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RESUMEN
La industrialización y desarrollo en el mundo ha traído consigo una serie
consecuencias sobre las áreas naturales, grandes extensiones de áreas verdes
están siendo devastadas y con ellas muchas especies de importancia para los
ecosistemas, alimenticias u ornamentales se están perdiendo. Ante esta
problemática el cultivo de tejidos vegetales o cultivos in vitro es una técnica que
ha permitido recuperar muchas especies de plantas. Al ser una técnica utilizada
con mucho éxito nuestro interés se centró en conocer el efecto de diferentes
concentraciones de sacarosa en el crecimiento de violetas africanas Saintpaulia
ionantha cultivadas in vitro y su importancia como fuente de carbono. Ante
diferentes interrogantes sobre cuál es el papel que desempeña la sacarosa en el
crecimiento de las plantas en este tipo de cultivos, se diseñó un experimento para
conocer su efecto, se subcultivaron plántulas de violetas africanas en Medio de
cultivo MS, con reguladores de crecimiento 20, 30 y 40 gramos de sacarosa y
condiciones de luz y temperatura controladas. Se realizaron tres mediciones
diferentes de la talla de las plántulas, las cuales fueron colocadas en 6 frascos
con Medio MS con 20 g, 6 frascos con Medio MS con 30 g y 6 frascos con MS con
40 g de sacarosa, en cada frasco se colocaron tres plantas. El análisis de los
resultados muestran que si existe diferencias significativas en el tamaño de las
plantas.
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INTRODUCCIÓN
El Cultivo de Tejidos Vegetales es una técnica de propagación utilizada en plantas
y que consiste en seleccionar un explante de hojas, tallos, raíces, etc. a partir del
cual es posible obtener una planta completa, este explante se cultiva
asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba
en condiciones ambientales controladas. (Cruz, 2012)
El cultivo de tejidos vegetales permiten el cultivo de las células y tejidos
totipotenciales, es decir, con capacidad de regeneración de una planta entera a
partir de una célula o un grupo de células.
Desde hace más de 120 años, aproximadamente, en las investigaciones de
fisiología vegetal se ha utilizado esta técnica de cultivo (Hurtado, 1991). Diferentes
estudios han demostrado resultados favorables en el cultivo de plantas in vitro a
partir de explantes; otra línea de investigación se ha dedicado a probar diferentes
medios de cultivo con una variedad de constituyentes químicos adicionados con
extractos naturales y reguladores de crecimiento.
Uno de los componentes principales de los medios de cultivo es la adición de
sacarosa, esencial para que una planta tenga un buen crecimiento ya que
interviene en el proceso de fotosíntesis de las plantas que en cultivo “in vitro” no
son suficientemente autótrofas, no pueden adquirir suficiente carbono del CO2, por
lo tanto el carbono necesario lo tiene que adquirir del medio nutritivo.
Al ser una técnica que nos permite propagar planta con cierta facilidad (especies
de importancia biológica, que se encuentran en peligro de extinción, especies de
importancia alimenticia, económica o medicinal) nos propusimos identificar el
efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en el crecimiento de violetas
africanas Saintpaulia ionantha para optimizar y favorecer su crecimiento.
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MARCO TEÓRICO
El cultivo de tejidos vegetales y los medios de cultivos
El cultivo de tejidos vegetales en su acepción amplia, puede ser definido como un
conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que
un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos –células
desprovistas de pared celular– células, tejidos u órganos) se cultiva asépticamente
en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones
ambientales controladas, para formas a partir de ellos plantas completas (Cruz,
2012), aprovechamiento de su totipotencia de la plantas, que se refiere a la
capacidad de regeneración de una planta entera a partir de una célula o un grupo
de células.
El CTV tiene múltiples aplicaciones entre las que se encuentran: la multiplicación
de plantas: Micropropagación, la mejora sanitaria; microinjerto y la mejora
genética, incremento de variabilidad genética, método haplodiploide,
transformación genética. Entre las ventajas que tiene el uso del CTV se
encuentran las siguientes: uniformidad y reproducibilidad, obtención de un
producto de sano, mayor control sanitario, aplicable a un amplio espectro de
especies, mejor planificación durante el año, ahorro de espacio, alta tasa de
multiplicación, disminución de costos, saneamiento del material cultivado,
eliminación de enfermedades por virus, aumenta la seguridad en el intercambio
de germoplasma y mayor rapidez en la obtención de plantas. (Hurtado, 1991).
Castillo (1999) del Instituto de Biotecnología realizó una comparación entre las
características de las plantas que crecen en condiciones in vitro y las que crecen
in vivo, menciona que las plantas in vitro reducen el proceso fotosintético, los
estomas de la plantas no funcionan además de carecer de pelos radiculares o
ausencia de cutícula, por lo que establecerse y crecer dentro de un frasco
requerirá de un proceso de aclimatación posterior a su cultivo in vitro. Sin
embargo, su propagación puede llevarse de manera masiva, favoreciendo el
3
aumento de ejemplares. Esta es una gran ventaja si se propagan especies en
peligro de extinción (recuperación de individuos) o especies de importancia
ornamental.
Las plantas in vivo tienen una reproducción más lenta comparada con las plantas
que se propagan in vitro, su reproducción puede ser de manera sexual o asexual,
pero se encuentran expuestas a patógenos y gérmenes del ambiente y requieren
de extensiones de terreno para su propagación masiva.
La aplicación del Cultivo de Tejidos Vegetales es una opción de solución a graves
problemas relacionados con especies de plantas de importancia biológica,
medicinal, ornamental o de alimento. Promover su utilización puede ayudarnos al
resacate de especies en peligro de extinción y su propagación masiva.
Medios de Cultivo MS
El Medio Murashige & Skoog (MS), o MS fue inventado por los científicos Toshio
Murashige y Folke K. Skoog en 1962 durante sus investigaciones de nuevos
reguladores del desarrollo vegetal, hoy en día se ha convertido en el medio más
comúnmente usado en el cultivo in vitro de tejidos vegetales. Demostró que
variando los niveles de éstos nutrientes se promovía el crecimiento de diferentes
especies vegetales. A través de los medios de cultivo se suministran los
elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal,
vitaminas, azúcares como fuente de energía y hormonas vegetales que controlan
el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. La acumulación en las
plantas de la energía de los carbohidratos proviene de los azúcares agregados al
medio.
Importancia de la sacarosa
La sacarosa es esencial para que una planta tenga un buen crecimiento en los
medios de cultivo “in vitro”, es decir, que se permita el crecimiento de una planta
dentro de un frasco de vidrio, ya que la sacarosa es tanto parte del proceso de
4
fotosíntesis de las plantas como del metabolismo de las mismas, dentro de los
frascos las plantas no pueden adquirir suficiente carbono, proporcionado por el
CO2 atmosférico por lo tanto el carbono necesario lo tiene que adquirir del medio
nutritivo.
La sacarosa es un disacárido compuesto por una molécula de glucosa y una
molécula de fructosa. Estas dos estructuras se unen por medio de un puente
Oxígeno.
La molécula de sacarosa está
compuesta por C12H22O11
Los azúcares ocupan una
posición central en el metabolismo
de todas las plantas, es producida
o sintetizada como principal
producto de la fotosíntesis.
(Müller, 2008). La fotosíntesis es
el proceso mediante el cual se captura la energía de la luz y se utiliza para
impulsar la síntesis de los azúcares a partir de dióxido de carbono (CO2) y agua,
produciéndose, además, el oxígeno que respiramos. Las plantas cultivadas in vitro
realizan fotosíntesis pero su metabolismo se reduce. Por lo que es importante
mantener a las plantas en condiciones de luz y temperatura controladas. (Curtis,
1997).
La sacarosa la podemos encontrar en hojas, tallos, raíces y frutos de muchas
plantas, pero solamente se obtiene para su uso, mayormente de la caña de azúcar
(Saccharum officinarum) y de la remolacha azucarera (Beta vulgaris). Pero
también del arce azucarero (Acer saccharum), un árbol muy abundante en
Canadá, de algunas palmeras (Arenga pinnata y Caryota urens) y del sorgo
azucarero (Sorghum bicolor). De manera natural también podemos encontrarla en
la miel de abeja en mezcla con la glucosa y la fructosa.
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En diferentes trabajos se ha observado el efecto de la sacarosa, como se reporta
en los siguientes trabajos: La presencia de azúcar en el medio nutritivo, es
esencial para el desarrollo de una planta in vitro (Pierik, 1990) debido a que la
fotosíntesis en estas condiciones de cultivo, suele ser insuficiente para satisfacer
la demanda de carbono por la planta, los tejidos verdes in vitro no son
suficientemente autotróficos y la concentración de CO2 en la atmósfera del tubo
de cultivo no es siempre la más adecuada (Gibson, 1967). En consecuencia, la
planta in vitro necesita tomar carbono del medio de cultivo para satisfacer sus
necesidades, la presencia de azúcar en el medio nutritivo es el mejor sistema para
complementar el nivel adecuado de carbono a la planta.
La sacarosa a concentraciones entre 1%, 3% y 5% resulta ser adecuado en
cultivos in vitro y utilizados de acuerdo al tipo de tejido y planta. No obstante,
también se pueden utilizar otros azúcares como glucosa y fructosa. La nutrición
heterotrófica del carbono a partir de sacarosa en el medio, implica la hidrólisis del
azúcar por la planta (Galzy, 1985 y 1990 Y Lees y cols, 1991). Aunque de
antemano no es posible definir la concentración óptima de sacarosa en el medio,
se sabe que cuando ésta es elevada, tiende a disminuir la capacidad fotosintética.
Langford y Wainwright (1988) mostraron que la capacidad fotosintética de brotes
de rosa in vitro con 40 g/I de sacarosa en el medio fue significativamente menor
que cuando en el medio sólo existían 20 g/I del azúcar.
Chee y Pool (1988) obtuvieron plantas de Vitis remainly seedless de baja calidad y
con poca facilidad para resistir el trasplante cuando en el medio había 3% de
sacarosa. Por el contrario, cuando las concentraciones de sacarosa son más
bajas, se tiende a incrementar la capacidad fotosintética y con ello se reducen los
cambios fisiológicos de la planta para adaptarse al suelo con lo que mejora su
respuesta al trasplante (Conner y Thomas, 1982). Se pueden producir otros
efectos no deseados. Así, concentraciones de 10 gl-I de sacarosa provocaron un
bajo contenido de clorofila en la planta in vitro y fuerte tendencia a la vitrificación
6
(Langford y Wainwright, 1988). Van ArnoW y Ericksson (1984) habían indicado
que los brotes vitrificados o hiperhidratados originan plantas con graves problemas
para ser trasplantadas. Wainwright y Marsh (1986) también relacionaron la
presencia de brotes vitrificados con 'la concentración de sacarosa en el medio y
Debergh y col. (1981) con los cambios de presión osmótica del medio originados
por la mayor o menor presencia de azúcar. (Tomado de Troncoso)
Descripción taxonómica de la especie utilizada
El cultivo de tejidos es una técnica utilizada para propagar una diversidad de
especies vegetales entre las que se encuentran plantas ornamentales como las
violetas africanas, que se utilizaron en el presente trabajo por el rápido crecimiento
que presentan.
Saintpaulia ionantha (violeta africana)
Las violetas africanas son plantas herbáceas de 10 a 15 cm de alto. Hojas
basales, redondas a ovaladas, pubescentes, con peciolos de 2 a 10 cm. Las flores
tienen un diámetro de 2 a 3 cm, de textura aterciopelada de color violeta, púrpura,
azul, rosa o blanco.
Nombre científico: Saintpaulia ionantha H. Wendl
Nombre común: Violeta africana
Origen: transversal de África.
Plantas herbáceas de 10 a 15 cm de alto. Hojas basales, redondas a ovaladas,
pubescentes, con peciolos de 2 a 10 cm. Las flores tienen un diámetro de 2 a 3
cm, de textura aterciopelada de color violeta, púrpura, azul, rosa o blanco.
Usos: Es principalmente una planta ornamental.
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OBJETIVOS
Objetivo general:
➢ Identificar el efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en el
crecimiento in vitro de violetas africanas.
Objetivos específicos:
➢ Comparar el crecimiento de plantas de Saintpaulia ionantha en tres
concentraciones diferentes de sacarosa.
➢ Relacionar el crecimiento de las plantas mantenidas in vitro con la
disposición de carbono.
PROBLEMA
Dentro de los componentes orgánicos del medio de cultivo se encuentran
carbohidratos, vitaminas, aminoácidos, extractos naturales y reguladores de
crecimiento vegetal.
La nutrición que es desarrollada en las condiciones in vitro en los diferentes
órganos y tejidos son ampliamente heterótrofos con respecto al carbono debido a
la ausencia o insuficiencia de asimilación clorofílica, por lo cual resulta
indispensable añadir azúcares a los medios de cultivo como fuente de energía y
reguladores osmóticos.
Al reconocer la importancia de la sacarosa y lo esencial que es para el crecimiento
y desarrollo de la planta in vitro nos planteamos la siguientes pregunta, el medio
MS se prepara generalmente con 30 g/l de sacarosa para un litro, sin embargo
¿Cómo será el desarrollo de las plantas cultivadas in vitro si disminuimos o
aumentamos la cantidad de sacarosa?
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HIPÓTESIS
El crecimiento de Saintpaulia ionantha en medios de cultivo MS con diferentes
concentraciones de sacarosa será diferenciado, si la concentración utilizada
generalmente es de 30g/l al agregar a los medios de cultivo 20 y 40 g se espera
una respuesta diferente. Las plantas cultivadas en concentración de 20g/l crecerán
menos mientras que las que se cultivan en medios con 40 g/l crecerán más.
DESARROLLO
Realizamos una investigación experimental a partir del cultivo de plantas de
violetas africanas Saintpaulia ionantha cultivadas en medio Murashige Skoog
(MS) con variación en la concentración de sacarosa.
Para iniciar nuestra investigación nos capacitamos y aprendimos la técnica de
Cultivo de Tejidos Vegetales durante el semestre 2017-2, al asistir a un curso
sobre Aspectos generales y metodología del Cultivo de tejidos vegetales.
Se prepararon cada una de las soluciones para preparar el medio de cultivo MS, el
cual se esterilizó en una autoclave, una vez que se solidifico el medio se preparó
el material para llevar a cabo la siembra de nuestras plantas, el cual se realizó en
una campana de flujo laminar.
Se utilizaron plántulas de violetas africanas obtenidas de hojas que se
mantuvieron durante el semestre 2018-1. Se colocaron tres plantas de violetas en
6 frascos gerber con medios MS adicionado con 20g, 30g y 40 g de sacarosa por
litro. Para cada tratamiento 18 plantas en total. Estas plantas se mantuvieron
durante los meses de diciembre, enero y febrero, en condiciones de luz con
fotoperiodo de 16 luz / 8 de oscuridad, a una temperatura de 24-25 °C.
Se realizaron mediciones en la talla de las plantas en el momento de la siembra,
con un vernier digital KNOVA en unidades de cm y una segunda medición al final
del experimento. Durante los tres meses que duró nuestro estudio se llevó a cabo
9
un registro fotográfico que dan cuenta de las condiciones de cada una de las
plantas.
Los resultados de la mediciones se registraron un cuadro en excel, se obtuvieron
los promedios del crecimiento de la plantas y se realizó una desviación estándar.
Una vez obtenidos los resultados se llevó a cabo el análisis de los mismos y
obtuvieron conclusiones.
“PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO MS”
MATERIALES UTILIZADOS
La elaboración del medio de cultivo se usa generalmente con agua destilada, no se recomienda recomienda usar agua de la llave por su alto contenido de sales. el medio de cultivo se esteriliza a temperatura de 121° y presión de 1.5 kg/cm durante 15 min.
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ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL VEGETAL PARA INDUCIR FORMACIÓN DE NUEVOS INDIVIDUOS A PARTIR DE HOJAS
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MEDIOS DE CULTIVO MS
SIEMBRA DE MATERIAL VEGETAL
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PRIMERA MEDICIÓN
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MANTENIMIENTO DE PLANTAS EN CUARTO DE INCUBACIÓN
RESULTADOS
Primera y ùltima mediciòn del 13-Dic-2017 al 23-Feb-2018 con vernier de los
frascos con medios de cultivo de Saintpaulia ionantha con 20 g/l de
concentraciòn de sacarosa. (tabla 1)
Primera medición de
Saintpaulia ionantha con
20 g/l de sacarosa
Ùltima mediciòn de Saintpaulia
ionantha con 20 g/l de sacarosa
# Frasco # Planta
Tamaño
cm # Frasco # Planta
Tamaño
cm
1
1 1.358
1
1 2.067
2 2.082 2 2.443
3 0.805 3 2.235
14
2
1 1.066
2
1 1.391 SE
SECÒ 2 1.066 2 0
3 1.056 3 1.303
3
1 1.066
3
1 1.816 SE
SECÒ 2 0.914 2 0
3 0.568 3 1.684
4
1 0.863
4
1 0.972
2 0.777 2 1.219
3 0.259 3 1.176
5
1 0.812
5
1 1.323
2 1.205 2 1.869
3 0.876 3 1.681
6
1 1.122
6
1 1.188
2 0.965 2 1.109
3 0.914 3 1.681
PROMEDIO
0.98744
44444 PROMEDIO
1.3976111
11
DIFERE
NCIA
0.41016
66667
Primera y ùltima mediciòn del 13-Dic-2017 al 23-Feb-2018 con vernier de los
frascos con medios de cultivo de Saintpaulia ionantha con 30 g/l de
concentraciòn de sacarosa. (tabla 2)
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Primera mediciòn de
Saintpaulia ionantha con
30 g/l de sacarosa
Ùltima mediciòn de Saintpaulia
ionantha con 30 g/l de sacarosa
# F
rasco # Planta
Tamaño
cm # Frasco # Planta
Tamaño
cm
1
1 1.358
1
1 1.953
2 2.082 2 2.796
3 0.805 3 3.182
2
1 0.889
2
1 1.277
2 0.24 2 1.44
3 0.254 3 1.77
3
1 0.85
3
1 0.909
2 1.117 2 0.924
3 0.292 3 1.318
4
1 0.408
4
1 0
SE
SECÒ
2 0.863 2 0.782
3 0.825 3 2.057
PROMEDIO
0.83191
66667 PROMEDIO 1.534
DIFERE
NCIA
0.70208
33333
Primera y ùltima mediciòn del 13-Dic-2017 al 23-Feb-2018 con vernier de los
frascos con medios de cultivo de Saintpaulia ionantha con 30 g/l de
concentraciòn de sacarosa. (tabla 3)
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Primera medición de
Saintpaulia ionantha con
40 g/l de sacarosa
Ùltima medición de Saintpaulia
ionantha con 40 g/l de sacarosa
# Frasco # Planta
Tamaño
cm # Frasco # Planta
Tamaño
cm
1
1 0.66
1
1 0.791
2 0.571 2 1.122
3 0.66 3 1.031
2
1 0.546
2
1 1.953
2 0.609 2 2.396
3 1.778 3 3.182
3
1 0.101
3
1 1.064
2 1.651 2 0
SE
SECÒ
3 0.825 3 1.539
4
1 0.571
4
1 1.242
2 0.622 2 1.292
3 0.635 3 1.259
5
1 0.355
5
1 0
SE
SECÒ
2 0.304 2 1.371
3 0.838 3 1.059
6
1 0.055
6
1 0.972
2 0.127 2 1.219
3 0.076 3 1.176
PROMEDIO
0.61022
22222 PROMEDIO
1.2593333
33
DIFERE
NCIA
0.64911
11111
17
ANÁLISIS E INTERPRETACIÒN DE RESULTADOS
DIFERENCIAS DE
CRECIMIENTO
20G
0.410166666
7
30G
0.702083333
3
40G
0.649111111
1
Conforme a los datos obtenidos en los resultados se interpretan de la siguiente
manera. Se observa que en los resultados de las diferentes concentraciones
18
utilizadas, que la más favorable para el crecimiento en factor del tamaño de la
planta es de 30 g/l de sacarosa, ya que se puede observar en la diferencia de los
promedios obtenidos de los resultados de la primera mediciòn con la ùltima
mediciòn.
El desarrollo de las plantas fueron variables entre las diferentes concentraciones,
siendo la concentraciòn con 20 g/l de sacarosa de mucho menor crecimiento en
factor del tamaño a comparaciòn de las concentraciones de 30 y 40 gramos por
litro que presentan mayor crecimiento, asì mismo, se observa una ligera variación
entre la concentraciòn de 30 g y 40 g/l de sacarosa, siendo esta ùltima ligeramente
menor que en la concentraciòn de 30 g/l de sacarosa.
Se observò que en la concentraciòn de 20 g/l de sacarosa se obtuvo mayor
proliferaciòn de follaje de la planta, pero con menor desarrollo de raíces, además
presenta un desarrollo de crecimiento aglomerado.
19
Asì mismo, en la concentraciòn de 30 g/l de sacarosa se observò que, además se
visualiza que tiene el mayor crecimiento en factor de tamaño, las plantas
presentan un mayor desarrollo de crecimiento de las raíces, pero el follaje no es
tan abundante como en la concentraciòn de 20 g/l de sacarosa.
Por ùltimo se observò en la concentraciòn de 40 g/l de sacarosa que, el desarrollo
del crecimiento en factor tamaño de la planta difieren ligeramente de la
concentraciòn de 30 g/l, pero también difieren ligeramente en el crecimiento de
raíces, no presenta alto follaje en comparación con la concentraciòn de 20 g/l de
sacarosa y presenta una separaciòn mayor entre las hojas de sus plantas.
CONCLUSIONES
En la concentraciòn de 20 g de sacarosa nuestra hipótesis se comprueba, debido
a que, observamos una talla de crecimiento menor comparada con los dos
concentraciones, en cuanto a la concentración de 40 g/l no obtuvimos un mayor
crecimiento comparado con la concentración de 30 g/l en donde fue la máxima
talla alcanzada por lo tanto, podemos concluir que una saturación de carbono en
el medio de cultivo no garantiza un crecimiento mayor puesto que, la planta ocupa
lo que requiere, finalmente en la concentraciòn de 20 g/l se observa mayor follaje
con una talla pequeña, mientras que en la concentraciòn de 40 g/l se observa un
menor número de hojas pero de mayor talla parecidas a las de 30 g/l, pero siendo
estas más espaciadas.
FUENTES DE INFORMACIÓN
Bibliografía:
● Daniel H. M. 1987. Cultivo de tejido vegetales. ed. trillas
● Elsevier G.2004. Biocheime. Eime Einfûrung fûr Mediziner und Natur
wissenschaftler. ed. Slevogtstr
20
● Ewind G., Hall M. and Klerk D. 2008. Plant Propagation by tissue culture
Volume 1. Ed. Klerk.
Páginas web:
● Cultivo de células y tejidos vegetales: generalidades
http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2211/4_-_Cultivo_in_vi
tro.pdf?sequence=6
Recuperado el 06/02/2018
● Efecto de los citoquinas, Ácido ascórbico y sacarosa en la obtrenciòn de
plantas in vitro de sorghum bicolor para la formaciòn de callos.
http://www.scielo.org.co/pdf/biote/v14n2/v14n2a11.pdf
Recuperado el 21/02/2018
● La sacarosa el dulce de las plantas
ttps://www.sabermas.umich.mx/archivo/articulos/267-numero-31/479-la-sac
arosa-el-dulce-de-las-plantas.html
Recuperado el 04/01/2018
● Troncoso et al. Influencia de la concentración de sacarosa en el medio
sobre la respuesta de material de vid in vitro
http://digital.csic.es/bitstream/10261/66626/1/Influencias%20de%20la%20co
ncentraci%C3%B3n%20de%20sacarosa%20en%20el%20medio....pdf
Consultado el día 12 de enero de 2018.
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