Resumen Prcticas 5-9 Bacteriologa.

IMPORTANCIA DE LAS CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LAS BACTERIAS.-

Identificar el agente causal en el menor tiempo posible.Dar un diagnstico presuntivo y corroborarlo con resultados de pruebas de laboratorio.Con informacin de laboratorio, historia clnica, y exploracin fsica puede orientar al mdico del tipo de tratamiento antimicrobiano.MORFOLOGA MACROSCPICA.-

La identificacin preliminar de las bacterias se basa en las siguientes caractersticas:

TAMAO: Dimetro de las colonias en mm.

FORMA: circular, puntiforme, filamentosa, irregular, rizoide y fusiforme.ELEVACIN: colonias planas, elevadas, convexas, monticularesMARGEN (BORDE DE LA COLONIA): entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso o rizado.COLOR DE LA COLONIA: blanco, amarillo, negro, ante, naranja...etc.SUPERFICIE (LUZ REFLEJADA): brillante o mate.DENSIDAD (LUZ TRANSMITIDA): opaca, translcida, transparente.CONSISTENCIA DE LA COLONIA: viscosa, membranosa, quebradiza.REACCIONES EN MEDIOS DE AGAR UTILES EN LA IDENTIFICACION DE BACTERIAS:Hemlisis En Agar Sangre: Alfa: Aclaramiento parcial de la sangre alrededor de las colonias, (coloracin verde).Beta: zona de aclaramiento completa de la sangre alrededor de las colonias debido a la lisis de los eritrocitos.Gamma: No hay cambio en el medio que rodea a las colonias, no hay lisis de eritrocitos.Produccin de pigmentos:

Hidrosolubles: Que colorean el medio. Piocianinas: Pigmento antibitico azul verdoso producido por Pseudomonas aeruginosa. Fluorocrmicos: (fluorescencia) No difusibles: Confinados a la colonia.Cambios en medios diferenciales (Viraje color olor):A los medios de cultivo se adicionan diversos colorantes e indicadores de pH. Estos actan como indicadores de actividades enzimticas. Ej. Olor a zumo de uvas (Pseudomonas spp), chocolate quemado (Proteus spp), humedad (Streptomyces spp), ftido (Clostridium spp).IDENTIFICACIN DE LA FORMA Y AGRUPAMIENTO DE LAS BACTERIAS (TINCIN DE GRAM):

Las caractersticas de la pared celular esta estrechamente relacionada con la forma que van a asumir las bacterias.

Formas morfolgicas bsicas: Cocos y Bacilos

Modificaciones a la forma bsica: Cocobacilos, bacilos curvos, bacilos fusiformes, bacilos helicoidales

Agrupaciones:Diplococos: Neisseria meningitidis Ttradas: Aerococcus viridans Sarcinas: Sarcina spp Cadenas: Streptococcus pneumoniae, S. pyogenesEstreptobacilos: Bacillus anthracis En Racimos: Staphylococcus aureus Forma de letras chinas: Corynebacterium diphteriae

TCNICAS DE TINCIN PARA DEMOSTRAR OTRASCARACTERSTICAS O ESTRUCTURAS ESPECFICAS.

Para identificar correctamente las bacterias, no slo por su forma y agrupamiento, es necesario utilizar tinciones como:Cpsula: Tincin de Gin Tincin de Anthony : Haemophylus influenzae Esporas: Tincin de Shaeffer y Fulton : Clostridium tetani Grnulos metacromticos (Acumulaciones de fosfasto) : Tincin de Albert: Corynebacterium diphteriae

Flagelos: Tincin de Leifson: Proteus mirabilis Afinidad a colorantes: Tincin de Gram, Tincin Ziehl Neelsen Tinciones argnticas: Tinciones con plataProcedimientos especiales: Microscopio de campo oscuro: Treponema pallidum.

COLORANTES:Los colorantes permiten una definicin ms precisa de la forma, el agrupamiento y la afinidad de las bacterias a ellos.cidos: Tien los componentes celulares bsicos, como citoplasma y pared celular . Ej. Fuscina cida, eosina, eritrosina. Bsicos: Tien componentes celulares como ncleo. Ej. cristal violeta, azul de metileno, fuscina bsica, safranina, hematoxilina.TINCION: Las tcnicas de coloracin se dividen en 2 grupos:Tcnicas de coloracin simple o directa: Utilizan un solo colorante: azul de metileno y safranina. Tcnicas de coloracin compuesta o diferencial: Utilizan 2 o ms colorantes: Gram y Ziehl - Neelsen. TINCIN DE GRAM:

Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1844. Se utiliza para poder referirse a la morfologa celular bacteriana Para realizar una primera aproximacin a la diferenciacin entre bacterias Gram + y Gram - .CARACTERISTICAS DE GRAM POSITIVASGran cantidad de murena Gran cantidad de peptidoglicanos Poca cantidad de protenasPresentan cidos teicoicos Se tien de azul / purpuraCARACTERISTICAS DE GRAM NEGATIVAS

Poca cantidad de murena Poca cantidad de peptidoglicanos Gran cantidad de protenasNo presentan cidos teicoicos No fijan mordenteAbsorben el coloranteSe tien de rosa / rojo.Fundamento de la Tincin de Gram Las Gram negativas son solubles en solventes orgnicos, (alcohol/acetona)

La capa de peptidoglicanos que poseen es demasiado delgada para retener el cristal violeta/yodo. Por lo tanto este complejo se escapa, perdiendo la coloracin azul-violcea y se observan de color rojo o rosa. Las Gram positivas, poseen una pared celular ms resistente,

con mayor proporcin de peptidoglicanos.

No son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.METODOLOGA TINCIN DE GRAM:

Toma de muestra

Preparacin del Frotis

Fijacin al calor

Primera coloracin con cristal violeta

1er enjuague con agua de la llave

Agregar el mordente (Lugol) que es un fijador de colorante.

lavar con agua de la llave

Decolorar con alcohol acetona

Lavar con agua de la llave

Agregar 2 colorante de contraste safranina

Lavar con agua de la llave

Dejar secar a temperatura ambiente

Observar al microscopio a 10x, 40x y 100x.

PRUEBAS BIOQUMICAS: TSI, LIA, MIO, CITRATO DE SIMMONS:TSI: Triple azcar hierro

Determina la fermentacin de carbohidratos

Produccin o no de gases

Produccin de cido sulfhdrico H2S. Interpretacin:

FERMENTACIN DE GLUCOSA: fondo del tubo el medio cambia a amarillo FERMENTACIN DE LACTOSA: La superficie del tubo el medio cambia a amarillo FERMENTACIN DE SACAROSA: Todo el tubo cambia a amarillo PRODUCCIN DE GAS: burbujas en el medio y/o el medio se desplaza hacia arriba. PRODUCCIN DE ACIDOSULFRICO: Precipitado negro en el fondo del tubo. MEDIO SIN ACTIVIDAD METABOLICA: Rojo naranja LIA: Agar hierro lisina Determina la Descarboxilacin y Desaminacin de la lisina, as como la Produccin de SH2.

Interpretacin:

Fermentacin de la glucosa : el medio se torna amarillo. Descarboxilacin de la lisina: + el medio se torna color prpura, - el medio permanece amarillo. Desaminacin de la lisina: la superficie del medio se torna rojo/naranja . No degradacin base del tubo amarillo plido. Produccin de HS2 precipitado negro en la base del agar del tubo.MIO: Movilidad Indol Ornitina:

Movilidad: Determina movilidad de un microorganismo. Interpretacin: Turbidez en el medio fuera del rea de inoculacin.Indol: Se detecta a partir del triptfano. Se manifiesta cuando se adiciona reactivo de Kovac o reactivo de Ehrlich..Interpretacin: Indol + Formacin de anillo rojoIndol - Formacin de anillo amarilloOrnitina: Determina la descarboxilacin de la ornitina.

Interpretacin:Descarboxilacin: medio color lila o violetaNO Descarboxilacin: el medio vira a amarilloCITRATO DE SIMMONS: Determina la capacidad de la bacteria a utilizar el citrato como nica fuente de carbono para la obtencin de energa, provocando una alcalinizacin del medio.Interpretacion: citrato + el medio se torna azul

citrato - el medio se mantiene de color verde

Otras PRUEBAS BIOQUIMICAS Prueba de la Bacitracina y Optoquina Prueba de la Coagulasa Prueba de CAMP Prueba de PYR (Pirrolidonilarilamidasa) Prueba de Coaglutinacin Prueba de la Oxidasa Prueba de la CatalasaSEROLOGIA ELISA CoaglutinacinPRUEBA DE LA BACITRACINAPrueba rpida de identificacin presuntiva de Streptoccoccus beta-hemoltico grupos A y B.Fundamento: Con las colonias aisladas en el primocultivo se efectan estras superpuestas en tres sentidos, cubriendo una superficie aproximada de un cuarto de una placa de agar sangre. En el centro de esta superficie se coloca un disco de 0,04 U de bacitracina y uno de optoquina .Se deja incubar 18-24 horas a 35C y se observa la formacin o no de un halo de inhibicin alrededor del disco. Interpretacin:

Prueba positiva: Produccin de un halo de inhibicin de > 10 mmde dimetro alrededor de cualquier disco. Prueba negativa: ausencia de halo de inhibicin.PRUEBA DE CAMP Prueba de identificacin presuntiva de Streptoccoccus beta

hemoltico grupo B.Fundamento:

La actividad hemoltica de la -hemolisina producida por la > decepas de Staphylococcus aureus es intensificada por un pptido

(protena extracelular) de Streptococcus del grupo B., conocido

como Factor Camp. La interaccin de la -hemolisina con este

factor produce una hemlisis sinrgica. Este fenmeno se

observa tanto en los aislamientos hemolticos como en los no

hemolticos.

Procedimiento:Hacer en el centro de la placa de agar sangre una nica estra

en lnea recta que contenga Staphylococcus aureus productor

de -hemolisina. Realizar una estra de los estreptococos beta

hemolticos a identificar (perpendicular a la de estafilococo).Sembrar en la parte de arriba de la caja una cepa conocida de

estreptococo grupo A, B como controles. Incubar de 18 a 24 hrs.

a 35C.

Interpretacin:

Prueba positiva: Produccin de un halo de inhibicin de > 10 mmde dimetro alrededor de cualquier disco. Prueba negativa: ausencia de halo de inhibicin.PRUEBA DE LA COAGULASAPrueba para diferenciar especies de StaphylococcusTECNICA : En un tubo de 13 x 100 estril mezclar 0.5 ml de plasma humano o de conejo y una asada grande de la bacteria

aprobar. Rotar suavemente el tubo sin sacudir. Incubar a 35

grados C de 4-6 horas, observe cada 30 minutos

interpretacin: Coagulasa positiva: Staphylococcus aureusCoagulasa negativa: Staphylococcus epidermidis.

PRUEBA PYR (de la Pirrolidonilarilamidasa).-

Identificacin presuntiva de Streptoccoccus beta-hemoltico del

grupo A y de Enterobacterias (Enterococcus).Sobre un portaobjetos o la tapa de placa de Petri se coloca un

disco de PYR comercial. Se humedece y se lo frota con un palillo

cargado con varias colonias del microorganismo a ensayar. Se le

agrega 1gota del reactivo PYR al 0.01%), se deja unos 5 minutos y

se efecta la lectura.Prueba positiva: color rojo cereza oscuro al minuto de agregar

el reactivo. Prueba negativa:: color amarillo o naranja.

PRUEBA DE LA OXIDASAEsta basada en la deteccin de la enzima oxidasa y es til para

la Identificacin de bacterias Gram negativas.Oxidasa positiva: apariencia de un color prpura oscuro en el

papel filtro en menos de 10 segundos.Oxidasa negativa: ausencia de color.

PRUEBA DE LA CATALASASe utiliza para la Diferenciacin de bacterias gram positivos Diferencia los gneros de Staphylococcus y MicobacteriasSe estudia la hidrlisis del perxido de oxigeno (agua oxigenada)

por la Catalasa. Catalasa positiva: libera oxigeno hay burbujeoCatalasa negativa: no hay burbujeo.

PRUEBA DE COAGLUTINACIN (Prueba serolgica)

Se basa en una reaccin Ag-Ac, la cual consiste en aglutinar a

Estreptococos del grupo A con Ac especficos unidos a

estafilococos (anti-estafilococos).Reaccin positiva: Se observa la aglutinacin en el fondo del

pozo. Reaccin negativa: No se observa aglutinacin.

SIEMBRA DE PRUEBAS BIOQUIMICAS: TSI: En el fondo por picadura y luego, en la superficie inclinada

por estra.

LIA: En el fondo por picadura y luego, en la superficie inclinada

por estra.

MIO: Por picadura con aguja de cultivo. CS: Por estra en la superficie inclinada del medio

ANTIBIOGRAMA:

Estas pruebas estn indicadas para microorganismos que causan infecciones intrahospitalarias.

Para microorganismos reportados como resistentes.

Infecciones crnicas o cuadros clnicos de repeticin.

Para seleccionar el antibitico mas adecuado en pacientes de edad avanzada o hipersensibles a los antibiticos.

MICROORGANISMOS QUE DESARROLLAN RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS CON MAYOR FRECUENCIA.

Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae Neisseria gonorrheae Streptococcus pneumoniae Proteus sp. PRUEBAS UTILES PARA REALIZAR ANTIBIOGRAMA Pruebas de sensibilidad por difusin en disco

Prueba de concentracin mnima inhibitoria (mic)

Concentracin mnima bactericida.

Pruebas de produccin de beta lactamasa

Pruebas para detectar la resistencia a oxacilina (metacilina) en Staphylococcus.

Pruebas de sensibilidad por microdilucion en caldo para bacterias anaerobias.TIPOS DE ANTIBIOGRAMALos antibiogramas se clasifican segn la forma de incorporacin del agente antimicrobiano y segn el medio de cultivo empleado.

Antibiograma por dilucin en medio lquido slido. Antibiograma por difusin en medio slido

Antibiograma por elucin en disco Prueba de la beta - lactamasa

ANTIBIOGRAMA POR DILUCIN Y MICRODILUCION:

EN MEDIO LQUIDO: Se basa en un estudio cuantitativo,

empleando distintas concentraciones de agente antimicrobiano.

INTERPRETACIN:

Se observa el crecimiento de los microorganismos mediante la

aparicin de turbidez en el medio, o mediante cambio de color

debido al viraje del indicador previamente adicionado al medio.

EN MEDIO SLIDO: Puede detectar la accin del

antimicrobiano frente a varios microorganismos a la vez en una

misma placa de petri. Se divide la placa en distintas partes y se inoculan diferentes microorganismos en cada una de ellas.

INTERPRETACIN:

Se observa en la placa la mnima concentracin inhibitoria, es

decir la [ ] del antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de

los microorganismos . ANTIBIOGRAMA POR ELUCIN EN DISCO:

Permite identificar cuando un microorganismo es capaz de

resistir la accin del agente antimicrobiano y crecer, siendo as

resistente a dicho agente. Interpretacin: Si es capaz de crecer el microorganismo se

considera resistente. PRUEBA DE LA BETA-LACTAMASA:Algunos microorganismos son capaces de producir enzimas

beta-lactamasas destruyendo derivados del grupo de las

penicilinas. Tambin pueden actuar las penicilasas,

cefalosporinasas y enzimas r-te que destruyen penicilinas,

ampicilinas y cefalosporinas. Ejemplos:Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae y Neisseria

gonorrhoeae .

TECNICA KIRBY BAUER (Es la ms utilizada en laboratorio).ANTIBIOGRAMA POR DIFUCIN EN DISCO (MEDIO SLIDO:Consiste en colocar discos de papel impregnado conantibiticos sobre el medio de agar Muller-Hinton, el cual ha sido

antes inoculado con el microorganismos problema.

INTERPRETACIN:

A medida que el/los antibiticos se difunden desde los discos

van matando las bacterias sensibles, observndose halos de

inhibicin alrededor de los disco, cuyo dimetro es proporcional

a la accin del agente antimicrobiano.CONCENTRACIN MNIMA BACTERICIDA (CMB):

Permite identificar la concentracin mnima de antibitico que

mata a las bacterias. PRUEBA DE CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA (MIC CMI):Concentracin mnima de antibitico que impide el crecimiento

de una cepa Bacteriana (CMI50 y CMI90, ,inhiben el 50 y 90% de

las bacterias, respectivamente). SITIOS DE ACCION ANTIMICROBIANA.

Permeabilidad de la membrana Sntesis de cidos nucleicos Sntesis de la pared celular Sntesis de protenas

CONDICIONES QUE DEBEN TOMARSE EN CUENTA PARA

PREESCRIBIR UN MEDICAMENTO A UN PACIENTE:

DEL FARMACO

Farmacodinamia

Efectos secundarios

Costo de los medicamentos Dosis del medicamentoDEL PACIENTE

Edad

Estado nutricional

Alergias a medicamentosMETODOLOGIA DE PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A

ANTIMICROBIANOS POR LA TECNICA DE DIFUSIN EN DISCO

(Kirby-Bauer)

Inoculacin del microorganismo problema en solucin salina.

Ajuste del inoculo a Escala de MacFarlan. Siembra del microorganismo en Medio de cultivo MllerHinton. Colocacin de sensidiscos segn morfotipo al Gram.

Incubacin a 37C 24 hrs. Comparar resultados con tablas de interpretacin M. en C. Yolanda Guevara G.