Revalorización de Descartes Agroindustriales Para La Obtención de Bioetanol

7/24/2019 Revalorizacin de Descartes Agroindustriales Para La Obtencin de Bioetanol

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Aimaretti, Nora; Ybalo, Carolina; Escorcia, Mercedes; Codevilla, AgustnREVALORIZACIN DE DESCARTES AGROINDUSTRIALES PARA LA OBTENCIN DE BIOETANOL

Invenio, vol. 15, nm. 28, junio, 2012, pp. 141-157

Universidad del Centro Educativo Latinoamericano

Rosario, Argentina

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Invenio,

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Latinoamericano

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REVALORIZACIN DE DESCARTES AGROINDUSTRIALES

PARA LA OBTENCIN DE BIOETANOL

Nora Aimaretti - Carolina Ybalo - Mercedes Escorcia - Agustn Codevilla*1

RESUMEN: En la provincia de Santa Fe (Argentina) se producen diariamente gran can-tidad de descartes de masa panaria, afrecho de trigo, zanahoria y levadura de cerveza sinningn valor agregado. Como solucin sostenible e integradora se propuso su utilizacincomo sustratos para la produccin de etanol de segunda generacin. Aplicando diferentesestrategias de hidrlisis enzimtica y fermentacin, se obtienen 56, 42 y 120 l de etanol porcada tonelada de masa panaria, zanahoria y salvado de trigo respectivamente.

Palabras claves: bioetanol - descartes agroindustriales afrecho zanahoria - masa pana-ria - hidrlisis enzimtica

ABSTRACT:New value of agroindustrial waste for bioethanol productionIn the province of Santa Fe, Argentina, a large amount of bread dough, wheat bran, carrotand brewers yeast with no added value is thrown away. The use of these discarded ma-terials as substrates for the production of second generation ethanol was suggested as anintegrative and sustainable alternative. Different strategies of enzymatic hydrolysis andfermentation were applied to obtain 56, 42 and 120 l of ethanol per ton of bread dough,carrot and wheat bran respectively.

Key words: bioethanol - agro-industrial waste - bran - carrot - bread dough - enzymatichydrolysis

Introduccin

Debido a la disminucin de reservas de combustibles fsiles, han sido revalorizadaslas fuentes alternativas de energas renovables, sustituibles, ecientes, efectivas, convenien-tes y seguras (Chum y Overend, 2001). En este contexto es necesaria la incorporacin dematerias primas renovables en las cadenas productivas de los productos de elevada demanda,atendiendo a su mejor biodegradabilidad y menor toxicidad.

*Nora Aimaretties Bioqumica, doctorada en Ciencias Qumicas por UNED, magister en Ciencia y Tecnologa deAlimentos, licenciada. en Biotecnologa y Bioqumica por UNL y profesora universitaria por UCEL. Es docente einvestigadora en la Universidad Nacional del Litoral y en la Universidad del Centro Educativo Latinoamericano.Su tarea de investigacin se desarrolla en el rea del diseo de alimentos innovares y en el rea de los biocom-

bustibles, en las cuales ha formado a numerososestudiantes y graduados. Sus trabajos de investigacin son publi-cados en revistas nacionales e internacionales, como as tambin en Congresos. Actualmente es Directora de losProyectos ALI 120 y ALI 121 radicados en UCEL. email: [email protected]. Carolina Ybaloes ingeniera. en Tecnologa de Alimentos por UCEL, es docente e investigadora en la UCEL eintegra el grupo responsable del Proyecto ALI 121.Mercedes Escorcia es alumna de 4 ao de la carrera de Ingeniera en Tecnologa de los Alimentos, se desempeacomo pasante de investigacin en el Proyecto ALI 121.Agustn Codevilla es alumno de 4 ao de la carrera Ingeniera en Tecnologa de los Alimentos, se desempea

como pasante en docencia y como pasante en investigacin en el Proyecto ALI 121.Los autores agradecen los aportes de UCEL en el proyecto de investigacin ALI 121: Proceso continuo parala obtencin de Bioetanol a partir de residuos agroindustriales, en cuyo marco se desarroll esta investigacin.


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Las cantidades comercializadas de alcohol etlico son importantes debido a que stetiene muchos y diferentes usos, tales como: combustible, anticongelante, agente de deshi-dratacin, medio de reaccin, antisptico, agente de precipitacin, curado de tabaco manu-facturado, disolvente y materia prima en la industria qumica, entre otros (Demain y Davies,

1999). Adems, por las legislaciones vigentes, se ha incrementado mundialmente su usocomo oxigenante de la nafta, lo que permite una mayor combustin y en consecuencia unadisminucin de las emisiones contaminantes de hidrocarburos no oxidados completamente,de CO y de compuestos aromticos (Snchez y Cardona, 2008).

Sin bien an muchas de las vas de obtencin de energa y productos qumi-cos a partir de materiales renovables no son competitivas, en los ltimos aos se haestado investigando la utilizacin de materiales de descarte o desecho para la pro-duccin de etanol, con el propsito de disminuir su costo, al tiempo que se pretendecolaborar con el depsito responsable y tratamiento de algunos residuos (Sulaemanet al.,2001; Acaroglu y Aydogan,2012). Este proceso de biotransformacin se perlacomo un recurso energtico potencialmente sostenible, que puede ofrecer ventajasmedioambientales y econmicas a largo plazo en contraposicin con los combusti-bles fsiles. Adems, en la medida que se incremente el precio del petrleo y avancela biotecnologa, las biotransformaciones de materias primas renovables se tornarnms atractivas (Cardoso et al.,2012).

En sntesis, la fermentacin alcohlica puede ser una alternativa viable de ser aplica-da al tratamiento y revalorizacin de los desechos orgnicos de las agroindustrias, dado quese estima que estos comprenden aproximadamente el 50 % de la biomasa en todo el mundo(FAO, 2008).

Fermentacin alcohlica

La fermentacin puede denirse como un proceso de biotransformacin en el que se

llevan a cabo cambios qumicos en un sustrato orgnico por la accin de enzimas sintetizadaspor microorganismos conocidos como catalizadores bioqumicos o biocatalizadores, en estecaso, capaces de convertir las hexosas del mosto en etanol cuando las condiciones son anae-rbicas, tal como Colin y Bjorn (2002) lo indican en la siguiente reaccin:

Glucosa 2 etanol + 2 dixido de carbono (Eq. 1) C6H12O6 2 C2H6O + 2 CO2

Concretamente en la fabricacin de alcohol por fermentacin se comprenden trespasos bsicos:

1.-Preparacin del mosto

Particularmente el alcohol etlico puede ser producido a partir de cualquier tipo deazcar fermentable que sea sometido a un proceso de fermentacin alcohlica. En conse-cuencia esta etapa incluye todo el tratamiento que se requiere para extraer de la materia primalos azcares fermentables a los nes de lograr una fermentacin sustentable. Puesto que el

almidn y otros hidratos de carbono pueden ser hidrolizados a azcares fermentables, por


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medios biolgicos o por medios qumicos, se puede disponer de muchas fuentes de azcarque se clasican segn su composicin del siguiente modo:

Materias primas sacaroideas: incluyen azcar de caa, remolacha, melaza, jugos

de fruta, etc. La preparacin del mosto es muy parecida para todas ellas, ya que por su altocontenido de azcares simples requieren poco o ningn tratamiento preliminar, slo un mto-do eciente de extraccin, una dilucin en algunos casos y la inversin de la sacarosa cuando

el biocatalizador as lo requiera.

Materias primas amilceas como los cereales: maz, trigo, sorgo y cebada y tam-bin los tubrculos: yuca, papa, etc. Se diferencian de las anteriores en que la preparacindel mosto incluye una etapa previa de hidrlisis del almidn que permita dejar la glucosadisponible para el biocatalizador.

Materias celulsicas como madera, residuos de la fabricacin de papel, vege-

tales, residuos ricos en celulosa, lignina, y quitosanos, etc. Por la estructura qumica de lospolisacridos, stas tambin requieren de una hidrlisis previa a la fermentacin. Cuentancon la ventaja de que son las materias primas ms abundantes y ms baratas procedente de labiomasa, pero en contraposicin poseen la desventaja de que como producto de la hidrlisisse obtienen azcares no fermentables, que dicultan el proceso (Snchez y Cardona, 2008).

Durante la extraccin de azcares los compuestos minerales y orgnicos pasan par-cialmente al mosto, junto con los azcares constituyen un excelente sustrato para el desa-rrollo del biocatalizador. Los ms importantes son los fosfatos, las sales de magnesio y deamonio y los aminocidos: asparagina, glutamina y leucina, que actan como factores decrecimiento (Crueger y Crueger, 1993). La importancia de los iones magnesio se debe a su

funcin como cofactores de muchas de las enzimas que intervienen en la reaccin de fermen-tacin y como restauradores de la estabilidad de la membrana externa de la clula daada porla presencia del etanol. Todas estas funciones aumentan su importancia cuando se incrementala concentracin de etanol en el medio (Stanbury y Whitaker, 2003). Por estos motivos, ala hora de seleccionar las materias primas para la preparacin del mosto, se deben tener encuenta que stas deben ser:

- fermentables- almacenables durante el perodo requerido- esterilizables sin ningn inconveniente- de composicin poco variable- carentes de residuos que no puedan ser tratados o eliminados- de energa potencial elevada- abundantes y de bajo costo (Gaden, 2000).

Como ya se ha mencionado cualquier producto que contenga azcares o hidratos decarbono fcilmente transformables en azcar fermentable, puede servir de material de partidapara la fermentacin desde un punto de vista estrictamente terico. Para que en la prcticastos puedan utilizarse, es imprescindible considerar su rendimiento en producto nal y su

costo. En todos los casos, si el mosto formado no es adecuado para el desarrollo del biocata-lizador, ste debe ser complementado con sales nutritivas como fosfato amnico y/o sulfato


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magnsico (Stanbury y Whitaker, 2003).

2.-Fermentacin del mosto preparado

Para que la fermentacin proceda, adems, del mosto, se requiere de un biocataliza-dor, que es un catalizador biolgico que puede acelerar las reacciones entre 10 6y108veces.Este biocatalizador o microorganismo ha de ser capaz de atacar enzimticamente determina-dos grupos qumicos del sustrato, ya sea por hidrlisis, oxidacin, reduccin u otros medios.Los sustratos orgnicos sobre los que actan los microorganismos tienen un doble papel: elprimero como fuente de nutrientes para dicho biocatalizador y el segundo como fuente deenerga. En general, el valor energtico de una sustancia depende del grado de oxidabilidadde la misma. Es decir, la hidrlisis de sustancias nutritivas durante la fermentacin no slo setraduce en desprendimiento de calor, sino que adems en una primera etapa viene acompaa-da de la formacin de nuevas clulas (Gaden, 2000).

Mediante la accin de dichos microorganismos o biocatalizadores, que pueden sertanto levaduras como bacterias, se transforma el azcar en alcohol. Esto se debe a que stos,bajo condiciones de crecimiento anaerbico, tienen la habilidad de utilizar la glucosa me-diante el complejo camino de Embden-Mereyhof-Parnas (Baily y Ollis, 1986). En el mismo,los carbohidratos son fosforilados durante un curso metablico de varias etapas dando comoproductos nales: 2 moles de etanol y 2 de dixido de carbono por cada mol de glucosa del

mosto, tal como se observa en la Eq. 1. Las formas de utilizacin de estos biocatalizadorespueden clasicarse del siguiente modo:

Clulas individuales libres en suspensin, lo que permite que al nalizar el pro-ceso las clulas de la biomasa puedan ser cosechadas y reutilizadas.

Clulas inmovilizadas sobre un soporte adecuado.

Las clulas enteras pueden ser unidas a un soporte slido y jadas en forma de una

monocapa activa. De este modo, cuando el sustrato pasa sobre la supercie, la reaccin en -zimtica transforma el sustrato en el producto deseado. Si bien son varias las ventajas de unsistema de clulas inmovilizadas debido a la capacidad de reutilizar los microorganismos ydisear un proceso continuo, las clulas pueden contener numerosas enzimas catalticamenteactivas que pueden catalizar reacciones no deseadas y adems la membrana celular puedeactuar como una barrera difusiva reduciendo la productividad (Sheldon, 2007). De este modose hace indispensable llevar a cabo una investigacin aplicada sobre cada sistema fermenta-tivo propuesto, a n de analizar las ventajas y desventajas globales del proceso (Ljunggren

et al.,2012).Actualmente, si bien son muchos los microorganismos adaptados a la fermentacin

etlica, el ms utilizado para la obtencin de etanol es la levadura Saccharomyces cerevisiaeya sea en su forma inmovilizada o libre en suspensin (Snchez y Cardona, 2008).

Todo proceso biotecnolgico debe ser controlado para lograr un efectivo desarrollo.En el caso particular de la fermentacin, su xito viene dado por la interaccin ptima devariables tales como: concentracin de azcar (Gaden, 2000), pH, concentracin de O

2 y

temperatura (Stanbury y Whitaker, 2003). Asimismo su progreso se controla mediante el


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crecimiento celular del biocatalizador, el consumo de sustratos y la aparicin del producto,en este caso etanol.

3.-Destilacin del alcohol producido

Esta operacin se realiza para concentrar el etanol hasta una riqueza de 95-97%.Tambin se la puede utilizar para depurar y puricar, extrayendo los aldehdos y teres que

acompaan al etanol en el mosto fermentado. Si se desea obtener alcohol absoluto, se debeadems deshidratar el alcohol obtenido (Gaden, 2000).

Revalorizacin y seleccin de descartes agroindustriales

El tratamiento y la disposicin de los descartes y/o residuos plantean problemas es-peccos para cada pas, regin y aun para cada localidad. Hoy en da, en donde es extremada-mente necesario considerar los factores ecolgicos y de conservacin de recursos naturales,

deben estudiarse todos los posibles mtodos de tratamientos para los mismos, considerandotanto los criterios tcnico-econmicos, como los sociales y medioambientales. Puntualmentela seleccin de sustratos alternativos para la fermentacin etlica debe circunscribirse al reade produccin y es por ello que se deben profundizar los estudios particulares, en lo querespecta a la reutilizacin de materiales descartados, de modo de fomentar la produccin debiocombustibles de segunda generacin. La FAO asegura desde hace dcadas que la trans-formacin agroalimentaria es una actividad que va adquiriendo cada vez ms importanciaporque permite una utilizacin completa de las materias primas locales, un aumento del valoragregado, reduccin del dcit comercial con el exterior, creacin de empleo y generacin de

divisas (Alegre, 1978; FAO, 2008; Schmitt et al.,2012).El bioetanol producido actualmente a nivel industrial a partir de las materias primas

sacaroideas y amilceas forma parte de los denominados combustibles de primera generacinsiendo su principal problema el elevado coste de la materia prima ya que estn ligadas al mer-cado alimentario. Adems del dilema moral que puede suponer la utilizacin de productosalimentarios con nes energticos. La produccin de etanol a partir de materias primas saca-roideas, como melaza de caa y maz,permiten producir etanol a menores costes que partien-do de materiales amilceos como los granos. Actualmente el rendimiento de etanol a partirde maz es ms elevado que el de azcar de caa, pero el bajo rendimiento por hectrea (ha)del primer cultivo, hace necesario el uso de grandes extensiones de tierra (Snchez y Cardo-na, 2008; Aimaretti, 2011). Por su parte el bioetanol obtenido de materias lignocelulsicastambin puede ser llamado bioetanol de segunda generacin y se presenta como alternativafutura que requiere de investigaciones que permitan su aplicacin.

De un anlisis global realizado sobre los descartes del sector industrial santafesinose evidenci una gran utilizacin de los subproductos por parte de las industrias, con el ob-jetivo de recuperar el valor econmico, manteniendo una clara conciencia del cuidado de laecologa y del medio ambiente. Sin embargo, el mismo anlisis realizado sobre la industriaprimaria, revel que los productos descartados principalmente en el sector agroindustrial noreciben ningn tipo de reutilizacin. Si bien es cierto que los descartes agroindustriales sonaptos para la alimentacin de animales de invernada, no se debe enmarcar sta como nicaposibilidad, ya que poseen todas sus caractersticas y su potencial intacto para ser utiliza-dos y/o explotados en otros procesos (Aimaretti, 2006). Entre los descartes agroindustriales


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cuantitativamente ms destacados en distintas zonas de la provincia de Santa Fe se puedenmencionar:

o Masa panaria: se reere a porciones de masa que no cumplen con los parmetros

de calidad requeridos para continuar en la cadena de produccin. Son 0,3 toneladas (t) diarias

descartadas, no poseen ningn tipo de reutilizacin en la industria de la ciudad de Rosario.o Salvado de trigo, tambin llamado afrecho de trigo. La molienda de trigo se

realiza durante todo el ao, produciendo 76 % de harina de trigo, 14 % de afrechillo, 6% deremolienda de negra y blanca, 2% de harina de baja calidad y 2% de merma. As, diariamentese obtienen 8 t de afrechillo de trigo como subproducto de la molienda del grano de trigo, enlos molinos ubicados en la zona del Gran Rosario. De ellos el 95% se destina a consumo ani-mal y el resto a consumo humano, en virtud de sus propiedades nutricionales (Casini, 2003).

o Zanahoria:su cultivo en el Distrito de la Costa ofrece rendimientos de 40 t/ha,siendo la cantidad de producto que cumple con los parmetros de calidad el 6590 %. Estoimplica que durante el perodo de cosecha, se descartan diariamente entre 20-100 t/da dezanahorias con un ptimo grado de madurez y frescura que no reciben ningn tipo de indus-

trializacin.o Levadura de cerveza: en promedio se obtiene como descarte de la industria cer-

vecera en la ciudad de Santa Fe 1 t diaria de levadura ltrada, que ya no es reutilizada en la

industria.

Haciendo referencia exclusivamente a los descartes agroindustriales se cree, talcomo lo describen Barbieri y Antola (2000), que estamos frente a materiales biotecnolgi-camente aptos para emprender nuevos desafos, como la aplicacin de distintas tecnologasque permitan revalorizarlos, no slo con el n de disminuir los productos descartados, sino

tambin de obtener otros productos econmicamente ms rentables.En este contexto, el objetivo del presente trabajo fue investigar la posibilidad de

reutilizar descartes agroalimentarios cuantitativamente importantes en la regin para obtenerbioetanol de segunda generacin mediante un proceso fermentativo cuyo rendimiento podraser aumentado a travs de la hidrlisis de sus tejidos.

Materiales y mtodos

a) Descartes agroindustriales y mostos

El descarte de masa panariase obtuvo directamente de la industria que lo genera. Elmismo se traslad al laboratorio en donde se proces dentro de las 12 hs. Para la preparacindel mosto, 100 g de masa se combinaron con 100 ml de agua destilada y se procesaron du-rante 2 minutos, logrando una suspensin llamada mosto de masa (MM), con un rendimientode 2 l/kg masa.

El afrecho de trigo, se extrajo de un molino harinero ubicado en la zona el GranRosario. Debido a su contenido de humedad promedio (11,4%) se lo almacen en bolsa depolietileno, cerrado y a temperatura ambiente hasta el momento de su utilizacin. Para lapreparacin del mosto de afrecho (MA) se suspendieron 30 g en 180 ml de agua destilada yse agit manualmente durante 1 minuto. El rendimiento promedio de MA fue 7 l/kg. Previo ala fermentacin este mosto fue hidrolizado enzimticamente. Segn sea la enzima seleccio-nada se corrigi pH del mosto con cido sulfrico diluido hasta el valor indicado, se calent


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en un bao de agua termostatizado y cuando se alcanz la temperatura ptima se le adicionla dosis de enzima especicada en la Tabla 1 homogeneizando manualmente (tiempo = 0 de

la hidrlisis).El descarte dezanahoriase obtuvo de un galpn de empaque ubicado en la zona del

Distrito de la Costa (Santa Fe, Argentina). Para la preparacin del mosto stas se procesaroncrudas, previa seleccin y descarte de las zonas visiblemente atacadas por microorganismos.Se sometieron a la extraccin de su jugo mediante un proceso continuo de molienda, pren-sado y ltrado. El rendimiento de este procedimiento fue de 0,54 l de MZ y de 0,46 kg de

bagazo, por cada 1,0 kg de zanahoria de descarte. Como subproducto de esta operacin sur-gi el bagazo de zanahoria, el cual fue utilizado para preparar mosto de bagazo (MB), se sus-pendieron 35 g de ste en 65 ml de agua destilada y se agit manualmente durante 1 minuto.Mediante esta preparacin se obtuvieron aproximadamente 1,3 l/kg de zanahoria de MB cuyaconcentracin promedio de azcares reductores fue 5,8 0,4 g/l, siendo la concentracin deazcares totales: 29,6 4,7 g/l.

En todos los casos los mostos son utilizados inmediatamente despus de preparados.

b) Microorganismos y medios de cultivo

La levaduraSaccharomyces cerevisiae CCUBdescartada de la industria cerveceraluego de ser utilizada en 5 procesos fermentativos consecutivos, fue utilizada como bioca-talizador en todos los casos. Clulas enteras de levadura ltrada se conservaron en envase

estril, sin agregado de nutrientes, a 4 C y saturacin de humedad. Para la preparacin delinculo, se deslieron las clulas en agua y mediante un recuento directo diferencial (Alfenoreet al.,2002) en cmara de Neubauer fue posible obtener el inculo deseado de clulas viableslibres en suspensin.

c) Hidrlisis

De las enzimas especcas actualmente disponibles en nuestro pas, se utilizaron

las siete preparaciones cuyas especicaciones tcnicas se describen en la Tabla 1 junto a las

condiciones de hidrlisis utilizadas para cada una.

Tabla 1: Especicaciones de las enzimas utilizadas para la hidrlisis de MB.

Ref. Actividad enzimtica Nombre comercial Origen Temp. pH Dosis

1 Amiloglucosidasa Spirizyme Fuel Aspergillus niger 65 C 4,5 0,25%v/v

2 -amilasa Fungamyl Aspergillus oryzae 55 C 4,7 0,32%p/v

3 celulasa, betagluconasa,xylanasa Rohalase OS Trichoderma reesei 55 C 5,5 0,05%v/v

4 celulasa IndiAge MAX L Trichoderma reesei 50 C 5,0 0,05%v/v

5 1 endo-1,4--glucanasa Rohament CL Trichoderma reesei 50 C 5,0 0,05%v/v

6 celulasa experimental Enzigrex Trichoderma reesei 50 C 5,5 0,02%p/v

7 Xylanasa termoestable OptimaseCX255L Trichoderma reesei 70 C 5,5 0,05%v/v


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El pH se ajust con cido sulfrico diluido segn sea el pH ptimo de la enzimaa utilizar. La temperatura se modic mediante la utilizacin de una bao termostatizado.

Cuando el mosto logr la temperatura deseada, se le adicion la dosis de enzima correspon-diente, se homogeneiz manualmente y se control el tiempo de hidrlisis.

d) Fermentacin

Las fermentaciones alcohlicas, se realizaron utilizando mosto recin preparado,respetando las siguientes condiciones de cultivo:

- Inculo: 108cls/ml (Aimaretti, 2006).- Temperatura de incubacin: 29 1 C.- Volumen de trabajo: 75% del volumen nominal del reactor utilizado (Stanbury y

Whitake, 2003).En todos los cultivos realizados, la evolucin de la fermentacin alcohlica se sigui

mediante la produccin de CO2. Este gas se recogi en probeta gasomtrica y se consider

como nal de la fermentacin al momento en el que se detuvo su produccin. Las fermentacio-nes se desarrollaron en un sistema de cultivo de frascos erlenmeyers. El volumen nominal delos mismos fue de 125 ml o alternativamente de 250 500 ml. Las bocas de los frascos fueroncerradas con tapones de goma horadados centralmente. A travs del oricio y mediante una

manguera de silicona, se conect la cmara superior del erlenmeyer con la probeta gasomtrica.La termostatizacin del cultivo se realiz por inmersin del frasco en bao de agua con controlde temperatura constante. La agitacin del cultivo se realiz en forma manual cada 10 minutos.En el momento en que fuera requerido, para la toma de muestras de los cultivos, se sometierona centrifugacin durante 10 min a 5000 rpm. El sobrenadante se trasvas a tubos Eppendorf de1,5 ml de capacidad para su almacenamiento y conservacin a 20C.

e) Parmetros de cultivo

-Rendimiento de etanol por cantidad de sustrato(Yp/s): est dado por la concen-tracin de etanol (g/l) que se produce a partir de una concentracin especica de sustrato del

mosto (base hmeda) (Colin y Bjorn, 2002).-Rendimiento de etanol por cantidad de materia prima(Yp/mp): representado por la

cantidad de etanol producido (g/l) por cada gramo de materia prima expresado en base seca.- Efciencia: la eciencia de un proceso fermentativo fue denida como la relacin

entre la concentracin total de etanol producida en un cultivo sobre la concentracin terica deetanol que debera haberse producido, la cual se calcul de forma estequiomtrica considerandoque por cada 100 g de hexosa se producen 51,1 g de etanol y 48,9 g de CO

2(ver Eq. 1).

f) Determinaciones analticas

- Humedad: se determina de forma indirecta, mediante secado trmico, segn elmtodo homologado 44-15A (AACC, 2005).

- Concentracin de azcares: como mtodo de valoracin rpida de los azcarespresentes en el mosto, se emple la variacin del ndice de refraccin, determinado en formadirecta con un refractmetro manual (Cosmo, mod. K32, Japn). La determinacin de laconcentracin de azcares reductores y azcares fermentables totales se realiz mediante


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la tcnica colorimtrica del cido 3,5-dinitrosaliclico modicada por Aimaretti (2011). La

mencionada tcnica considera como azcares fermentables totales a la sacarosa, adems delos azcares reductores.

- Concentracin de etanol: se utiliz un cromatgrafo gaseoso (PERKIN-ELMER,

Sigma 3B, Dual FID Chromatograph, EE.UU.) con detector de ionizacin de llama (FID)equipado con una columna capilar de 2 m de longitud, empacada con Chromosorb 102, elcual se oper con nitrgeno como carrier a un caudal de 30 ml/min y las siguientes condi-ciones: temperatura de la columna: 150 C (isotrmica), temperatura de inyeccin: 195C,temperatura del detector: 220 C. Para la determinacin de la concentracin de etanol en lasmuestras, previa homogenizacin se separaron 100 ml del descongelado y se mezclaron con100 ml del estndar interno (isopropanol al 1,5 %) y 1 ml de agua destilada. De esta dilucinse emplearon 3 ml para ser inyectados en el cromatgrafo (Mabud, 2000).

Resultados

La evaluacin de la fermentabilidad y rendimientos de los mostos preparados condescartes de masa panaria, zanahoria y afrecho de trigo responde a las conclusiones a lascuales se arrib luego de realizar un anlisis de los materiales renovables existentes en laregin que pudieran reunir las propiedades necesarias para ser propuestos como sustratos defermentacin alcohlica. A continuacin se describen los resultados obtenidos en los diferen-tes ensayos realizados sobre cada una de estas materias primas.

Masa panaria

Dado que al momento no se han encontrado antecedentes bibliogrcos que indi-quen el uso de masa panaria como sustrato, se evalu en primer lugar la fermentabilidad del

mosto preparado (MM). Para ellos se realiz una fermentacin en el dispositivo descriptoanteriormente, en el que comenz la produccin de gas a los 10 minutos y se obtuvo una con-centracin de etanol de 2,14 g/l en un tiempo total de 150 minutos. Al nalizar la fermenta-cin, se centrifug el cultivo a 5000 rpm durante 5 minutos y se reconstituyeron dos sistemasfermentativos similares al inicial: por un lado se inocul nuevamente el mosto fermentado(sobrenadante) y por otro se agreg mosto fresco a la biomasa celular. En el cultivo realizadocon mosto fresco, la fermentacin se reinici aproximadamente a los 10 minutos obtenin-dose una concentracin de etanol nal de 2,56 g/l en un tiempo de 140 minutos. Por otro

lado, en el mosto formado por el sobrenadante (mosto fermentado) re-inoculado con nuevasclulas de biocatalizador, no se produjo fermentacin durante un lapso de 140 minutos que secaracteriz por la ausencia de gas en la probeta y de etanol en el sobrenadante. Coincidiendocon lo propuesto por Cceres-Farfn et al. (2008), cuando a este cultivo se le agreg melazade caa de azcar (Melrico, Albuin y Ca. S.R.L., Argentina), producto de descarte en laproduccin de azcar renado rico en azcares simples, se reinici el proceso fermentativo

Los resultados obtenidos sugieren que la ausencia de fermentacin se debe a unabaja concentracin de sustratos fermentables. Esto se evidencia ya que al agregar ms sustra-to (melaza) se retom la actividad de las levaduras en presencia del mismo mosto ya fermen-tado. Por otro lado la actividad de las levaduras continu cuando se le adicion mosto fresco.Estos resultados coinciden con antecedentes bibliogrcos que sealan que la produccin de

etanol posee mayor dependencia de deciencias nutricionales que de la toxicidad propia del


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etanol (Sanches Peres y Laluce, 1998). De este modo se puso en evidencia tambin la posibi-lidad de reutilizar la biomasa luego de nalizada la fermentacin.

En virtud de que la produccin de etanol se detuvo cuando las condiciones no eranadecuadas, se investig la inuencia de diferentes concentraciones de sustratos en el mosto,

hidrolizando la masa como paso previo a la fermentacin. Dado que se trata de una materiaprima amilcea, se realizaron hidrlisis multienzimticas utilizando diferentes concentracio-nes de las enzimas 1 y 2, por su actividad amiloglucosidasa y -amilasa respectivamente,

bajo las condiciones descriptas en la Tabla 1.En la Tabla 2 se muestran los resultados comparativos de la cantidad de etanol y del

rendimiento de materia prima (Yp/mp) obtenidos para los mostos hidrolizados con distintasconcentracin de enzimas, acompaados por su desviacin estndar.

Tabla 2: Rendimientos etlicos de MM sometidos a hidrlisis multienzimticas.

ENSAYO Enzima 1 Enzima 2Azcares totales

(g/l) Etanol (g/l)Eciencia

% Yp/mp

a - - 2,4 0,5 0,1 40 0,013b 0,025 %v/v 0,03 %v/v 4,3 0,8 0,1 38 0,021

c 0,25 %v/v 0,3 %v/v 13,6 2,2 0,3 32 0,057

Como se desprende de la tabla anterior, conforme aumenta la concentracin de en-zimas, aumenta la hidrlisis del almidn y aumenta el rendimiento etlico, sin presentar lamisma proporcionalidad en la eciencia. Adems los resultados de las experiencias de fer-mentacin muestran que el rendimiento etlico es bajo como para implementar un procesosostenible que permita valorizar este descarte, ya que considerando que la humedad de lamasa es del 22,3 %, en las condiciones c se obtendran aproximadamente 17 l de etanoldiarios, al utilizar todo el descarte de masa panaria de dicha empresa. Si bien es certero que

el proceso de hidrlisis enzimtica podra ser estudiado con mayor profundidad con el n deoptimizar el rendimiento etlico y disminuir el efecto negativo provocado por la presenciade lpidos en la masa, tambin se podran evaluar otros mtodos de revalorizacin de estedescarte, o de disminucin en origen.

Zanahoria

La zanahoria (Daucus carota) es una fuente importante de pro-vitamina A, bra yotros componentes nutricionales, siendo uno de los cultivos ms ecientes en acumulacin de

biomasa (Diamantopoulou et al.,2011). En las plantas superiores, las semillas almacenan prin-cipalmente almidn, protenas y lpidos, mientras que las races de acumulacin, tubrculos y

rizomas, normalmente depositan carbohidratos en forma de almidn. Sin embargo, las zanaho-ria es uno de los pocos vegetales que acumula azcares libres en vacuolas (40-60 % de los car-bohidratos totales), como los principales carbohidratos de reserva. El 95 % del total de azcareslibres est compuesto por sacarosa, fructosa y glucosa, y junto a los terpenos son los principalesdeterminantes de su sabor. De ellos, los azcares reductores (AR): fructosa y glucosa, estnpresentes en forma equimolar, siendo la relacin sacarosa/AR creciente conforme la raz llegaa su madurez y decreciente luego de la cosecha y durante el almacenaje en fro (Simon, 2000).

Tal como indica Aimaretti (2011) de resultados anteriores, la cantidad de etanol ob-tenido es proporcional a la cantidad de slidos solubles aportados por el mosto, no encon-


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trndose en la fermentacin regiones de saturacin o de inhibicin por sustrato, en el rangode 25 a 152 g/l. Considerando que en promedio la concentracin de azcares reductores delmosto de zanahoria fue 49,8 13,4 g/l, sobre un total de azcares de 94,0 11,7 g/l se obtieneun rendimiento (Yp/s) constante e igual a 0,47g/g. Este valor es comparable al rendimiento

obtenido utilizando cebollas como sustratos, que poseen 67,3 g/l de azcar total en el jugo yrinden 30,6 g/l de etanol (Yp/s= 0,45 g/g) (Horiuchi et al., 2000), o anans cuyo contenido de

sacarosa es de 125 g/l y producen 59,0 g/l de etanol (Yp/s= 0,47 g/g) (Tanaka et al., 1999).Ya conocida la fermentabilidad de la zanahoria, se estudi la posibilidad de aumen-

tar el contenido de azcares fermentables genuinos mediante la hidrlisis enzimtica de lostejidos del bagazo, al dejar disponibles los azcares componentes de las bras para que pu-dieran ser utilizados por el biocatalizador. Para ello, conforme a que la composicin de labra del bagazo es principalmente de celulosa y slo el 1% es almidn (Yoon y cols., 2005),

se ensayaron las enzimas 1 y 2 con actividad amiloglucosidasa y -amilasa, adems de com-plejos enzimticos de celulasas como las enzimas 3 y 4, en las condiciones mencionadas (verTabla1). Los resultados comparativos de la cantidad de etanol y del rendimiento de producto

sobre sustrato (Yp/s) obtenidos para los mostos hidrolizados con distintas enzimas, se mues-tran en la Tabla 3.

Tabla 3: Rendimientos etlicos de MB sometidos a hidrlisis enzimtica.Azcares totales

(g/l) Etanol (g/l)Yp/s(g/g)

Sin hidrolizar 28,7 5,9 0,4 0,205

Enzimas 1 y 2 44,1 9,5 0,7 0,216

Enzima 3 39,8 9,1 0,6 0,228

Enzima 4 46,2 11,0 0,5 0,239

El anlisis de estos datos, permite concluir acerca de las condiciones ptimas parala hidrlisis enzimtica y as llevar a cabo la optimizacin de la metodologa utilizada parapreparar el mosto de bagazo y la utilizacin integral del descarte de zanahoria. En este senti-do, tal como puede observarse en la Tabla 3, todas las enzimas son capaces de hidrolizar, endiferentes proporciones, el tejido vegetal del bagazo de la zanahoria, transformndolo en az-cares simples. En consecuencia es posible incrementar, mediante esta metodologa, la con-centracin de sustratos fermentables en MB. No obstante, estos resultados no son sucientes

como para poder inferir que el incremento se vera reejado en el rendimiento etlico, por lo

que los mostos fueron sometidos a un proceso fermentativo en condiciones estndares y losresultados se muestran en la misma Tabla. As pudo determinarse que tal como ocurre en MZ,el rendimiento etlico aumenta conforme lo hace la concentracin de azcares del mosto. De

este modo se descarta la posibilidad de que entre los productos de la hidrlisis se obtengansustancias inhibidoras del biocatalizador o derivados de azcares que no sean fermentables.La combinacin de los resultados de las experiencias de fermentacin de MB junto

a los valores ya conocidos de rendimiento etlico de MZ permiten predecir que si por cadatonelada de zanahoria descartada se obtienen 540 l de MZ que poseen en total 50,8 kg de az-cares, entonces podran obtenerse 30,6 l de etanol. Adems, si el bagazo se usa para prepararMB hidrolizado (=1,3 l MB/Kg zanahoria) y se lo fermenta, se lograra una produccin de

11,9 l de etanol. En consecuencia la cantidad de etanol obtenida por cada tonelada de zanaho-ria descartada e hidrolizada en las condiciones indicadas utilizando la enzima 4 es de 42,5 l.


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En funcin de estos resultados, se estima que a partir de la zanahoria descartada diariamentepodran obtenerse entre 850 y 4250 l de etanol. En funcin de estos resultados, actualmentecontinuael estudio de la hidrlisis de MB con el n de aumentar el rendimiento etlico ydisminuir los desechos ocasionados por el proceso.

Afrecho de trigo

Con el nombre de afrechillo de trigo o salvado se conoce a uno de los subproductosprovenientes de la industrializacin de trigo. ste se obtiene luego de separar, por medio detamices, el producto obtenido de la molienda de los granos limpios y libres de tegumento. Con-secuentemente est integrado por la cscara (pericarpio) desmenuzada por la molienda y unpequeo porcentaje de la parte supercial del albumen (endosperma), eventualmente tambin

puede contener una porcin muy pequea del germen (Casini, 2003).Por su composicin fsico-qumica, puede clasicarse como un material rico en celu-

losa. La celulosa es un polisacrido formado por unidades de glucosa, unidas mediante enlaces

-1,4 glucosdicos que le permiten formar cadenas largas y lineales unidas mediante puentesde hidrgeno intermoleculares, formando una estructura supramolecular ordenada y cristalina,resistente a la hidrlisis.

Como se describi anteriormente, la preparacin de un mosto a partir de este tipo dematerias primas requiere de una hidrlisis previa con el n de aumentar el contenido de az -cares fermentables. Si bien son muchas las alternativas actuales que permiten la hidrlisis delos tejidos vegetales, los mtodos principalmente aplicados sobre este tipo de sustratos son:hidrlisis cida y enzimtica. Al respecto, varios investigadores coinciden en que la hidrlisisenzimtica ha demostrado mejores resultados en la posterior fermentacin, debido a que porsu especicidad no se forman componentes de degradacin de la glucosa. Sin embargo el in-conveniente principal de este mtodo es que la velocidad de reaccin es mucho menor (Toms,

2009; Ovando y Waliszewski, 2005). Adems diversos estudios comparativos demuestran quela hidrlisis enzimtica puede dar un producto puro con un rendimiento cuantitativo mayor,consumiendo menos energa y generando menos euentes con respecto a la hidrlisis cida.

Por estos motivos, se utilizaron diferentes enzimas especcas para el sustrato a en-sayar que fueron oportunamente donadas por las empresas comercializadoras y por otroscentros de investigacin. As, se ensay la eciencia de la hidrlisis sobre una suspensin de

afrecho en agua, medida a travs del aumento de la concentracin de azcares provocada porla actividad cataltica de cada una de las enzimas descriptas en la Tabla 1. Para el seguimientodel proceso de hidrlisis se prepararon 600 ml de MA, se acondicion segn se describe enel apartado Materiales y mtodos y se analiz la evolucin de la concentracin de azcaresreductores (AR) y azcares totales (AT) en MB, durante el transcurso de la hidrlisis, paracada una de las enzimas ensayadas. Los resultados de estas experiencias se muestran en losgrcos de la Figura 1.


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Figura 1: Evolucin de la concentracin de azcares totales ( ) y reductores (- - - )en funcin del tiempo en cada proceso de hidrlisis enzimtica.

De este modo, tal como puede observarse en los grcos de la gura anterior, todas

las enzimas, excepto ROHALASE OS, son capaces de hidrolizar el mosto de afrecho y enconsecuencia podran ser utilizadas para aumentar el contenido inicial de azcares. De to-das las enzimas ensayadas, Rohament CL, Optimase CX255L y Spirizime Fuel han logrado

mayores porcentajes de incremento de azcares en el mosto hidrolizado: 105; 84; y 83 %respectivamente. Adems se puede destacar que el tiempo ptimo de accin enzimtica delas enzimas Rohament CL y Spirizime Fuel es de 2,5 horas, mientras que Optimase CX255Llo alcanza en 2 hs. Por su parte, otra alternativa visible es la hidrlisis realizada por la enzimaEnzigrex, dado que si bien el incremento no es mximo, logra aumentar 15 g% en slo 1 horade actividad cataltica, lo que representa un incremento del 57 % de los azcares inicialesdel mosto. El anlisis de estos datos, permite concluir acerca de las condiciones ptimas parala hidrlisis enzimtica y as llevar a cabo la optimizacin de la metodologa utilizada parapreparar el mosto.


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A posteriori, con el n de optimizar el proceso de fabricacin del mosto, se veric

la fermentabilidad de los azcares de los diferentes mostos de modo de evaluar la posibilidadde aumentar as los rendimientos etlicos. Para ello se ltraron los mostos hidrolizados y se

los ferment en las condiciones ya descriptas. Los resultados comparativos de la cantidad de

etanol y del rendimiento de producto sobre sustrato (Yp/s) obtenidos para los mostos hidroli-zados con distintas enzimas el tiempo adecuado, se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Rendimientos etlicos de MA sometidos a diferentes hidrlisis enzimticas.

Azcarestotales (g/l) Etanol (g/l)

Yp/s(g/g)

Eciencia

%

Rohament CL, 150 min 47,3 15,2 0,4 0,321 63

Optimase CX255L, 120 min 46,0 12,8 0,7 0,278 54

Spirizime Fuel, 150 min 37,1 11,3 0,6 0,305 60

Enzigrex, 60 min 41,5 9,0 0,5 0,216 62

As, del anlisis de estos datos surge que, tal como sucede con los otros sustratos, elrendimiento etlico aumenta conforme lo hace la concentracin de azcares del mosto mos-trada en los grcos anteriores, pero sin mantener el mismo rendimiento de producto sobre

sustrato. Estos resultados indican que es necesario seguir estudiando el perl de azcares pro-venientes de la hidrlisis de modo de descartar la posibilidad de que entre los productos de lahidrlisis se obtengan sustancias inhibidoras del biocatalizador. De este modo, la hidrlisisenzimtica de MA, utilizando Rohament CL se consider un paso ms de la preparacin delmosto en las experiencias posteriores.

El anlisis integrado de los resultados de las experiencias anteriores permite conside-rar que la cantidad de etanol obtenida por t de afrecho utilizado para preparar MA hidrolizadocon la enzima Rohament CL es 136 l. De este modo, si se utilizara todo el descarte diario deafrecho de trigo para la produccin de bioetanol, podran obtenerse 1088l. Resultara tambininteresante el estudio de la posibilidad de reutilizar el material remanente de la preparacindel mosto como alimento para el ganado.

Discusin

Si bien se ha demostrado que es posible aumentar el rendimiento etlico de todoslos mostos mediante la hidrlisis enzimtica, sera conveniente seguir trabajando en el temaa n de poder comprender con mayor profundidad la inuencia de cada uno de los factores

intervinientes sobre el proceso de hidrlisis enzimtica, considerando que un exceso en laconcentracin de azcares tambin puede disminuir la eciencia, al igual que la presencia

de pentosas o el exceso de etanol producido. Otras alternativas que podran ser ensayadaspara aumentar el rendimiento etlico son: la implementacin de modicaciones en el proceso

de preparacin del mosto (Aimaretti, 2011), el uso de los biocatalizadores con capacidadesparticulares (Horiuchi et al.,2000b; Guo et al., 2010), la implementacin de hidrlisis cida(Staniszewski et al., 2009) o de etapas de pretratamiento (Voca et al.,2009), as como tam-bin los procesos de sacaricacin-fermentacin simultneas (SSF) (Mielenz et al.,2009;Patle y Lal, 2008; Suresh, et al., 1999).

Considerando las concentraciones de azcares de los mostos preparados con los tressustratos evaluados y su respectivo rendimiento de etanol, en comparacin con el rendimien-


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to etlico de otros sustratos alternativos, puede observarse que los valores son comparables(Horiuchi et al.,2000; Tanaka et al.,1999). Sin embargo, comparando los resultados obte-nidos en esta investigacin con rendimientos etlicos de los cultivos comnmente utilizadospara la obtencin de bioetanol de primera generacin, expresados por tonelada de materia

prima (base hmeda), puede observarse (Tabla 5) que si bien el rendimiento que se obtienecon estas materias primas de descarte es un tanto inferior, se debe resaltar la elevada dispo-nibilidad de las mismas a un costo mnimo y la no utilizacin de productos destinados parala alimentacin humana.

Tabla 5: Rendimientos etlicos de MA sometidos a diferentes hidrlisis enzimticas.

Materia prima

Rendimiento etlico

(l/t)

Caa 70*

Bagazo de caa 140*

Maz 370*

Bagazo de maz 227*

Yuca 180*

Sorgo dulce 86*

Remolacha 100*

Produccin diaria etanol (l)

Masa panaria 56,2 17

Zanahoria 42,5 850 - 4250

Afrecho de trigo 136 1088

*Fuente: Snchez y Cardona, 2008.

Asimismo, al utilizar la biomasa regional se evitaran los costos de traslado que aveces pueden llegar a ser contraproducentes, segn indican Cardoso et al.,2012 y se conduceal desarrollo de un proceso industrial sostenible. Adems de ello es muy importante destacarque luego de revalorizar estos descartes, obteniendo biocombustible de segunda generacin,surge adems un remanente de fermentacin que podra ser utilizado para alimentacin ani-mal, luego de su adecuacin (Castillo y Gallardo, 1989).

ConclusionesEs posible obtener bioetanol de segunda generacin a partir de desechos provenien-

tes de la comercializacin de zanahoria, de la molienda de trigo y de la elaboracin de pro-ductos panicados, utilizando como biocatalizador S. cerevisiaedescartada de la elaboracinde cerveza. Adems, es viable incrementar el contenido de azcares de los mostos por mediode la incorporacin de la hidrlisis enzimtica como paso previo a la fermentacin. Si bien lahidrlisis enzimtica permiti aumentar tambin el rendimiento etlico de estos sustratos, sonmuchas las variables de este proceso y en consecuencia se estn estudiando actualmente losfactores intervinientes con el n de incrementar an ms el rendimiento. Como consecuencia,

siguiendo la directriz del objetivo del trabajo, es muy importante realizar un anlisis globaldel proceso de obtencin sustentable de etanol, ya que luego de extraer ste de los mostosMA y MZ fermentados, surge un remanente de mosto rico en levaduras y bras que posible-


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mente pueda ser utilizado para alimentacin animal luego de que sus componentes se hayanaprovechado para obtener un biocombustible de segunda generacin.

Estos resultados son muy promisorios ya que este proceso, parte de residuos agroin-dustriales disponibles en nuestra regin para obtener bioetanol, al tiempo que se colabora con

la disposicin responsable de esos residuos. Adems generan el marco para continuar coninvestigaciones que permitan obtener productos biotecnolgicos de relativo valor agregadocomo bioetanol de segunda generacin, una bebida alcohlica o un condimento innovador.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Dr. Francisco Gasca, Dra. Mara Luisa Rojas y Dr.Juan Carlos Yori por la colaboracin en la ejecucin de este proyecto. Adems se agradece ala Ing. Adriana Clementz por la colaboracin en la redaccin del mismo.

Recibido: 12/12/11. Aceptado: 07/03/12

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