RPB v20n3

Rev. peru. biol. ISSN 1561-0837

Universidad nacional Mayor de san MarcosFacUltad de ciencias Biolgicas

volUMen 20 Marzo, 2014 nMero 3

LIMA, PER

revistaPerUana de

Biologa

2revista PerUana de BiologaPublicacin cientfica de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Maximilian Weigend Freie Universitt Berlin- AlemaniaHlio Ricardo da Silva Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, BrazilCarlos Frederico Duarte da Rocha Universidade do Estado do Rio de Janeiro- BrasilFabrcio Rodrigues dos Santos Universidade Federal de Minas Gerais- BrasilDavor Vrcibradic Universidade do Estado do Rio de Janeiro- BrasilBerta Calonge Camargo Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, ColombiaSergio Solari Universidad de Antioquia- ColombiaFinn Borchsenius Aarhus University- DenmarkJulissa Roncal Aarhus University- DenmarkArnaud Bertrand IRD. Institut de recherche pour le dveloppement- FranciaFrancis Kahn IRD. Institut de recherche pour le dveloppement, - FranciaJean-Christophe Pintaud Institut de Recherche pour le Dveloppement- FranciaMutsunori Tokeshi Kyushu University - JaponFrancisco Alonso Sols Marn Universidad Nacional Autnoma de Mxico- Mxico

Mnica Romo Asociacin Peruana para la Conservacin de la Naturaleza- PerRenato Guevara-Carrasco Instituto del Mar del Per- PerReynaldo Linares-Palomino Universidad Nacional Agraria La Molina- PerMarcel Gutirrez-Correa Universidad Nacional Agraria La Molina - PerGretty K. Villena Universidad Nacional Agraria La Molina - PerGerardo Lamas Universidad Nacional Mayor de San Marcos- PerPablo Ramrez Universidad Nacional Mayor de San Marcos- PerJuan Tarazona Universidad Nacional Mayor de San Marcos- PerArmando Yarlequ Universidad Nacional Mayor de San Marcos- PerManuel Tantalen Universidad Peruana Cayetano Heredia- PerNigel Pitman Duke University- USAMaria del Carmen Ulloa Ulloa University of Missouri- USAKenneth Young University of Texas at Austin USAPaul Velazco American Museum of Natural History, USA

RectorDr. Pedro Atilio Cotillo Zegarra Vicerrector de Investigacin Dr. Bernardino Ramrez BautistaConsejo Superior de InvestigacinDr. Manuel Gngora Prado Decana de la Facultad de Ciencias BiolgicasMag. Olga Bracamonte GuevaraInstituto de Investigacin en Ciencias Biolgicas Antonio RaimondiMag. Ins Miriam Grate Camacho

Editor JefeLeonardo Romero, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.Editores asociadosDra. Rina Ramrez, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.Dra. Mnica Arakaki-Makishi, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.Dra. Diana Silva Dvila, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Revista Peruana de BiologaHecho el Depsito Legal 98-3017Rev. peru. biol. - ISSN-L 1561-0837Rev. peru. biol. - ISSN 1561-0837Rev. peru. biol. - ISSN 1727-9933 (on line)http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/rpb/http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/biologia/biologiaNEW.htmhttp://redalyc.uaemex.mx/

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Informacin adicional a: Revista Peruana de BiologaFacultad de Ciencias Biolgicas UNMSMCiudad Universitaria, Av. Venezuela Cdra. 34 s/n. LimaCasilla Postal: 11-0058 Lima-11, Per.Telfono 619-7000-1502 / Telefax 619-7000-1509Editor Jefe, email: [email protected]

Resumida/Indizada (Abstracted/Indexed) en:Peridica (ndice de Revistas Latinoamericanas en Ciencias), LIPECS (Literatura Peruana en Ciencias de la Salud), Zoological Record (BIOSIS), Scielo (Scientific Electronic Library Online), Index to American Botanical Literature (The New York Botanical Garden), BIOSIS Previews, Biological Abstracts (BIOSIS), ProQuest (Biological Science Journals), Redalyc, CABI, AGRICOLA, Scopus.

La Revista Peruana de Biologa es una publicacin cientfica arbitrada, producida por el Instituto de Ciencias Biolgicas Antonio Raimondi, Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Per, y auspiciada por el Vicerrectorado de Investigacin. La Revista es publicada tres veces al ao (abril, agosto y diciembre) y esta dedicada a la publicacin de artculos cientficos originales e inditos de las reas de biodiversidad, biotecnologa, ecologa y biomedicina. La Revista publica los trabajos realizados por acadmicos e investigadores nacionales y extranjeros, en idioma espaol o ingls. Los trabajos recepcionados son evaluados por rbitros segn criterios internacionales de calidad, creatividad, originalidad y contribucin al conocimiento. La Revista es publicada simultneamente en la pgina web de la Universidad.

Foto en la caratula: Krapfia weberbaueri, cortesia de Mery Suni y Beatriz Roca

Dra. Blanca R. Len, Profesora Honoraria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. The University of Texas at Austin, Geography and the Environment, Faculty Member, Estados Unidos.

Dr. Carlos Pea, Laboratory of Genetics, Department of Biology, University of Turku, Finlandia.

Cesar Arana, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.Jos Roque, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Comit Editor

Comit consultivo en los recientes nmeros

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Revista PeRuana de Biologa

Volumen 20 Marzo, 2014 Nmero 3Rev. peru. biol. ISSN-L 1561-0837

CONTENIDOTRABAJOS ORIGINALES205 Agrotransformacin y evaluacin de la resistencia a Phytophthora infestans en Solanum tuberosum L. variedad Dsire Agro-transformation and evaluation of resistance to Phytophthora infestans in Solanum tuberosum L. variety Dsire Jeanette Orbegozo, Mara Lupe Romn, Cristina Rivera, Jos Carlos Tovar, Willmer Prez, Soledad Gamboa, Greg Forbes, Jan Kreuze

y Marc Ghislain

211 Identificacin de genes relacionados a sequa en papas nativas empleando RNA-Seq Identification of genes related to drought in native potatoes using RNA-Seq Yerisf Torres, Roberto Lozano, Carlos Merino y Gisella Orjeda

215 Diversidad gentica de papas nativas (Solanum spp.) conservadas en cultivares nativos del Per Genetic diversity of native potatoes (Solanum spp.) conserved in landraces from Peru Julin Soto, Tulio Medina, Yeny Aquino, Rolando Estrada

223 Efecto de Maytenus macrocarpa Chuchuhuasi en el sistema reproductor masculino del ratn (Mus musculus) Effect of Maytenus macrocarpa Chuchuhuasi in the male system reproductive of mouse (Mus musculus) Lyonal G. Acosta, Jonathan Vsquez, Vctor Nez, Jos Pino1, Betty Shiga

227 Efecto ahorrativo de la protena usando niveles altos de energa y obtencin de la relacin optima energa digestible/protena digestible en dietas para el crecimiento de Oreochromis niloticus (L)

Protein-sparing effect with high energy levels and obtaining the optimum digestible energy/digestible protein ratio in growth diets to Oreochromis niloticus (L.)

Felix Walter Gutierrez, Mximo Quispe, Luz Valenzuela

233 Desarrollo reproductivo de Krapfia weberbaueri (Ranunculaceae) en condiciones controladas de luz y temperatura Reproductive development of Krapfia weberbaueri (Ranunculaceae) under controlled conditions of light and temperature Beatriz Roca, Mery Suni, Asuncin Cano

NOTA CIENTFICA241 Parmetros reproductivos de Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Anura: Hylidae) en el extremo sur de su rea de distribucin Reproductive parameters of Hypsiboas punctatus (Schneider 1799) (Anura: Hylidae) in the south limit of its distribution area Carolina E. Antoniazzi, Romina Ghirardi, Javier A. Lpez, Andrea P. Armando

245 Caracterizacin citogentica de Caesalpinia spinosa de los distritos de Tarma y Palca (Junn) Cytogenetic characterization of Caesalpinia spinosa from Tarma and Palca (Junn) Alberto Lpez, Mara Siles-Vallejos, Diego Orihuela, Jos Linares, Shary Ros, Yvette Villafani, Misael Guevara, Olga Bracamonte

249 Depositorios del material tipo de la especie Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012 (Insecta: Coleoptera: Coccinellidae) Depositories of the type material of the species Coccidophilus lozadai Gonzalez, 2012 (Insecta: Coleoptera: Coccinellidae) Pedro W. Lozada y Juana Aliaga-Camarena

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Agrotransformacin y resistencia a PhytoPhthora infestans en solanum tuberosum

Rev. peru. biol. 20(3): 205 - 210 (March 2014)

Rev. peru. biol. 20(3): 205 - 210 (Marzo 2014)Facultad de ciencias Biolgicas unMsM ISSN-L 1561-0837

Agrotransformacin y evaluacin de la resistencia a Phytophthora infestans en Solanum tuberosum L. variedad Dsire

Jeanette Orbegozo, Mara Lupe Romn, Cristina Rivera, Jos Carlos Tovar, Willmer Prez, Soledad Gamboa, Greg Forbes, Jan Kreuze y Marc Ghislain

Agro-transformation and evaluation of resistance to Phytophthora infestans in Solanum tuberosum L. variety Dsire

Laboratorio de Biotecnologa Aplicada, Centro Internacional de la Papa (CIP), Apartado 1558, Lima 12, Per.

E-mail Jeanette Orbegozo: [email protected]

E-mail Mara Lupe Romn : [email protected]

E-mail Cristina Rivera : [email protected]

E-mail Jos Carlos Tovar : [email protected]

E-mail Willmer Prez: [email protected]

E-mail Soledad Gamboa: [email protected]

E-mail Greg Forbes: [email protected]

E-mail Jan Kreuze: [email protected]

E-mail Marc Ghislain: [email protected]

Presentado: 18/12/2013Aceptado: 15/01/2014 Publicado online: 14/03/2014

TRABAJOS ORIGINALES

Los autores. Publicado por la Revista Peruana de Biologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artculo de acceso abierto, distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es_ES), que permite el uso no comercial, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor pngase en contacto con [email protected].

Citacin:Orbegozo J., M.L. Romn, C. Rivera, J.C. Tovar, W. Prez, S. Gamboa, G. Forbes, J. Kreuze & M. Ghislain. 2013. Agrotransformacin y evaluacin de la resistencia a Phytophthora infestans en Solanum tuberosum L. variedad Dsire. Rev. peru. biol. 20(3): 205 - 210 (Marzo 2014)

ResumenEl Oomiceto Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, agente causal de la enfermedad deno-minada tizn tardo, es el principal responsable del dficit en rendimiento y produccin en el cultivo de papa a nivel mundial; una de las alternativas a considerar en la lucha contra este patgeno es la integracin de secuencias completas de genes R en el genoma de la papa a travs de Agrotransformacin. El gen Rpi-blb2 (gen R) de la especie silvestre Solanum bulbocastanum Dunal, presenta una amplia resistencia a los aislamientos de P. infestans, hacindolo un importante candidato en los estudios de mejoramiento gentico en plantas. En el presente trabajo se describe la introduccin del gen Rpi-blb2 por Agrobacterium tu-mefaciens en el genoma de la papa variedad Dsire, la caracterizacin molecular de 29 eventos transformados e infeccin de plantas completas con el aislamiento POX067 de P. infestans obtenido en el Per. Los eventos Dsire [Rpi-blb2] 4 y Dsire [Rpi-blb2] 30, presentaron una resistencia considerable frente a la infeccin de P. infestans, comprobando de esta manera la transferencia del gen Rpi-blb2 de una especie silvestre a una cultivada mediante transformacin gentica.

Palabras clave: papa; Phytophthora infestans; Agrobacterium tumefaciens; gen Rpi-blb2.

AbstractThe Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, the causal agent of the disease known as late blight, is primarily responsible for the decreased in production performance and potato crops worldwide. The integration of the complete R genes sequences in the potato genome using Agro-transformation appears an alternative to be considered in the fight against this pathogen. The Rpi-blb2 gene (R gene) from the wild species Solanum bulbocastanum Dunal shows a broad resistance to isolates of P. infestans, making it an important candidate for plant breeding studies. This paper reports the integration of the Rpi-blb2 gene into potato var. Dsire genome by Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation system, the molecular characterization of 29 events transformed and whole plant infection with isolate POX67 of P. infestans from Peru. Dsire events [Rpi-blb2] 4 and Dsire [Rpi-blb2] 30, showed a substantial resistance to P. infestans infection confirming complete transfer of the Rpi-blb2 gene from a wild species to a cultivated species by genetic transformation.

Keywords: potato; Phytophthora infestans; Agrobacterium tumefaciens; Rpi-blb2 gene.

IntroduccinDesde el inicio del uso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens en los aos 80, se

revolucion la obtencin de plantas resistentes a diversos patgenos de una manera rpida y sencilla, siendo considerado hasta la fecha como un proceso importante en la biotecnologa vegetal (Petti et al. 2009). Asimismo, la bsqueda de nuevas fuentes de resistencia ha impulsado el uso de genes de la misma especie o de una familia cercana a la planta que se desee modificar (Storck et al. 2012). Un ejemplo de ello son los genes R (genes de resistencia) de la familia de genes NB-LRR (Nucleotide binding and leucine-rich repeat), provenientes de la especie silvestre Solanum bulbocastanum (Collinge et al. 2008, Jacobs et al. 2010; Pel et al. 2009). Los genes R de S. bulbocastanum ms

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representativos son Rpi-blb1, Rpi-blb2 y Rpi-blb3, y se encuen-tran localizados en los cromosomas 8, 6 y 4 respectivamente (Naess et al. 2000, Song et al. 2003). El inters que se tiene en estos genes radica en la resistencia que confieren ante el tizn tardo, enfermedad ocasionada por el Oomiceto Phytophthora infestans y descrita como la ms devastadora en el cultivo de la papa (Garelik 2002, Fry 2008).

La lucha contra P. infestans es continua debido a su elevado potencial evolutivo y debido a que en su genoma posee regiones altamente repetitivas, las cuales presentan caractersticas muy dinmicas que les permite secretar protenas efectoras (AVR) facilitando su colonizacin y patognesis en la planta hospedera (Haas 2009). En consecuencia, la obtencin de plantas con re-sistencia a P. infestans es apremiante. Es por este motivo, que el estudio de los genes R a tenido gran atencin, como es el caso del gen Rpi-blb2, el cual presenta un amplio espectro de resistencia a P. infestans (van der Vossen et al. 2005). Se ha demostrado que este gen evolucion ms recientemente que el gen RB / Rpi-blb1 y codifica una protena de 1,267 aminocidos, cuya secuencia gnica presenta 82% de similitud con el gen Mi-1 de tomate, el cual tambin confiere resistencia a nematodos, fidos y a la mosca blanca (Nombela et al. 2003, Lokossou et al. 2010).

En el 2011, el grupo BASF (Alemania) obtuvo el cultivo de papa Fortuna, a partir de la introduccin de genes Rpi-blb2, as como otros genes no reportados de S. bulbocastanum y otras

especies silvestres. Sin embargo, de estas investigaciones slo se conocen notificaciones de avances, y en la actualidad el grupo ha retirado su solicitud de liberacin del cultivo en la Unin Europea por temas de mercado (Gillund et al. 2013). Debido a esta situacin poco se conoce acerca de la resistencia que puede conferir este gen en cultivos de inters, es por ello que el presente trabajo provee de informacin actual en la generacin de plantas transgnicas de S. tuberosum var. Dsire con el gen Rpi-blb2, as como la evaluacin de la resistencia frente la infeccin con el aislado POX067 de P. infestans.

Materiales y mtodosMaterial vegetal.- Las plntulas de papa var. Dsire fueron

obtenidas del banco de germoplasma del Centro Internacional de la Papa (CIP) (CIP800048). Se usaron explantes tipo hoja-peciolo y entrenudos con cuatro semanas de su propagacin in-vitro. El aislamiento POX067 (Oxapampa, Pasco), se obtuvo de S. tuberosum var. Amarilis, perteneciente al tipo de apareamiento A1 y linaje clonal EC-1 (Prez et al. 2001).

Diseo del plsmido pCIP95.- La secuencia completa del gen Rpi-blb2 fue obtenida del GenBank (nmero de accesin DQ122125.1), y sintetizado por la empresa Entelechon GmbH (Alemania). Posteriormente este gen fue clonado en el plsmido pCAMBIA1300 obtenindose el plsmido pCIP95 (Fig.1). Por transformacin de shock trmico se introdujo el plsmido en la

Figura 1. Plsmido pCIP95. RB, borde derecho; gen Rpi-blb2; P35S, promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S; gen hpt, higromicina fosfotransferasa; t35S, terminador del virus del mosaico de la coliflor 35S; LB, borde izquierdo; gene nptII, neomicina fosfotransferasa II; pBR322, ori pBR322 origen de replicacin; pBR322 bom, pBR322 bases de mobilidad; pVS1 rep, pVS1 funcin de replicacion; pVS1 Sta, funcin de estabilidad. Posiciones de sitios de amplificacin de los cebadores, indicados por flechas en negro.

Figure 1. Plasmid pCIP95. RB, right border; Rpi-blb2 gene; P35S, promoter of the cauliflower mosaic virus 35S; hpt gene, hygromycin phos-photransferase; t35S, terminator of the cauliflower mosaic virus 35S; LB, left border; nptII gene, neomycin phosphotransferase II; pBR322 ori, pBR322 origin of replication; bom pBR322, pBR322 bases mobility; pVS1 rep, pVS1 replication function; pVS1 Sta, stability function. Positions of sites for amplification primers, indicated by black arrows.

hpt-Fhpt-R Blb2-F

Blb2-R

nptII

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cepa DH5 de E. coli y por electroporacin en la cepa EHA105 de A. tumefaciens (Hood et al. 1993, Sambrok & Russell 2001).

Evaluacin de la sensibilidad de los explantes de S. tu-berosum var. Dsire al agente selector higromicina.- Por cada tipo de explante se us 30 unidades sin transformar, las cuales fueron colocadas en un medio de regeneracin semislido (4.60 g/L de sales Murashigue & Skoog, 2% de glucosa, 0.02 mg/L de cido giberlico, 0.02 mg/L de cido naftalen actico, 2 mg/L de ribsido de zeatina, pH 5.6 y 0.23% de gelride) complementado con una gradiente de concentracin del antibitico higromicina: 1, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 mg/L. El control negativo fue la var. Dsire (no transformada) colocada en el medio de propagacin sin antibitico. El cambio de placas se realiz cada 15 das.

Transformacin de papa.- La transformacin fue va organo-gnesis directa, siguiendo el protocolo establecido por Medina et al. 2003, con modificaciones para la var. Dsire. Las plantas fueron propagadas in-vitro en magentas en un medio lquido de propagacin (4.3 g/L de sales Murashige & Skoog, 0.4 mg/L de tiamina, 2 mg/L de glicina, 0.5 mg/L de cido nicotnico, 0.5 mg/L de piridoxina, 0.1 mg/L de cido giberlico, 2% de sacarosa y pH 5.6).

La bacteria A. tumefaciens conteniendo el plsmido pCIP95 fue sembrada en el medio semislido Luria-Bertani (LB) (1% de bacto-triptona, 0.5% de extracto de levadura, 1% NaCl, pH 7.5 y 2.5 g/L de agar) con 100 mg/L de kanamicina, a 28 C por 48 horas.

Los explantes fueron cortados de forma transversal con una cuchilla estril que previamente fue puesta en contacto con una colonia de A. tumefaciens. Los explantes tratados fueron trans-feridos a un medio que contena: 4.60 g/L de sales Murashige & Skoog, 2% de sacarosa, 30 mg/L de acetosiringona, pH 5.6 y 0.23% de gelride, sin antibitico de seleccin, a 18 22 C por 24 horas en oscuridad. Posteriormente, stos fueron colo-cados en el medio de regeneracin semislido con el antibitico higromicina y 200 mg/L de carbenicilina. Cada 15 das el mate-rial vegetal fue transferido a placas conteniendo un medio de regeneracin nuevo. Una vez obtenidos los regenerantes fueron individualizados para su posterior evaluacin. Los clculos de las eficiencias de regeneracin y transformacin fueron obtenidos segn Garca et al. (2008) y Luo et al. (2006), respectivamente.

Caracterizacin molecular por PCR.- El proceso de extrac-cin de DNA se realiz siguiendo lo descrito por Doyle y Doyle (1990). Para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se usaron los siguientes sets de cebadores: gen Rpi-blb2: Blb2-F: 5'- AATACGCAAACCGCCTC-3' y Blb2-R: 5'-AGCTTCA-GATCCTTGGCC-3' (Vector NT 9.1.0), para el gen hpt: hpt-F: 5'-TCCATCACAGTTTGCCAGTGATACA-3' y hpt-R: 5'-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGA-3' (Nishizawa et al. 1999). El volumen final de la reaccin de PCR fue de 15L, conteniendo 10ng de DNA, 1X PCR buffer (Promega), 0.4 M de cada cebador, 0.5 M dNTPs y 1 U de la enzima Taq DNA polimerasa (Promega). El programa de PCR usado fue: 95 C por 5 min, la temperatura de hibridacin para ambos cebadores fue de 56 C con 34 ciclos de 95 C por 1 min, 56 C por 45 s y 72 C por 1 min, y una elongacin final de 72 C por 5 min. Una vez terminada la amplificacin los productos de PCR se mezclaron con solucin de carga (0.25% azul de bromofenol, 40% sacarosa) y separados en geles de agarosa al

1% en amortiguador TBE 1X (20 mM Tris-borato y 0.5 mM EDTA, pH 8.0). Los tamaos del producto de PCR fueron comparados con el peso molecular del marcador Lamdda DNA previamente digerido con PstI. El gel fue teido con bromuro de etidio para la visualizacin de los fragmentos de DNA a travs de la irradiacin del gel con luz UV (Sambrok & Russell 2001). Imgenes del gel donde se observan los fragmentos de DNA obtenidos por PCR fueron capturadas con el equipo EpiChemi3 Darkroom para su posterior anlisis.

Ensayo de infeccin con P. infestans.- Se usaron 2 plantas por evento de transformacin de la segunda propagacin veg-etativa, de un mes y medio de siembra. Los ensayos de infeccin se realizaron en los cubculos de bioseguridad del CIP bajo condiciones controladas de temperatura 16 18 C, 12 h /12 h de exposicin de luz/oscuridad y 60 75% de humedad rela-tiva. La infeccin se realiz por aspersin de la planta completa con una suspensin de 3000 esporangios/mL del aislamiento POX067 de P. infestans. Una vez inoculadas las plantas, estas fueron colocadas en cmaras con humedad relativa alta (> 90%) para promover y aumentar el desarrollo del patgeno. Las plantas de S. tuberosum var. Dsire (susceptible) y el clon CIP 387164.4 (resistente) fueron usadas como control negativo y positivo, respectivamente. Las evaluaciones fueron realizadas por el Laboratorio de Patologa del CIP al quinto da post infec-cin (dpi). El dao foliar observado en cada uno de los clones se report en porcentaje y los valores promedios fueron anali-zados usando la siguiente escala: Altamente resistente= 10%, resistente= 11 20%, medianamente resistente = 21 50%, medianamente susceptible =50 65%, susceptible =>65 80%, altamente susceptible =>80%.

Resultados y Discusin

Determinacin de la dosis letal de higromicina y trans-formacin gentica.- A travs de los ensayos de sensibilidad al antibitico higromicina se determin que la dosis letal para los explantes hoja-peciolo y entrenudos no transformados fue de 5 mg/L y 10 mg/L, respectivamente. Las soluciones del antibitico en las concentraciones descritas arriba fueron usadas de manera directa sobre los explantes, sin necesidad de adicionar un paso previo de precultivo, el cual incrementa la aparicin de eventos considerados escapes (Chaudhry y Rashid 2010). Durante los ensayos de transformacin se obtuvieron 29 regenerantes a partir de 898 explantes transformados (364 entrenudos y 534 hoja-peciolo), reportndose una eficiencia de regeneracin de 1.5% para hoja-peciolo y 5.7% para entrenudos. As tambin, se registro una eficiencia de transformacin de 1.5% en hoja-peciolo y 5% para entrenudos.

La caracterizacin molecular de los 29 regenerantes obteni-dos, identific 26 eventos positivos conteniendo el gen de inters. De este anlisis se concluye que los explantes tipo entrenudos presentaron una mejor respuesta de eficiencia de transformacin (18 eventos positivos) que los explantes hoja-peciolo (8 eventos positivos). Esta observacin confirma lo descrito por Beaujean et al. (1998), quienes al trabajar con las variedades Dsire, Bintje y Kaptah Vandel, identificaron que los explantes tipo entrenudos presentan una mejor respuesta a las condiciones in vitro debido a que son menos sensibles al dao durante los pasos de manipulacin de transformacin y tienen un alto poder regenerativo a diferencia de las hojas (Sarker et al. 2009, Soto et al. 2007). En relacin al uso de higromicina durante el proceso

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Orbegozo et al.


de obtencin de transformantes, se concluye que la eficiencia en ambos tipos de explantes fueron bajas en el presente trabajo esto se determin al comparar los resultados obtenidos con ensayos reportados previamente donde se describe el uso del mismo antibiotico (M'Hamdi et al. 2003, Kashani et al. 2012). Estas diferencias pueden deberse a mltiples factores asociados a las condiciones de transformacin o al tipo de explante usado (Lagunes 2009). No obstante la principal causa puede deberse a que los ensayos de regeneracin y transformacin son genotipo-dependiente del tipo de cultivo que se use en los experimentos a realizar (Cingel et al. 2010).

Anlisis de eventos transformados por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).- De los 29 eventos obtenidos en el primer experimento de transformacin, 26 (90%) eventos fueron positivos por PCR para las amplificaciones de los genes Rpi-blb2 y hpt (Fig. 2A y 2B). Los eventos restantes fueron considerados como escapes, esto se puede deber a una proliferacin de algunas clulas no transformadas presentando una resistencia o tolerancia natural ante el agente selector (Lpez y Chaparro 2007). As tambin es posible que la superficie de estos explantes no haya tenido un contacto perenne con el medio de cultivo haciendo favorable su desarrollo (Monserrat et al. 2001).

Respuesta de resistencia a la infeccin con P. infestans.-

Del total de los 26 eventos transformados, solo 13 presentaron aclimatacin total y produjeron tubrculos en invernadero. Los eventos Dsire [Rpi-blb2]: 4 y Dsire [blb2] 30 registraron un 42.5% y 37.5% de severidad, respectivamente (Fig. 3). La respuesta de hipersensibilidad (HR) inducida por la infeccin en estos dos eventos no estuvo correlacionada con una completa resistencia al patgeno, otorgando slo una resistencia moderada. Esto pudo deberse a que el aislamiento POX067 presenta una gran variedad de genes Avr (genes de avirulencia de P.infestans) incluyendo a los Avr8 y Avr9 identificados previamente en infecciones en S.demissum (Villamon et al., 2005). Es prob-able que estos genes Avr incrementen la agresin del aislado

POX067durante la infeccin a la var. Dsire. Por lo general, la respuesta HR es asociada con otro tipo de respuestas que cooperan para restringir el desarrollo del patgeno (Chen & Halterman, 2011). Es por ello que la muerte celular y la re-sistencia pueden actuar de manera independiente, indicando que mltiples respuestas, as como la presencia de ms de un gen R por parte de los hospederos, seran necesarias para lograr obtener resistencia o inmunidad. La deteccin de los eventos Dsire [Rpi-blb2] 4 y Dsire [Rpi-blb2] 30, muestra el xito logrado en el presente trabajo debido a que las infecciones se realizaron en una poblacin pequea (13 plantas transgnicas) y con el aislamiento POX067 el cual es considerado una raza compleja y agresiva.

AgradecimientosEl presente trabajo fue realizado gracias al financiamiento

de la Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Inter-nacional (USAID).

Literatura citadaBeaujean A., R.S Sangwan, A. Lecardonnel & B.S. Sangwan-Norreel. 1998.

Agrobacterium-mediated transformation of three economically important potato cultivars using sliced internodal explants: an ef-ficient protocol of transformation. Journal of Experimental Botany 49 (326): 15891595. doi: 10.1093/jxb/49.326.1589.

Chaudhry Z., & H. Rashid. 2010. An improved Agrobacterium mediated transformation in tomato using hygromycin as a selective agent. African Journal of Biotechnology 9 (13): 1882-1891. doi: http://dx.doi.org/10.4314%2Fajb.v9i13.

Chen Y. & D.A Halterman. 2011. Phenotypic characterization of potato late blight resistance mediated by the broad-spectrum resistance gene RB. Phytopathology 101(2):263-70. doi: 10.1094/PHY-TO-04-10-0119.

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Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa de los amplificados por PCR. Gen Rpi-blb2, 520 pb (A), gen hpt, 500 pb (B). B, agua libre de nu-cleasas; NT, control negativo (DNA genmico de una planta no transformada); C+, control positivo (DNA de pCIP95); M, marcador molecular del -DNA digerido con PstI; 1-5 DNA genmico de plantas regeneradas.Figure 2. Agarose gel electrophoresis of PCR products. Rpi-blb2 gene, 520 bp (A), hpt gene, 500 bp (B). B, nuclease-free water; NT, negative control (DNA genomic from an untransformed plant); C +, positive control (DNA of pCIP95); M, molecular marker from -DNA digested with PstI; 1-5, DNA genomic from regenerants.

209



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Figura 3. Infeccin de plantas completas de la var. Dsire con el aislado POX067 de P. Infestans. Dsire [Rpi-blb2] 4 (A), Dsire [Rpi-blb2] 30(B), S. tuberosum var. Dsire (C), y el clon CIP 387164.4 (D). El desarrollo de los sntomas fue visualizado 5 dpi.Figure 3. Infection of complete plant of var. Dsire with isolated POX067 from P. infestans. Dsire [Rpi-blb2] 30 (A), Dsire [Rpi-blb2] 4 (B), S. tuberosum var. Dsire (C) and clon CIP 387164.4 (D). Disease symptoms were visuals 5 dpi.

210

Orbegozo et al.


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211

Identificacin de genes relacionados a sequa en papas nativas empleando RNA-Seq




Yerisf Torres*, Roberto Lozano, Carlos Merino y Gisella Orjeda

Identification of genes related to drought in native potatoes using RNA-Seq

Unidad de genmica, Laboratorios de Investigacin y De-sarrollo (LID), Universidad Peruana Cayetano Heredia. Av. Honorio Delgado 430, Urb. Ingeniera, S.M.P. Lima - Per.

Email Yerisf Torres: [email protected];

Email Roberto Lozano: [email protected]

Email Carlos Merino: [email protected]

Email Gisella Orjeda: [email protected]

*Autor para Correspondencia


TRABAJOS ORIGINALES


Citacin:Torres Y., R. Lozano, C. Merino & G. Orjeda. 2014. Identi-ficacin de genes relacionados a sequa en papas nativas empleando RNA-Seq. Rev. peru. biol. 20(3): 211 - 214 (Marzo 2014)

ResumenEl reciente desarrollo del RNA-Seq, un mtodo de secuenciamiento masivo en paralelo para el anlisis de transcriptomas permite conocer el perfil de expresin de las plantas en respuesta a estrs de tipo abitico y bitico. En este estudio, se secuenci el mRNA proveniente de hojas y races de dos variedades de papas nativas expuestas a diferentes niveles de sequa. Lecturas o reads de 50 pares de bases provenientes de mRNA se mapearon al genoma de papa: 75 82% mapearon a posiciones nicas, 6 14% mapearon a mltiples posiciones y 9 12% no mapearon a posicin alguna del genoma. Comparando los perfiles de expre-sin, se encontraron entre 887 1925 genes inducidos/reprimidos por sequa en la variedad sensible y 998 1995 en la tolerante. Este estudio gener informacin de gran valor que podr ser utilizada en futuros estudios para comprender mejor los mecanismos moleculares de resistencia a sequa en papa y especies cercanas.

Palabras clave: RNA-Seq; transcriptoma; sequa; papa; mRNA.

AbstractThe recent advent RNA sequencing technology (RNA-Seq), a massively parallel sequencing method for transcriptome analysis, provides an opportunity to understand the expression profile of plants in response to biotic and abiotic stress. In this study, the mRNA was sequencing from leaves and roots of two native potato varieties at different levels of drought. Fifty-base-pair reads from whole mRNAs were mapped to the potato genomic sequence: 75 82% mapped uniquely to the genome, 6 14% mapped to several locations in the genome and 9 12% had no match in the genome. Comparing expression profiles, 887 to 1925 genes were found to be induced/repressed by drought in the sensible variety and 998 to 1995 in the tolerant. This research provides valuable information for future studies and deeper understanding of the molecular mechanism of drought resistance in potato and related species.

Keywords: RNA-Seq; transcriptome; drought; potato; mRNA.

Introduccin

La sequa es el estrs medio ambiental ms importante en la agricultura, por lo que se vienen realizado muchos esfuerzos para mejorar la productividad de los cultivos bajo condiciones limitantes de agua. La papa, el tercer cultivo alimentario ms importante del mundo (FAOSTAT 2008) es muy sensible a la sequa, ya que necesita un riego frecuente. A diferencia de Solanum tuberosum subs. tuberosum, las especies nativas de los andes, cultivadas a altitudes de 3500 m, estn adaptadas a diversas condiciones climticas adversas (Vasquez-Robinet et al., 2008). Esto hace a estas variedades de papa los candidatos ideales para estudiar la expresin de genes responsables de la tolerancia a la sequa.

Este trabajo pretende identificar genes relacionados a sequa en papa, empleando la tecnologa de secuenciamiento de RNA (RNA-Seq), una herramienta revolucionaria de la transcriptmica (Mortazavi et al. 2008) que permite secuenciar genes transcritos y cuantificarlos de manera precisa.

212

Torres et al.


Materiales y mtodosMaterial vegetal.- Dos variedades de S. tuberosum andigena,

Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) fueron propagadas in-vitro, enraizadas y transferidas a un sistema aeropnico de cultivo en la Estacin Experimental de INIA- Huancayo.

Diseo del experimento.- Las plantas recibieron una ir-rigacin normal durante aproximadamente 3 meses, tiempo despus del cual comienza la tuberizacin, en este momento se inici la induccin del estrs por sequa dejando de regar a las plantas.

Se tomaron muestras de hojas y races de ambas variedades considerando cuatro tiempos de muestreo. Para determinar los tiempos de muestreo se realizaron mediciones de la tasa fotosintticas de la variedad tolerante (703671) en condiciones normales y de sequa, empleando el equipo CI-340 Handheld Photosynthesis System (CID Bio-Science, Inc. USA) que es un analizador infrarrojo de CO2/H2O que mide la cantidad de CO2 asimilada por un rea de hoja conocida en un tiempo dado. El Tiempo Cero correspondi al control del experimento, antes del inicio de la sequa. Los tiempos T1, T2 y T3 cor-respondieron a una disminucin de la tasa fotosinttica en la planta tolerante de 25%, 50 60% y una recuperacin hasta del 80% del valor control respectivamente (Vsquez- Robinet et al. 2008). Los tiempos T1, T2 representaron la respuesta temprana y tarda de las plantas frente a la sequa, mientras que el tiempo T3 represento la recuperacin de las plantas luego de reiniciado el riego.

Anlisis de expresin.- El RNA fue aislado de aproxima-damente 1 2 g de tejido de hojas y races usando el mtodo fenol-cloroformo (Buell Lab - Michigan State University, co-municacin personal 2010), y purificado usando el Kit Ambion DNA-free (Cat. No. 1906).

El RNA extrado fue secuenciado empleando un secuen-ciador Illumina Hi-SeqTM 2000. Brevemente consiste en que la poblacin de RNA extrado fue convertido a una librera de fragmentos de DNA, cada molcula luego fue amplificada, cu-antificada y secuenciada, con lecturas de 50 pares de bases (bp).

Este procedimiento fue realizado en la Universidad de Michigan (Buell Lab, Michigan State University). Se generaron en total 16 libreras correspondientes a mRNA de hojas y races de las dos variedades en estudio en los cuatro tiempos de muestreo (Tabla 1).

Para el anlisis bioinformtico se realiz primero un control de calidad de las lecturas empleando el programa FastQC versin 0.10.0, y dos herramientas de FastX, FASTQ Clipper, que elimi-nan secuencias de adaptadores o linkers y FASTQ Trimmed, que permite eliminar bases de mala calidad presentes en las lecturas, acortando el tamao de stas.

Las lecturas fueron alineadas al genoma de referencia de papa (PGSC. 2011), empleando los programas Bowtie 2.0.0 (Lang-mead et al. 2009) y TopHat (Trapnell et al. 2009). Posterior-mente se ensamblaron y cuantificaron las lecturas empleando el programa Cufflinks 1.3.0 (Trapnell et al., 2010), y se emple la herramienta Cuffdiff para identificar los genes con cambios ms significativos en el nivel de expresin durante el experimento.

Resultados y discusinControl de calidad.- Con el programa FastQ se determin

el Phred Score para los reads de las 32 libreras. Los valores Phred varan entre 4 y 60, y asignaron un valor de calidad a cada base de una secuencia, siendo ms alta la calidad al ms alto valor. Se consider como umbral un valor Phred > 28 (considerando que un valor de Phred = 30 indica que la probabilidad de tener una base incorrecta es de 1 en 1000). En 5 libreras las 50 bases de los reads tienes un valor Phred por encima del umbral, 6 libreras presentaron las 3 primeras bases con un valor Phred debajo del umbral y 5 libreras presentaron las 4 primeras bases con un valor Phred debajo del umbral. En estos dos ltimos casos se emple la herramienta FastX-Trimmer para cortar las primeras 3 4 bases de todos los reads de estas libreras y optimizar la calidad de los mismos.

Mapeo de las lecturas.- Una vez realizado el control de calidad, se emple el programa TopHat para mapear todas las secuencias obtenidas al genoma de referencia de papa que cor-responde a S. tuberosum Group Phureja DM1-3 516R44 (PGSC 2011). En base al alineamiento, las secuencias fueron clasificadas en tres clases: reads nicos que son aquellos que mapean con una nica posicin en el genoma, reads que mapean con ms de una posicin en el genoma de referencia y los reads que no mapean con regin genmica alguna. Empleando el script Perl mapping stadisticas se calcul el nmero y porcentaje de estos reads (Tabla 2).

Del total de reads evaluados por cada librera, el 75 83% de reads fueron nicos, mientras que el 6 14% mapearon a mltiples localizaciones en el genoma y 8 11% no mapearon con el genoma. Estos valores indican un desempeo/ rendimien-to similar de construccin y secuenciamiento entre las libreras. Adicionalmente, como un control de calidad se secuenci una librera construida a partir de hojas del individuo de referencia DM1-3 516R44, encontrndose valores semejantes.

Expresin diferencial de genes.- El siguiente paso en el anlisis de RNA-Seq fue la reconstruccin del transcriptoma y su cuantificacin El nivel de expresin de todos los transcriptos que mapearon en el genoma fue cuantificado como fragmentos por kilobase de exn por milln de reads (FPKM).

Nivel de sequa Variedad Tejido Librera

Control 703671

Hoja TLCRaz TRC

703248Hoja SLCRaz SRC

Respuesta temprana 703671

Hoja TL1Raz TR1

703248Hoja SL1Raz SR1

Respuesta tarda 703671

Hoja TL2Raz TR2


Recuperacin 703671

Hoja TL3Raz TR3


Tabla 1. Descripcin de las 16 libreras secuenciadas. T: tolarante, S: susceptible, L: hojas, R: races.

213



La comparacin de niveles de expresin entre diferentes muestras es parte clave del secuenciamiento de transcriptoma. Empleando el programa Cuffdiff se compararon los perfiles de expresin de las variedades susceptible (703248) y tolerante (703671) durante la exposicin a sequa (respuesta temprana, tarda y recuperacin) y adems entre ambos individuos.

En la Figura 1 se muestra la comparacin del nmero total de transcriptos diferencialmente expresados en hojas y races de 703248 y 703671 bajo los tratamientos de sequa; el nmero de genes diferencialmente expresados entre los tratamientos vara entre 887 1995 y se encontr un aumento de este nmero conforme avanza el experimento.

Respecto a la induccin y represin gnica, en hojas de 703248 durante la respuesta temprana se encontr que 364 genes

fueron inducidos significativamente, mientras que en la sequa tarda y en la recuperacin 893 y 989 genes respectivamente; esta tendencia creciente en la induccin de genes se mantiene en hojas y races de ambas variedades conforme la sequa avanza. Por otra parte, el nmero de genes reprimidos vari entre 359 en races de 703671 durante la respuesta temprana y 1085 en hojas de 703671 tambin en la respuesta temprana (Fig. 2).

Comparando el perfil de expresin de ambas variedades, se encontr que en la variedad 703671 un mayor nmero de genes mostraron cambios significativos en respuesta a la sequa. En la respuesta temprana, 149 genes inducidos y 276 reprimidos fueron comunes a hojas de las dos variedades bajo estudio. Se

Librera Total reads nico % Mltiple % Unmapped %

TLC 26304956 21291611 80,94 2758808 10,49 2254537 8,57

TL1 17079619 14158415 82,9 1535509 8,99 1385695 8,11

TL2 22260826 18156792 81,56 2257435 10,14 1846599 8,3

TL3 25424875 20546901 80,81 2214432 8,71 2663542 10,48

TRC 30840996 25101293 81,39 2153567 6,98 3586136 11,63

TR1 19780525 16431906 83,07 1478617 7,48 1870002 9,45

TR2 23292392 19398147 83,28 1475718 6,34 2418527 10,38

TR3 14717082 12249428 83,23 1047903 7,12 1419751 9,65

SLC 27976839 21798560 77,92 3250580 11,62 2927699 10,46

SL1 28223430 21187144 75,07 4139513 14,67 2896773 10,26

SL2 23408804 18275867 78,07 2455980 10,49 2676957 11,44

SL3 20067948 15983176 79,65 2002679 9,98 2082093 10,38

SRC 27993309 22590737 80,7 2129629 7,61 3272943 11,69

SR1 27415791 22386601 81,66 1945125 7,09 3084065 11,25

SR2 24620110 20164169 81,9 1711811 6,95 2744130 11,15

SR3 16975442 13975326 82,33 1162503 6,85 1837613 10,83

DM Hojas 15983851 12481572 78,09 1513613 9,47 1988666 12,44

Tabla 2. Resumen estadstico del nmero de reads secuenciados y mapados con TopHat al genoma de referencia. DM hojas: corresponde a una librera construida a partir del RNA de hojas de DM, a quien corresponde el genoma de referencia.

887

16231729

1506 1450

1853

918

1654

1925

998

1731

1995

0

500

1000

1500

2000

2500

Respuesta temprana Respuesta tarda Recuperacin

Nm

ero

tota

l de

gene

s

Tratamientos de sequa

703248-Hojas

703671-Hojas

703248-Races

703671-Races

Figura 1. Nmero total de genes diferencialmente expresados en hojas y races de S. tuberosum andigena, variedad Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) durante el estrs por sequa.

- 523

- 730 - 740

- 1085

- 662

- 897

- 536

- 924- 839

- 359

- 729- 609

364

893989

421

788

956

382

730

1086

639

1002

1386

-1400

-1200

-1000

-800

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Nm

ero

de g

enes

Reprimidos Inducidos

Figura 2. Distribucin del nmero de genes inducidos y reprimidos en S. tuberosum andigena, variedad Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) durante el estrs por sequa.

214

Torres et al.


encontr un mayor nmero de genes especficos y diferencial-mente expresados en hojas de la variedad 703671 (272 inducidos y 809 reprimidos), mientras que se encontraron solo 562 genes (215 inducidos y 247 reprimidos) especficos de hojas de la variedad 703248 (Figs. 3 y 4). Un patrn similar se encontr en races, 170 genes inducidos y 101 reprimidos fueron comunes en las dos variedades, encontrndose un mayor nmero de genes especficos y diferencialmente expresados en la variedad 703671 (469 inducidos y 983 reprimidos), mientras que se encontraron solo 646 genes (211 inducidos y 435 reprimidos) especficos de la variedad 703248 (Figs. 3 y 4). Estos genes especficos de la variedad tolerante representan candidatos que debern ser estudiados a mayor profundidad para conocer el rol que estos cumplen en la resistencia a sequa.

Es importante resaltar que, durante la respuesta temprana de ambas variedades se encontr un mayor nmero de genes nicos y especficos con expresin diferencial en comparacin al de los genes comunes, mientras que en la etapa de recuperacin es mayor el nmero de genes comunes con expresin diferencial. Lo cual podra indicar que los mecanismos de respuesta temprana a sequa son especficos de cada variedad, pudiendo ser esta la etapa clave para encontrar genes responsables de la resistencia a sequa.

En este trabajo, el empleo del RNA-Seq permiti generar 400 millones de reads, que analizados y procesados con herramientas bioinformticas permitieron identificar y cuantificar un gran nmero de genes de papa relacionados a sequa y que podran permitir comprender mejor los mecanismos de resistencia en papa y otras especies relacionadas.

Informacin adicionalContribucin de autores.- Gisella Orjeda y Yerisf Torres:

concepcin y diseo de experimento. Yerisf Torres, Roberto Lozano: realizacin del experimento. Yerisf Torres, Roberto Lo-zano y Carlos Merino: anlisis de datos. Yerisf Torres, Roberto Lozano y Carlos Merino: redaccin del artculo.

Conflicto de inters.- Los autores han declarado no incurrir en conflicto de intereses.

Financiamiento.- Los autores agradecen el financiamiento FINCyT (099-FINCyT-EQUIP-2009)/(076-FINCyT-PIN-2008).

Literatura citadaFAOSTAT 2008. Potato world: Production and consumption. International

Year of the Potato. . Ac-ceso: 08/10/2008.

Langmead B., C. Trapnell, M. Pop & S. Salzberg. 2009. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol.10:R25.

Mortazavi A., B. Williams, K. McCue, L. Schaeffer & B. Wold 2008. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods, Vol. 5, Isuue7, pp. 621-628.

PGSC (The Potato Genome Sequencing Consortium). 2011. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature 475, 189195.

Trapnell C., L. Pachter & SL. Salzberg. 2009. TopHat: discovering splice junc-tions with RNA-seq. Bioinformatics.;25:11051111.

Trapnell C., A. Roberts, L. Goff, et al. 2012. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cuf-flinks. Nature Protocols, Vol. 7, Issue 3, pag 562578

Vasquez-Robinet C., Sh. Mane, A. Ulanov, et al. 2008. Physiological and molecular adaptations to drought in Andean potato genotypes. Journal of Experimental Botany, Vol. 59, No. 8, pp. 21092123.

170

Respuesta temprana

438

703671Respuesta tarda

577

Recuperacin

149

703248 703671Respuesta temprana

HOJAS RACES

347


792

703671Recuperacin

703248

703248

703248

703248

703248703671

703671

215 272

455 347

412 379

212 469

383 555

294 594

Figura 3. Nmero de genes inducidos por sequa (respuesta tem-prana y tarda) y en la recuperacin. Se muestra el nmero de genes compartidos por S. tuberosum andigena, variedad Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) y aquellos de expresin nica.

101

Respuesta temprana

298


347

Recuperacin

276

703248 703671Respuesta temprana

HOJAS RACES

267


345

703671Recuperacin

703248

703248

703248

703248

703248703671

703671

247 809

432 356

393 550

435 983

656 562

494 263

Figura 4. Nmero de genes reprimidos por sequa (respuesta tem-prana y tarda) y en la recuperacin. Se muestra el nmero de genes compartidos por S. tuberosum andigena, variedad Negrita 703671 (tolerante a sequa) y Wila-HuakaLajra 703248 (susceptible a sequa) y aquellos de expresin nica.

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Diversidad gentica de papas nativas en cultivares nativos del Per



Diversidad gentica de papas nativas (Solanum spp.) conservadas en cultivares nativos del Per

Julin Soto3, Tulio Medina2, Yeny Aquino2, Rolando Estrada1*

Genetic diversity of native potatoes (Solanum spp.) conserved in landraces from Peru

1 Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Ciudad Universitaria de San Marcos Av. Venezuela s/n. Apartado 110058, Lima 11 Per.

2 Instituto Nacional de Investigacin Agraria-INIA, Av. La Molina # 1981. Apartado Postal 2791, La Molina, Lima - Per

3 Centro Internacional de la Papa, CIP-Lima. Av. La Molina 1895 La Molina Apartado 1558, Lima 12, Per

*Autor para correspondencia

Email Rolando Estrada: [email protected]

Email Julin Soto: [email protected]


TRABAJOS ORIGINALES


Citacin:Soto J., T. Medina, Y. Aquino, R. Estrada. 2014. Diversidad gentica de papas nativas (Solanum spp.) conservadas en cultivares nativos del Per. Rev. peru. biol. 20(3): 215 - 222 (Marzo 2014)

ResumenEl presente trabajo analiza el grado de diversidad gentica utilizando 18 marcadores micro-satlites, de una muestra aleatoria de 79 variedades nominales de papa nativa (Solanum spp.) procedentes de cinco regiones polticas del Per (Ayacucho, Cajamarca, Cusco, Huancavelica y Puno), cultivadas en chacras de agricultores que colaboraron con el proyecto Conservacin in situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres. De los 18 marcadores, 17 amplifica-ron un solo locus polimrfico, siendo el promedio de alelos por locus de 8.79. Se obtuvo una similitud media de 0.62 y rangos de agrupamiento que vararon desde 0.41 a 0.98. Para los 19 loci registrados se obtuvo un total de 166 alelos. La regin de Cuzco present el mayor nmero de alelos (130 alelos). De los 166 alelos caracterizados, 72 alelos (43.37%) fueron comunes o compartidos con las 5 regiones de colecta. La regin de Puno presento el mayor numero de alelos exclusivos (8 alelos). Las 42 variedades nominales de S. tuberosum subsp. andigena tuvieron una diversidad promedio de 0.74 y las 18 variedades nominales de S. x chaucha una diversidad promedio de 0.70. Los valores de polimorfismo (PIC = 0.55 0.85) y los ndices de diversidad gentica obtenidos indicaran que los microsatlites evaluados logran identificar altos niveles de diversidad gentica, pero a la vez no son suficientes para discriminar grupos diferenciados por procedencia o especies. Nuestros anlisis indican que existe un alto grado de diversidad gentica y corroboran los resultados obtenidos de los inventarios y caracterizaciones morfolgicas realizadas in situ; tambin podemos concluir que existira un pool de genes comn que se encontraran ampliamente distribuidos entre las regiones estudiadas.

Palabras claves: Conservacin in situ; Diversidad gentica; papa nativa; microsatlites; SSR.

Abstract This paper analyzes the genetic diversity of 79 accessions of native potato varieties (Sola-num spp.) using 18 microsatellite markers. A random sample from Ayacucho, Cajamarca, Cusco, Huancavelica and Puno from "chacras" of farmers who collaborated with the "In situ conservation of native crops and wild relatives" were used. 17 markers amplified one single polymorphic locus, the mean number of alleles per locus was 8.79. The mean similarity was 0.62 and clustering indexes varied between 0.41 and 0.98. 19 loci showed a total of 166 alle-les. Cuzco had the highest number of alleles (130 alleles). Of the 166 characterized alleles, 72 alleles (43.37%) were common or shared with 5 sampling sites. Puno had the highest number of exclusive alleles (8 alleles). The 42 varieties of S. tuberosum subsp. andigena showed a mean diversity of 0.74 and 18 varieties of S. x chaucha an average diversity of 0.70. Polymorphism (PIC = 0.55 to 0.85) and genetic diversity indices show that microsatellites evaluated can identify high levels of genetic diversity, but also are not sufficient to discriminate differentiated by origin or species groups. Our analyzes indicate a high genetic diversity and are consistent with inventories and morphological characterizations performed in situ, we can also conclude that there would be a common pool of genes would be found widely distributed among the regions studied.

Keywords: In situ conservation; genetic diversity; native potato; microsatellites; SSR.

216

Soto et al.


IntroduccinEl gnero Solanum tiene ms de 300 especies que forman

tubrculos, entre especies cultivadas y silvestres; sin embargo el gnero, considerado altamente polimrfico y muy complejo (Linnaeus 1753 en Ochoa 1990) incluye alrededor de 2400 especies alrededor del mundo (Ochoa 1999).

En los Andes, el gnero est representado por ocho especies cultivadas y alrededor de 200 silvestres. La rica diversidad de las especies cultivadas est incluida en una serie poliploide (2n = 24, 36, 48 y 60), que incluye unas 4000 variedades comestibles, con alto potencial gentico para el rendimiento y amplia adaptabi-lidad a diferentes climas, lo que le ha permitido convertirlo en uno de los cultivos de mayor importancia para la alimentacin mundial (Estrada 2000, Hawkes 1962). A pesar del gran poli-morfismo que existe entre las ocho especies cultivadas de papa (Fig. 1), estas tienen como caractersticas comunes el producir numerosos tubrculos, de gran tamao y agradables al paladar (Matsubayashi 1991), lo que las distingue de las especies silves-tres, que poseen gran diversidad de caracteres y que pueden ser incorporarlos en las especies cultivadas mediante cruzamientos o manipulaciones genticas.

La alta variabilidad de caracteres de las especies silvestres incluye tolerancias y resistencias a estrs bitico y abitico, que han permitido mejorar las variedades comerciales desde el punto de vista nutricional, agronmico, industrial y farmacutico. Es por ello que cada vez se incrementa ms el inters por conocer las caractersticas morfolgicas, bioqumicas y moleculares de las especies silvestres y cultivadas para prevenir la erosin gentica de las mismas.

En el Per existe una gran diversidad cultural ligada a la conservacin de la biodiversidad, en este contexto el proyecto Conservacin in situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres (Proyeto in situ, llevado a cabo entre los aos 2001

- 2006 en el Instituto Nacional de Innovacin Agraria, INIA), estuvo orientado a reforzar la conservacin de los cultivos nati-vos en las chacras, identificar los factores que lo hacen posible y elevar el nivel de conciencia sobre su valor biolgico, cultural y nutricional en el mbito local y nacional, contando con la participacin de las comunidades campesinas del pas (INIA 2005 a-e). Los resultados del proyecto permitieron sustentar el alto grado de diversidad que presentan estos cultivos y fueron la base cientfica ms importante para justificar la necesidad de proteccin que debe ejercer el Estado en los aspectos culturales y biolgicos sobre los cultivares de papa nativa.

Dentro de este contexto, se consider necesario afianzar los resultados obtenidos en la caracterizacin morfolgica de las papas nativas con el uso de marcadores moleculares. Para el caso de la papa, los microsatlites vienen siendo usados hace ms de 18 aos para la genotipificacin de este cultivo. Provan (1996), fue uno de los primeros en estudiar el potencial de los micro-satlites para el anlisis de la diversidad gentica de cultivares de papa. Por otro lado, Milbourne et al. (1997) compararon la eficiencia de tres marcadores basados en PCR para diferenciar variedades de papa tetraploide llegando a la conclusin que los microsatlites presentaban mayor polimorfismo y mayores venta-jas que los AFLP y RAPD. En el Per, Ghislain et al. (2001) en el Centro Internacional de la Papa (CIP), lograron seleccionar 18 iniciadores para secuencias microsatlites de papa, con un alto grado informativo y son este grupo de iniciadores los que fueron utilizados en el presente trabajo.

Materiales y mtodosMaterial Vegetal y Extraccin de ADN.- Se colectaron

al azar tubrculos de 79 variedades nominales de papa nativa (Solanum spp.) perteneciente a agricultores colaboradores del Proyecto in situ y procedentes de cinco regiones politicas: ocho variedades del distrito de Luricocha y 17 del distrito de Vinchos en la Regin Ayacucho, 14 variedades del distrito de Ocongate

Especies silvestres

Especies cultivadas

S. acaule (4X)

S. sparsipilum (2X)

S. leptophytes(2X)

S. megistracolobum(2X)

S. Tuberosum S. stenotomum S. ajanhuiri(2X)

subsp. andigena(4X)

subsp. stenotomum(2X)

S. Tuberosumsubsp. tuberosum

(4X)S. x chaucha

(3X)

S. stenotomumsubsp. goniocalyx

(2X)

S. phureja(2X)S. x curtilobum

(5X)

S. x juzepczukii(3X)

Figura 1: Diagrama de evolucin de las especies de papa cultivada, sus relaciones genticas y sus posibles ancestros silvestres segn Hawkes (1994).

217



en la Regin Cusco, 15 variedades del distrito de Pomata en la Regin Puno, 13 variedades del distrito de Huasmn en la Regin Cajamarca y 12 variedades del distrito de Yauli en la Regin Huancavelica. De las 79 variedades, se identificaron 6 especies de papa cultivada: S. tuberosum subsp. andigena (42 variedades), S. stenotonum subsp. stenotonum (5 variedades) y S. stenotonum subsp. goniacalyx (4 variedades), S. phureja (2 varie-dades), S. ajanhuri (1 variedad), S. x chaucha (19 variedades) y S. x curtilobum (6 variedades). El ADN fue aislado a partir de hojas jvenes y frescas mediante el mtodo CTAB modificado de Doyle y Doyle (1990).

Amplificacin de microsatlites.- Se utilizaron 18 iniciad-ores microsatlites identificados como altamente informativos por Ghislain et al. (2004) y desarrollados por Milbourne et al. (1998). Las condiciones de amplificacin se llevaron a cabo segn protocolos del CIP (CIP 1997, Ghislain et al. 2001) adaptados de Provan et al. (1996). La mezcla de reaccin const de: 20 ng de ADN, 0.5 M de cada iniciador, 2.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de dNTPs, 1X de Taq buffer y 0.5 U de Taq polimerasa en un volumen total de 20 L. El programa de amplificacin se desarroll de la siguiente manera: 3 min. a 94 C, dos minutos a la temperatura de alineamiento, 1.5 minutos a 72 C, 30 ciclos de 1 minuto a 94 C, dos minutos a la temperatura de alineamiento, 1.5 minutos a 72 C y una elongacin final de 5 minutos a 72 C, utilizando un termociclador modelo PTC100 (MJ Reasearch Inc.). La temperatura de alineamiento fue usada segn los datos reportados por Ghislain et al. (2001, 2004).

Los productos de amplificacin fueron separados en geles denaturantes de poliacrilamida (acrilamida 6%, bisacrilamida 0.3%, Urea 7M y TBE 1X) mediante electroforesis vertical en un sistema de secuenciamiento modelo S2-Gibco aplicndole un voltaje de 1600 V (40W). Se utiliz como marcador de peso la reaccin de secuenciamiento del plsmido pUC-18 (Kit de secuenciamiento -Promega) y la deteccin de los fragmentos se realiz mediante tincin con nitrato de plata (Promega Corpo-ration 1996).

Anlisis de datos.- El patrn de bandas obtenido para cada iniciador fue registrado en una matriz binaria donde a las bandas presentes se les asign el valor 1 y las ausentes el valor 0. Se cal-cul el ndice de similaridad DICE (Dice 1945, Nei y Lei 1979) y se realiz un anlisis de agrupamiento UPGMA mediante el programa NTSYSpc ver 2.0 (Rohlf 1993), adems se realiz un anlisis bootstrap con ayuda del programa WinBoot (Yap 1992). Las variedades analizadas se agruparon segn su procedencia, para determinar la cantidad de alelos que presentaban del total registrado, se analiz la presencia de los alelos compartidos entre las cinco regiones polticas de colecta y se determin el rango de alelos comunes y exclusivos en cada regin.

Por ltimo, se determin el ndice de diversidad gentica (Nei 1973) para las especie S. tuberosum subsp. andigena (4x) y S. x chaucha (3x), por ser las que poseen mayor nmero de variedades en la muestra analizada. Teniendo en cuenta que su valor vara entre 0 a 1, siendo los valores cercanos a 1 los de mxima diversidad.

h = 1 i=1

q xi

2

xi = frecuencia del alelo i

q = N de alelos observados en el locus

h = probabilidad que 2 alelos tomados al azar de la poblacin sean diferentes (Nei 1973)

ResultadosNmero de alelos amplificados por locus e individuos no

definidos.- De los 18 iniciadores microsatlites utilizados, 17 amplificaron un solo locus polimrfico mientras que el inicia-dor STM0019 amplific 2 loci. El rango de alelos encontrados por locus, fue desde 5 (STM1049 y STM1053) a 16 alelos (STM0019a), siendo el promedio de alelos por locus de 8.79. Adems los valores superiores a 0.5 encontrados (0.55 0.85) en el Contenido de Informacin Polimrfica (PIC) indican que los microsatlites evaluados son muy informativos detectando variaciones genticas en el cultivo de papa (Tabla 1).

De las 79 variedades nominales analizadas, 16 no concorda-ron con el nmero de alelos esperados para un marcador segn la especie y ploidia asignada, siendo el iniciador STM2013 el que present con mayor frecuencia este fenmeno (13 variedades nominales). Adems, se identificaron 5 variedades nominales (4 accesiones diploides S. stenotomum subsp stenotomum y 1 acce-sin triploide S. x chaucha) que no concordaron con la especie asignada, debido a que el nmero de alelos para la mayora de iniciadores exceda a lo esperado para cada especie.

Anlisis de agrupamiento.- Se obtuvo una similitud media de 0.62 y amplios rangos de agrupamiento que varan desde 0.41 a 0.98. El agrupamiento fue reforzado por medio del anlisis de bootstrap para ver la consistencia de los grupos formados. Aunque se usaron 18 marcadores microsatlites repartidos por todo el genoma de la papa y se analizaron 19 locus muy po-limrficos, las variedades nominales no lograron diferenciarse en grupos homogneos. Sin embargo, en un rango de similitud de 0.51 a 0.72, se logr determinar 18 pequeos grupos en los cuales la mayora guardan alguna relacin de nombre, lugar y/o especie (Fig. 2).

De estos 18 grupos, 7 grupos (I, IV, VIII, IX, X, XIII y XVIII) presentaron una consistencia de media a alta (46.1 a 83.8%) segn el anlisis bootstrap. Los grupos restantes presentaron una consistencia media a baja (39.6 a 10.4%). Con respecto a la procedencia del material colectado y a su identidad taxonmica, se observaron 5 grupos formados con accesiones pertenecientes a la misma regin poltica y con cierta relacin de especie (VII, VIII, X, XII y XVII).

Se encontraron 4 variedades, posiblemente duplicadas: a) 2 accesiones de S. x curtilobum procedente de Cusco y b) 2 accesiones de S. x chaucha, una procedente de Ayacucho y la otra de Cusco.

Riqueza allica.- Para los 19 loci registrados se obtuvo un total de 166 alelos. La regin de Cusco present el mayor nmero de alelos (130 alelos), seguido de Puno con 120, Ayacucho con 115, Huancavelica con 111 y Cajamarca con 105 alelos. Cabe resaltar que se analiz un mayor nmero de muestras de Ayacucho, sin embargo no se encontr un mayor nmero de alelos en esa regin; y ms an, solo 4 de los 19 locus analizados presentaron un mayor nmero de alelos en Ayacucho (Tabla 2)

Alelos comunes y exclusivos.- De los 166 alelos caracteriza-dos, 72 alelos (43.37%) fueron comunes o compartidos con las 5 regiones de colecta. Se registraron alelos exclusivos (aquellos que solo se encontraron en una de las 5 regiones) en todas las zonas

218

Soto et al.


Iniciador (SCRI) Motivo Repetitivo

Secuencia de iniciadores forward - Reverse (5- 3)

T de alineamiento

(C)Cromosoma Nmero de Alelos

Rando de Alelos PIC

STM1049 (ATA)6 CTACCAGTTTGTTGATTGTGGTG 57 I 5 185 - 204 0.5874

AGGGACTTTAATTTGTTGGACG

STM2022 (CAA)3(CAA)3 GCGTCAGCGATTTCAGTACTA 53 II 6 184 - 257 0.6713

TTCAGTCAACTCCTGTTGCG

STM1053 (TA)4 (ATC)5 TCTCCCCATCTTAATGTTTC 55 III 5 169 - 179 0.6835

CAACACAGCATSCAGATCATC

STM3023 (GA)9,(GA)8,(GA) AAGCTGTTACTTGATTGCTGCA 50 IV 7 167 - 202 0.6849

GTTCTGGCATTTCCATCTAGAGA

STM1031 (AT)13 TGTGTTTGTTTTTCTGTAT 55 V 7 262 - 298 0.5469

AATTCTATCCTCATCTCTA

STPcAo58 (TA)13 TTGATGAAAGGAATGCAGCTTGTG 57 V 9 233 - 255 0.7873

ACGTTAAAGAAGTGAGAGTACGAC

STM0019a (AT)7(GT)10(AT)4 (GT)5(GC)4(GT)4AATAGGTGTACTGACTCTCAATG 47 VI 16 157 - 214 0.8124

TTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTG

STM0019b (AT)7(GT)10(AT)4 (GT)5(GC)4(GT)4AATAGGTGTACTGACTCTCAATG 47 n.d. 6 93 - 106 0.6903

TTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTG

STM0031 (AC)5(AC)3 (GCAC)(AC)2 (GCAC)2CATACGCACGCACGTACAC 57 VII 10 148 - 199 0.7091

TTCAACCTATCATTTTGTGAGTCG

STM1052 (AT)14 GT (AT)4 (GT)6 CAATTTCGTTTTTTCATGTGACAC Td. 60-50 VII 6 212 - 229 0.7683

ATGGCGTAATTTGATTTAATACGTAA

STM2013 (TCTA)6 TTCGGAATTACCCTCTGCC 55 VII 11 146 - 171 0.8291

AAAAAAAGAACGCGCACG

STM1104 (TCT)5 TGATTCTCTTGCCTACTGTAATCG 57 VIII 12 163 - 180 0.8475

CAAAGTGGTGTGAAGCTGTGA

STM1016 (TCT)9 TTCTGATTTCATGCATGTTTCC 53 VIII 14 236 - 261 0.8405

ATGCTTGCCATGTGATGTGT

STGBSS (TCT)9 AATCGGTGATAAATGTGAATGC 53 VIII 11 125 - 142 0.8393

ATGCTTGCCATGTGATGTGT

STWAX-2 (ACTC)5 CCCATAATACTGTCGATGAGCA 53 VIII 7 243 - 218 0.7713

GAATGTAGGGAAACATGCATGA

STM3012 (CT)4, (CT)8 CAACTCAAACCAGAAGGCAAA 57 IX 7 150 - 212 0.5852

GAGAAATGGGCACAAAAAACA

STM1106 (ATT)13 TCCAGCTGATTGGTTAGGTTG 55 X 9 132 - 166 0.8276

ATGCGAATCTACTCGTCATGG

STM0037 (TC)5 (AC)6 AA (AC)7 (AT)4 AATTTAACTTAGAAGATTAGTCTC 53 XI 8 76 - 95 0.7164

ATTTGGTTGGGTATGATA

STM0030 Compuesto (GT/GC)(GT)8 AGAGATCGATGTAAAACACGT 53 XII 10 130 - 167 0.8434

GTGGCATTTTGATGGATT

Tabla 1. 19 locus registrados por 18 iniciadores microsatlites, nmero de alelos, rangos del tamao de alelos e ndice Polimrfico (PIC) registrados para 79 variedades nominales de papa nativa (Solanum spp).

219



de colecta y para 15 de los 18 iniciadores, siendo los iniciadores STWAX-2, STM1049 y STM1106 los que no presentaron alelos exclusivos (Tabla 3). La regin de Puno presento el mayor numero de alelos exclusivos (8 alelos).

ndice de Diversidad gentica. - Para el caso de las 42 variedades nominales de S. tuberosum subsp. andigena, el valor promedio de diversidad fue de 0.74 y para las 18 variedades nominales de S. x chaucha, el valor promedio de diversidad fue de 0.70, siendo S. tuberosum subsp. andigena ligeramente ms diversa que S. x chaucha.

DiscusinIniciadores multilocus

En papas tetraploides, Milbourne el al. (1998) describieron la existencia de iniciadores que amplifican varios loci en simul-taneo (multilocus); como es el caso del iniciador STM0019 que presenta dos regiones bien diferenciadas anteriormente reportado (Andrade 2001, Ames 2003, Ghislain et al. 2001). El incremento del nmero alelos esperados en el iniciador STM2013 para 13 accesiones, indicara la posibilidad de ser un marcador multilo-cus, presentando un locus bien definido y otro con problemas

Figura 2: Dendograma obtenido por el mtodo de agrupamiento UPGMA a partir de una matriz de similitud (DICE) con 79 variedades de papa nativa (Solanum spp.) utilizando 18 iniciadores microsatlites. Los nmeros romanos indican los 18 grupos mejor formados y los nmeros entre cada brazo indican el grado de consenso segn el anlisis bootstrap. Abreviaturas: adg = S. tuberosum subsp. andigena, cur = S. x curtilobum, cha = S. x chaucha, gon = S. stenotomum subsp. goniacalyx, stm = S. stenotomum subsp. stenotomum, phu = S. phureja, aja = S. ajanhuri, AYA = Ayacucho, CUZ = Cuzco, CAJ = Cajamarca, PUN = Puno y HUA = Huancavelica.

220

Soto et al.


de especificidad en la regin amplificada, por lo que presentara bandas sobrepuestas y una gran cantidad de alelos nulos, esto tambin fue sugerido por Ghislain (1999) y Andrade (2001).

Individuos no definidos

La probable explicacin para que 5 variedades nominales no concuerden con el nmero de alelos esperado sera una mala cla-sificacin taxonmica in situ y por lo tanto no concuerdan con la especie asignada. Aunque tambin deberamos tomar en cuenta que los campesinos no siembran los cultivos de papa separn-dolos por especie y no tienen cuidado de la hibridacin natural que puede sufrir este cultivo (Sevilla 2004, Brush et al. 1981, Jackson et al. 1978) lo que estara ayudando a cometer errores involuntarios en la caracterizacin. Esta caracterstica natural de la papa de formar hbridos espontneos interespecficos podra hacer que fenotpicamente un hbrido sea reconocido como alguna especie determinada debido a que expresa caracterstica de uno de sus progenitores pero que genotpicamente comparte regiones genmicas de sus dos especies parentales.

Anlisis de agrupamiento

La baja similitud media obtenida (0.62) y los amplios rangos de agrupamiento nos indican una alta variacin gentica entre las accesiones evaluadas. Si bien existen ciertas relaciones entre zonas de procedencia y/o especie, la consistencia de estos grupos no es fuerte, por lo que no se puede afirmar grandes relaciones genticas entre las variedades nominales agrupadas.

Estos resultados sugieren que los 18 iniciadores microsatlites no fueron suficientes para lograr una completa diferenciacin en grupos homogneos por especies, zona de procedencia ni por ploida. Este fenmeno ya fue observado por Raker y Spooner en el 2002, donde encontraron que muchas accesiones de S. tuberosum subsp. andigena (tetraploides) se mantenan agrupadas junto con sus ancestros diploides sin formar grupos definidos. Adems debemos tener en cuenta el alto porcentaje de hibridacin natural presente en las especies de papa nativa y que posiblemente los marcadores moleculares evaluados no se encuentren ligados a regiones genticas que puedan diferenciar estas especies.

La presencia de variedades duplicadas indicara la existencia de un pequeo grado de sobreestimacin de la diversidad gentica, especficamente en el caso de las 2 variedades que provienen de la misma regin. Por otro lado, las 2 variedades duplicadas que provienen de lugares diferentes podran explicarse por los mecanismo de intercambio de semillas que se efectan entre los agricultores (trueques, ferias regionales y nacionales) referenciado en los informes del Proyecto in situ (INIA 2005a-e).

Riqueza allica

La respuesta ms probable para que las cinco regiones pre-senten valores similares de polimorfismo, adems de presentar cantidades similares de alelos totales, de alelos exclusivos y de no formar grupos homogneos, probablemente se deba a la seleccin realizada por los agricultores (realizado desde los

Marcador SSR Total

N alelos

AYA CUZ PUN CAJ HUA

STWAX-2 7 6 7 6 5 6

STM3012 7 5 5 3 4 3

STM1104 12 8 8 9 8 9

STM1031 7 5 6 3 2 2

STM0031 10 6 7 5 7 6

STGBSS 11 6 8 9 7 7

STM1052 6 4 5 6 5 5

STPcAo58 9 9 7 7 4 5

STM2022 6 3 4 5 5 6

STM1049 5 3 5 5 4 4

STM1016 14 8 11 10 8 9

STM0030 10 8 7 7 8 7

STM3023 7 4 7 3 4 6

STM1106 9 8 9 6 6 7

STM1053 5 3 4 4 3 3

STM0037 8 8 6 7 6 5

STM0019a 16 9 10 10 6 9

STM0019b 6 5 6 5 5 4

STM2013 11 7 8 10 8 8

Total 166 115 130 120 105 111

Promedio 8.74 6.05 6.84 6.32 5.53 5.84

Tabla 2. Nmero total de alelos presentes para los 19 locus analizados y nmero total de alelos por zona de colecta. AYA = Ayacucho, CUZ = Cuzco, CAJ = Cajamarca, PUN = Puno y HUA = Huancavelica.

Marcador SSR

Alelos comunes

N alelos exclusivos

AYA CUZ PUN CAJ HUA

STWAX-2 4 0 0 0 0 0

STM3012 3 2 1 0 0 0

STM1104 5 0 0 0 1 0

STM1031 1 1 0 0 0 0

STM0031 3 0 0 0 2 0

STGBSS 6 0 1 2 1 0

STM1052 4 0 0 1 0 0

STPcAo58 4 1 0 0 0 0

STM2022 2 0 0 0 0 1

STM1049 3 0 0 0 0 0

STM1016 6 0 1 0 1 0

STM0030 4 0 0 0 1 1

STM3023 3 0 0 0 0 0

STM1106 4 0 0 0 0 0

STM1053 3 0 1 1 0 0

STM0037 4 1 0 0 0 0

STM0019a 3 1 1 2 0 0

STM0019b 3 0 1 0 0 0

STM2013 7 0 0 2 0 0

Total 72 6 6 8 6 2

Tabla 3. Nmero de alelos comunes entre las zonas de colecta y n-mero de alelos exclusivos para cada zona de colecta. AYA = Ayacucho, CUZ = Cuzco, CAJ = Cajamarca, PUN = Puno y HUA = Huancavelica.

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primeros pobladores andinos) que tienden a conservar diversos cultivares de papa; pero que entre todas ellas comparten las mis-mas caractersticas de utilidad comercial y de consumo (sabor, tamao, productividad, etc.) que hace que prevalezca un pool de genes especfico, adems no todos los agricultores mantienen las mismas variedades, pero s todas ellas se encuentran dentro de un solo pool de genes utilitarios.

En el caso de Ayacucho, el tener un mayor nmero de muestras no signific encontrar un mayor nmero de alelos. Por lo que se puede afirmar que conservar el mayor nmero de variedades en una regin no necesariamente significar conservar la mayor cantidad de variacin gentica, ya que la diversidad gentica dentro de una especie no se distribuye homogneamente a travs de los ambientes donde se desarrolla (Hodgkin 1995).

Por otro lado, casi la mitad de alelos caracterizados son co-munes para las 5 regiones de colecta, lo que indicara que estos alelos son fijos para las especies de papa nativa y se encuentran ampliamente distribuidas en la zona andina del Per.

Diversidad gentica de las especies evaluadas

Los valores de diversidad gentica encontrados para las especies analizadas (S. tuberosum subsp. andigena y S. x chaucha) son altos y reafirman el alto grado de diversidad gentica mantenido en la poblacin muestreada. En promedio el valor de diversidad gentica es ms alto en S. tuberosum subsp. andigena (0.74) en comparacin con el valor obtenido para S. x chaucha (0.70), probablemente esto se deba a un menor nmero de muestras analizadas por parte de la especie triploide, pero tampoco podemos descartar la naturaleza gentica de la misma especie y sus diferencias de ploida como responsables del grado de diversidad.

Los resultados nos indican que los microsatlites evaluados para papa nativa logran identificar altos niveles de diversidad gentica dado por los valores de polimorfismo (PIC = 0.55 0.85) y los ndices de diversidad gentica obtenidos, pero a la vez no son suficientes para discriminar grupos diferenciados por procedencia y/o especies.

Asimismo, el anlisis de agrupamiento, la riqueza allica y los valores de diversidad gentica obtenidos indican que existe un alto grado de diversidad gentica y corrobora los resultados obtenidos de los inventarios y caracterizaciones morfolgicas realizadas en las chacras de los agricultores; tambin podemos concluir que debido a los niveles similares de riqueza allica, de alelos exclusivos y el gran porcentaje de alelos compartidos para las cinco regiones de colecta, existira un pool de genes comn y fijo para las especies de papa nativa y que se encontraran ampliamente distribuidos entre las chacras de los campesinos.

AgradecimientosEl presente trabajo ha sido realizado en el Instituto Nacional

de Investigacin Agraria INIA de la Direccin de Investigacin Agraria DIA en la Sub direccin de Recursos Genticos y Biotecnologa SUDIRGEB, en el Centro Experimental La Molina - Lima, dentro del marco del Proyecto Conservacin in situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres, con el apoyo financiero del Fondo Mundial para el Medio Ambiente FMAM, la Cooperacin Italiana y el Gobierno Peruano. Los autores agradecen la colaboracin del Centro Internacional de la Papa por permitirnos usar los programas informticos necesarios para este trabajo.

Literatura citadaAmes M. 2003. Validacin de la seleccin de la coleccin ncleo de Sola-

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Documents

RPB v20n3