivo 7.58 71 Reactivo No reactivo 0.94* 73 Reactivo No reactivo 8.1 77 Reactivo No reactivo 0.7 81 Reactivo No reactivo 7.5 82 Reactivo No reactivo 0.94* 85 No reactivo N.D 0.72 123 No reactivo N.D 6.42 124 Reactivo No reactivo 0.5 121 Reactivo No reactivo 0.56 119 Reactivo No reactivo 0.83 118 Reactivo No reactivo 0.5 117 Reactivo No reactivo 6.69 116 Reactivo No reactivo 0.54 115 Reactivo No reactivo 0.37 111 Reactivo No reactivo 5.9
109 Reactivo No reactivo 1.03* 113 Reactivo No reactivo 0.3 114 Reactivo No reactivo 0.96* 105 Reactivo No reactivo 0.162 132 No reactivo N.D 0.22 135 No reactivo N.D 0.1 136 No reactivo N.D 0.38 138 No reactivo N.D 0.16 129 Reactivo No reactivo 0.61 150 No reactivo N.D 0.89 143 No reactivo N.D 0.54 149 No reactivo N.D 0.23
N.D = prueba no realizada. * = Los sueros en zona gris fueron considerados negativos.
Tabla 14. Correlación IFI vs. ELISA
Positivos Negativos Total
ELISA 16 16 32 IFI 14 18 32
Por su parte, de las 41 muestras analizadas por CHAGATEK, 32 fueron
positivas y 9 negativas. De estas, mediante la técnica de ELISA 17 dieron
positivas y 24 dieron negativas (Tabla 15), para una sensibilidad de 50% y
especificidad de 88.9%.
Tabla 15. Correlación CHA GATEK vs. ELISA
Positivos Negativos Total ELISA 17 24 41
CHAGATEK 32 9 41
6.4.5.2 Correlación de las pruebas ELISA, CHAGATEK e IFI
La correlación entre el ELISA desarrollado en este trabajo, e IFI y entre la
prueba de ELISA y CHAGATEK fue determinada a través del índice Kappa
de concordancia (Anexo 6), teniendo en cuenta los sueros listados en la tabla
13. Obteniéndose un índice Kappa de 0.62 entre el ELISA y el IFI; el cual
según la clasificación del índice de concordancia Kappa es bueno (Anexo 6).
Por su parte, se obtuvo un índice Kappa de 0.243 entre CHAGATEK y el
ELISA, índice catalogado como regular.(Anexo 6).
Los resultados anteriores demuestran como en primer lugar de acuerdo a lo
reportado por Salles y col., 1996, las pruebas serológicas para Chagas en
general presentan poca concordancia entre sí, reportándose diferentes
grados de sensibilidad y especificidad. Sobre todo si se aplican a
poblaciones con bajos niveles de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi,
como es el caso de los donantes de este estudio, procedentes en su mayoría
de la ciudad de Bogotá, área no endémica para la enfermedad de Chagas.
En segundo lugar vemos como a pesar de tener el CHAGATEK y el ELISA
desarrollado en este trabajo, el mismo principio serológico, estas técnicas
difieren ampliamente, en sensibilidad y especificidad y además presentan un
índice Kappa regular de correlación (0.243).
La discrepancia entre nuestros resultados y los arrojados por la prueba
CHAGATEK puede ser debida a algunos de los siguientes hechos o a una
combinación de los mismos: (1) La procedencia geográfica de las cepas.
Mientras CHAGATEK utiliza cepas argentinas, en nuestro caso se utilizaron
cepas colombianas caracterizadas por el desarrollo de afecciones cardiacas
y menor virulencia. En contraste, las cepas del cono sur se caracterizan por
desarrollar megasíndromes intestinales y presentar mayor virulencia.
Además, mientras en Colombia la mayoría de las cepas estudiadas
pertenecen al Zimodema ZI (Saravia y col., 1987; Márquez y col., 1998; Ruíz
G. y col., 2000) en Argentina, se ha detectado la ocurrencia de 12
zimodemas diferentes, ninguno de los cuales corresponde a los tres
Zimodemas (ZI,ZII,ZIII), clásicamente descritos por Miles y col., 1980. (2) El
número, ciclo de transmisión y huésped de las cepas usadas como antígeno.
En nuestro ensayo se usaron tres cepas que difieren en su ciclo, huésped y
región geográfica de procedencia. Aún cuando en CHAGATEK no es posible
conocer las características de la cepa empleada tales como: número de
cepas, grupos o zimodemas, procedencia y estadio de desarrollo; difícilmente
se podría pensar en un mismo número de cepas de iguales características.
Por lo tanto hay que tener en cuenta los estudios de Souto y col., 1996,
quienes sugieren asociación entre el grupo 1 y el ciclo silvestre de
transmisión de la infección; mientras el grupo 2, se asocia al ciclo doméstico
de transmisión. Adicionalmente, Fernández y col., 1999 han encontrado
como ambos grupos del parásito tienen preferencias por huéspedes
específicos. (3) Estadio del parásito utilizado como antígeno. En nuestro
ensayo se utilizaron formas epimastigotas procedentes de cultivo in vitro. Es
bien conocido como el parásito exhibe antígenos estadío-específicos,
muchos de los cuales han sido reconocidos como participantes en los
mecanismos la infección y respuesta del sistema inmune. (4) La preparación
del antígeno. Estudios realizados por Mendes y col., 1997, indican como el
proceso de obtención de extractos solubles del parásito, así como las
condiciones de centrifugación, afectan profundamente el perfil de antígenos
y/o epítopes reconocidos por los sueros.
Por otra parte hay que destacar que si bien la prueba de ELISA en relación a
CHAGATEK presentó una sensibilidad de tan solo el 50% su especificidad
fue del 88.9%. Lo anterior, analizado dentro del contexto de que CHAGATEK
es una prueba usada en banco de sangre para el “screening” inicial de
sueros positivos, que arroja de falsos positivos, sugiere que el ELISA
desarrollado en este trabajo arroja menos falsos positivos y por lo tanto si se
aplicara a banco de sangre se desecharían menos unidades de sangre por
razones de falsos positivos; debido quizá mayoritariamente al uso de cepas
colombianas como antígeno.
Por su parte, la correlación del índice Kappa entre las pruebas de IFI y ELISA
fue mayor, debido probablemente al uso de cepas colombianas en ambos
tipos de pruebas. Resultados similares fueron obtenidos por Bucio y col.,
1999, quienes obtuvieron una mayor reactividad anti- T. cruzi en pacientes
Mexicanos al usar cepas mexicanas que Argentinas.
Por otra parte, las discrepancias entre IFI y ELISA pueden estar dadas por
las diferencias en el numero de cepas, grupo o zimodema de las mismas,
procedencia geográfica, ciclo de transmisión, huésped de origen, en la
preparación del antígeno y la técnica empleada.
Por otra parte, es importante destacar como al seguir las recomendaciones
de la OMS y redefinir el grupo III, cuatro de los pacientes catalogados como
negativos resultaron positivos. Este hecho es muy importante ya que si bien
la existencia de falsos positivos tiene como consecuencia el desecho
innecesario de unidades de sangre, los falsos negativos implican posibilidad
de transmisión de la enfermedad de Chagas al usar productos de bolsas
contaminadas.
7. CONCLUSIONES
En cuanto a los objetivos planteados en este estudió, se concluye
principalmente que la respuesta inmune humoral de los pacientes
colombianos es dependiente del estadío de la enfermedad, y por lo tanto
deben existir moléculas marcadoras de cada uno de los diferentes estadíos
que permitan monitorear la transición de la fase latente a crónica.
En segundo lugar, en cuanto a la técnica desarrollada en este estudio, se
pueden concluir los siguientes aspectos:
• El uso de más de una cepa con diferentes características amplía, al
menos en teoría la posibilidad de detectar más determinantes antigénicos
del parásito.
• El uso de cepas colombianas del parásito como antígeno, aumenta la
especificidad de la prueba, tal como lo indica la buena correlación
obtenida entre el IFI y la prueba de ELISA desarrollada en este estudio.
• Debido a lo anterior en banco de sangre se debe utilizar una prueba inicial
de “screening” que incluya cepas colombianas como antígeno.
• Igualmente, en banco de sangre ante dos pruebas serológicas con
resultados diferentes, se debe realizar una tercera prueba que defina la
positividad o negatividad del donante ante la infección por el parásito.
8. RECOMENDACIONES
En primer lugar se recomienda continuar con el estudio para localizar ya de
manera específica las moléculas marcadoras de cada estadío de la
enfermedad de Chagas, mediante ensayos de “Western blot”.
En cuanto a la prueba de ELISA se recomienda investigar el uso también de
las formas amastigotes y tripomastigotes de cepas colombianas del parásito
como antígeno. Así como también difundir los resultados obtenidos a las
autoridades pertinentes para tomar las medidas adecuadas.
9. ANEXOS
Anexo 1. Formato de consentimiento Fecha: Yo_________________________________________________________ Con cédula de ciudadanía No._______________de__________________ después de haberse sido debidamente informado sobre la naturaleza del proyecto de investigación titulado “Respuesta inmune humoral de pacientes chagásicos frente a lisados de Trypanosoma cruzi” y sus riesgos potenciales, acepto voluntariamente participar en el, y no demandare de los responsables del mismo una compensación diferente a la de ser informado de los resultados de los exámenes que me sean practicados. Entiendo que mi participación en este estudio y sus hallazgos pueden resultar en una importante contribución al avance del conocimiento sobre la enfermedad de Chagas. Así mismo declaro que mi participación consiste en la donación de una muestra de sangre. Soy libre de retirarme del estudio una vez haya comenzado, si no deseo continuar participando en el. Firmas: _______________ ________________
Paciente Testigo
C .C C.C _____________________
Investigador C.C
Anexo. 2 Medio REI modificado modificado al 2% con suero fetal bovino (SFB). Para preparar 3 litros. g/l BHI 30 NaCl 24 KCl 1.2 MgSO47H2O 0.6 KH2PO412H2O 0.18 CaCl 0.21 Glucosa 6.0 NaHCO3 3.0 El pH se ajusta a 7.2 y se esteriliza por filtración de 0.22 µm. El control de esterilidad se realiza dejando el medio BHI a 37ºC durante 72h. Agregar suero fetal bovino a 56ºC durante 30 minutos, realizar pruebas de esterilidad.
Anexo 3. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford. 1. Adicionar a cada pozo 200 µµl de Bradford diluido e el momento de
usar (1 ml de Bradford y 4 ml de agua destilada) y 5 µµl de la muestra a la dilución indicada.
2. Usar 5µµl de agua para el blanco. 3. Mezclar e incubar por 5 minutos. 4. Leer a 540 nm, realizando cada muestra por triplicado. • Reactivo de Bradford (Bio –Rad).
Anexo 4. Electroforesis vertical de proteínas en geles de acrilamida Reactivos Solución A: mezcla acrilamida/ bisacrilamida 30: 1 (p/v) Acrilamida: 29.2 g. Bisacrilamida: 0.96 g. Agua destilada: 100 ml. Almacenar a 4º C en frasco ámbar. Solución B: Buffer Tris 1,5 M pH: 8.8 Tris base 27.33 g. Agua destilada 80 ml. Ajustar el pH con HCl 1N, completar a 150 ml con agua destilada. Almacenar a 4º C en frasco ámbar. Solución C: Mezcla acrilamida/ Bisacrilamida 30:1.6 Acrilamida 30 g. Bisacrilamida 1.6 g. Agua destilada: 100ml Almacenar en frasco ámbar a 4ºC. Solución D: Buffer Tris 0.5M pH 6.8 Tris Base 6 g. Agua destilada: 60 ml. Ajustar el pH 6.8 con HCl 1N, completar la solución a la 100 ml. Almacenar a 4ºC en frasco ámbar. PSA 10% (Preparar al momento de usar) Persulfato de amonio (PSA): 0.1 g. Agua destilada: 1,0 ml.
Buffer muestra 15% de β-mercaptoetanol 15% SDS 1.5% azul de bromofenol 50% glicerol Se completa a 100% de agua destilada. Buffer de corrido-solución stock 5x pH 8.3 300ml 600ml Tris base 4.5 g 9.0 g. Glicina 21.6 g 43.2 g SDS 1.5 g 3 g Agua destilada 300ml 600ml. Diluir 60 ml de solución Stock 5x en 240 ml de agua destilada para una corrida. Almacenar en frasco ámbar. Calentar a 37ºC después de usar, si hay precipitación. 1. Preparación del gel separador o de corrido
8% 10% 15% Agua destilada: 2.235 ml 2.0 ml 1.05 ml Solución A: 1.36 ml 1.7 ml 2.55 ml Solución B: 1.3 ml 1.3 ml 1.3 ml SDS 10%: 50 µl 50 µl 50 µl PSA 10%: 50 µl 50 µl 50 µl Temed: 5 µl 5 µl 5 µl Volumen Total: 5 ml 5 ml 5 ml
Aplicar 3 a 5 ml de solución entre los cristales, adicionar unos mililitros de agua destilada y dejar polimerizar de 30 a 45 minutos. 2. Preparación del gel concentrador a 4% Agua destilada 1.4 ml Solución C: 0.33 ml Solución D: 0.25 ml SDS: 20 µl PSA: 30 µl Temed: 3 µl Volumen Total: 2 ml Remover el agua y adicionar la solución del gel concentrador, colocar el peine que forma los pozos de siembra y dejar gelificar de 30 a 45 minutos. 3. Preparación de las muestras: Hacer las diluciones necesarias de las muestras y de los patrones de peso molecular. Calentar las muestras en baño María durante 5 minutos. Sembrar 20 µl del patrón de peso molecular, sembrar 25 µl de cada una de las muestras (máximo 30µl por pozo para la microcámara). 4. Condiciones de corrido: El corrido electroforetico debe hacerse a 150 voltios, 50 milámperios y 200 walts durante una hora.
ANEXO 5. COLORACIÓN AZUL DE COOMASIE Azul de Coomasie 0.25% Acído Acético 10% Metanol 30% Mezclar y filtrar antes de usar. Coloración 10 minutos Decolorante de Coomasie Acído acetico 10% Metanol 30% Agua destilada 65% Procedimiento: Se deja el gel con el decolorante hasta que aparezcan las bandas de la intensidad deseada y el transfondo sea lo más claro posible, para obtener un mejor contraste.
Anexo. 6 Tabla de Dos por Dos, correlacionado ELISA e IFI
ELISA Positivos Negativos Total
Positivos 12 2 14
Negativos 5 13 18
IFI
Total 17 15 32
Anexo. 7
Tabla de Dos por Dos, correlacionando ELISA y CHAGATEK
ELISA
Positivos Negativos Total
Positivos 17 15 32
Negativos 1 8 9
CHAGATEK
Total 18 23 41
ANEXO 8. Cálculo de la sensibilidad (S) Positivos verdaderos
S= ----------------------------------------------------------------
Positivos verdaderos + Negativos falsos
Calculo de la especificidad (E) Negativas verdaderas
E= -------------------------------------------------------------
Negativas verdaderas + Falsos positivos
Calculo del índice Kappa
po: índices de concordancia observados. pe: índice de concordancia esperados.
po - pe
K= -----------------
1-pe a+d po = --------------- n
[ (a+b) x (a+c) ] Concordancia de casos positivos (P)= ---------- ----------- n n
Clasificación del índice de concordancia de Kappa Concordancia Kappa 1. Deficiente <0.20 2. Regular 0.21 - 0.40 3. Moderada 0.41 - 0.60 4. Buena 0.61 - 0.80 5. Muy buena 0.81 - 1.00
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