Revision 1 Tesis Doctoral

7/21/2019 Revision 1 Tesis Doctoral

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El objetivo general de esta Tesis Doctoral consiste en descubrir nuevosmecanismos fsiopatolgicos operantes en el desarrollo de Ne ropataDiabtica, para una mejor comprensin de la misma y descubrimiento denuevos marcadores de diagnstico, evolucin y potenciales dianasteraputicas. ara ello, nos centramos principalmente en el estudio de lose!osomas aislados de orina como nueva uente de protenas marcadoras.

ara este abordaje general, planteamos los siguientes objetivos particulares"#. uesta a punto de un protocolo ptimo para el an$lisis protemico dee!osomas de orina de individuos sanos y pacientes con Ne ropata Diabtica%ND& mediante 'DE, ()*+ -+ y +. '. /dentifcacin de nuevas protenaspresentes en e!osomas de orina de individuos sanos y pacientes ND.0n$lisis cualitativo del proteoma e!osomal por ()*+ -+ . 1. 0n$lisisdi erencial cuantitativo del proteoma de e!osomas de la orina en individuossanos y pacientes ND en estados avan2ados por ()*+ -+ %cuantifcacinlibre de marcaje&. 3. 0n$lisis di erencial cuantitativo del proteoma del ri4nen un modelo animal de ND en estadio temprano mediante 'D*D/5E./dentifcacin de potenciales marcadores en 6uidos biolgicos directamenteaccesibles" orina y e!osomas de orina. 7. 8alidacin de los resultadosobtenidos en la identifcacin de las protenas di erencialmente e!presadasy candidatos a marcador de ND mediante tcnicas complementarias"9estern :lot, /nmuno;isto? ?+0 DE ? /N0 @A+0N0 DE /ND/8/DA? 0N? B0)/ENTE )?N NEC ? 0T 0 D/0: T/)0" + T?D? DE 0/ (0+/ENT? B

DE (E)/FN DE ?TE/N0 +0B? /T0 /0 )?NT0+/N0NTE .

#.# eleccin de pacientes y recogida de muestras. a& eleccin depacientes. (os pacientes seleccionados para todos los estudios reali2ados,padecan ne ropata diabtica de grado avan2ado ///*8 %pre*di$lisis&. edescartaron a


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empleando un n()* c;ip cube*MMM. e!o Edad )reatinina mg-dl 0lbuminuriamg-dl 0lb-creatinina mg-g aciente # ;ombre HH 7',H 'J3 7KK,L aciente 'mujer 7J #71 '1' #7#,J aciente 1 mujer HJ 31,J 3LH,L IHI,3 7' +aterial ymtodos b& ecogida de muestras. e recogi la segunda orina de lama4ana, en un recipiente esteril de pl$stico. e recogi siempre un volumenmnimo de 7K ml para asegurar un rendimiento sufciente de e!osomase!trados para un an$lisis protemico, siendo pre eribles vol menes entornoa los #KK ml. 0 cada muestra se le a4adi una me2cla comercial dein;ibidores de proteasas %#K3 m+ 0E: C, IKO+ aproteinina, 3m+ bestatina,'m+ leupeptina, #,7 m+ pepstatina, #,3 m+ E*J3. igma 0ldric; I13K, 7KPl por cada #KK ml&. Todas las muestras ueron almacenadas a *IKQ) ;astasu an$lisis, ya


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+aterial y mtodos 71 recuperar el sobrenadante y unirlo al sobrenadanteobtenido en la primera centri ugacin. Esta ve2 se descart defnitivamenteel precipitado. El sobrenadante resultante de estas dos centri ugaciones debaja velocidad se llev a botellas de policarbonato. or cada #KK ml desobrenadante se utili2aron ' tubos especfcos de ultracentri ugacin de '7ml de capacidad cada uno %:ottle, Uit; )ap 0ssembly, olycarbonate,:ecVman )oulter& %7K ml en cada ciclo de centri ugacin, ' ciclos& y sesometieron a ultracentri ugacin a #H7.KKKg durante HK minutos a 3Q). Elnuevo sobrenadante resultante del primer ciclo de ultracentri ugacin sedescart y al precipitado se le a4adi el volumen adicional de 7K ml parallevar a cabo el ciclo de ultracentri ugacin siguiente. e emplearon ' tubosen ve2 de 3 por


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1K minutos, se descart el sobrenadante y el precipitado se resuspendi en7K Pl de 73 +aterial y mtodos solucin de aislamiento %u otros tamponesdependiendo cual sea el siguiente paso, como se e!plica m$s adelante&. (asmuestras se congelaron a *IKQ) ;asta su posterior an$lisis. Este reactivo ueempleado sobre muestras de orina control y sobre muestras de orina depacientes, siguiendo las indicaciones del abricante, como se ;a comentadoy tambin empleando el doble de volumen de partida para las muestrascontrol para intentar mejorar los resultados. Cigura #. (os tres mtodos dee!traccin,


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precipitado e!osomal ;a de ser recuperado mediante la adicin de 'K ml desolucin de aislamiento y un nuevo ciclo de ultracentri ugacin. Tras ello elprecipitado sera resuspendido en 7K Pl solucin de lisis %H+ urea, '+tiourea, 3[ )@0 &. Este proceso de deplecin se llev a cabo en e!osomasno lisados. El !ito de la recuperacin por ultracentri ugacin re


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e


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)@0 & y se cuantifc empleando el mtodo de :rad ord %:rad ord ultra,E!pedeon&. En cada pocillo se cargaron '7Pg de protenas e!osomales, sea4adio solucin de carga 3! %'7'm+ Tris* @)l, 3K[ 5licerol, I[ D & y sellev a una concentracin fnal de #!, y a4adiendo posteriormente un 7[ deb*mercaptoetanol y tra2as de a2ul de bromo enol. (a muestra se calentdurante 7 minutos a L7Q). Estas muestras se cargaron en un gel deacrilamida y se llev a cabo la electro oresis, D * 05E a HK*#KK 8, en untampn compuesto por K,K1+ Tris %:iorad&, K,'+ glicina %:iorad& y K,#[dodecil sul ato sdico D %:iorad&. El gel separador empleado contena un#K[ de acrilamida-bisacrilamida % roto5el&, Tris*@)l #+ p@I,I, #K[ D ,N,N,N_,N_*Tetrametiletilendiamina %TE+ED, :io ad&, y una solucin #K[persul ato amnico %0 , :io ad& preparada en el momento en @' ?dd. Elgel concentrador empleado estaba compuesto por 3[ deacrilamida-bisacrilamida, #+ Tris*@)l p@J,I, solucin de #K[ D , TE+ED ysolucin de #K[ 0 . (as protenas ueron trans eridas desde el gel a unamembrana de nitrocelulosa %:iorad& por electrotras erencia a #K8 durante #;ora. e blo


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recomendado por el abricante. En el momento previo a cargar lasmuestras, se les a4adi K,7[ de an olitos %:io ad&, 'Km+ DTT %:io ad& yuna punta de esp$tula de a2ul de bromo enol. (as tiras / 5 empleadas

ueron de rango no lineal de p@ 1*## y de longitudes de #Hcm %5E@ealt;care&. (a re;idratacin se reali2 de manera activa a 7K8 durante #';oras, en una uente / 5p;or %5E @ealt;care&. (as tiras se cubrieron conaceite mineral %:io ad& para evitar la evaporacin de la muestra durante elproceso. El programa de isoelectroen o


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y se reali2aron dos lavados de #K minutos. Todas las incubaciones y lavadosse reali2aron en agitacin. Ana ve2 te4idos, los geles se escanearon en undensitmetro 5 *IKK %:io ad&. JK +aterial y mtodos

'. 0N=(/ / D/CE EN)/0( DE( ?TE?+0 DE E>? ?+0 DE ? /N0

@A+0N0" 0(TE 0)/FN DE( ?TE?+0 EN ND. '.# 0n$lisis di erencial por 'D*D/5E de saturacin. (a puesta a punto de laelectro oresis bidimensional para e!osomas e!trados de orina de individuossanos y de pacientes con ND permiti, adem$s de ;acer un buenseguimiento de la efcacia de los mtodos de aislamiento para una correctae!traccin y deplecin de los e!osomas, llevar a cabo un estudiocomparativo por electro oresis bidimensional di erencial en gel 'D*D/5E.

ara este estudio se emple el Vit comercial para muestras escasas conmarcaje de saturacin %\)yDye D/5E Cluor (abeling Zit or carce amples\5E @ealt;care& ya


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tuvieron


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a4adida en una relacin #Pg"7KPg %tripsina"protena& en bicarbonatoamonico 7Km+ %grado @ (), c;arlau&, p@ I,7. ara parar la reaccin seemple # Pl de $cido tri6uoroactico %+ercV&. e recogi la disolucin y sellev a un tubo limpio para llevar a se


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bovina modifcada %+ercV& en un ratio #Pg"'KPg %tripsina"proteina&%toda lanoc;e,1HQ), oscuridad y agitacin&. (a reaccin de digestion se detuvomediante la adicin de #Pl de $cido tri6uoroactico %+ercV&. (a me2cla depptidos trpticos obtenida se someti a un proceso de limpie2a con unascolumnas )#I %\spin columns]& % rotea :ioesciences& siguiendo el protocolocomercial. (a muestra se llev a se


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:agsvaerd, Dinamarca& mediante una inyeccin subcut$nea cada tres das,con el propsito de evitar la muerte de estos animales pero sin corregirtotalmente la ;iperglucemia. (a administracin de insulina comen2 sietedas despus de la inyeccin con T , una ve2 se ;ubo comprobado


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los t bulos pro!imales. El da4o glomerular se defni como aumento en lae!pansin de la matri2 mesangial y da4o intersticial cuando ;ay presenciade fbrosis. ara evaluar la fbrosis intersticial, te* 4imos las secciones detejido renal con una me2cla % igma*0ldric;&, parasu conservacin.

1.3 ?btencin de e!tracto protico a partir de ri4n de rata y preparacinde la muestra para el an$lisis protemico di erencial por 'D*D/5E. (os

ragmentos de los ri4ones conservados en nitrgeno l


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Ol de cada muestra sobre papel indicador de p@ %+ercV&. (os luorocromos,se suministran como polvo slido ormando parte del Vit D/5E %)yDye D/5ECluor, minimal labeling Vit, 5E @ealt;care &y se reconstituyeron endimetil ormamida an;idra % igma*0ldric;&, creando una solucin madre auna concentracin de #m+. ara su utili2acin, la cantidad


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e!traer los geles de los cristales y ;abiendo empleado cristales de baja6uorescencia las im$genes de los geles 'D*D/5E se digitali2aron empleandoun esc$ner de 6uorescencia %Typ;oon L3KK 8ariable +ode /mager, 5E@ealt;care&. e obtuvieron las im$genes emitidas por cada 6uorocromo porseparado %aplicando las longitudes de onda de e!citacin y emisinespec icas de cada luorocromo& con una resolucin de #KK Om. (asim$genes ueron entonces importadas a los di erentes mdulos delprograma \De)yder Di^erential 0nalysis o tUare] %5E @ealt;care&, versinJ.7, con el


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sencilla a la ;ora de interpretarlos y puede usarse para ver la agrupacin delos datos y encontrar valores e!tremos o atpicos dentro de los mismos. d&

Tincin de los geles y escisin de manc;as proteicas. Tras la digitali2acinde las im$genes los geles del e!perimento 'D*D/5E se ti4eron con plata%como se detalla en el apartado#.J.b& para poder cortar las manc;asproteicas e!presadas de manera di erencial y poder as identifcarlas. 1.J /dentifcacin de las manc;as proteicas di erenciales mediante +0(D/*

T?C + . (as manc;as proteicas de los geles '*DE escindidas manualmente,tras su tincin con plata ueron digeridas autom$ticamente empleando unEttan Digester %5E @elat;care&. El protocolo de digestin empleado uedescrito por ;evc;enVo et al. R##3S con mnimas variaciones" los

ragmentos de gel ueron sometidos a reduccin empleando #Km+ de DTTen 7K m+ de bicarbonato amnico y a posterior al


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tolerancia de precursor de 7Kppm, una tolerancia de masa K,J Da en losragmentos de + -+ y permitiendo la presencia m$!ima de # nico punto

de corte allido. (os espectros de + y + -+ y los resultados de lasb s


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un 7[ de lec;e en : T. 1.I 0n$lisis di erencial del tejido renal por tcnicasinmuno;isto


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R##', #'IS J#L Tabla 7. ptidos proteotpicos de la regucalcina anali2adosen el estudio comparativo por +. esultados esultados H7 #. 0N=(/ /DE E>? ?+0 DE ? /N0 @A+0

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