Revista GEN-T. Efectos Del FR-91 Sobre Las Células Tumorales Humanas

7/26/2019 Revista GEN-T. Efectos Del FR-91 Sobre Las Células Tumorales Humanas

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L A APOPTOSIS ha sido un área de investigación

intensa, que incluye el estudio de los componen-tes que inhiben o desencadenan este mecanismode muerte celular. Siendo un importante procesoimplicado en muchas enfermedades patológicas,incluyendo el cáncer, se ha investigado nuevoscomponentes naturales en un intento de inhibiro desencadenar este proceso celular fundamen-tal haciendo la apoptosis susceptible a nuevasintervenciones biofarmacéuticas. El objetivo deeste estudio fue investigar el efecto antitumoralde FR-91, un lisado estandarizado de célulasmicrobianas pertenecientes al género Bacillus,en las líneas celulares tumorales SW872 (célulasadiposas humanas), SW982 (sarcoma sinovial

humano), HL-60 (células promielocíticas), HS

274.T (adenocarcinoma de mama), HS 313.T(linfoma), H2126 (adenocarcinoma pulmonar),TOV 21G (cáncer epitelial ovárico), WM 115S(melanoma) y HS 281T (adenocarcinoma demama). Usamos el ensayo MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-y1) 2,5 bromuro de difeniltetrazolium)para estudiar la actividad de inhibición de cre-cimiento y apoptosis del FR-91. Informamos dela actividad potencial apoptogénica de FR-91después de 24 horas de incubación a 10, 25 y 50µl/ml. Se observó apoptosis, determinada porla fragmentación del DNA celular, en las líneasHL-60, HS 313T, SW872, SW982 y TOV-21Gtratadas con 25 y 50 µl/ml de FR-91. El nivel

Gen-T50



diciembre 2009 51Gen-T

más alto de inhibición del crecimiento en el en-

sayo de citotoxicidad, se observó en las líneasSW872 (55, 78 y 87%), SW982 (50, 70, 87%) y TOV-21G (42, 66, 85%), con respecto a lascélulas no tratadas, mientras que los resultadosde la expresión de genes asociada a la apoptosisindicó regulación a la baja de Bcl-2 en todas laslíneas celulares. Todos estos resultados juntossugieren que el FR-91 contiene pequeños pépti-dos que pueden contribuir a la inducción de laapoptosis. Se requerirán futuras investigacionespara claricar la naturaleza de estos constitu- yentes bioactivos y los efectos del FR-91 in vivo sobre modelos animales experimentales tumor-inducidos.

La proliferación no regulada parece ser un sello delincremento de la susceptibilidad a la neoplasia. Laprevención del cáncer está generalmente asociadacon la inhibición, reversión o retardo en la hiper-proliferación celular. Estudios experimentales y epi-demiológicos han demostrado que una variedadde alimentos y componentes alimenticios, debidoa varias propiedades biológicas, pueden modularel sistema inmune de los mamíferos y pueden serutilizados en la prevención de muchas enfermeda-des degenerativas siendo más económicos y menosdolorosos representando así una nueva forma ra-cional de aproximación al control del cáncer.

Introducción


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Efectos de FR-91 sobre líneas celulares tumorales humanas

Es bien conocido que ciertas isoavonas y avonasde la dieta se comportan como inhibidores del cre-cimiento celular. Una de sus propiedades biológicas,es de hecho proporcionar resistencia al crecimientofúngico y bacteriano. Y aunque la mayoría de ellas

parecen ser no tóxicas para humanos y animales,han demostrado inhibir la proliferación de muchascélulas cancerígenas humanas cultivadas.

Se han presentado informes de los efectos anti-proliferativos de quercetina, taxifolin, nobiletin ytangretin a 2-8 µg/ml durante 3-7 días sobre lassiguientes líneas células tumorales: meningioma,carcinoma de pulmón, carcinoma de células esca-mosas, carcinoma de colon y leucemia.

Estudios sobre ratones, ratas y pollos han demos-trado que muchos animales son portadores de vi-rus oncogénicos latentes que se mantienen inacti-

vos pero que ocasionalmente se activan para cau-sar el desarrollo de tumores o leucemia. El procesode activación puede desencadenarse por variosfactores externos o internos, tales como la radia-ción, ciertas hormonas o productos químicos. Sinembargo, la activación de estos virus inductores detumores latentes puede ser sustancialmente retar-dada o incluso prevenida evitando o reduciendo,la exposición a ciertos factores inductores así comopor el uso de productos naturales.

Las bacterias que residen en el tracto intestinalgeneralmente tienen una relación simbiótica

con el huésped. Las bacterias beneciosas pro-ducen antibióticos naturales que mantienen losmicrobios patógenos bajo control (previniendodiarreas e infecciones) y produciendo algunas vi-taminas B en el intestino delgado dónde puedenser utilizadas. Las bacterias beneciosas ayudana) en la digestión proporcionando exo-enzimastales como la lactasa en el intestino delgado, b)fortalecimiento del sistema inmune en el intes-tino donde tienen lugar muchas de las interac-ciones entre el mundo exterior y el organismo y

c) previniendo reacciones alérgicas alimentarias.Además pueden ayudar a prevenir el cáncer endiferentes estados de desarrollo. Estas bacteriasbeneciosas pueden mejorar la absorción deminerales, maximizando la utilización de los ali-

mentos. Sin embargo, el balance entre bacteriasbeneciosas y potencialmente patógenas en elintestino es dieta-dependiente.

Estudios llevados a cabo en ratas han mostradoque los probióticos pueden inhibir la forma-ción de focos de criptas aberrantes identica-dos como lesiones precancerosas en el colon.Los mejores resultados se obtuvieron con unacepa de probióticos consumida junto a inulina,un tipo de fructooligosacárido. El total de fo-cos de criptas aberrantes químicamente indu-cidas se redujo un 74% tratando a las ratas coninulina y B. longum, pero sólo un 29% y 21%

cuando se trataron con B. longum e inulina res-pectivamente, por separado. Hubo un efecto si-nérgico usando ambos productos juntos. Se vioel mismo efectos sinérgico en ratas con azoxi-metano con cáncer de colon inducido en otroestudio. Ratas alimentadas con Raftilosa, unamezcla de inulina y oligofructosa, o Raftilosacon Lactobacillus rhaminosus (LGG) y bifdobacte-rium lactis (Bb12) tuvieron un signicante me-nor número de tumores en comparación con elgrupo control. Una mezcla probiótica, sin nin-gún prebiótico, dado a ratas a las que se habíaadministrado azoximetano, redujo los tumores

de colon comparado con el grupo control (50% vs 90%) y también redujo el nº de tumores enratas tumor-inducidas.

En el presente estudio, se han empleado diferentesconcentraciones de FR-91, un lisado estandariza-do de células microbianas pertenecientes al géne-ro Bacillus, para investigar la potencial actividadantitumoral frente a las líneas tumorales SW872,SW982, HL-60, HS274.T. HS 313.T, H2126,TOV 21G, WM115 y HS281T.


http://slidepdf.com/reader/full/revista-gen-t-efectos-del-fr-91-sobre-las-celulas-tumorales-humanas 5/1253Gen-Tdiciembre 2009

Cultivos y líneas celularesLas células adiposas humanas (SW872) y la línea

del sarcoma sinovial humana (SW982) se obtuvieron de la Colección Americana de CultivosTipo (ATCC Rockville, MD, USA). Las célulasse mantuvieron en el medio L-15 (medio Leibo- vitz-15 con L-glutamina [PAA, The Cell CultureCompany, Oasching, Austria]), suplementado con10% de suero de feto bovino inactivado al calor(FBS, PAA) y bicarbonato sódico [1,5 g/lt, Gib-co]), incubados a 37ºC y 5% CO

2. La línea celular

HL-60 (células promielocíticas) fue obtenida de laColección Americana de Cultivos Tipo (ATCCRockville, MD, USA). Las células crecieron en me-dio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFBinactivado al calor, 100 IU de Penicilina, 100 µg/

ml Estreptomicina, y 2 mM L-glutamina. La líneacelular HS 274.T (adenocarcinoma de mama)se obtuvo de Colección Americana de CultivosTipo (ATCC Rockville, MD, USA). Crecieronen medio Eagle Dulbecco modicado (DMEM)suplementado con 10% de SFB inactivado al ca-lor, 100 UI Penicilin, 100 µg/ml Estreptomicina y2 mM L-glutamina. La línea celular hipotriploi-de H2126 procedente de metástasis del derramepleural de adenocarcinoma se obtuvo de la Co-lección Americana de Cultivos Tipo (ATCC Roc-kville, MD, USA). Crecieron en medio DMEM/F12 suplementado con 5% de SFB inactivado al

calor, 100 UI Penicilin, 100 µg/ml Estreptomicina y 2 mM L-glutamina y suplemento G-5. La líneacelular TOV 21G de cáncer epitelial ovárico, seobtuvo de la Colección Americana de CultivosTipo (ATCC Rockville, MD, USA). Las célulascrecieron en medio DMEM suplementado con1% de SFB inactivado al calor, Colección Ame-ricana de Cultivos Tipo (ATCC Rockville, MD,USA). La línea celular WM 115 (melanoma) seobtuvo de la Colección Americana de CultivosTipo (ATCC Rockville, MD, USA). Las célulascrecieron en Medio Eagle (MEM), 100 UI Penici-lina, 100 µg/ml Estreptomicina y 2 mM L-gluta-mina. La línea 281T (Adenocarcinoma de mama)

se obtuvo de la Colección Americana de CultivosTipo (ATCC Rockville, MD, USA). Crecieron enmedio DMEM suplementado con 10% se SFBinactivado al calor, 100 UI Penicilina, 100 µg/mlEstreptomicina y 2 mM L-glutamina. El stock decélulas se mantuvo en nitrógeno líquido.

Antes de ser usadas en ensayos experimentales, lascélulas crecieron en monocapa dónde se liberarondel falcon con 0,25% de tripsina (PAA), lavadas 2 veces con medio fresco y posteriormente sembra-das en microplaca de 96 pocillos. El recuento decélulas viables se conrmó antes de cada experi-mento usando exclusión por tripán.

Reactivos químicosEl medio RPMI 1640 Buffer Hepes, DMEM,DMEM/F-12, L-15, MEM, Tripsina, suple-mento G-5 y el CrioMaxx se obtuvieron dePAA. La Glutamina y los antibióticos (Penicili-

na y Estreptomicina) se compraron en Sigma-Aldrich (Madrid, España).

Ensayo de reducción MTTEl ensayo de proliferación celular se determi-nó usando el ensayo MTT. Las líneas celulares(1x105 cel/ml) se incubaron en placa de 96 po-cillos con diferentes dosis de FR-91 (10, 25 y50 µl/w) durante 24 horas. Se añadió 10 µl deMTT (10 mg/ml) a cada pocillo y se incubarona 37ºC durante 4 horas. Tras la incubación, elprecipitado MTT-formazan se disolvió en 100µl de DMSO y la absorbancia fue registradaa 570nm en un lector automático (BioRAD).

Los datos se presentaron como el % de cito-toxicidad frente a las células no tratadas.

Determinación de DNA en escaleraLa determinación de DNA en escalera fue rea-lizada por el método estándar. Este métodopreviene la contaminación del DNA genómicocompleto con DNA fragmentado. En resumen,después del tratamiento con FR-91, las célulasfueron recogidas, lavadas 2 veces con PBS frío y lisadas durante 30 minutos a 4ºC en buffer delisis (50 mM Tris-HCL, pH 7.5, 1 mM EDTA.,0,2% TRiton X-100) usando cuentas de zirco-

nium y lisador automático de células.

Después se centrifugó a 15.000 x g durante 20minutos. El sobrenadante se trató con un cóctelinhibidor de la proteasa y 0,5% SDS durante1hora a 37ºC. Se extrajo el DNA dos veces confenol y se precipitó con 150 mM de CLNa y dos

volúmenes de etanol a -20ºC. El DNA precipita-do se lavó dos veces con etanol frío 70%, disuel-to en TE buffer y tratado durante 1 hora conRNAasa a 37ºC. Finalmente, los precipitadosde DNA fueron teñidos con yoduro de propidio,realizada la electroforesis sobre gel de agarosa al2% y visualizado en un sistema automático dedocumentación de gel (BioRAD system).

Estimación cuantitativa de fragmentación de DNAusando un ensayo de inmuno absorción ligado a en-zimas (Enzyme-linked immunosorbent assay -ELISA )Tras el tratamiento con tripsina, las células serecogieron con una breve centrifugación y se

Materiales y métodos

El equilibrio entre las bacterias

beneficiosas y potencialmente patógenas

en el intestino es dependiente de la dieta

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transrieron a una microplaca de 96 pocillosa una densidad de 1 x 104 cel/pocillo (Costar)e incubadas toda la noche en medio comple-to a 37ºC y 5% de atmósfera de C0

2. Al día

siguiente el medio se cambió por 100 µl demedio completo con o sin la concentraciónindicada de 10, 25 y 50 µl de FR-91 incuba-das de nuevo durante 24 horas más. En algu-nos experimentos, las células se preincubaroncon Z-vad-FMK (Promega) o inhibidor de laadenosin kinasa 5´-iodotubercidin (IT; Sigma)antes de la incubación con FR-91. Después deesto, los fragmentos de DNA fueron cuanti-tativamente estimados en las restantes célulasjadas usando la técnica de ELISA (Cell De-tection ELISA plus, Behringer Mannheim, Man-nheim Germany). De acuerdo al protocolo del

fabricante.

Se midió la absorbancia a 405 nm (referenciaa 492 nm) en cada pocillo y la media ± fuetrazada como una función de la concentracióndel agente indicado. Todas las incubacionescontrol contenían la máxima concentración deDMSO el cual tenía una concentración típi-ca <0,1%. La concentración de DMSO hasta1,25% no indujo una fragmentación signica-tiva de DNA (datos no mostrados). Cada ex-perimento independiente se llevó a cabo portriplicado usando todas las diferentes líneascelulares tumorales.

Aislamiento de RNA y RT-PCREl RNA celular total fue aislado mediante lisisen un buffer de tiocianato guanidina por unsimple proceso de extracción con fenol: cloro-formo: alcohol isoamilo. En resumen las célu-las fueron recolectadas y lisadas en una solu-ción que contenía 4M isocianato de guanidina,25mM de sodio citrato, (pH 7.0), 0,5% sodiosarcosina y 0,1 M βmercaptoetanol. Secuen-cialmente, se añadió para homogeneizar 1/10 volumen de 2M acetato sódico (pH 4,9) un vo-lumen de fenol y 1/5 volumen de cloroformoalcohol isoamilo (49:1,v/v).

Después de agitar vigorosamente durante 30segundos, la solución fue centrifugada a 10.000x g durante 15 minutos a 4ºC. El RNA de lafase acuosa se precipitó por la adicción de 0,5ml de isopropanol. Un µg del RNA total sufrió

un proceso de transcripción inversa en cDNApor incubación con 200 unidades de transcrip-tasa inversa en 20 µl de buffer de reacción quecontenía 0,25 µg random primers (cebadoraleatorio) y 0,8 mM dNTPs a 42 ºC durante 1hora. Dos µl de cada primer (cebador) y 5 uni-dades Taq DNA polimerasa durante 30 ciclosde desnaturalización a 94ºC durante 1 minutoa la temperatura de hibridación de 55ºC/1 min y extensión a 72ºC/2 min. Los productos resul-tantes de la PCR se analizaron en electroforesisde 1,5% gel de agarosa. Las secuencias para loscebadores especícos usados en la PCR pare-cen resumidas en Tabla 1.

Análisis estadísticosTodos los test estadísticos fueron llevados a cabousando SPSS (versión 11.0; SPSS Inc, Chicago) ya valor P <0,005 signicado estadístico indicado.

Los datos se analizaron usando factor doblede análisis de medidas repetidas de varianza(ANOVA) seguido por análisis post hoc, don-de el 1-factor medida repetidas ANOVA, se-guido por el test de Turkey’s para un efectosignicante de dosis y emparejado t test paraun signicante efecto del tratamiento FR-91.

Inhibición del crecimiento en líneas celularestumorales de FR-91Para examinar el posible efecto antineoplásico delFR-91 en células tumorales, se determinó primerosu efecto sobre el crecimiento celular mediante elensayo MTT, el cual mide el metabolismo de lascélulas vivas basado en su actividad mitocondrialdehidrogenasa. Como muestra la Fig 1, FR-91 ori-gina inhibición del crecimiento dosis dependiente.La citotoxicidad no fue limitada a una línea celularespecíca sino que otras 5 líneas celulares fueron

sensibles a los efectos del FR-91. El mayor nivel deinhibición del crecimiento se observó en la líneaSW872 (55%, 78%, 87%), SW982 50%, 70%,87%) y TOV-21G (42%, 66%,85%) mientras queen la línea HL-60 (6%,33%,48%) y en HS 313.T(5%, 50% 60%) mostraron un ligero, pero signi-cativo efecto citotóxico en comparación con lascélulas no tratadas.

A concentraciones más bajas de FR-91 (10µl/ml) se observó una diferencia signicativaentre las células control y las líneas tumoralesSW872, SW982, y TOV-21G. No se observóefecto citotóxico en HS 274.T, H2126, WM

Resultados



115, y HS281.T. Para determinar si es reversi-ble el efecto antiproliferativo, las líneas SW872,SW982, y TOV-21G fueron tratadas con 25µl/ml de FR-91 o con medio de cultivo durante48 horas. Las células tratadas con FR-91 y las

que sólo lo hicieron con medio, se incubaronen medio completo durante 0, 6, 24, y 72 ho-ras seguidamente se tripsinaron y se realizó elrecuento. Tras 48 h de tratamiento con FR-91,el número de células había decrecido un 50%en todas las líneas celulares. Una vez eliminadoel FR-91 el nº de células no se incrementó perobastantes mostraron una pequeña disminuciónadicional, mientras que el número de células,en ausencia de tratamiento, se incrementó conel tiempo ( Fig 2 ). Estos datos indican que el FR-91 no tiene efecto reversible.

Inducción de la apoptosis en líneas celulares

tumorales con FR-91Lo siguiente fue testar si la administración deFR-91 indujo efectos citotóxicos en las líneas tu-morales humanas SW872, SW982, HL-60, HS274.T, HS 313.T, H 2126, TOV 21G, WM115,HS 281.T. Cuando las células fueron tratadas con10, 25, y 50 µl/ml de FR-91 durante 24 horas yse las examinó morfológicamente al microscopio,se observó que una porción de las células mos-traba condensación (punta de echa) y escisión(echa) del núcleo, ambos típicos de la apopto-sis ( Fig 3 ). Ninguna de estas imágenes se observóen las células control no tratadas. Los resultados

siguientes, medidos en absorbancia, (570 nm),claramente muestran que el tratamiento conFR-91 induce a la apoptosis en las líneas celu-lares HL-60 (FR-91 25 µl/ml: 0,96, p<0,001 vsnegativo, 0,12, y positivo, 1,47, de los controles).FR-91 50 µl/ml: 1,1 p<0,001 vs negativo 0,18 ypositivo 1,72 del control); HS 313T (FR-91 25µl/ml: 0,77, p<0,001 vs negativo 0,18 y positivo1,72 del control; FR-91 50 µl/ml: 0,68, p<0,001 vs negativo, 0,18 y positivo, 1,72 del control);SW872 (FR-91 10 µl/ml: 0,58, p<0,001 vs ne-gativo, 0,17, y positivo; FR-91 25o 1,64 del con-trol; FR-91 25 µl/ml: 0,76, p<0,001 vs negativo,0,17, y positivo, 1,64 del control; FR-91 50 µl/ml

p<0,001: 1,55 µl/ml vs negativo 0,17 y positivo,1,64 del control); SW982 (FR-91 10 µl/ml 0,77,p<0,002 vs negativo, 0,24 y positivo1,8 del con-trol; FR-91 25 µl/ml: 0,99, p<0,001 vs negativo,0,17 y positivo 1,64 del control; FR-91 50 µl/ml:1,48, p<0,001 vs negativo 0,17 y positivo 1,64 delcontrol); y TOV-21G 25 µl/ml: 0,58, p<0,001 vsnegativo 0,17 y positivo 1,8 del control; FR-9150µl/ml: 1,6, p<0,001 vs negativo, 0,17 y posi-tivo 1,8 del control ( Fig 4 ). El DNA procedentede las líneas celulares tratadas HL-60, HS 313.T,SW872, SW982, y TOV-21G con FR-91 duran-te 24 horas mostró fragmentación nucleosomalen escalera sobre electroforesis de gel de agarosa

(datos no mostrados). No se observaron signos deapoptosis en las líneas HS 274.T (FR-91 10 µl/ml: 0,22, p=0,28 vs negativo 0,2 y positivo 1,65del control; FR-91 25 µl/ml: 0,24, p= 0,08 vsnegativo 0,22 y positivo 1,65 del control; FR-9150 µl/ml: 0,2, p= 0,33 vs negativo 0,22 y positivo, 1,65 del control); HS2126 (FR-91 10 µl/ml:0,18, p= 0,32 vs negativo, 0,2 y positivo 1,75 del

Figura 1Inhibición del crecimiento de las líneas celulares humanas SW872, SW982, HL-60, HS 274.T, HS313.T, H2126, TOV 21G, WM 115 y HS 281T. Las células se cultivaron en microplacas de 96 pocillosy expuestas a tres dosis de FR-91 (10, 25 y 50μl/ml). La inhibición del crecimiento se expresa comoel porcentaje de las células expuestas al medio de cultivo. La media fue calculada a partir de 5 expe-rimentos independientes por triplicado.

Figura 2

Efecto antiproliferativo de FR-91 en las células SW 872, SW 982 y TOV-21G. Las células se tratarondurante 48 horas con 25μl/ml de FR-91 o medio completo. El medio fue reemplazado con medio sóloy después varias veces (0-72 horas) las células fueron tripsinazas y recontadas. Los resultados seexpresan en relación al control (48 horas de incubación con medio). Todos los valores son la media delos cultivos por triplicado en tres experimentos independientes.




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control, FR-91 25 µl/ml: 0,23, p= 0,78 vs nega-tivo, 0,2 y positivo 1,75 del control; FR-91 50 µl/ml: 0,22, p=0,52 vs negativo, 0,2 y positivo 1,75del control), WM 115 (FR-91 10 µl/ml: 0,23, p=0,25 vs negativo, 0,14 y positivo, 1,69 del control;FR-91 25 µl/ml: 0,22, p=0,27 vs negativo, 0,14 ypositivo, 1,69 del control; FR-91 50 µl/ml: 0,24,p=0,07 vs negativo, 0,14 y positivo, 1,69 del con-trol) y HS 281T (FR-91 10 µl/ml: 0,2, p= 0,25 vs negativo 0,24 y positivo 1,81 del control; FR-91 25 µl/ml: 0,22, p= 0,27 vs negativo, 0,24 ypositivo 1,81 del control; FR-91 50 µl/ml: 0,24p=0,07 vs negativo, 0,24 y positivo 1,81 del con-trol ( Fig 5 ).

Expresión del gen regulador Bcl-2 en líneas tumo-rales tratadas con FR-91En una investigación siguiente se estudiaron losmecanismos moleculares responsables de queel FR-91 indujera apoptosis en las líneas HL-

60, HS 313T, SW872, SW982 y TOV-21G. Seanalizó la expresión genética de algunos genesde apoptosis tales como p53, p21, Bax y Bcl-2por Rt-PCR ( Fig 6 ). El tratamiento con FR-91originó la regulación de la expresión del genBcl-2, mientras que no fueron afectados otrosgenes. Por tanto mostraron un relativo incre-mento de la selección Bax/Bcl-2.

En un intento de comprender y tratar las enfer-medades, se han descubierto, por ensayo y error, varios componentes naturales que han sido

usados durante miles de años por una fracciónimportante de la población en muchos países yregiones alrededor del mundo. Se estima, quealrededor de un 25% de los fármacos mundial-mente prescritos actualmente, derivan de plan-tas y que un 60% de los medicamentos antican-cerígenos/antiinfecciosos, en el mercado o bajoexperimentación clínica, son de origen natural y que extractos procedentes de plantas comoTaxol, curcumina, ácidos fenólicos, y avonoi-des se han descrito como inhibidores del creci-miento tumoral en muchos tipos de cánceres. Elcrecimiento tumoral está generalmente asociado

con cambios marcados en la hematopoyesis, in-muno respuesta, mielosupresión y anemia.

El sistema inmune tiene varios recursos potencia-les para limitar, e incluso prevenir, el crecimientotumoral. Entre estos se incluyen: a) Inmunidadespecíca contra tumores mediada por células Tasociada a antígeno transplante (TATAs.); b) Pro-ducción de anticuerpos contra TATAs y/o otrasestructuras antigénicas asociadas con células tu-morales; c) Inmunidad natural cel-mediada con-tra tumores la cual consiste, principalmente, decélulas natural-killer (NK) y macrófagos activados y d) Anticuerpos antitumorales naturales.

Aunque hay alguna evidencia de efecto antitu-moral de anticuerpos especíca o naturalmenteinducidos, particularmente si son citotóxicos, enpresencia de complemento o en combinación conlinfocitos o macrófagos que expresan receptorespara la porción Fc de las inmunoglobulinas, y porlo tanto puede mediar entre anticuerpo cel-depen-diente de la citotoxicidad cel-mediada ADCC), lamayoría de la atención y de los datos experimen-tales han estado focalizados sobre la inmunidadcel-mediada como la base para una posible resis-tencia del huésped contra el crecimiento progresivodel tumor. Ha habido mucho interés y controversia

Figura 3Examen morfológico de las células SW 982 tratadas con FR-91. Las células SW 982 fueron cultivadasen presencia o ausencia de 25μl/ml de FR-91 y 1μl/ml de una mezcla inductora de apoptosis (Actino-micina D, Camptothecin, Cicloheximida, Dexasometasona, Etoposide) como un control positivo de lainducción a la apoptosis, durante 24 horas COTAL y como se indicó en la sección de materiales y mé-todos. Después de la tinción de Giemsa, se examinó la apariencia morfológica de las células usandola luz del microscopio. Las flechas negras indican condensación nuclear. Células típicas apoptósicas,caracterizadas por núcleos separados como indican las flechas negras. Aumento de 400 x.

Discusión



durante muchos años sobre el posible papel de cadauno de estos mecanismos inmunológicos en preve-nir el desarrollo inicial de tumores detectables.

Las consideraciones entre estas líneas abarcanla vigilancia inmunológica contra los tumores.Se ha realizado un informe de una versión ac-tualizada de esta hipótesis, la cual incluye lapotencial participación de células NK y otrosaspectos de inmunidad natural así como la in-munidad especíca mediada por células T.

El más convincente apoyo a esta hipótesis ha venido de observaciones, en situaciones clínicasasí como en modelo experimental animal, delos tumores más sustancialmente frecuentes de-sarrollados en individuos inmunodecientes encomparación con individuos con un funciona-miento normal del sistema inmune. Por ejemplo,el desarrollo frecuente de la enfermedad linfo-proliferativa en pacientes inmuno suprimidoscon trasplante de algún órgano, pacientes infec-tados con el virus del SIDA, o en niños con

Figura 4Detección de la fragmentaciónde DNA en las líneas celularesHL-60, HS 313 T, SW 982 yTOV-21G después del cultivodurante 24 horas en presenciade las concentraciones indica-

das de FR-91 y 1μl/ml de unamezcla inductora de apoptosis(Actinomicina D, Camptothecin,Cicloheximida, Dexametasona,Etoposide) como un controlpositivo de la inducción a laapoptosis. Los experimentosfueron repetidos 5 veces y losresultados son expresadoscomo densidad óptica.

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inmunodeciencia congénita, donde el sistemainmune tiene un papel en la prevención de este

tipo de cáncer. Sin embargo ha sido muy efec-tivo en la vigilancia del sistema inmune. Es unhecho bastante posible que diferentes seccionesdel sistema inmune contribuyan a la resistenciacontra el desarrollo del tumor primario con laapariencia de una enfermedad maligna ma-niesta posiblemente representando el fallo demás de una línea de defensa.

Aunque hay al menos 120 sustancias químicasútiles como medicamentos antineoplásicos, yentre ellas Paclitaxel (Taxol), aislada de tres es-pecies del género Taxus, procedentes de plantasde todo el mundo, existe todavía controversia

sobre el papel de componentes naturales enel tratamiento de diferentes tipos de tumores.

Estudios epidemiológicos, que valoran la inges-tión diaria de componentes naturales aunquebasados rmemente en hipótesis biológicamen-te plausibles, han proporcionado ayuda para laasociación entre la reducción del riesgo y laingesta bioactiva en la mayoría, aunque no enla totalidad de los datos de los estudios publica-dos. Aunque el extracto FR-91 ha demostradoin vitro e in vivo actividad antineoplásica contradiferentes líneas celulares tumorales, no ha sidocompletamente examinado el mecanismo deeste efecto. En este estudio, el FR-91 demostrócitotoxicidad selectiva in vitro en células tumo-rales humanas testadas (liposarcoma, sarcoma,

Figura 5 Detección de la fragmentaciónde ADN en las líneas celularesHS 274.T, H2126, WM 115 yHS 281T después del cultivo

durante 24 horas en presenciade las concentraciones

indicadas de FR-91 y de 1μl/ ml de una mezcla inductora

de apoptosis (Actinomicina D,Camptothecin, Cicloheximida,

Dexametasona, Etoposide)como un control positivo de lainducción a la apoptosis. Los

experimentos fueron repetidoscinco veces y los resultados

están expresados como densi-dad óptica.



líneas celulares tumorales mielocíticas, de ova-rio y linfoma) cuando se las compara con célu-las no tratadas. Más aún, FR-91 mostró el mayor efecto citotóxico en cel. HS.313.T que sonresistentes a la quimioterapia. La habilidad de

este compuesto para matar efectivamente va-rios tipos de tumores sin efecto aparente en cé-lulas normales indica que este compuesto pue-de ser un potencial agente quimioterapéutico.La inducción a la apoptosis del FR-91 ocurrióde una manera dosis dependiente y se acompa-ñó de la disrupción del potencial mitocondrialtransmembrana (datos no mostrados) y la acti- vación de caspasa-3 y quizás la caspasa-8.

El resultado del estudio sugiere que el FR-91 in-habilita la proliferación de las células tumoralespor un mecanismo que implica citotoxicidad.La forma predominante de la muerte celular

es la apoptosis puesto que se vio inicialmentela apoptosis en la muerte celular. Sin embargo,a periodos de incubación mayor, se observó lamuerte celular por necrosis. Es probable quela muerte celular por necrosis ocurriera comoun efecto secundario, y que sea un fenómeno visto in vitro debido a la falta de fagocitosis decel blancas. Sin embargo, la posibilidad de queFR-91 cause ambas formas de muerte celularno puede ser excluida y la incidencia de estasformas de muerte depende de la concentraciónempleada y del periodo de incubación.

La apoptosis es regulada y ejecutada por la in-teracción de diferentes genes frente a varios estí-mulos. Hay dos caminos centrales que conducena la apoptosis.1) inducción positiva a la unión alos receptores de la membrana plasmática y 2)inducción negativa por pérdida de una actividadsupresora. La inducción positiva implica ligandosrelacionados con TNF, mientras que la inducciónnegativa de la apoptosis por pérdida de la activi-dad supresora implica a las mitocondrias. El estu-dio de la apoptosis en la terapia del cáncer es muyimportante. Ha sido probado que la aparicióndel cáncer es debida a la pérdida de control de laapoptosis normal y a la alteración del equilibrio

entre la apoptosis y la proliferación celular. Los ge-nes relacionados con la apoptosis (familia de Bcl-2)están divididos en 2 categorías: apoptosis represor y apoptosis promotor. El Bcl-2 es un importan-te apoptosis represor mientras que el Bax es unimportante apoptosis promotor. La proteína quecodica puede combinarse con Bcl-2 para formarcompuestos que resisten la acción de la apoptosisrepresiva, pero tiene una acción reguladora posi-tiva. Estudios recientes indican que la regulaciónde la apoptosis por Bcl-2 y Bax no está solamentebasada en el nivel de cualquiera de las dos proteí-nas reguladoras sino que también está basada enla proporción de las mismas. Si el ratio es alto, las

células se dirigen a la apoptosis. Todas las líneascelulares utilizadas en el presente estudio, han sidoproducidas por una variedad de reactivos quími-cos para experimentar apoptosis a través de dife-rentes vías como por ejemplo p53-dependiente ofamilia relacionada con Bcl-2.

Para aclarar el mecanismo de apoptosis me-diada por diferentes concentraciones de FR-91

examinamos la expresión de los genes incluyen-do p53, p21, Bax y la familia de Bcl-2 por PCR-RT. Los resultados indicaron que la apoptosisocurrió en las líneas HL-60, HS 313T, SW872,SW982 y en TOV-21G tratadas con 25 µl/mlde FR-91 acompañado por la expresión de laregulación a la baja del gen Bcl-2, dosis depen-diente mientras que en otras no hubo cambiossignicativos ( Fig 6 ). En el estudio presente de-mostramos que el incremento relativo del ratioapoptótico Bax/Bcl-2 tuvo buena correlacióncon la apoptosis inducida por FR-91 en dife-rentes líneas celulares humanas. Es posible queel FR-91, por una señal apropiada, induzca un

cambio conformacional en el gen Bax el cual semueve a la membrana mitocondrial donde ori-gina la liberación del citocromo mitocondrial cdentro del citosol .

En conclusión, el uso del extracto FR-91 de-muestra un efecto de inducción a la apoptosisen varias líneas celulares humanas. Aunquese puedan llevar a cabo estudios futuros paraaclarar los mecanismos por los cuales el FR-91induce a la apoptosis en líneas celulares huma-nas, los datos actuales indican que el FR-91 po-dría ser un compuesto quimioterapéutico útilen pacientes con diferentes tipos de tumores.

Figura 6 FR-91 induce la regulación a la baja de Bcl en las líneas celulares HL-60, HS 313T, SW 872, SW 982,y TOV-21G. Las células fueron tratadas con 25μl/ml de FR-91, como se indicó durante 24 horas. Y lascélulas fueron recolectadas para aislamiento de RNA y RT-PCR. Los controles positivos fueron trata-dos con 1μl/ml de ua mezcla inductora de apoptosis (Actinomicina D, Camptothecin, Cicloheximida,Dexametasona, Etoposide) como un control positivo de la inducción de la apoptosis. Los experimentosse repitieron 3 veces y los resultados son expresados como el % de la expresión génica comparadacon los controles positivos.

Dr. Valter R.M. Lombardi

[email protected]



Referencias

1. Voutilanen S, Nurmi T, Mursu J, RissanenTH. Carotemoids and cardiovascular health.

Am J Clin Nutr 2006; 83:1265-71.

2. Biesalski HK. Diabetes preventive compo-nents in the Mediterranean diet. Eur J Nutr.

2004; 43 Suppl 1:l/26-30.

3. Slattery ML, Curtin KP, Edwards SL, Schaffe rDM: Plants foods, fiber, and rectal cancer.

Am J Clin Nutr 2004; 79:274-81.

4. Pan MH, Ho CT. Chemop revent ive effectsof natural dietary compounds on can-cer development. Chem Soc Rev 2008;37:2558-74.

5. Fan E, Jiang S, Zhang L, Bai Y. Molecularmechanism of apoptosis induction by res-veratrol, a natural cancer chemopreventiveagent. Int J Vitam Nutr Res 2008; 78 (1): 3-8.

6. Yang H, Landis-P iwowar KR, Chen D, Milacic

V, Dou QP. Natural compounds with protea-some inhibitory activity for cancer preven-tion and treatment. Curr Protein Pept Sci2008; 9:227-39.

7. Yu W, Jia L, Wang P, Lawson KA, Simmons-Menchaca M, Park SK, Sun L, Sanders BG,Kline K. In vitro and in vivo evaluation ofanticancer actions of natural and syntheticvitamin E forms. Mol Nutr Food Res 2008;52:447-56.

8. Choi EJ, Bae SM, Ahn WS. Antiproliferativeeffects of quercetin through cell cycle ar-rest and apoptosis in human breast cancerMDA-MB-453 cells. Arch Pharm Res 2008;31:1281-5.

9. Brusselmans K, Vrolix R, Verhoeven G, Swin-nen JV. Induction of cancer cell apoptosisby flavonoids is associated with their abilityto inhibit fatty acid synthase activity. J BiolChem 2005; 280:5636-45.

10. Luo G, Guan X. Zhou L. Apoptotic effect ofcitrus fruit extract nobiletin on lung cancercell line A549 in vitro and in vivo. CancerBiol Ther 2008; 7:966.73.

11. Kong D, Aoki S, Sowa Y, Sakai T, KobayashiM. Smenospongine, a sesquietrpene amino-quinone from a marine sponge, induces g1arrest or apoptosis in different leukemiacells. Mar Drugs 2008; 6:480-8.

12. Rezacova M, Zaskodova D, Vavrova J, Vok urkova D, Tichy A. Ant il eukemic ac-tivity of the combination of ionizing radi-ation with valproic ac id in promyelocyticleukemia cells HL-60. Neoplasma 2008;55:519-25.

13. Lollini PL, Nicoletti G, Landuzzi L, De Gio-vanni C, Nanni P. New target antigens forcancer inmunoprevention. Curr Cancer DrugTargets 2005; 5:221-8.

14. Salvini F, Granieri L, Gemmellaro L, Giovan-nini M. Probiotics, prebiotics and child health:where are we going? J Int Med Res 2004;32:97-108.

15. Chouraqui JP, Grathwohl D, Labaune JM, Has-coet JM, de Montgolfier I, Leclaire M, Giarre M,Steenhout P. Assessment of the safety, toler-ance, and protective effect against diarrhea ofinfant formulas containig mixtures of probiot-ics and prebiotics in a randomized controlled

trial. Am J Clin Nutr 2008; 87:1365-73.

16. Macfarlane GT, Steed H, Macfarlane S. Bacte-rial metabolism and health-related effects ofgalacto-oligosaccharides and other prebiot-ics. J Appl Microbiol 2008; 104:305-44.

17. Blaut M, Clavel T. Metabolic diversity of theintestinal microbiota: implications for healthand disease. J Nutr 2007; 137:751S-5S.

18. Isolauri E, Salminen S; Nutrition, Allergy, Mu-cosal Inmunology, and Intestinal Microbiota(NAMI) Research Group Report. Probiotics:use in allergic disorders: a Nutrition, Allergy,Mucosal Inmunology, and Intestinal Micro-biota (NAMI) Research Group Report. J Clin

Gastroenterol 2008; 42:S91-S96.

19. Klein K, Stevens R. The clinical use of probi-otics for young children. J Farm Health Care2008; 18:66-8.

20. Ouwehand AC. Antiallergic effects of probiot-ics. J Nutr 2007; 137:794S-797S.

21. del Giudice MM, Rocco A, Capristo C. Probiot-ics and the atopic march: highlights and newinsights. Dig Liver Dis 2006; 38:S288-S290.

22. Parvez S, Malik KA, Ah Kang S, Kim HY. Pro-biotics and their fermented food products arebeneficial for health. J Appl Microbiol 2006;100:1171-85.

23. Milner JA. Nutrition and cancer: essentialelements for a roadmap. Cancer Lett 2008;269:189-98.

24. Rowland IR, Rumney CJ, Coutts JT, LievenseLC. Effect of Bifidobacterium longum andinulin on gut bacterial metabolism and car-cinogen-induced aberrant crypt foci in rats.Carcinogenesis 1998; 19:281-5.

25. Femia AP, Luceri C, Dolara P, Giannini A, Big-geri A, Salvadori M, Clune Y, Collins KJ, Pagli-erani M, Caderni G. Antitumorigenic activity ofthe prebiotic inulin enriched with oligofructosein combination with the probiotics Lactobacil-lus rhamnosus and Bifidobacterium lactis onazoxymethane-induced colon carcinogenesis

in rats. Carcinogenesis 2002; 23:1953-60.

26. Marotta F, Naito Y, Minelli E, Tajiri H, BertuccelliJ, Wu CC, Min CH, Hotten P, Fesce E. Chemo-preventive effect of a probiotic preparation onthe development of preneoplastic and neo-plastic colonic lesions: an experimental study.Hepatogastroenterology 2003; 50:1914-8.

27. Wang JW, Cheng JQ. A simple method forprofiling miRNA expression. Methods Mol Biol2008; 414:183-90.

28. Drago-Ferrante R, Santulli A, Di Fiore R, Giulia-no M, Calvaruso G, Tesoriere G, Vento R. Lowdoses of paclitaxel potently induce apoptosos

in human retinoblastoma Y79 cells by up-reg-ulating E2F1. Int J Oncol 2008; 33:677-87.

29. Hussain AR, Ahmed M, Al-Jomah NA, Khan AS, Manogaran P, Sultana M, Abubaker J, Pla-tanias LC, Al-Kuraya KS, Uddin S. Curcumin

suppresses constitutive activation of nuclearfactor-kappa B and requires functional Bax toinduce apoptosis in Burkitt’s lymphoma celllines. Mol Cancer Ther 2008; 7:3318-29.

30. Seeram NP. Berry fruits for cancer prevention:currente status and future prospects. J AgricFood Chem 2008; 56:630-5.

31. Raza H, John A. In vitro effects of tea polyphe-nols on redox metabolism, oxidative stress,and apoptosis in PC12 cells. Ann N Y Acad Sci2008; 1138:358-65.

32. Varela JC, Imai M, Atkinson C, Ohta R, Rap-isardo M, Tomlinson S. Modulation of protec-tive T cell inmunity by complement inhibitor

expression on tumor cells. Cancer Res 2008;68:6734-42.

33. Bergmann C, Strauss L, Wang Y, Szczepan-ski MJ, Lang S, Johnson JT, Whiteside TL. Tregulatory type 1 cells in squamous cell car-cinoma of the head and neck: mechanismsof suppression and expansion in advance dis-ease. Clin Cancer Res 2008; 14:3706-15.

34. Rethi B, Vivar N, Sammicheli S, Fluur C, RuffinN, Atlas A, Rajnavolgyi E, Chiodi F. Priming of Tcells to Fas-mediated proliferative signals byinterleukin-7. Blood 2008; 112:1195-1204.

35. Sullivan RJ, Pantanowitz L, Casper C, Steb-bing J, Dezube BJ. HIV/AIDS: epidemiology,pathophysiology, and treatment of Kaposisarcoma-associated herpesvirus disease:Kaposi sarcoma, primary effusion lymphoma,and multicentric Castleman disease. Clin In-fect Dis 2008; 47:1209-15.

36. Chua I, Quinti I, Grimbacher B. lymphoma incommon variable inmunodeficiency: interplaybetween inmune dysregulation, infection andgenetics. Curr Opin Hematol 2008; 15:368-74.

37. Johansson M, Persson JL. Cancer therapy:targeting cell cycle regulators. Anticancer

Agents Med Chem 2008; 8:723-31.

38. Brantley EC, Nabors LB, Gillespie Gy, Choi YH,Palmer CA, Harrison K, Roarty K, BenvenisteEN. Loss of protein inhibitors pf activated

STAT-3 expression in gioblastoma multiformetumors: implications for STAT-3 activationand gene expression. Clin Cancer Res 2008;14:4694-704.

39. Heat-Engel HM, Chang NC, Shore GC. Theendoplasmic reticulum in apoptosis and au-tophagy: role of the BCL-2 protein family. On-cogene 2008; 27:6419-33.

40. Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahsan H, MukhtarH, Ahmad N. Combination of vitamin E andselenium causes an induction of apopto-sis of human prostate cancer cells by en-hancing Bax/Bcl-2 ratio. Prostate 2008;68:1624-34.

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Revista GEN-T. Efectos Del FR-91 Sobre Las Células Tumorales Humanas