UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOLOGÍA

CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DE BACTERIAS

AISLADAS DE HOJAS DE PAPA (Solanum tuberosum L.)

COLECTADAS EN EL VALLE DEL RÍO CHAMA, ESTADO MÉRIDA,

VENEZUELA

Trabajo Especial de Grado. Presentado ante la Ilustre

Universidad Central de Venezuela, por la bachiller

Francesca Marina Coppola Guerriero, como requisito

parcial para optar por el título de Licenciada en Biología.

Tutora: Dra. Ana Karina Marcano

Caracas, Venezuela

Octubre 2015

A mi familia quienes por ellos soy lo que soy. Para mis padres

por su apoyo, consejos, comprensión, amor y ayuda en los

momentos difíciles. Me han dado todo lo que soy como

persona, mis valores, mis principios, mi carácter, mi empeño, mi

perseverancia, mi coraje para conseguir mis objetivos.

ii

RESUMEN

La papa (Solanum tuberosum L.) constituye uno de los cultivos más importantes a nivel

mundial y es atacado severamente por distintas enfermedades. La región andina de

Venezuela es el mayor productor de este cultivo de gran importancia social y económica

en el país. El objetivo de este trabajo es caracterizar a nivel bioquímico y molecular las

bacterias aisladas de hojas de plantas de papa colectadas en el Valle del Río Chama,

Estado Mérida. Para el aislamiento de las cepas bacterianas, se lavarán las hojas con y

sin lesiones con agua y jabón, y se colocaron en distintas soluciones con el fin de eliminar

patógenos ambientales en la superficie de las mismas. Los macerados de las hojas en

caldo LB, se traspasaron a agar LB; donde se observó la morfología de las colonias y se

obtuvieron aislados diferentes. Luego se realizó una prueba de patogenicidad para

obtener las cepas capaces de ocasionar pudrición a los tubérculos comerciales.

Posteriormente se les realizaron las pruebas bioquímicas y moleculares de identificación y

Genotipificación, usando como controles aislados bacterianos ya identificados como

patogénicos en papa, obteniéndose así 6 aislados bacterianos identificados como

Pectobacterium carotovorum. Para finalizar se realizaron pruebas de patogenicidad

empleando microtubérculos y hojas de las variedades ‘Arbolona negra’ y ‘Granola’, donde

se calcularon los índices de severidad e incidencia de la enfermedad, cultivadas in vitro y

se comprobaron los postulados de Koch, lo cual permitió la descripción de su

sintomatología.

Palabras claves: Solanum tuberosum, ‘Arbolona negra’, ‘Granola’, Río Chama, papa,

diagnóstico de bacteriosis.

iii

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a Dios, por darme la oportunidad de vivir y por estar conmigo en

cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber

puesto en mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía

durante todo el periodo de estudio.

A mis padres Tomas Coppola y Maria Antoniella Guerriero, por darme la

vida, quererme mucho, creer en mi y porque siempre me apoyaron. Papá y Mamá

gracias por darme una carrera para mi futuro, todo esto se lo debo a ustedes. Los

amo.

A mi hermano Matteo, por ser parte importante de mi vida, por llenar mi vida

de amor y alegría cuando más lo necesito.

A mi ahijado Sebastián, por tantas sonrisas abrazos y amor, por enseñarme

que la verdadera felicidad si existe.

A mis abuelos, tíos, tías y primos, especialmente a mi tía Adriana Guerriero

por ser una gran protagonista de este logro, por haber creído en mí hasta el último

momento. Gracias por tanta comprensión.

A mi tutora, la Dra. Maira Oropeza, por guiarme en este camino, por

hacerme parte de su equipo y la familia del LMV. Por enseñarme tanto. A mi

segunda tutora, la Dra. Ana Karina Marcano por hacer posible este sueño, por

creer en mí y por darme ánimos. Las quiero.

iv

A mis jurados, la Dra. Guillermina Alonso, y la Dra. Iselen Trujillo, por

ayudarme a crecer, por tantas horas de dedicación, por las exigencias y darme

ánimo para ser cada día mejor. A los demás jurados por su tiempo, sus consejos y

su dedicación.

Al Instituto de Biología Experimental, a los profesores, al personal

administrativo, y a mi familia del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal: Ingrid,

Sandra, Beatriz, Erick, Mayeli, Raiza, Maybeling, Yayfré y Rudy. Por las

sugerencias por el apoyo, por la gran solidaridad, por compartir conmigo sus

conocimientos, sus sugerencias y experiencias en pro de hacer las cosas cada día

mejor.

Al Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos, a la profesora

Juanita y a Indira, por los aislados bacterianos, y sobre todo por compartir sus

conocimientos y por la dedicación desinteresada.

A mi familia del Herbario Dr. Victor Manuel Ovalles de la Facultad de

Farmacia, Giovannina Orsini, Stephen Tillett y Gerad Haiek, por su colaboración,

asesoría, consejos, paciencia, cariño y dedicación

A mis amigos especialmente a Mary Carmen, Juan Luis, Joselin, Carlos,

Yetsenia, Verónica, Estefanía, Daniela, Jesús, Daniel y Jorge, por su cariño, por

su energía, por sus consejos y por estar siempre ahí. Por haber hecho de mi etapa

universitaria un trayecto de vivencias que nunca olvidare.

v

ÍNDICE DE CONTENIDO

Contenido Pág.

I. INTRODUCCIÓN 1

II. ANTECEDENTES 4

1. La papa (Solanum tuberosum L.) 4

1.1. Clasificación taxonómica y descripción botánica de la especie 4

1.2. Origen 5

1.3. Morfología de la planta 6

1.4. Variedades de papa 7

2. Importancia del cultivo 9

3. Las bacterias como patógenos vegetales 11

3.1. Género Ralstonia 12

3.2. Género Burkholderia 14

3.3. Género Erwinia (Pectobacterium y Dickeya) 17

3.3.1. Pectobacterium carotovorum 19

3.3.2. Dickeya chrysanthemi(Syn. Pectobacterium chrysanthemi) 20

4. Pruebas para la identificación de bacterias fitopatógenas 23

4.1. Pruebas morfológicas 23

4.2. Pruebas Bioquímicas 25

4.2.1. Actividad de la enzima Catalasa 26

vi

4.2.2. Actividad de la enzima Citocromo – Oxidasa 26

4.2.3. Producción de Indol 27

4.2.4. Producción de óxido- fermentación 27

4.2.5. Reducción de Nitratos 27

4.2.6. Triple Agar Hierro Kliger 27

4.2.7. Licuefacción de la gelatina 28

4.2.8. Simmons Citrato 28

4.2.9. Motilidad 28

4.2.10. Crecimiento y fermentación de lactosa en agar MacConkey 28

4.2.11. Hidrolisis de la esculina 29

4.2.12. Reducción de amilasas 29

4.2.13. Prueba de KOH 30

4.2.14. Agar YDC 30

4.3. Pruebas Moleculares 31

4.4. Pruebas de patogenicidad 37

4.4.1. Cultivo in vitro de papa 39

III. OBJETIVOS 43

1. Objetivo general 43

2. Objetivos específicos 43

IV. MATERIALES Y MÉTODOS 44

1. Colecta de material vegetal con sintomatología de marchitez bacteriana 44

2. Obtención de aislamientos bacterianos 44

vii

3. Prueba de patogenicidad en tubérculos comerciales 46

4. Identificación morfológica de los aislados bacterianos patogénicos 47

5. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias causantes de la

pudrición en tubérculos de papa 48

5.1. Tinción Gram 48

5.2. Prueba de oxidación – fermentación 49

5.3. Actividad de la enzima citocromo – oxidasa 49

5.4. Actividad de la enzima catalasa 50

5.5. Licuefacción de la gelatina 50

5.6. Producción de indol 50

5.7. Prueba de motilidad en fresco 51

5.8. Crecimiento y fermentación de lactosa en agar MacConkey 51

5.9. Prueba de la hidrólisis de la esculina 51

5.10. Prueba Simmons Citrato 52

5.11. Reducción de amilasas 52

5.12. Fermentación de lactosa y glucosa en Kliger 52

5.13. Prueba de KOH 53

5.14. Reducción de nitrato 53

5.15. Agar YDC 53

6. Identificación molecular de los aislados patogénicos 54

6.1. Extracción de ADN bacteriano 54

6.2. Calificación y cuantificación del ADN 55

viii

6.2.1. Espectrofotometría 55

6.2.2. Electroforesis en gel de agarosa 55

6.3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 56

6.3.1. PCR con iniciadores universales bacterianos 56

6.3.2. PCR con iniciadores específicos 57

6.4. Genotipificación mediante ERIC – PCR 61

7. Prueba de patogenicidad de los aislados bacterianos en microtubérculos y

hojas de las variedades de papa (Solanum tuberosum L.) 'Arbolona Negra' y

'Granola'. Postulados de Koch 62

7.1. Material vegetal y aislados bacterianos 62

7.2. Propagación in vitro de plantas y microtubérculos 62

7.3. Establecimiento del patosistema 64

7.3.1. Incidencia y severidad en microtubérculos 65

7.3.2. Incidencia y severidad en hojas 66

7.4. Postulados de Koch 67

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 69

1. Colecta de material vegetal con sintomatología de marchitez bacteriana 69

2. Obtención de aislamientos bacterianos 70

3. Prueba de patogenicidad en tubérculos comerciales 72

4. Identificación morfológica de los aislados bacterianos patogénicos 75

5. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias causantes de la

pudrición en tubérculos de papa 78

ix

6. Identificación molecular de los aislados patogénicos 88

6.1. Extracción de ADN bacteriano 89

6.2. Calificación y cuantificación del ADN 89

6.2.1. Espectrofotometría 90

6.2.2. Electroforesis en Gel de agarosa 91

6.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 92

6.3.1. PCR empleando iniciadores universales bacterianos 93

6.3.2. Identificación mediante PCR especie – específica 95

6.3.3. Amplificación mediante regiones repetitivas 103

6.3.4. Genotipificación 108

7. Prueba de patogenicidad de los aislados bacterianos en microtubérculos y

hojas de las variedades de papa (Solanum tuberosum L.) 'Arbolona Negra' y

'Granola'. Postulados de Koch 110

7.1. Propagación in vitro de plantas y microtubérculos 110

7.2. Establecimiento del patosistema 112

7.2.1. Incidencia y severidad en microtubérculos 113

7.2.2. Incidencia, severidad y sintomatología en hojas 124

7.3. Postulados de Koch 143

VI. CONCLUSIONES 146

VII. RECOMENDACIONES 149

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 150

IX. ANEXOS 164

x

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Pág.

Figura 1. Ensayo de patogenicidad en tubérculos comerciales a los 6 dpi…… 74

Figura 2. Colonias de los aislados bacterianos patogénicos en placas de agar LB

de 24 horas de crecimiento……………………………………………………………. 77

Figura 3. Tinción Gram de los aislados bacterianos patogénicos………………… 77

Figura 4. Aislados bacterianos patogénicos sembrados por agotamiento en Agar

YDC……………………………………………………………………………. …………80

Figura 5. Prueba de óxido – fermentación, 48 hpi medio Hugh & Leifson

suplementado con glucosa de las 6 cepas patogénicas y los aislados

control……………………………………………………………………………………. 85

Figura 6. Prueba de Indol……………………………………………………………… 86

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % de los productos de la

extracción del ADN bacteriano….……...……………………………………………. 92

Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa al 1,6% de los productos de PCR para

la estandarización del método de amplificación de la banda de 996 pb

correspondiente a ADN procariota, empleando iniciadores específicos U1 y

U2…………………………………………………………………………………........... 94

xi

Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa al 1,6% de los productos de PCR para

la amplificación de la banda de 996 pb correspondiente al ADN procariota,

empleando los iniciadores U1 y U2…………………………………………………... 95

Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR para

la detección de R. solanacearum, empleando iniciadores específicos OLI1 y

Y2………………………………………………………………………………………….96

Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR para

la detección de Ralstonia solanacearum, empleando iniciadores específicos OLI1 y

Y2………………………………………………………………………………………….98

Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa al 1,8% de los productos de PCR para

la estandarización del método de detección de Burkholderia gladioli, empleando

iniciadores específicos Gla-f y Gla-r……………………………………………..…….99

Figura 13. Electroforesis en gel de agarosa al 1,8% de los productos de PCR para

la detección de Burkholderia gladioli, empleando iniciadores específicos Gla-f y

Gla-r…………………………………………………………………………………..….100

Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa al 1,2% de los productos de PCR para

la estandarización del método de detección de Pectobacterium carotovorum,

empleando iniciadores específicos Y1pel y Y2pel………………………………....101

xii

Figura 15. Electroforesis en gel de agarosa al 1,2% de los productos de PCR para

la detección de Pectobacterium carotovorum, empleando iniciadores específicos

Y1pel y Y2pel…………………………………………………………………………...102

Figura 16. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR de la

región ITS 16S – 23S RNAr, empleando los iniciadores G1 y L1……………….. 104

Figura 17. Patrones de amplificación ITS- PCR de especies pertenecientes a

Erwinia, Pantoea , Enterobacter , y otros géneros de enterobacterias…………..106

Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % de los productos de PCR de

la amplificación de las regiones repetitivas del genoma bacteriano, mediante ERIC

– PCR, empleando los iniciadores ERIC1 Y ERIC2……………………………… 109

Figura 19. Incidencia de la enfermedad en microtubérculos a las 144 hpi, en

ambos tratamientos……………………………………………………………..……. 115

Figura 20. Severidad de la enfermedad en microtubérculos a las 144 hpi, en

ambos tratamientos……………………………………………………………........ 117

Figura 21. Sintomatología inducida por el aislado LMV01 a las 144 hpi…..........120

Figura 22. Sintomatología inducida por el aislado LMV27 a las 144 hpi. ……….120

Figura 23. Sintomatología inducida por el aislado LMV28 a las 144 hpi ….... ….121

Figura 24. Sintomatología inducida por el aislado LMV29 a las 144 hpi……….. 121

Figura 25. Sintomatología inducida por el aislado LMV30 a las 144 hpi ……….122

xiii

Figura 26. Sintomatología inducida por el aislado LMV31 a las 144 hpi…..... ….122

Figura 27. Sintomatología inducida por el aislado LMV32 a las 144 hpi……….. 123

Figura 28. Rodajas de microtubérculos control, inoculadas con 10 µL de caldo

estéril LB a las 144 hpi ………………………………………………………………..123

Figura 29. Rodajas de microtubérculos control, sin inóculo a las 144 hpi ..…….124

Figura 30. Incidencia de la enfermedad en hojas a las 144 hpi…………………..125

Figura 31. Severidad de la enfermedad en hojas a las 144 hpi…………………..129

Figura 32. Sintomatología inducida por el aislado LMV01 a las 144 hpi………. 131

Figura 33. Sintomatología inducida por el aislado LMV27 a las 144 hpi…..…….132

Figura 34. Sintomatología inducida por el aislado LMV28 a las 144 hpi………...133

Figura 35. Sintomatología inducida por el aislado LMV29 a las 144 hpi……. ….134

Figura 36. Sintomatología inducida por el aislado LMV30 a las 144 hpi………...135

Figura 37. Sintomatología inducida por el aislado LMV31 a las 144 hpi……….. 136

Figura 38. Sintomatología inducida por el aislado LMV32 a las 144 hpi……….. 137

Figura 39. Hojas control inoculadas con 10 µL de caldo LB esteril a las 144

hpi…………………………………………………………………………………….… 138

Figura 40. Hojas control sin inóculo a las 144 hpi………………………………. 139

xiv

Figura 41. Detalle macroscópico de las distintas sintomatologías observadas en

hojas. ………………………………………………………………………………… 140

xv

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla Pág.

Tabla 1. Características más importantes de R. solanacearum (Chavarro y col.,

2004)………………………………………………………………………………………13

Tabla 2. Pruebas bioquímicas para la diferenciación de Burkholderia gladioli

(Henry y col., 2001)……………………………………………………………………..15

Tabla 3. Características fenotípicas y fisiológicas más relevantes de B. gladioli y R.

solanacearum (Fonseca, 2014)……………………………………………………….16

Tabla 4. Características bioquímicas de los aislados LMV10, LMV11, LMV12,

pertenecientes al género Pectobacterium (Barrios, 2015)………………………. 18

Tabla 5. Características bioquímicas de Pectobacterium carotovorum ssp.

carotovorum (Schaad y col., 2001)………………………………………………….. 20

Tabla 6. Resumen de las pruebas de identificación de Erwinia spp. de papa

(García, 2000)…………………………………………………………………………....22

Tabla 7. Clave para diferenciar entre géneros de bacterias fitopatógenas (Schaad

y col., 2001)……………………………………………………………………………....26

Tabla 8. Características morfológicas de los aislados obtenidos de las hojas de

papa con sintomatología de bacteriosis……………………………………………....71

Tabla 9. Ubicación y código de los aislados patogénicos…………………………...75

xvi

Tabla 10. Morfología de las colonias de las cepas bacterianas patogénicas en agar

LB………………………………………………………………………………………....76

Tabla 11. Pruebas bioquímicas para la identificación de géneros en bacterias

patógenas de papa……………………………………………………………………..79

Tabla 12. Pruebas bioquímicas realizadas a los controles positivos Ralstonia

solanacearum y Burkholderia gladioli…………………………………………….…...81

Tabla 13. Resultado de las pruebas bioquímicas realizadas a los aislados

bacterianos patogénicos…………………………………………………………….….83

Tabla 14. Valores de D.O y concentración de ADN en los extractos de los aislados

bacterianos patogénicos…………………………………………………………….….90

Tabla 15. Tamaño de bandas para las distintas Erwinias, causantes de pudrición

blanda, por amplificación de PCR 16S-23S ITS (ITS-PCR). Tomado de Toth y

colaboradores (2001)………………………………………………………………… 106

Tabla 16. Incidencia de la enfermedad en microtubérculos a las 144 hpi…. ….. 114

Tabla 17. Severidad de la enfermedad en microtubérculos a las 144 hpi……….116

Tabla 18. Incidencia de la enfermedad en hojas a las 144 hpi………………….. 124

Tabla 19. Severidad de la enfermedad en hojas a las 144 hpi………………….. 128

xvii

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo Pág.

Anexo 1. Procedimiento para realizar la tinción Gram……………………………..164

Anexo 2. Fundamento de algunas pruebas bioquímicas empleadas (MacFaddin,

2003)……………………………………………………………………………………..166

Anexo 3. Preparación de los medios empleados para la identificación de los

aislados patogénicos…………………………………………………………………..169

Anexo 4. Preparación de medio Murashigue y Skoog (1962) sólido (MS)…….. 172

Anexo 5. Matriz de datos de la severidad en microtubérculos…………………. 173

Anexo 6. Matriz de datos de la severidad en hojas………………………………...174

xviii

TABLA DE ABREVIATURAS

A

ADN

AgNO3

AN

ARN

ARNr

Absorbancia

Ácido Desoxirribonucleico

Nitrato de Plata

'Arbolona Negra'

Ácido Ribonucleico

Ácido Ribonucleico ribosomal

BA

CaCO3

CIP

Benciladenina

Carbonato de Calcio

Centro Internacional de la Papa

Col Colaboradores

CTAB

CVCM

Bromuro de Cetiltrimetilamonio

Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos

CVCM76 Aislado número 76 del Centro Venezolano de Colecciones de

Microorganismos

CVP

Dntp

D.O

Crystal Violet Pectate

Dinucleótido trifosfato

Densidad Óptica

Dpi Dias post inoculación

ERIC

G

Región consenso repetida de Enterobacterias

'Granola'

Hpi Horas post inoculación

IBE Instituto de Biología Experimental

ITS Región Intergénica Espaciadora

KOH

KCL

LB

Hidróxido de Potasio

Cloruro de Potasio

Lysogeny broth

LMV Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

xix

LMV01 Aislado número 1 del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

LMV11 Aislado número 11 del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

LMV24 Aislado número 24 del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

LMV27 Aislado número 27 del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

LMV28 Aislado número 28 del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

LMV29 Aislado número 29 del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

LMV30 Aislado número 30 del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

LMV31 Aislado número 31 del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

LMV32

MgCl2

min

MPPAT

Aislado número 32 del Laboratorio de Mejoramiento Vegetal

Cloruro de Magnesio

Minutos

Ministerio del Poder Popular para la Agricultura y Tierras

MS Murashige y Skoog (1962)

NaCl Cloruro de sodio

NCBI National Center for Biotechnology Information

OF

ONPG

Pb

PDA

Oxido-Fermentación

Ortonitrofenil-(3-D-galactopiranósido (3-galactosidasa))

Pares de bases

Agar de patata y dextrosa

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

Pel

PFGE

Gen pel que codifica para la pectato liasa

Electroforesis en gel de campo pulsado

PHB

REP

rep-PCR

poli-β-hidroxiburato

Secuencias palindrómicas extragénicas repetitivas

Amplificación de secuencias repetidas

r.p.m

SDS

Revoluciones por minuto

Dodecil sulfato de sodio

seg

Subsp

Segundos

Sub-especie

xx

TZC Tetrazolium chloride

TTC

UCV

ULA

UV

V

v

YDC

Tri-phenyltetrazolium chloride

Universidad Central de Venezuela

Universidad de Los Andes

Ultra violeta

Voltios

Volumen

Extracto de levadura, dextrosa y carbonato de calcio

Introducción

1

1

I. INTRODUCCIÓN

La papa (Solanum tuberosum L.) es uno de los cultivos más importantes

para la alimentación de gran parte de la población en todo el mundo, debido a que

proporciona un valioso aporte de vitaminas, minerales, proteínas, aminoácidos

esenciales y carbohidratos (Buckenhüskes, 2005; Van Gijssel, 2005). La papa es

cultivada a escala mundial y es el cuarto cultivo en producción alimenticia,

después del maíz, el arroz y el trigo. Es el cultivo vegetal más productivo, además

ocupa el primer lugar entre los tubérculos y las raíces a nivel mundial, seguido por

la yuca (Manihot esculenta Crantz.) y el camote (Ipomoea batatas L.) (FAOSTAT,

2013).

En Venezuela, el cultivo de la papa se encuentra principalmente en la zona

denominada Páramo, con altitudes entre 2.000 y 3.899 msnm en los estados

Mérida, Táchira y Trujillo (zona alta) y en la Región Centro Occidental, en los

estados Lara, Aragua y Carabobo (zona baja) (Romero, 2007).

El cultivo de la papa en Venezuela es de gran importancia, por la superficie

dedicada a su siembra y los hábitos de consumo del venezolano. Es considerado

un cultivo líder entre los rubros denominados raíces y tubérculos, contribuyendo

con el 50% del valor de la producción total de éstos (Mora y Rojas, 2007). Los

elevados rendimientos por unidad de superficie y su ciclo vegetativo relativamente

corto, hacen que este cultivo sea más atractivo para los productores, así como

también que forme parte importante en nuestra dieta alimenticia (Álvarez, 2002).

Introducción

2

2

Una de las grandes limitantes en la producción de papa son los problemas

fitosanitarios o de enfermedades, que afectan plantas y tubérculos, generando

pérdidas en los rendimientos y en la calidad del producto final. Los daños

ocasionados pueden ser totales o parciales, comprometiendo la rentabilidad final

del cultivo (Méndez y Gaete, 2004).

Probablemente es la planta cultivable con la mayor incidencia de

enfermedades, superando a cualquier otro cultivo. Si se consideran las principales

enfermedades de la papa, las menores y aquellas de etiología desconocida,

sobrepasaría a 100 enfermedades (Notario, 2009). De las enfermedades

bacterianas de mayor impacto mundial que atacan el cultivo de la papa, han sido

reportadas en Venezuela, en orden de relevancia, la marchitez bacteriana

causada por Ralstonia solanacearum, pierna negra y pudrición blanda causadas

por Pectobacterium spp., pudrición anular causada por Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus, y la sarna común causada por Streptomyces scabies (CIP,

1995). Además se ha reportado que este cultivo es susceptible a Burkholderia

gladioli causante de pudrición blanda (Fonseca 2014).

En la papa cultivada en el estado Mérida las bacterias de mayor relevancia

que han sido reportadas son Ralstonia solanacearum y Erwinia spp. Estas

bacterias presentan un serio peligro para la comunidad del rubro, ya que producen

infección latente en tubérculos – semillas y además, tienen la capacidad de

sobrevivir en el suelo dependiendo del manejo del cultivo, las condiciones

edafoclimáticas y las especies o sub especies involucradas (García, 2000).

Introducción

3

3

Las fitobacterias causan diversos síntomas en campo, invernadero y/o

almacén, por lo que se utilizan diferentes métodos para detectar los géneros y

especies de cada una de estas. Los métodos más usados son los microbiológicos,

bioquímicos y patogénicos, sin embargo estos estudios fenotípicos deben de ser

complementados con otros métodos de detección y caracterización de las

especies, como es el uso de técnicas moleculares basadas en la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) que es una herramienta rápida y sensible (Helias y

col., 1998). La detección en la variabilidad fenotípica, bioquímica y genética de las

bacterias, su rango de hospederos, la homología con bacterias de otros orígenes

son importantes para el establecimiento programas preventivos en el manejo de la

enfermedad con base en las condiciones ambientales de cada región.

Por tanto, resulta urgente para el país, la implementación de metodologías

moleculares de detección altamente sensibles, rápidas y específicas; la

identificación y caracterización genética de los patógenos nativos; estudios de

patogenicidad en variedades de plantas comerciales y nativas cultivadas en el

país y el establecimiento de variedades resistentes, o al menos tolerantes capaces

de reemplazar cultivos susceptibles que favorecen entre otras cosas, la dispersión

de plagas (Fonseca, 2014). Considerando todo esto, en éste trabajo se reporta el

diagnóstico de bacteriosis presente en hojas de papa (Solanum tuberosum L.)

colectadas en río Chama, Estado Mérida - Venezuela.

Antecedentes

4

4

II. ANTECEDENTES

1. La papa (Solanum tuberosum L.)

La papa pertenece al género Solanum dentro de la familia de las

solanáceas donde también se encuentran el tomate (Lycopersicon esculentum), el

ají (Capsicum spp.), la petunia (Petunia spp.), el tamarillo (Cyphomandra spp.), el

tabaco (Nicotiana Tabacum) y otras especies con bayas venenosas (Hawkes,

1990).

Solo una parte reducida del género Solanum se encuentra conformado por

especies que forman tubérculos o son tuberizantes, a las que se denomina papa

(Ponce, 2013).

1.1. Clasificación taxonómica y descripción botánica de la especie

El cultivo de papa que tiene mayor importancia económica, industrial y

alimenticia a nivel mundial es Solanum tuberosum L., dicho nombre científico fue

usado por primera vez por el botánico suizo Gaspar Bahin en 1959 (Ramos,

1991).

Actualmente la clasificación taxonómica de la papa es la siguiente:

Reino: Vegetal

División: Magnoliophyta

Subdivisión: Angiospermae

Clase: Magnoliopsida

Subclase: Asteridae

Antecedentes

5

5

Orden: Solanales

Familia: Solanaceae

Subfamilia: Solanoideae

Género: Solanum

Especie: Solanum tuberosum L.

Subespecies: S. tuberosum subsp. andigena

S. tuberosum subsp. tuberosum

La especie Solanum tuberosum se divide en dos subespecies: tuberosum y

andigena. La subespecie tuberosum es la papa más cultivada en el mundo

especialmente en Norte América y Europa, mientras el cultivo de la subespecie

andigena, ocurre en el Centro y Sur América (Perilla y col., 2002).

La subespecie tuberosum presenta período vegetativo corto, de tres a

cuatro meses, adaptación a días largos, escasa floración, poca producción de

bayas, período corto de reposo del tubérculo y bajo porcentaje de almidón y de

biomasa seca. La subespecie andígena presenta período vegetativo de cinco a

siete meses, adaptación a días cortos, floración abundante y producción de bayas,

período largo de reposo del tubérculo, y alto porcentaje de almidón. (Roa y col,

2010).

1.2. Origen

Los investigadores del Centro Internacional de la Papa (CIP) en el 2012,

afirman que la historia de este cultivo comenzó hace unos 8.000 años, cerca del

lago Titicaca, ubicado a 3.800 metros sobre el nivel del mar, en la cordillera de los

Andes, en la frontera entre Bolivia y Perú. Desde entonces, la papa, en todas sus

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formas, ha sido por excelencia el "alimento del pueblo", y ha desempeñado un

papel central en el comercio de todos los países de esta región.

1.3. Morfología de la planta

La papa (Solanum tuberosum L.) es una planta herbácea, tuberosa,

perenne, de tallo erecto que puede medir hasta 1 metro de altura. Las hojas en su

madurez son compuestas imparipinadas, y se disponen de forma helicoidal a lo

largo del tallo. Sus inflorescencias son cimosas, con flores púrpuras o blancuzcas

de 3 a 4 cm de diámetro, 5 sépalos y 5 pétalos unidos, ovario súpero. Los tallos

aéreos son herbáceos, suculentos y pueden alcanzar de 0,6 a 1,0 m de longitud.

El sistema radical es fibroso, ramificado y extendido superficialmente, pudiendo

penetrar hasta 0,8 m de profundidad. Los tubérculos son tallos modificados y

constituyen los principales órganos de almacenamiento de la planta. Un tubérculo

tiene dos extremos: el basal, ligado al estolón, llamado talón, y el extremo opuesto

que se llama extremo apical o distal. Los ojos se distribuyen sobre la superficie del

tubérculo siguiendo un espiral, se concentran hacia el extremo apical y están

ubicados en las axilas de hojas escamosas llamadas cejas (Moreno, 2012).

Morfológicamente, los ojos del tubérculo corresponden a los nudos de los

tallos, las cejas representan las hojas y las yemas de los ojos representan las

yemas axilares. Los tubérculos pueden presentar una forma alargada, redondeada

y oblonga, y su color puede ser blanco, amarillo, violeta, rojizo, entre otros

(Poehlman y Allen, 2003). Además, los tubérculos, tienen de dos a diez ojos,

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dependiendo de la variedad y después de un periodo de reposo, brotan para

producir nuevas plantas. Por esta característica, los tubérculos son usados como

semillas (Alva, 2014).

1.4. Variedades de papa

Un aspecto importante a considerar es la disponibilidad de cultivares o

variedades para la multiplicación de la papa. Según Romero (2007), se considera

que una variedad es elegible cuando por sus características agronómicas y

tecnológicas, reúne las condiciones necesarias como para ser plantada en el país,

de manera que satisfaga las necesidades económicas del agricultor, así como las

de la industria nacional.

De acuerdo con el CIP en el 2012, existen 226 especies silvestres

distribuidas en 10.000 km de longitud, desde el suroeste de Estados Unidos hasta

el sur de Chile, con la mayoría de las especies concentradas en Perú y Bolivia.

Estas especies, no comestibles, son los antepasados originales de las papas

cultivadas hoy en día. Los tubérculos silvestres son más pequeños que las papas

cultivadas y poseen una gran variedad de formas y colores. Según Romero

(2007), en Venezuela los productores de papa siembran las variedades „Granola‟,

procedente de Alemania y „Arbolona Negra‟, procedente del estado Mérida, y en

menor proporción, se cultivan otras variedades tales como Caribay, Diacol capiro,

Monserrate, Atlantic, Kennebec, Alpha, entre otras.

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La variedad „Granola‟, perteneciente al grupo S. tuberosum subsp..

tuberosum, es de alta preferencia en el mercado. En Venezuela es comercializada

ampliamente, aun en la actualidad pese a su susceptibilidad a muchas

enfermedades. La planta desarrolla 3 a 5 tallos y posee hojas medianas de color

verde pálido. En los primeros 15 a 20 días presenta una formación lenta del follaje,

que luego acelera su tasa de crecimiento cubriendo bien el terreno. Los tubérculos

de esta variedad se adaptan a zonas medias y altas de cultivo en nuestro país,

pueden demorar de 3 a 4 meses para poder ser cosechados, son de tamaño

mediano a grande, forma ovalada, piel de color amarilla y pulpa amarilla clara

(Salas y col., 2000). También, Alva (2014) y Marín (2015), demostraron que esta

variedad es susceptible a Phytophthora infestans. Además, Fonseca en el 2014,

demuestra que esta variedad es susceptible a las bacterias Burkholderia gladioli,

Ralstonia solanacearum y Pectobacterium carotovorum, causantes de pudrición

blanda en tubérculos.

Por otra parte, 'Arbolona Negra' es una variedad nativa agrupada dentro de

las conocidas “papas negras”, y perteneciente al grupo S. tuberosum subsp..

andigena. Se cultiva significativamente en algunas comunidades del estado

Mérida (Gavidia, Pueblo Llano y en el Páramo del Pajarito). La flor de Arbolona

negra es de color morado intenso y es muy resistente a las heladas. Los

tubérculos tienen una corteza de color oscuro y son resistentes a la mayoría de las

enfermedades que atacan este cultivo. Su maduración ocurre a los 7 o 9 meses,

luego de este tiempo se cosechan los tubérculos y se comercializan, siendo sus

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cualidades principales: alta calidad y diversidad en los sabores y texturas, además

de la capacidad para permanecer en almacenamiento por varios periodos de

tiempo sin dañarse (Romero y Monasterio, 2008). Así pues, Alva en el 2014,

reportó que esta especie es resistente al hongo Phytophthora infestans, y Fonseca

(2014) que esta variedad de papa es menos susceptible a especies bacterianas

como Ralstonia solanacearum.

2. Importancia del Cultivo

La papa es el cuarto cultivo alimenticio más importante del mundo después

del maíz, el arroz y el trigo. Hasta inicios de la década de los 90s, casi la totalidad

de las papas se producían y consumían en Europa, América del Norte y en los

países de la antigua Unión Soviética. Hoy, se cultivan papas en 19 millones de

hectáreas de tierras agrícolas en 149 de los 167 países del mundo (MPPAT,

2003).

En el 2010, la producción mundial de papa fue de 324.420.782 toneladas

(FAOSTAT, 2013). Entre los principales productores mundiales de papa se

encuentran China, Rusia; India, Estados Unidos, y finalmente ocupando el quinto

lugar encontramos a Ucrania (FAOSTAT, 2013).

A nivel de Sudamérica, Perú produce el 26,6% del total del cultivo, por lo

que según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la

Agricultura, lo ubica como el mayor productor de esta parte del globo, superando a

Brasil (25,1%), Colombia (14,8%) y Argentina (14,0%). Aunque, en el ámbito

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10

mundial la producción peruana representa solo el 1,2%, bastante alejada de los

grandes productores mencionados antes (FAOSTAT, 2013).

En Venezuela el cultivo de papa es de gran importancia social y económica.

La producción se encuentra en la zona alta denominada Páramo, con altitudes

entre 2.000 y 3.899 msnm en los estados Mérida, Táchira y Trujillo (denominada

Zona Alta), y en la Región Centro Occidental, en los estados Lara, Aragua y

Carabobo (Zona Baja) (Romero, 2007). En la Zona Alta se siembra en los meses

entre enero y abril, para obtener cosecha entre marzo y mayo, y en la Zona Baja,

se obtiene la cosecha entre los meses de septiembre y enero (Coraspe – León y

col, 2002).

Como alimento, la papa adquiere importancia debido al contenido de

sustancias nutritivas, ya que produce alrededor de 80 Kcal/100 g de peso fresco y

tiene cerca del 2% de proteínas (peso del producto fresco), el contenido más

elevado de proteínas de la familia de los cultivos de raíces y tubérculos. En

promedio, el valor biológico de la proteína de papa es superior que el de la

mayoría de las fuentes vegetales (Trujillo, 2004).

El contenido vitamínico de la papa es similar al de otras hortalizas: 100 g de

papa hervida suministran cerca del 10% de la cantidad total diaria recomendada

para adultos de tiamina, niacina, ácido ascórbico, de 5 al 10% de ácido fólico, y

cerca de la mitad de la ingesta diaria recomendada de vitamina C. Además, la

papa es una fuente de minerales tales como: hierro, fósforo, magnesio y potasio.

Todo lo anterior muestra que la contribución de la papa a la dieta diaria no es

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solamente de energía, sino además de proteínas, vitaminas y minerales (Trujillo,

2004).

3. Las bacterias como patógenos vegetales

Los patógenos son responsables de gran parte de la disminución en la

producción agrícola a nivel mundial, y su manejo se realiza básicamente

empleando métodos químicos, lo cual, tiene un costo tanto económico como

ambiental (Madriz, 2002). Las bacterias pueden causar enfermedades graves y

económicamente dañinas, ocasionando desde manchas, mosaicos o pústulas en

hojas y frutos, o podredumbres malolientes de tubérculos, hasta la muerte de las

plantas (Vidaver y Lambrecht, 2004).

Las bacterias pueden entrar a la planta a través de aberturas naturales tales

como estomas, hidatodos o lenticelas y también por heridas en hojas, tallos o

raíces, o ser introducidas por ciertos insectos fitófagos. El inóculo llevado por la

lluvia que es arrastrada por el viento puede ser muy efectivo. En inoculaciones

artificiales, las bacterias suelen introducirse en las plantas por heridas, aerosoles

aplicados con presión para imitar las lluvias llevadas por el viento, infiltración por

vacío, o por inmersión de las semillas en el inóculo (Vidaver y Lambrecht, 2004).

La pudrición blanda es una patología que se ha estudiado

considerablemente en el cultivo de la papa. Se caracteriza por la maceración del

tejido parenquimatoso, que termina en una pudrición húmeda. El olor

desagradable que frecuentemente acompaña a la pudrición es causado por

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organismos secundarios, los cuales son particularmente activos a temperaturas

superiores a los 25 °C. La pudrición puede iniciarse en las heridas y propagarse

rápidamente por el tejido afectado, en muchos casos, al momento de la cosecha,

los tejidos aparentemente sanos ya están infectados latentemente, estos no

muestran síntomas, pero llevan bacterias en la superficie (Elphistone, 1987).

Dado que las bacterias pertenecientes a los géneros Ralstonia,

Burkholderia y Erwinia son las principales causantes de podredumbre en papa, en

este trabajo se hará énfasis en la descripción de estos tres géneros.

3.1. Género Ralstonia

De este género, el fitopatógeno por excelencia es Ralstonia solanacearum,

de gran importancia en las zonas tropicales y subtropicales, ya que afecta más de

200 especies de plantas en todo el mundo, aumentando cada día las especies

susceptibles. En los cultivos causa marchitez bacteriana (Hernández y col., 2005),

y es una de las enfermedades más graves de la papa, que con frecuencia

restringe la producción de este cultivo (CIP, 1995). En Venezuela, esta bacteria se

ha detectado en los cultivos de papa en los estados Lara, Monagas, Mérida y en

tomate en los estados Aragua, Carabobo, Cojedes, Yaracuy y Guárico donde

también se ha detectado en los cultivos de banano (Hernandez y col., 2005).

Ralstonia solanacearum pertenece a la subdivisión β de las proteobacterias

(Poueymiro y Genin, 2009). Las especies de R. solanacearum son bacterias Gram

negativas, bacilos de 0.5 a 0.7 por 1.5 a 2.5 μm, oxidasa y catalasa positivas,

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capaces de acumular poli-β-hidroxiburato (PHB) y reducir nitratos. Incapaces de

crecer a 40°C, crecen poco o nada en NaCl 2%. Los cultivos son negativos para la

prueba de arginina dihidrolasa, licuefacción de gelatina e hidrólisis de esculina o

almidón. Las colonias son no fluorescentes. Al contrario de las especies de

Burkholderia, a los ácidos grasos celulares de las especies de Ralstonia les faltan

los lípidos ornitina OL-1 y OL-2, y menos del 1 % del ácido graso total es C19:0

ácido ciclopropanoico (Schaad y col., 2001). Las características fisiológicas más

importantes de esta bacteria, se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Características más importantes de R. solanacearum (Chavarro y col., 2004).

Prueba Reacción

Coloración de Gram -

Gránulos de Poly-B- Hidroxybutirato +

Prueba de KOH 3% +

Prueba de oxidación de Glucosa +

Prueba de Oxidasa +

Tolerancia a soluciones de NaCl al 0.5% -

Tolerancia a soluciones de NaCl al 2% -

Tolerancia a soluciones de NaCl al 4% -

Prueba de Catalasa +

Prueba de Hidrólisis -

Prueba se Simmons Citrato +

Prueba de Hidrólisis de Almidón -

Prueba de Reducción de Nitratos +

Prueba de Arginina dihidrolasa ±

Utilización de Arginina -

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3.2. Género Burkholderia

Es de importancia resaltar que la identificación de las especies del género

Burkholderia es una tarea laboriosa y compleja que demanda laboratorios con

personal entrenado. Para una correcta identificación es necesario emplear medios

de cultivo diferenciales sistemas automatizados y ensayos bioquímicos

complementarios. Con frecuencia debe recurrirse a métodos moleculares, de alto

costo pero de mayor sensibilidad y especificidad, como la PCR (Reacción en

Cadena de la Polimerasa), electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE),

tipificación de secuencias de ADN, ribotipificación o una combinación de estas

técnicas, debido a que los sistemas de identificación comerciales no son capaces

de diferenciar entre las distintas especies dentro del complejo y a menudo fallan

en separar estos patógenos de otras especies o géneros relacionados; por lo

tanto, es difícil la identificación de esta especie mediante técnicas convencionales

(Fonseca, 2014).

Los organismos de las especies de Burkholderia corresponden a bacterias

Gram-negativas, tipo bacilo de un tamaño de 0.5 a 1.0 por 1.5 a 4.0 μm, polares o

con múltiples flagelos. La mayoría son aerobias estrictas incapaces de producir

pigmentos fluorescentes en condiciones limitantes. (Schaad y col., 2001). B.

gladioli produce colonias no fluorescentes, de coloración blanco cremoso, las

cuales tienen pigmentos amarillentos en la mayoría de los medios de cultivo y no

producen ningún tipo de estructura de resistencia o latencia (Fonseca, 2014). La

temperatura óptima de crecimiento oscila entre 30 y 35º C, y se sabe que la

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ocurrencia de vientos y lluvia con granizo favorecen el desarrollo del patógeno

(Cassanello, 2011).

Las características fisiológicas más relevantes de esta especie se

encuentran en la Tabla 2.

Tabla 2. Pruebas bioquímicas para la diferenciación de Burkholderia gladioli (Henry y col., 2001).

Prueba Porcentaje

Oxidación de:

Glucosa 100

Maltosa 0

Lactosa 0

Xylosa 96

Sacarosa 0

Lisina decarboxilasa 0

Crecimiento a 42 ºC 4

PNPG o ONPG 100

Oxidasa 0

Reducción de nitratos 33

Licuefacción de gelatina 70

Hidrólisis de esculina 11

Crecimiento en MacConkey 96

Pigmento marrón 33

Pigmento Amarillo 44

Alfa hemólisis 22

Beta hemólisis 22

BCSA 18

API20 NE 70

BCESM 0

Fonseca en el 2014, caracterizó un aislado de Burkhoderia gladioli, y

reportó que por la complejidad en la identificación de las especies de este género,

usualmente es asociada a especies filogenéticamente cercanas dentro de los

géneros Burkholderia y Ralstonia. En este sentido, la autora describe las

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características fisiológicas diferenciales de estas dos especies y se muestran en la

Tabla 3.

Tabla 3. Características fenotípicas y fisiológicas más relevantes de B. gladioli y R. solanacearum

(Fonseca, 2014).

Prueba B. gladioli R. solanacearum

Gram

Tipo

Colonias en LB

Colonias en YDC

Colonias en TZC

Crecimiento en PDA

Crecimiento a 41oC

Movilidad

Crecimiento en MacConkey

KOH 3%

Oxidasa

Movilidad en TTC.

Fermentación de Lac.

MacConkey

Citrato.

Catalasa

Lugol

Fermentación de lac. en

Kliger

Fermentación de gluc. en

Kliger

Nitrato reductasa

Arginina dihidrolasa

Anaerobiosis

Hidrólisis de almidón

Ureasa

Sacarosa

Resistencia a polimixina B

Identificación API20NE

Identificación 32GN

Identificación OLI1-Y2

Identificación RSF-RSR

Patogenicidad en Granola

Patogenicidad en A. negra

Sintomatología

-

Bacilos

Redondas a Irregulares y

Cremas

Cremas a Amarillas y secas

irregulares

Cremas a amarillas con estrías

rojo claro

Amarillas con borde blanco

-

+

+

+

+

+

-

+

+

-

-

+

+

-

-

-

-

-

+

B. cepacia

B. cepacia

-

+

Media-Alta

Baja

Pudrición ennegrecimiento

-

Bacilos

Redondas Blanco cremoso

Blanco cremoso y redondas

húmedas

Blanco cremoso con estrías rojo

oscuro

blancas

-

+

-

+

+

+

-

+ reacción lenta

+

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

+

+

Alta

Alta

Pudrición ennegrecimiento

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17

3.3. Género Erwinia (Pectobacterium y Dickeya)

El género Erwinia, dividido ahora en los géneros Erwinia, Pectobacterium,

Pantoea, Brenneria y Dickeya, inicialmente fue denominado así en honor a Erwin

Smith, quien fue el primero en proponer el género para bacterias patógenas de

plantas con forma de bastón, móviles por flagelos perítricos y anaeróbicos

facultativos (Solano, 2010).

Barrios (2015), aisló 3 cepas bacterianas de tubérculos de papa de Sanare

del Estado Lara, que presentaban síntomas de pudrición blanda, y las identificó

como pertenecientes al género Pectobacterium, denominándolas LMV10, LMV11 y

LMV12. Los resultados de las pruebas bioquímicas aplicadas a estos aislados se

muestran en la tabla 4.

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Tabla 4. Características bioquímicas de los aislados LMV10, LMV11, LMV12, pertenecientes al

género Pectobacterium (Barrios, 2015).

Pruebas Bioquímicas LMV10 LMV11 LMV12

Rafinosa + + +

Sorbitol + + +

D-ribosa + + +

Fructosa + + +

Catalasa + + +

CPG + + +

Gelatina + + +

Hidrólisis de almidón - - -

Indol - - -

McConkey Lac+

Lac-

Lac-

Nitrato - - -

OF: ** ** **

Glucosa + + + + + +

Lactosa + + + + + +

Oxidasa - - -

Prueba de KOH + + +

Simmons citrato + + +

Urea - - -

Motilidad + + +

Fermentación de Glucosa en Kliger

+ + +

Fermentación de Lactosa en Kliger

- - -

Producción de ácido sulfhídrico en Kliger

- + +

Producción de gas en Kliger - + +

*Aerobio **Anaerobio

La papa es afectada por tres especies del género Erwinia, que son E.

carotovora subsp.. atroseptica, cuyo rango de hospederos está restringido a

climas fríos; E. chrysanthemi que es patógena de numerosos cultivos tropicales y

sub-tropicales, incluyendo rubros extensivos como el maíz, la piña y el arroz;

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mientras que E. carotovora subsp.. carotovora (=Pectobacterium carotovorum

subsp.. carotovorum) está distribuida en zonas tropicales y templadas (García,

2000).

Pectobacterium carotovorum subsp.. carotovorum, P. carotovorum subsp..

atrosepticum y P. chrysanthemi pueden causar pudrición blanda en el tubérculo,

pero sólo carotovorum y chrysanthemi causan pierna negra. La patogénesis es

temperatura dependiente. P. carotovorum spp carotovorum causa pierna negra a

temperaturas menores a 25°C; mientras que P. chrysanthemi lo hace a

temperaturas mayores (Pérombelon, 2002).

3.3.1. Pectobacterium carotovorum

Los miembros del género Pectobacterium pertenecen a la familia

Enterobacteriaceae (Toth y col., 2003), son bacilos rectos 0,7 – 1,5 µm, Gram

negativos, no esporulados, móviles por flagelos perítricos. Son aerobios

facultativos, catalasa negativa y oxidasa positiva. Las colonias son blancas, grises

o amarillas, con temperaturas óptimas de cultivo de 27 °C ± 1 °C (Pérombelon y

Kelman, 1987).

Están reportadas dos sub especies de P. carotovorum como causantes de

dicha enfermedad, P. carotovorum subsp.. carotovorum y P. carotovorum spp.

atrosepticum, donde la principal arma que utilizan, es la producción de múltiples

exoenzimas, como las pectinasas, celulasas y proteasas, que dañan la pared

celular (Ortíz, 2013). De acuerdo a Toth y colaboradores (2003), estas bacterias

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20

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se encuentran principalmente sobre la superficie de las plantas o en el suelo. Las

vías de penetración son a través de heridas o de aperturas naturales en la

superficie de la planta. Una vez dentro, estos residen en el tejido vascular y

espacio intracelular del tejido parenquimático (Helias y col., 1998). Las principales

características bioquímicas para P. carotovorum subsp.. carotovorum se observan

en la tabla 5.

Tabla 5. Características bioquímicas de Pectobacterium carotovorum subsp.. carotovorum (Schaad

y col. 2001).

Prueba Reacción

Fermentación de glucosa (OFG) +

Catalasa +

Oxidasa -

Crecimiento a 37°C +

Reducción de azucares a partir de

sacarosa

-

Actividad fosfatasa -

Sensibilidad a la eritromicina -

Producción de Indol -

Formación de ácidos a partir de carbohidratos:

Sorbitol -

Citrato +

Rafinosa +

Lactosa +

3.3.2. Dickeya chrysanthemi (Syn. Pectobacterium chrysanthemi)

D. chrysanthemi es una bacteria Gram negativa, aneróbica facultativa, con

forma de varilla, mide de 1,3 – 3,8 x 0,5 – 1 micras; por lo general solitarias,

móviles con muchos flagelos perítricos. Es oxidasa negativa, catalasa positiva,

fermenta la glucosa y reduce nitratos (Tabla 6). La principal característica que

distingue a la pudrición blanda de Dickeya de otras especies del mismo género, es

Antecedentes

21

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la capacidad para producir grandes cantidades de enzimas pectolíticas que les

permiten ablandar el tejido parenquimático de una amplia gama de especies de

plantas (Ortiz, 2013).

D. chysanthemi es el patógeno de la pudrición suave, degrada órganos

suculentos de sus hospederos tales como rizomas, raíces, tubérculos y hojas

gruesas. La infección debilita el tallo y ocasiona una deformación y doblamiento de

la parte terminal. También coloniza el xilema, convirtiéndose en una infección

sistémica, causando marchitez general. Este último aspecto es el más alarmante

ya que el patógeno puede permanecer latente (Ortiz, 2013).

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Tabla 6. Resumen de las pruebas de identificación de Erwinia spp. en papa (García, 2000).

Pruebas E. carotovora E. chysanthemi

E.c.c E.c.a

Formación de huecos en el medio CVP + + +

Hidrólisis de la gelatina + + ±

KOH al 3% + + +

Pudrición de papa +++ +++ ++

Producción de ácido a partir de:

Lactosa + - -

Maltosa - + -

Trehalosa - + -

Producción de gas a partir de Glucosa - + +

Tolerancia al NaCl

5% + + +

10% + + +

Sensibilidad a Eritromicina:

< 10% - - -

= 10% - + +

> 10% + + +

Crecimiento a T° de:

3 - 6 °C - + -

28 °C + + +

30 °C + + +

36 °C + + +

37 °C + - +

45 °C - - +

E.c.c = Erwinia carotovora subsp. carotovora

E.c.a = Erwinia carotovora subsp. atroseptica

+++ = Reacción positiva. Pudrición total

Tanto P. carotovorum subsp. carotovorum como D. chrysanthemi tienen una

distribución mundial, y se consideran las bacterias patógenas de mayor

importancia en el cultivo de la papa desde el punto de vista comercial (Solano,

2010).

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23

23

4. Pruebas para la identificación de bacterias fitopatógenas

Para realizar el diagnóstico de bacterias fitopatógenas es importante la

observación de la sintomatología en campo y la información general del cultivo, ya

que es una clave para reconocer de manera preliminar el agente etiológico de la

enfermedad. Posteriormente se realizan pruebas bioquímicas y moleculares que

ayudan a diferenciar de un género predominante a otro (Schaad y col., 2001).

4.1. Pruebas morfológicas

Son todas aquellas características estudiadas a través de la observación

visual bajo lupas estereoscópicas y microscopio óptico de colonias formadas sobre

medios nutritivos de rutina, enriquecidos o diferenciales (Sánchez, 2011).

Luego de realizar una buena recolección de las muestras vegetales, se

aplican una serie de técnicas de aislamiento, principalmente la maceración que

permite la salida de fitobacterias epifíticas (Schaad y col., 2001). Posteriormente,

se realiza normalmente una siembra en medios de cultivo de enriquecimiento

primario como el agar nutritivo, para purificar y analizar las características

macroscópicas, como la morfología de las unidades formadoras de colonias y

características microscópicas mediante la tinción de Gram (Schaad y col., 2001).

Rivera (2014), describe que para la lectura, interpretación e identificación de

los cultivos de crecimiento bacteriano en medios sólidos, primero se debe seguir

un estudio cualitativo que comprenda los siguientes parámetros:

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24

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i. Tamaño: puntiforme, pequeño, mediano, grande, extendidas en velo,

invadiendo toda la superficie del medio.

ii. Forma: circular, alargada, irregular, filamentosa, rizoide, fusiforme.

iii. Bordes: enteros, dentados, lobulados, rizoides.

iv. Superficie: lisa, rugosa.

v. Levantamiento: plana, convexa, acuminada, umbilical

vi. Consistencia: mucoide, friable, seca, viscosa

vii. Transparencia: transparente, traslúcida, opaca

viii. Color: blanco, amarillo, gris, verde, rojo, etc.

La identificación morfológica de las bacterias se logra examinando un frotis

bacteriano en una lámina sometida a un proceso de tinción diferencial. Estos

criterios morfológicos encabezan las primeras etapas del proceso de identificación

bacteriana. Entre los tipos de tinciones más utilizados, se encuentra la tinción

Gram, la bacterias, teñidas se clasifican como Gram positivas o Gram negativas.

La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está en su resistencia

a la decoloración; la cual se debe probablemente al hecho de que en el caso de

bacterias Gram negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y

disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la

membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de

peptidoglicano es incapaz de retener el complejo cristal violeta-yodo y la célula se

decolora. Las células Gram positivas, a causa de sus paredes celulares más

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espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al

disolvente, provocando que el complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro

de la pared celular. Después de la decoloración, las células Gram positivas son

todavía azules, pero las Gram negativas son incoloras. Para poner de manifiesto

las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste, habitualmente

es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la

coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las

Gram positivas permanecen violetas (Notario, 2009).

4.2. Pruebas Bioquímicas

La identificación de bacterias no puede estar limitada sólo a las

características morfológicas, es importante conocer sus rasgos metabólicos y

fisiológicos, los cuales están al alcance mediante la realización de diferentes

pruebas bioquímicas. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el

microorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la

degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. Se ha

señalado que las bacterias más relacionadas pueden separarse hasta en dos

especies diferentes con base en pruebas bioquímicas (Schaad y col., 2001).

La identificación bioquímica de las especies bacterianas corresponde a un

conjunto de técnicas y no a una prueba específica, ya que puede cambiar entre

individuos de una misma especie, dependiendo de su vitalidad en el metabolismo

Antecedentes

26

26

de la bacteria (Fonseca, 2014). En la tabla 7, se muestra la clave descrita por

Schaad y colaboradores (2001) para la identificación de géneros bacterianos.

Tabla 7. Clave para diferenciar entre géneros de bacterias fitopatógenas (Schaad y col., 2001).

Pruebas

Erw

inia

Pan

tho

ea

Acid

ovo

rax

Pseu

do

mo

nas

Rals

ton

ia

Bu

rkh

old

eri

a

Xan

tho

mo

nas

Xylo

ph

ilu

s

Ag

rob

acte

riu

m

Cla

vib

acte

r

Clo

str

idiu

m

Bacil

lus

Str

ep

tom

yces

Gram positivas - - - - - - - - - + + + +

Crecimiento anaeróbico + + - - - - - - - - + + -

Crecimiento aeróbico + + + + + + + + + + - + +

Colonias amarillas o

naranjas en YDC - + - - - - + + - + - - -

Colonias mucoides en

YDC a 30°C - - + - + - + - + + ND ND -

Oxidasa - - + - + + - - + - - V +

Crecimiento a 40 °C - V + - - + - - - - + + -

ND: no determinado y V: variable entre 21 a 79% cepas positivas.

A continuación se detallaran las pruebas que se utilizan en la identificación

preliminar para determinar el género y la especie de las bacterias fitopatógenas,

además de la coloración Gram, que recomienda Schaad y colaboradores ( 2001).

4.2.1. Actividad de la enzima catalasa

Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en

agua y oxigeno gaseoso que se libera en forma de burbujas.

4.2.2. Actividad de la enzima Citocromo – Oxidasa

La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo-

oxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es reducido por el oxígeno

Antecedentes

27

27

molecular produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la especie

bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la

cadena transportadora de electrones.

4.2.3. Producción de Indol

Se determina la capacidad de un organismo de desdoblar el indol de la

molécula de triptófano. El indol se combina con el aldehído que se encuentra tanto

en el reactivo de Kovacs como en el de Ehrlich, para dar un color rojo en la capa

de alcohol. La coloración se basa en la coloración pirrólica en el indol.

4.2.4. Prueba de óxido- fermentación

La utilización del hidrato de carbono puede ser mediante dos procesos

metabólicos, fermentativo u oxidativo. Algunas bacterias pueden metabolizar el

hidrato de carbono solo en condiciones aerobias, y otras en condiciones tanto

aeróbicas como anaeróbicas.

4.2.5. Reducción de Nitratos

Determina la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos.

4.2.6. Triple Agar Hierro Kliger

Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono

específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de

Antecedentes

28

28

gases, junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico (SH)2.

El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa.

4.2.7. Licuefacción de la gelatina

Esta prueba muestra la capacidad de ciertos microorganismos para

hidrolizar la gelatina a péptidos y aminoácidos, mediante la acción de enzimas

gelatinasas.

4.2.8. Simmons Citrato

Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar

citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única

fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.

4.2.9. Motilidad

Determina si un microorganismo es móvil o inmóvil.

4.2.10. Crecimiento y fermentación de lactosa en agar MacConkey

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil

desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que

utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las

especies de la familia Enterobacteriaceae se desarrollan en el mismo; además es

Antecedentes

29

29

un medio inhibidor ya que permite el crecimiento de bacterias Gram negativas e

impide el crecimiento de las Gram positivas.

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para

el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la

mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben

el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.

Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.

Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en

las colonias, y la precipitación de las sales biliares.

Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias

incoloras.

4.2.11. Hidrólisis de la esculina

Medio de cultivo nutritivo que por la presencia de extracto y peptona de

carne aporta nutrientes para el desarrollo microbiano.

4.2.12. Reducción de amilasas

La molécula del almidón es muy compleja y para su asimilación por las

bacterias, éstas deben descomponerla (hidrolizarla) en sustancias más simples y

fácilmente asimilables. Un gran número de bacterias son capaces de elaborar una

enzima amilasa que hidroliza el almidón con formación de maltosa. La maltosa

puede ingresar a la célula para ser utilizada. La enzima amilasa es también una

Antecedentes

30

30

enzima extracelular, por lo tanto la demostración de la hidrólisis del almidón puede

hacerse tanto en medio líquido como en medio sólido.

4.2.13. Prueba de KOH

La determinación del Gram de las bacterias, también se puede realizar de

una forma más rápida y sencilla, empleando únicamente solución acuosa de KOH

al 3%. La edad del cultivo no influye en los resultados, a diferencia de la tinción

Gram. Si se mezcla KOH con colonias bacterianas, supuestamente se destruyen

las paredes celulares y se libera ácido desoxirribonucleico. Si se puede levantar

un hilo viscoso con el asa de inoculación. Se trata de una reacción positiva. La

colonia comprobada es Gram- negativa, o por lo menos, sospecha de serlo.

4.2.14. Agar YDC

Medio YDC (CaCO3 extracto de levadura-dextrosa), se puede utilizar para

evaluar la producción de pigmento. También puede ser utilizado para observar la

producción de ácido (ácido reacciona con el carbonato de calcio y crea una zona

clara alrededor de las colonias).

Antecedentes

31

31

4.3. Pruebas moleculares

Estas pruebas se han convertido hoy en día en el criterio principal para la

clasificación taxonómica, la identificación bacteriana, el diagnóstico etiológico en

enfermedades infecciosas y estudios epidemiológicos; y están basadas en el

grado de relación entre las secuencias de los ácidos nucleicos, mediante análisis

bien sea del DNA o RNA de los microorganismos (Rivera, 2014).

Una de las técnicas moleculares ampliamente utilizadas en la identificación

bacteriana es la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que consiste en

amplificar una región del ADN, en el caso de la PCR universal aplicada en ADN

bacteriano, se amplifica la región del gen 16S ARNr, la cual es una región

altamente conservada en procariotas. La PCR universal para la identificación

bacteriana mediante el análisis de esta secuencia consta de dos etapas: la

amplificación del ADN de la muestra y la posterior secuenciación del fragmento de

PCR para la identificación del microorganismo.

Para la identificación bacteriana por PCR con iniciadores específicos, las

regiones del genoma que se utilizan deben cumplir con características

fundamentales: a) estar presentes en todas las especies bacterianas; b) contener

secuencias altamente conservadas a las cuales van dirigidas los iniciadores y c)

incluir secuencias polimórficas para poder diferenciar distintas especies (Poggi y

col., 2009).

Los iniciadores que siguen siendo empleados comúnmente en los

laboratorios de identificación rutinaria para la identificación de R. solanacearum,

Antecedentes

32

32

son los propuestos por Seal y colaboradores (1992), OLI1 y Y2, diseñados a partir

de la región 16S ribosomal.

Respecto a la detección específica de B. gladioli, los iniciadores

comúnmente usados han sido diseñados por Furuya y colaboradores (2002), a

partir de la región espaciadora entre las regiones 16S y 23S del ARNr, y han sido

denominados GLA-f correspondientes a la región 3 a 20 nucleótidos aguas abajo

del gen 16S ARNr y GLA-r correspondiente a la región 256-272 nucleótidos aguas

arriba del gen 23S ARNr. Estos iniciadores son capaces de discrepar entre las

especies filogenéticamente más cercanas a B. gladioli, que son B. plantari y B.

glumae (Fonseca, 2014).

Darrase y colaboradores (1994), usando el gen de la pectatoliasa (pel)

desarrollaron una prueba de PCR para la detección de Erwinia carotovora. El set

de iniciadores permitió la amplificación de un fragmento de 434 pb en las cepas de

E. carotovora y no pudieron observar el fragmento en E. carotovora subsp.

betavasculorum y E. chrysanthemi. Luego hicieron RFLP a los fragmentos

amplificados utilizando 7 endonucleasas. Ellos además discuten el uso del RFLP

de fragmentos amplificados en epidemiología y diagnóstico, ya que por ejemplo, E.

carotovora subsp. atroseptica presentaba un grupo homogéneo mientras que las

cepas de E. carotovora subsp. carotovora y E. carotovora subsp. odorifera

exhibían diversidad genética que podía ser resultado de un origen no-monofilético.

Toth y colaboradores (2001), describen que los métodos de identificación

actuales para las Erwinias (Pectobacterium y Dickeya) causantes de pudrición

Antecedentes

33

33

blanda son imprecisos y requieren mucho tiempo. Se encontró que el análisis por

ITS-PCR e ITS-restricción es un método simple, preciso y rápido para

identificación de bacterias pertenecientes al género Erwinia. Las ITS se amplifican

de Erwinia y otros géneros usando cebadores de PCR universales. Para aumentar

el nivel de discriminación adicional, los productos ITS PCR son digeridos con

enzimas de restricción.

Khan y colaboradores (2003) generaron un par de iniciadores de 24 mer al

secuenciar la banda polimórfica derivada por URP-PCR que solo es compartida

por las cepas de Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum. El juego de

iniciadores denominado (EXPCCF/EXPCCR) amplificó una banda de 0.55 kb en

las 29 cepas de P. carotovorum subsp carotovorum y en tres cepas de

Pectobacterium carotovorum subsp. wasabiae pero no de las otras subespecies, ni

de otras Erwinias u otros géneros bacterianos. El perfil de digestión con Rsa I de

las bandas amplificadas, dividió las cepas de P. carotovorum subsp carotovorum

en cinco grupos con un perfil único para la subespecie wasabiae.

Nazerian y colaboradores (2011), encontraron manchas de color café

oscuro con lesiones acuosas extensas causadas por bacterias patógenas en

plantas de okra, que fueron colectadas en diferentes campos de Malasia en el

2010. Mediante la amplificación por PCR del gen de pectato liasa (pel) y la

amplificación del 16S-23S ARNr, (ITS) con los iniciadores G1 y L1 obtuvieron

fragmentos de 434, 535 y 570 pb, respectivamente. A partir de la similitud entre los

resultados de las pruebas bioquímicas y su equivalencia con fuentes de

Antecedentes

34

34

estándares bacteriológicos del gen pel basada en PCR, y el análisis de RFLP de

los productos de la PCR de la ITS, todos los aislamientos fueron identificados

como Pectobacterium carotovorum. Siendo este el primer reporte de P.

carotovorum en plantas de okra de Malasia.

En el año 2010 Zhu y colaboradores, aislaron treinta y dos cepas de

Pectobacterium carotovorum subsp.. de la col china y otras hortalizas. Estas cepas

fueron objeto de observación morfológica, identificación bioquímica y fisiológica,

así como análisis de la secuencia 16S RNAr. Todas las cepas excepto 5

manifiestan los mismos patrones de PCR. El análisis filogenético de las

secuencias de 16S RNAr indicó que estas cinco cepas que eran agrupadas con P.

carotovorum eran distintas de otras cepas de los grupos de P. carotovorum. Sin

embargo, el análisis de ácidos grasos de células enteras y las características

bioquímicas y fisiológicas sugirieron que estas cinco cepas todavía podrían ser

identificadas como P. carotovorum. Ellos concluyeron que esas cinco cepas son

probablemente de una nueva taxonomía evolutiva de P. carotovorum subsp..

(Barrios, 2015).

Baghaee – Ravari y colaboradores (2010), caracterizaron especies de

Pectobacterium de Irán usando métodos bioquímicos y moleculares. Todas las

bacterias que identificaron como pertenecientes al género Pectobacterium por

ensayos bioquímicos fueron confirmados por PCR para clasificarlos en especies y

subespecies, el producto no típico de PCR en P. carotovorum subsp. carotovorum

fue producido con los iniciadores EXPCCF/EXPCCR en todas las cepas probadas

Antecedentes

35

35

excepto en un aislado (ATCC 15713). El fragmento esperado de 434 pb,

correspondiente a la región conservada del gen de la pectatoliasa en P.

carotovorum fue obtenido en todas las cepas usando los iniciadores Y1 y Y2

incluso en el aislado ATCC 15713. En 5 de los aislados, empleando los iniciadores

ECA1f y ECA2r, lograron ampliar una banda de 690 pb especifica de P.

atrosepticum. Todas las cepas fueron analizadas por ITS –PCR para confirmar la

identificación de las especies.

Terta y colaboradores (2012), colectaron 22 aislados de P. carotovorum en

Morocco e investigaron sus características fenotípicas y genéticas. Todos los

aislados fueron identificados como P. carotovorum por la galería API 20E y

producían una banda de ADN de 434-bp del gen pel de la pectatoliasa en

experimentos de PCR. Evaluaron la diversidad genética por ERIC-PCR, y los

aislados se distribuyeron en dos grupos subdividos en muchos pequeños sub-

grupos. No encontraron una correlación entre el análisis ERIC-PCR, patrones de

susceptibilidad ni área geográfica (Barrios, 2015).

Kettani-Halabi y colaboradores (2013), presentan un método alternativo

usando el gen regulador de respuesta pmrA (parte del Sistema de dos

componentes (TCS) de esta bacteria para poder sobrevivir, colonizar y causar la

enfermedad), para la identificación y análisis de las relaciones entre 29

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum y otras subspecies de

Pectobacterium. El análisis de la secuencia del gen pmrA permitió la identificación

de las subespecies de Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, y la

Antecedentes

36

36

comparación con ERIC-PCR y la secuenciación del 16S RNAr, demostró que hay

una diversidad genética considerable en las razas de P. carotovorum subsp.

carotovorum.

Barrios (2015) aisló 3 cepas bacterianas de tubérculos de papa de Sanare

del Estado Lara, que presentaban síntomas de pudrición blanda, denominándolas

LMV10, LMV11 y LMV12, las cuales no amplificaron el gen pel de la pectatoliasa

(434 pb), identificándolas como pertenecientes al género Pectobacterium por las

pruebas bioquímicas y por su patrón de bandas obtenido en el ITS empleando los

iniciadores G1 y L1 las identifica como P. carotovorum subsp. betavasculorum,

esto por ser una de las únicas cepas reportadas por Darrase y colaboradores

(1994) en no amplificar el gen pel.

En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas moleculares de

tipificación basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que han

representado un avance importante en el estudio de las enfermedades

infecciosas. El polimorfismo detectado resulta de la variabilidad en la repetición de

dichas secuencias y de la distancia entre copias contiguas causadas por

inserciones o deleciones del ADN, siendo muy útiles al permitir discriminar

serotipos estrechamente relacionados y grupos de cepas no relacionadas

clonalmente, debido a su gran poder discriminatorio (Rivas y col., 2006).

Para completar la caracterización molecular de aislados bacterianos, es

necesario el estudio de variabilidad genética o tipificación comparativa del aislado

con las cepas control. La amplificación del ADN se realiza con los iniciadores

Antecedentes

37

37

ERIC propuestos por Lópes y colaboradores (2001), las secuencias REP

(Repetitive Extragenic Palindromic), así como BOX-PCR los cuales son de

naturaleza modular, y se componen de subsecuencias conservadas; las tres han

sido usadas ampliamente en tipificación, análisis genético y en la identificación de

brotes infecciosos bacterianos (Rademarker y col., 1997).

4.4. Pruebas de patogenicidad

La patogenicidad es la capacidad de ciertos organismos para iniciar el

desarrollo de una enfermedad. Estas pruebas se realizan en el huésped de donde

han sido aislados estos agentes fitopatógenos, para verificar y evaluar la

manifestación de síntomas en las mismas, evaluar resistencia y susceptibilidad de

variedades de plantas y comprobar el cumplimiento de los postulados de Koch.

Para desarrollar estas pruebas se debe preparar el inóculo bacteriano adecuado,

es decir a una concentración celular capaz de reproducir síntomas característicos

de la enfermedad; luego utilizar un método de inoculación dependiendo de la

forma de entrada en la planta y sitios de localización en la misma y por último,

estos ensayos se deben mantener bajo condiciones favorables para representar

los síntomas característicos de la enfermedad. El desarrollo de estas pruebas se

puede determinar por el periodo de incubación, aparición y progresión de

síntomas; luego para validar este ensayo se debe reaislar a partir de esas lesiones

la cepa bacteriana inoculada (Schaad y col., 2001).

Antecedentes

38

38

Estos ensayos biológicos son también una herramienta para restringir

especies bacterianas en patovariedades y razas (Benítez, 2010) y comprobar que

estas anteriores, sean capaces de causar enfermedad en otros hospedantes.

Si bien la aplicación de las nuevas técnicas moleculares a la microbiología

supone un gran avance, los investigadores son muy cautelosos a la hora de

desechar de forma drástica los postulados de Koch, sobre todo considerando la

importancia que han tenido y que aún tienen en la lucha contra las enfermedades

microbianas (Fuentes, 2007).

Robert Koch publicó sus postulados por primera vez en el año 1882 en un

artículo sobre la etiología de la tuberculosis, pero no fue hasta 1890 cuando estos

postulados fueron publicados tal y como los conocemos hoy. Koch descubrió que

el patógeno podía ser aislado de los individuos enfermos y cultivado en el

laboratorio sin perder su capacidad patogénica, ya que cuando se les inoculaba a

nuevos individuos se reproducía la enfermedad. Los cuatro criterios establecidos

por Koch son los siguientes:

1. El microorganismo patógeno debe estar presente en todos los casos de

enfermedad y ausente en organismos sanos.

2. El microorganismo sospechoso debe cultivarse en cultivo aséptico.

3. Las células de un cultivo aséptico del microorganismo aislado deben causar

la enfermedad en organismos sanos.

4. El microorganismo debe ser reaislado y ser idéntico al original. (Fuentes,

2007).

Antecedentes

39

39

4.4.1. Cultivo in vitro de papa

Actualmente, para realizar las pruebas de patogenicidad se emplea el

cultivo in vitro, como una herramienta de estudio con la cual se obtiene un numero

grande de plantas en un espacio pequeño, a bajos costos, en asepsia y en

condiciones controladas, características idóneas que permiten el estudio del

patógeno sobre el cultivo.

El cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto de técnicas que

presentan en común el hecho que un explante, tal como protoplastos, células,

tejidos y órganos, se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición

química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas (Salisbury y

col, 2000).

La propagación in vitro consiste en producir plantas a partir de porciones

muy pequeñas de ellas, tales como segmentos de tallo con yemas o meristemas

aislados, los cuales son cultivados asépticamente en un tubo de ensayo o en otro

recipiente en que se puedan controlar estrictamente las condiciones del ambiente

y la nutrición, teniendo como resultado plantas genéticamente idénticas a la planta

parental (Arellano y col., 2010).

La micropropagación junto con la microtuberización, son las técnicas de

cultivo in vitro más empleadas, para obtener vitroplantas y microtubérculos libres

de patógenos que posteriormente pueden ser empleados en la producción de

semillas de papa, como sistema modelo para el estudio de la interacción planta –

Antecedentes

40

40

patógeno (Alva, 2014), y para la realización de pruebas de patogenicidad, donde

luego se podrán comprobar los postulados de Koch.

En el 2012, Moreno estudió los efectos de la composición del medio de

cultivo y del fotoperiodo sobre la producción de microtubérculos de papa Solanum

tuberosum L. obteniendo los mejores resultados al micropropagar en medio líquido

Murashige y Skoog (1962), las distintas variedades en agitación orbital continua

bajo luz blanca por 4 semanas y posteriormente pasando estas vitroplantas a

medio liquido MS con 50g/L de sacarosa y 5mg/L de Benciladenina (BA) en las

mismas condiciones de agitación orbital continua, pero con fotoperiodo de 8h luz,

obteniendo en 2 meses 3,8 microtubérculos/planta en la variedad 'Granola' y 1,9

microtubérculos/planta en la variedad 'Arbolona Negra' y que además los mismos

presentaron un tamaño adecuado para su posterior utilización en pruebas de

patogenicidad.

Alva y Oropeza en el 2013, evaluaron los efectos de la consistencia del

medio de cultivo y del nitrato de plata en la micropropagación de dos cultivares de

papa Solanum tuberosum, concluyendo que el uso de medio MS (1962) semi-

sólido suplementado con 2mg/L de AgNO3 permite disminuir los síntomas

ocasionados por la producción de etileno, y además obtener vitroplantas con una

mayor área foliar en las mismas variedades de papa, lo cual es útil en el estudio

de las interacciones planta-patógeno o en pruebas de patogenicidad.

Igualmente Fonseca (2014), estableció un patosistema experimental

eficiente, que permitió establecer y cuantificar las diferencias del progreso de la

Antecedentes

41

41

enfermedad, analizando los índices de incidencia y severidad de aislados

bacterianos de B. gladioli, Pectobacterium sp y Ralstonia solanacearum en

microtubérculos y hojas de vitroplantas de papa variedades Granola y Arbolona

negra. Marín (2015) utilizó de manera exitosa hojas de vitroplantas de papa

variedades 'Granola' y 'Arbolona negra' para el estudio bioquímico de la

interacción papa- P. infestans, donde observó que el fotoperiodo no afecta

significativamente la micropropagación de plantas de papa variedades „Granola‟ y

„Arbolona negra‟, susceptibles y resistentes respectivamente a P. infestans.

Además Barrios (2015), determinó que el uso del cultivo in vitro resultó ser

un sistema apropiado para el desarrollo de las pruebas de patogenicidad y

cumplimiento de los postulados de Koch, empleando rodajas de microtubérculos, y

que las pruebas de patogenicidad lograron demostrar la resistencia de la variedad

„Arbolona Negra‟ frente al ataque de las bacterias pertenecientes al género

Pectobacterium, con respecto a la variedad „Granola‟ la cual es altamente

susceptible.

Todos estos trabajos realizados en el laboratorio de Mejoramiento Vegetal

han validado el uso de vitroplantas y microtubérculos tanto para el estudio de la

interacción planta-patógeno, como para comprobar el cumplimiento de los

postulados de Koch y pruebas de patogenicidad con bacterias. Estos estudios,

junto con la caracterización morfológica, fisiológica cultural y genotípica, permiten

un diseño idóneo para la identificación y caracterización de los fitopatógenos

bacterianos.

Antecedentes

42

42

Esta revisión bibliográfica permite tener las bases teóricas necesarias para

entender y desarrollar un diagnóstico de la bacteriosis presentes en hojas de

plantas de papa (Solanum tuberosum L.) colectadas en el valle del Río Chama,

Estado Mérida, Venezuela.

Objetivos

43

43

III. OBJETIVOS

Objetivo general

Caracterizar las bacterias presentes en hojas de papa (Solanum tuberosum

L.) colectadas en el valle del río Chama, Estado Mérida, Venezuela.

Objetivos específicos

1. Aislar bacterias patógenas de hojas de plantas de papa con sintomatología de

bacteriosis colectadas en el valle del Río Chama, Estado Mérida.

2. Purificar y caracterizar a nivel morfológico las bacterias aisladas de hojas de

plantas de papa con sintomatología de bacteriosis.

3. Realizar pruebas de patogenicidad para determinar la capacidad de las cepas

aisladas de producir pudriciones en tubérculos de papa comerciales.

4. Caracterizar a nivel bioquímico y molecular los aislados bacterianos

patogénicos.

5. Analizar la variabilidad genética de las cepas aisladas causantes de pudrición

en tubérculos de papa.

6. Comprobar los postulados de Koch empleando microtubérculos de Solanum

tuberosum variedad 'Granola'.

7. Evaluar la patogenicidad de las cepas aisladas en hojas y microtubérculos de

vitroplantas de las variedades ‘Granola’ y 'Arbolona Negra' de papa.

Materiales y Métodos

44

44

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Colección de material vegetal con sintomatología de marchitez bacteriana

Las muestras de hojas de papa con síntomas de bacteriosis fueron

colectadas por el Dr. Gustavo Fermín de la Universidad de Los Andes (ULA), en el

Valle del Río Chama (Vía Mucuchíes, Municipios Santos Marquina y Rangel,

Estado Mérida), el día sábado 21 de septiembre de 2013.

Los datos de la zona donde se tomaron las muestras se indican a

continuación:

WP 310: 2274 msnm, 8°41’47,3” N, 70°59´44,9” O

WP 311: 2269 msnm, 8°41’40,6” N, 70°59´47,0” O

El productor de este cultivo reiteró que los síntomas de marchitez solo se

observan en regiones más bajas del valle del río Chama, pero no en las zonas

más altas de esta región.

2. Obtención de aislamientos bacterianos

Se tomaron las hojas con o sin lesión y se lavaron con agua y jabón. Luego

se procedió a desinfectar las mismas en una solución de hipoclorito de sodio al

20% por 10 minutos, luego 10 minutos en agua destilada estéril con agitación,

inmediatamente se pasaron las hojas a una solución de etanol al 20% por 10

minutos y por último se lavaron nuevamente con agua destilada por 10 minutos en

agitación.

Materiales y Métodos

45

45

Paso seguido, se colocaron las hojas en un mortero con 2 – 3 mL de caldo

nutritivo LB y se procedió con el macerado de las mismas. Este extracto se colocó

en un tubo con 5 mL de caldo nutritivo LB y se incubó por 24 horas o hasta

observar turbidez.

Después de transcurrido el tiempo de incubación, se procedió con un asa

bacteriológica a tomar una gota del macerado y se sembró por agotamiento en

placas de agar nutritivo LB las cuales se incubaron por 24 horas a temperatura

ambiente.

Finalmente, se llevó a cabo el aislamiento de las distintas morfologías de

colonias por agotamiento en placas de agar LB, este proceso se repitió hasta

obtener cepas bacterianas puras, las cuales se conservan en punciones de agar

nutritivo LB. Para determinar su pureza, se visualizaron las colonias bajo el

microscopio estereoscópico y se les realizó una tinción Gram, para así observar

con más detalle la integridad de las mismas.

Además se emplearon como controles positivos de las pruebas de

caracterización bioquímica y molecular una cepa de Burkholderia gladioli (LMV01),

una cepa de Ralstonia solanacearum (LMV24) y una cepa de P. carotovorum

(LMV11), identificadas en el Laboratorio de Mejoramiento Vegetal (LMV) y como

control negativo se empleó una cepa de Escherichia coli (CVCM76), donada por el

Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM).

Materiales y Métodos

46

46

3. Prueba de patogenicidad en tubérculos comerciales

Se realizó una prueba de patogenicidad inicial utilizando rodajas de papas

obtenidas de tubérculos comerciales, con la finalidad de elegir las cepas

bacterianas con capacidad de provocar pudriciones. Para ello se llevó a cabo lo

siguiente:

Se seleccionaron tubérculos sanos, los cuales fueron lavados con agua

corriente y jabón, luego fueron pelados y lavados con agua destilada. Se

desinfectaron por 15 minutos en agua destilada estéril, 10 minutos en hipoclorito

de sodio 0,5 %, 15 minutos en agua destilada estéril y luego se colocaron en un

plato de aluminio previamente rociado con alcohol al 70 % y se flamearon para

cortar las rodajas de aproximadamente 5 mm de grosor, las cuales se dejaron en

una solución de ácido ascórbico estéril 0,05 % por 1 minuto para evitar posible

oxidación del tejido durante los días del ensayo. Se colocaron 2 rodajas por

cámara húmeda (Golkhandan y col., 2013). Para preparar las cámaras húmedas

se emplearon placas de Petri con 3 círculos de papel absorbente, 1 rejilla de

plástico y 10 mL de agua destilada estéril. Cabe destacar que se prepararon 2

cámaras húmedas por cepa y por control.

En el centro de la rodaja del tubérculo se realizó una incisión circular con un

saca-bocados con la finalidad de conocer el sitio de inoculación de la cepa

bacteriana y permitir su mayor penetración (Golkhandan y col; 2013).

Simultáneamente se prepararon suspensiones celulares tomando una

colonia de 24 horas de crecimiento bacteriano en agar nutritivo LB y se inoculó en

Materiales y Métodos

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3 mL de caldo nutritivo LB; se procedió a incubarlos por 24 horas a temperatura

ambiente con agitación continua.

Para la inoculación de las rodajas, se tomaron con pipetas estériles de 1 ml,

0,20 ml de cada una de las suspensiones bacterianas de 24 horas de crecimiento

en caldo nutritivo LB y se colocaron sobre la incisión realizada con el saca bocado

en el centro de la rodaja. Así mismo, se inocularon rodajas de papa con caldo

nutritivo estéril sin crecimiento bacteriano como control negativo y cepas

bacterianas conocidas e identificadas previamente causantes de pudriciones en

papa como control positivo.

Todas las rodajas inoculadas se incubaron en cámaras húmedas durante

una semana a temperatura ambiente 26°C y a 32 °C, esto con el fin de identificar

bacterias que puedan crecer a temperaturas elevadas. Se evaluaron y se realizó

un registro fotográfico de la sintomatología durante todo el ensayo.

Aquellas cepas que resultaron patogénicas, se les asignó código LMV

(Laboratorio de Mejoramiento Vegetal), para su posterior identificación.

4. Identificación morfológica de los aislados bacterianos patogénicos

Los aislados bacterianos purificados e identificados como patogénicos

causantes de pudrición de las rodajas de tubérculos comerciales, se dejaron

crecer en caldo nutritivo LB por 24 horas, luego se sembraron en placas de agar

LB y al cabo de 24 horas, se observaron las colonias en el microscopio

estereoscópico para su identificación morfológica. Así, las colonias se describieron

Materiales y Métodos

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según la metodología puntualizada por Rivera (2014) con base en las

características macroscópicas en medios sólidos, tomando en cuenta: tamaño,

forma, bordes, superficie, levantamiento, consistencia, transparencia y color de las

colonias bacterianas.

5. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias causantes de la

pudrición en tubérculos de papa

Para la identificación preliminar de las especies bacterianas causantes de la

pudrición en tubérculos de papa, se aplicó un esquema de pruebas bioquímicas y

de tinción descrita para bacterias patógenas de plantas, de acuerdo a las

recomendaciones de Schaad y colaboradores (2001). Los fundamentos de estas

técnicas se detallan en el anexo 2 y la preparación de los medios en el anexo 3.

5.1. Tinción Gram

La tinción Gram consiste en esparcir una muestra de cultivo bacteriano

procedente de agar nutritivo LB de 24 a 48 horas de crecimiento, sobre un

portaobjetos limpio y estéril, siendo cubierto con una solución de cristal violeta

durante un minuto; posteriormente se lavó el portaobjetos con agua destilada, se

secó y se cubrió con solución lugol, por un minuto. Una vez transcurrido este

tiempo, se lavó con abundante agua y se adicionó solución decolorante alcohol –

acetona por 1 minuto, a continuación se lavó el decolorante, y se aplicó una

solución de safranina y se dejó por 1 minuto, después de este tiempo se lavó con

Materiales y Métodos

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abundante agua y se observó en un microscopio óptico, donde las células Gram

positivas quedaron teñidas de violeta azul oscuro y las Gram negativas de color

rojo. El procedimiento para realizar la tinción Gram, se detalla en el anexo 1.

5.2. Prueba de oxidación – fermentación

Para la determinación de crecimiento anaeróbico facultativo de los

aislamientos bacterianos se preparó el medio Hugh y Leifson (1953),

suplementado bien sea con glucosa al 20% o lactosa al 20%. Se inocularon 2

tubos de vidrio con una colonia de cultivo bacteriano procedente de agar nutritivo

LB de 24 horas de crecimiento, a uno de los tubos se le añadió 0,5 mL de parafina

liquida estéril y se incubaron a temperatura ambiente, en incubadora por 24 horas.

Se usaron como control 2 tubos insertando el asa microbiológica sin inóculo

bacteriano y en uno de ellos de igual manera se adicionó la parafina estéril.

5.3. Actividad de la enzima citocromo – oxidasa

Para esta prueba se cortó papel de filtro de 2 cm2, al cual se le agregaron 2

gotas de solución citocromo oxidasa y con un palillo de madera estéril,

previamente impregnado con una muestra de crecimiento bacteriano de resiembra

de 24 horas, se mezcló con la solución sobre el papel de filtro. La prueba se

consideró positiva si, al cabo de 20 segundos, el papel de filtro adquiere una

coloración púrpura.

Materiales y Métodos

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5.4. Actividad de la enzima catalasa

En un portaobjetos limpio y estéril se colocó una gota de solución de

peróxido de hidrogeno al 5 %, posteriormente con un palillo de madera estéril,

previamente impregnado con una muestra de crecimiento bacteriano de resiembra

de 24 horas, se mezcló con la solución sobre el portaobjetos. La prueba se

consideró positiva, si al cabo de 20 segundos, se forman burbujas de gas.

5.5. Licuefacción de gelatina

Se inocularon cepas bacterianas por punción, en tubos de ensayo que

contenía medio para licuefacción de gelatina. La prueba se consideró positiva si el

medio obtiene una consistencia liquida.

5.6. Producción de indol

Se preparó el medio líquido producción de indol, el cual fue vaciado en

tubos de vidrio, estos se esterilizaron a 121 °C por 15 minutos. Posteriormente se

inocularon cepas bacterianas provenientes de agar nutritivo LB de 24 horas de

crecimiento, por punción en los tubos de ensayo que contienen el medio y los

tubos se incubaron a 28 °C durante 48 horas. Después de transcurrido este tiempo

se le adicionó 0,3 mL de reactivo de Kovac. La prueba se consideró positiva si se

forma un anillo rojo en la superficie del medio líquido.

Materiales y Métodos

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5.7. Prueba de motilidad en fresco

La base de esta prueba es determinar si la bacteria es móvil o inmóvil. Con

un asa de inoculación se colocó sobre un portaobjetos un poco de muestra de la

cepa bacteriana de 24 horas de crecimiento proveniente de medio líquido nutritivo.

Se colocó un cubreobjetos y se observó al microscopio. Se pudo observar si las

bacterias tienen movimientos rectilíneos o curvos y en todas direcciones.

5.8. Crecimiento y fermentación de lactosa en agar MacConkey

Se preparó el agar MacConkey se esterilizó y se sirvió en placas de Petri

estériles. Se procedió con el asa bacteriológica y tomando una colonia de

crecimiento de 24 horas procedente de agar nutritivo LB, a sembrar por

agotamiento sobre el agar. La placa se incubó por 24 – 48 horas a temperatura

ambiente.

5.9. Prueba de la hidrólisis de la esculina

Se preparó caldo nutritivo LB y se suplementó con una solución de esculina

0,1 % y una solución de citrato férrico 0,05 %. Se sirvieron 3 mL por tubo y se

inocularon con el microorganismo de interés de crecimiento 24 horas. Se

incubaron los tubos durante 24 horas. Si el organismo hidroliza la esculina se

observa un ennegrecimiento del medio (reacción positiva).

Materiales y Métodos

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5.10. Prueba Simmons Citrato

Se preparó el medio y se sirvieron 3 mL por tubo, los cuales se esterilizaron

y se dejaron solidificar en forma de cuña. A partir de un cultivo puro de 24 horas,

se sembró en el medio usando un asa bacteriológica. Se incubaron durante 24 –

48 horas. La prueba se considera positiva si se observa crecimiento y color azul

en el pico (alcalinidad). El resultado se considera negativo si el medio permanece

de color verde debido a que no existe desarrollo bacteriano y no hay cambio de

color.

5.11. Reducción de amilasas

El medio consiste en agar nutritivo suplementado con una solución de

almidón soluble al 0,2 % se esterilizó y se sirvió en placas de Petri estériles. Se

inoculó con un asa en forma de raya una colonia de cultivo puro de crecimiento de

24 horas. Se incubaron las placas durante 24 – 48 horas. La capacidad de

hidrolizar el almidón se detectó añadiendo unas gotas de solución de iodo.

5.12. Fermentación de lactosa y glucosa en Kliger

Se preparó el medio y se sirvieron 5 mL en los tubos los cuales se

esterilizaron y se dejaron solidificar en cuña. Se sembraron bacterias de 24 horas

de crecimiento observándose viraje de color, producción de gas y producción de

ácido sulfhídrico a las 24 y 48 horas.

Materiales y Métodos

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5.13. Prueba de KOH

Se preparó una solución estéril al 3% de KOH, se colocó una gota en un

portaobjetos y se tomó una colonia con un asa de punta disolviéndola en la sal.

Luego se levantó el asa para ver la formación de un hilo lechoso y viscoso.

5.14. Reducción de nitrato

Se preparó el caldo nitrato y se distribuyó en tubos (3 mL/tubo), se

inocularon y se incubaron por 24 horas. Al tubo con crecimiento se le añadieron

unas gotas de ácido sulfanílico y unas gotas de α – naftilamina. El desarrollo de un

color rosado indicó la presencia de nitritos. Se confirmaron los resultados

añadiendo Zinc en polvo.

5.15. Agar YDC

Se preparó el agar YDC se esterilizó y se sirvió en placas de Petri estériles.

Se procedió con el asa bacteriológica y tomando una colonia de crecimiento de 24

horas en agar nutritivo LB, a sembrar por agotamiento sobre el agar. La placa se

incubó por 24 – 48 horas en incubadora a temperatura ambiente. Se observó

coloración y mucosidad de las colonias.

Materiales y Métodos

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6. Identificación molecular de los aislados patogénicos

6.1. Extracción de ADN bacteriano

Para la obtención del ADN bacteriano de los aislados se empleó la

metodología propuesta por Gomes y colaboradores (2000):

Se dejaron crecer los aislados en 5 mL de caldo nutritivo al 10% de glicerol

durante 3 días a 27ºC. Se tomaron 1.5 mL del cultivo crecido y se centrifugaron a

13000 r.p.m durante 5 minutos. El sedimento se resuspendiò en 200 μL de

solución Tris 0,1M y se le añadieron 200 μL de solución de lisis (NaOH 0,2 N y 1%

de SDS). La mezcla se incubó durante una hora a 55 ºC. Transcurrido este tiempo

se añadieron 700 μL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1v/v/v), se

homogenizó y se centrifugó durante 10 minutos a 13000 r.p.m. Luego de esta

centrifugación se observaron tres fases de las cuales se tomó la fase acuosa. Por

último, se le añadieron al sobrenadante, 700 μL de etanol frío al 95% y se

centrifugó a 13000 r.p.m durante 5 minutos, luego se lavó con etanol al 70% y se

centrifugó a 13000 r.p.m durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y el

precipitado de ADN se secó y se resuspendió en 50 μL de agua destilada estéril.

Materiales y Métodos

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6.2. Calificación y cuantificación del ADN

6.2.1. Espectrofotometría

La concentración de ADN en el extracto se determinó usando la relación

260/280 D.O en un espectrofotómetro Genesys 10 Bio (Sambrook y Russell,

2001). La relación 260/280 indicó la pureza de la muestra en cuanto al contenido

de material genético libre de proteínas y otros compuestos. La concentración de

ácidos nucleicos se calculó empleando la siguiente ecuación, habiendo realizado

previamente diluciones de 1/200 (F.D = 200) y conociendo que 1 D.O para ADN

doble de doble cadena es igual a 50 ng.μL-1

:

[DNA] (μg/mL) = Abs (260 nm) x F.D. X 50 ng.μL-1

6.2.2. Electroforesis en gel de agarosa

La calidad e integridad del ADN se determinó por electroforesis en gel de

agarosa al 0,8%, preparado en tampón TBE 0,5X. Se tomó una alícuota de la

muestra y se mezcló con una alícuota de tampón de carga (azul de bromofenol

0,25%, xilene cianol 0,25% y glicerol 30% en H2O) y se colocó en un bolsillo del

gel de agarosa al 0,8%. Se aplicó corriente (80V) hasta que el primer colorante

alcanzó el final del gel. El gel se visualizó utilizando una solución 10 mg/mL de

bromuro de etidio durante 10 min y luego fue lavado en agua por 30min, luego fue

fotografiado bajo luz ultravioleta para su análisis en un transiluminador GelDoc

(BioRad) (Luque y Herraez, 2000).

Materiales y Métodos

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6.3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Se utilizó la PCR para evaluar la calidad del ADN extraído y para la

identificación de los aislados como organismos procariotas empleando iniciadores

universales bacterianos (U1 Y U2); e iniciadores específicos reportados en la

bibliografía para la identificación de género y especie. Además se emplearon

como controles positivos una cepa de Burkholderia gladioli (LMV01), una cepa de

Ralstonia solanacearum (LMV24) y una cepa de P. carotovorum (LMV11),

identificadas en el Laboratorio de Mejoramiento Vegetal (LMV) y como control

negativo se empleó una cepa de Escherichia coli (CVCM76), donada por el Centro

Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM).

6.3.1. PCR con iniciadores universales bacterianos

La PCR se realizó en un termociclador automatizado (GeneAmp PCR

System) y los fragmentos se revelaron mediante electroforesis en gel de agarosa

al 1,8%, los cuales fueron visualizados utilizando una solución de bromuro de

etidio al 5%. Como control negativo se utilizó un tubo que contenía todos los

componentes de la reacción en el cual se sustituyó el ADN por agua destilada

estéril. Se realizó una estandarización del método con el fin de corroborar y

encontrar las condiciones de ciclado y mezcla de reacción óptimas.

La amplificación se realizó según el protocolo descrito por Lu y

colaboradores (2000). La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μL

que contiene: 1X Amortiguador de reacción, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP’s, 0,2

Materiales y Métodos

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μM Iniciadores, 20 ng DNA de la muestra bacteriana y 1 U de Taq Polimerasa. Las

condiciones de amplificación se fijaron según el protocolo planteado por Lu y col.

(2000), con los siguientes ciclos:

Ciclo 1: Desnaturalización durante 5 min. a 94ºC (una repetición).

Ciclo 2: Desnaturalización durante 1 min. a 94ºC, hibridación de iniciadores

durante 1 min. a 48°C, elongación durante 2 min. a 72°C (35 repeticiones).

Ciclo 3: Extensión final durante 10 min. a 72°C (una repetición).

Se esperaron productos de amplificación de 996 pb y de 150 pb

aproximadamente. Los iniciadores para la amplificación que se emplearon fueron

los descritos por Lu y colaboradores (2000): U1: 5′- CCA GCA GCC GCG GTA

ATA CG -3′ y U2: 5′- ATC GG(C/T) TAC CTT GTT ACG ACT TC -3′

6.3.2. PCR con iniciadores específicos

Con el propósito de detectar la presencia de ADN correspondiente a

Pectobacterium carotovorum, Ralstonia solanacearum o Burkholderia gladioli, se

realizaron amplificaciones por PCR con iniciadores específicos. Para cada caso,

se realizó una estandarización del método con el fin de corroborar y encontrar las

condiciones de ciclado y mezcla de reacción óptimas.

En el caso de Ralstonia solanacearum se llevó a cabo una PCR con los

iniciadores OLI1 (5`-GGGGGTAGCTTGCTACCTCC- 3´) y Y2 (5´-

ACTCCTACGGGAGGCAGTGGG-3´), propuestos por Seal y colaboradores

(1992); específicos para la identificación de R. solanacearum, diseñados a partir

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de la región 16S ARNr, con los cuales Fonseca en el 2014 logró amplificar un

fragmento de 292pb del aislado LMV24 (R. solanacearum) en gel de agarosa al

1,5 %.

La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μL que contiene: 1X

Amortiguador de reacción, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP’s, 1 μM Iniciadores, 50 ng

DNA de la muestra bacteriana y 1 U de Taq Polimerasa. Con las siguientes

condiciones de ciclado:

Ciclo 1: Desnaturalización durante 2 min. a 96ºC (una repetición).

Ciclo 2: Desnaturalización durante 20 seg. a 94ºC, hibridación de

iniciadores durante 25 seg. a 67°C, elongación durante 30 seg. a 72°C (35

repeticiones).

Ciclo 3: Extensión final durante 5 min. a 72°C (una repetición).

En el caso de Burkholderia gladioli, la amplificación se llevó a cabo con los

iniciadores GLA–f (5´-CGAGCTAATACCGCGAAA-3´) y GLA-r (5´-

AGACTCGAGTCAACTGA-3´), en gel de agarosa al 1,8 %, propuestos por Furuya

y colaboradores (2002), específicos para la identificación de B. gladioli, con los

cuales Fonseca en el 2014 logró establecer la detección molecular específica para

B. gladioli logrando la amplificación del fragmento esperado de aproximadamente

300pb para los aislados LMV01 y CVCM1273, pertenecientes a la especie B.

gladioli pero no para los controles negativos CVCM1274 (B. difussa),

correspondiente a un re-aislamiento de la cepa CVCM1273 y LMV24 (R.

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solanacearum); demostrando la efectividad de esta prueba para la detección

molecular especie-específica de B. gladioli y la especificidad de estos iniciadores

diseñados a partir de las regiones 16S y 23S.

La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μL que contiene: 1X

Amortiguador de reacción, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP’s, 0,4 μM Iniciadores, 50

ng DNA de la muestra bacteriana y 1 U de Taq Polimerasa. Con las siguientes

condiciones de ciclado:

Ciclo 1: Desnaturalización durante 2 min. a 94ºC (una repetición).

Ciclo 2: Desnaturalización durante 1 min. a 94ºC, hibridación de iniciadores

durante 1,15 min. a 55°C, elongación durante 1 min. a 72°C (30

repeticiones).

Ciclo 3: Extensión final durante 7 min. a 72°C (una repetición).

En el caso de Pectobacterium carotovorum, la amplificación se llevó a cabo

mediante el protocolo utilizado por Golkhandan y colaboradores (2013), para la

amplificación del gen pel. Con los oligonucleótidos Y1 (5’-

TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT- 3’) y Y2 (5’-

CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT- 3’) (Darrasse y col., 1994), se esperó

obtener un fragmento amplificado de 434 pb, que fue visualizado en gel de

agarosa al 1,2 % para las especies Pectobacterium carotovorum (Nazeriam y col.,

2011).

Materiales y Métodos

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La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μL que contiene: 1X

Amortiguador de reacción, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP’s, 1 μM Iniciadores, 50 ng

DNA de la muestra bacteriana y 1 U de Taq Polimerasa. Con las siguientes

condiciones de ciclado:

Ciclo 1: Desnaturalización durante 5 min. a 94ºC (una repetición).

Ciclo 2: Desnaturalización durante 30 seg. a 94ºC, hibridación de

iniciadores durante 30 seg. a 60°C, elongación durante 1 min. a 72°C

(35 repeticiones).

Ciclo 3: Extensión final durante 7 min. a 72°C (una repetición).

Además se realizó la amplificación de la región intergénica espaciadora

transcripta (ITS-PCR) según lo descrito por Jensen y colaboradores (1993),

utilizando los iniciadores universales G1 (5’-GAAGTCG TAACAAGG- 3’) y L1 (5’ -

CAAGG CATC CACCGT -3’). En este caso se esperó obtener distintos patrones

de bandas, dependiendo de la sub especie de P. carotovorum presente en la

amplificación de los productos ITS- PCR en gel de agarosa al 2 % (Toth y col.,

2001).

La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μL que contiene: 1X

Amortiguador de reacción, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP’s, 1 μM Iniciadores, 50 ng

DNA de la muestra bacteriana y 1 U de Taq Polimerasa. Con las siguientes

condiciones de ciclado:

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Ciclo 1: Desnaturalización durante 5 min. a 94ºC (una repetición).

Ciclo 2: Desnaturalización durante 1 min. a 94ºC, hibridación de iniciadores

durante 2 min. a 55°C, elongación durante 2 min. a 72°C (28 repeticiones).

Ciclo 3: Extensión final durante 2 min. a 72°C (una repetición).

6.4. Genotipificación mediante ERIC-PCR

Con la finalidad de realizar la tipificación y el análisis comparativo de los

aislados con las cepas control, se realizó la amplificación del ADN con los

iniciadores ERIC propuestos por Lópes y colaboradores (2001).

Esto se llevó a cabo en un volumen final de 25 μL conteniendo: buffer 5X

(KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM [pH8.3]); MgCl2 25μM; 25 μM de cada iniciador

ERIC1 (5′ -ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C -3′) y ERIC2 (5′ -AAG TAA GTG

ACT GGG GTG AGC G -3′), 1.25μM de cada dNTP, 1 U de Taq ADN polimerasa y

50 ng de ADN. Las amplificaciones de ADN se realizaron en un termociclador

automatizado (GeneAmp PCR System) con un ciclo inicial de 3 min. a 95 °C,

seguidos por 35 ciclos de 1 min., a 94 °C, 1 min. A 50 °C, y 4 min., a 65 °C y con

una extensión final de 10 min., a 65 °C. Las muestras se visualizaron mediante

electroforesis en gel de agarosa al 1,8 %, esperándose productos de amplificación

entre 0,18 a 2,68 Kb con los iniciadores ERIC, los cuales hibridan con las regiones

repetidas dispersas en el genoma bacteriano según lo reportado por los autores

(Lopes y col., 2001).

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Posteriormente se realizó el análisis de resultados y cuantificación de

bandas empleando las herramientas informáticas del transiluminador Gel Doc

(BioRad).

7. Prueba de patogenicidad de los aislados bacterianos en microtubérculos

y hojas de las variedades de papa (Solanum tuberosum L.) ‘Arbolona

negra’ y ‘Granola’. Postulados de Koch.

7.1. Material vegetal y aislados bacterianos

Para el análisis de patogenicidad se emplearon los aislados bacterianos

identificados y capaces de inducir pudrición bacteriana en tubérculos comerciales

de papa. Como material vegetal para los ensayos de patogenicidad se emplearon

vitroplantas y microtubérculos de las variedades de papa ‘Arbolona Negra’ y

‘Granola’ mantenidas en el banco de germoplasma del Laboratorio de

Mejoramiento Vegetal, Instituto de Biología Experimental (IBE) de la UCV.

7.2. Propagación in vitro de plantas y microtubérculos

Para obtener las vitroplantas de papa, se siguió el protocolo establecido en

el CIP Perú (Espinoza y col., 1989). Se cultivaron asépticamente 2 segmentos

nodales de plantas de papa in vitro (variedades ‘Arbolona Negra’ y ‘Granola’), de

dos meses de edad, en cada tubo, y se incubaron en tubos de vidrio con tapas de

polipropileno que contenían medio semisólido MS (1962) (Anexo 4), suplementado

Materiales y Métodos

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con 25 g/L de sacarosa y solidificado con 6 g/L de agar (30 tubos por variedad).

Todo el material se incubó bajo luz blanca continua (95 µmol m-2 s-1) a 18 ºC,

durante dos meses. Luego de ese tiempo las vitroplantas presentaron el tamaño

adecuado para extraer los segmentos nodales que se emplearon en las siguientes

experiencias.

La multiplicación de las vitroplantas se realizó mediante el cultivo de

microesquejes de 1-1,5 cm, de las dos variedades en medio líquido con las sales

de MS (1962) y sacarosa (25 g/L). Se cultivaron 4 esquejes por fiolas, en 7 fiolas

(por cada variedad), dejándolas 3 semanas en agitación y luz constante (o el

tiempo necesario para alcanzar el tamaño deseado, 10cm de alto). El material se

incubó bajo luz blanca fluorescente a 18 ± 1 °C, con una intensidad lumínica de

95μ.mol/m2s-1 (Alva y Oropeza, 2013).

La microtuberización se realizó de acuerdo al protocolo establecido por

Moreno (2012). Culminadas las 3 semanas de la fase de micropropagación, a las

plántulas se les intercambió el medio por uno preparado de igual forma pero

suplementado con sacarosa (50 g/L) y BA (5mg/L), en condiciones de fotoperiodo

de 8 h luz, aumentando el tiempo de cultivo de dos semanas a 3 meses con el

objeto de conseguir un incremento en el número de microtubérculos y de mayor

diámetro (0.5 cm o más).

Para obtener hojas con mayor área foliar, la multiplicación de las

vitroplantas se realizó siguiendo la metodología de Alva y Oropeza (2013),

cultivando microesquejes de 1-1,5 cm, de las dos variedades en medio sólido con

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las sales de MS (1962) suplementado con sacarosa (25 g/L) y nitrato de plata

(AgNO3) 2mg/L incubándolas en condiciones de fotoperiodo de 16 horas luz a 18 ±

1 °C.

7.3. Establecimiento del Patosistema

Una vez obtenidos los microtubérculos y las hojas de vitroplantas, en

condiciones de asepsia y dentro de la cámara de flujo laminar, se cortaron los

microtubérculos en rodajas de aproximadamente el mismo grosor (2mm), y se

colocaron 5 rodajas por cámara húmeda. Así mismo, se procedió a retirar las

hojas de los tallos, y se colocaron de 3 a 4 hojas por cámara húmeda. A partir de

las cepas bacterianas patogénicas previamente obtenidas, se prepararon

suspensiones celulares tomando una colonia de 24 horas de crecimiento

bacteriano en agar nutritivo LB y se inocularon en 3 mL de caldo nutritivo LB y se

incubaron por 24 horas a temperatura ambiente con agitación continua. Luego de

este tiempo, se realizó una dilución 1/100, tomando 200 μL de cultivo bacteriano

en 2 mL de caldo LB y se dejaron crecer durante 4 horas. Con la dilución anterior

se espera alcanzar una concentración cercana a 108 células/mL recomendada

para los ensayos de patogenicidad (Alvez, 2014; Fonseca 2014).

Se tomó un volumen de 10µL de cada una de las suspensiones bacterianas

de 4 horas de crecimiento en caldo LB y se colocaron sobre el centro de la hoja o

de la rodaja de los microtubérculos. Así mismo, se inocularon rodajas de

microtubérculos y hojas con caldo nutritivo estéril sin crecimiento bacteriano, como

Materiales y Métodos

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control negativo y la cepa de B. gladioli (LMV01) previamente identificada en el

laboratorio como control positivo.

Todos los experimentos se incubaron en las cámaras húmedas durante 6

días a temperatura ambiente 26 °C y a 32 °C. Se prepararon 4 cámaras húmedas

por cepa y por control para cada temperatura.

7.3.1. Incidencia y severidad en microtubérculos

Una vez inoculados 10 µl de la solución bacteriana sobre cada segmento,

se observó la aparición de los síntomas (pudrición, exudado lechoso y viscoso en

la superficie del tubérculo y olor fétido) durante 144 horas, a ambas temperaturas

y se realizó el registro fotográfico cada 24 horas de la evolución de la enfermedad,

así como la descripción de los síntomas y conteo de microtubérculos afectados

para determinar la incidencia de la enfermedad a las 144 hpi.

La severidad fue calculada a las 144 horas, asignando valores de severidad

empleando la escala modificada por Fonseca (2014), propuesta por Montanelli y

colaboradores (1995), de acuerdo a la sintomatología presente en los

microtubérculos, de la siguiente manera: 1 cuando sólo el borde del tubérculo se

encuentra afectado, 2 cuando menos del 25% del tubérculo se encuentra

afectado, 3 cuando del 26% al 50% del tubérculo se encuentra afectado, 4 cuando

del 51% al 75% del tubérculo se encuentra afectado y 5 cuando del 76% al 100%

del tubérculo se encontró afectado.

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66

Una vez establecidos estos valores se calculó el índice de enfermedad

empleando la escala de gradiente de síntomas adaptada por Fonseca (2014), de

Rott y Chagvardieff (1987) para la siguiente fórmula:

( ) ( ) ( ) ( ) ( )

Donde: X1 es el número de microtubérculos con una escala de severidad igual a 1, X2 es el

número de microtubérculos con una escala de severidad igual a 2, X3 es el número de

microtubérculos con una escala de severidad igual a 3, X4 es el número de microtubérculos con

una escala de severidad igual a 4, X5 es el número de microtubérculos con una escala de

severidad igual a 5 y XT el número total de microtubérculos evaluados.

7.3.2. Incidencia y severidad en hojas

Una vez inoculados 10 µl de la solución bacteriana sobre cada hoja, se

observó la aparición de los síntomas durante 144 horas, calculando entonces el

porcentaje de hojas con presencia/ ausencia de síntomas como medida de

incidencia de la enfermedad a ambas temperaturas y se realizó el registro

fotográfico cada 24 horas de la evolución de la enfermedad, así como la

descripción de los síntomas.

La severidad se calculó determinando el índice de la enfermedad

empleando la escala de gradiente de síntomas de Rott y Chagvardieff (1987)

modificada por Fonseca (2014) y aplicando la siguiente fórmula:

Materiales y Métodos

67

67

( ) ( ) ( ) ( )

Donde: X1 es el número de hojas con necrosis únicamente en el lugar donde se colocó el

inóculo, X2 es el número de hojas con puntos negros en el área foliar, X3 es el número de hojas con

una lesión necrótica o clorótica de mayor tamaño que la gota del inóculo pero menor al 50% de la

hoja, X4 es el número de hojas cloróticas o necróticas en un porcentaje mayor al 50% y XT el

número total de hojas evaluados.

7.4. Postulados de Koch

Una vez concluido el ensayo de las rodajas de microtubérculos, se realizó el

re- aislamiento del patógeno de 3 rodajas infectadas y con sintomatología de

bacteriosis, causada por el aislado LMV30, en la variedad 'Granola' de crecimiento

a temperatura ambiente, con el fin de corroborar la identidad del aislado y el

cumplimiento de los postulados de koch.

Se tomó una pequeña parte del tejido infectado de las 3 rodajas, y cada uno

se colocó en un tubo de ensayo con 5 mL de caldo LB, y se incubó por 48 horas a

temperatura ambiente.

Una vez pasa este tiempo, se tomó una gota de cada tubo de ensayo y se

sembró en placas de agar LB, observándose la morfología de las colonias. Paso

seguido se realizaron punciones de estos 3 aislados.

Materiales y Métodos

68

68

Al azar se tomó uno de estos tres aislados, y se le extrajo el ADN como se

explica en la sección anterior; luego, se le realizaron las pruebas moleculares junto

con los aislados problema y controles positivos y negativos, para corroborar la

similitud con el aislado causante de la infección a las 144 hpi en las rodajas de

microtubérculos.

Resultados y Discusión

69

69

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Colecta de material vegetal con sintomatología de marchitez bacteriana

Se visitaron algunos de los cultivos de papa en las zonas categorizadas

como parcelas independientes, y se colectó en una parcela grande con distintos

cultivares. La zona en otros años estaba caracterizada por el predominio del

cultivo de papa, pero en esta oportunidad se observó que el cultivo predominante

era la zanahoria.

En las parcelas visitadas las variedades predominantes del cultivo de papa

eran R12 (provenientes de una mezcla de plantas de flores blancas y flores

violetas) y „Granola‟ (más homogénea). Además, en toda la parcela se observó la

presencia del daño por Phytophthora infestans, pero no la pérdida total de cultivo.

Se observaron plantas aisladas con presunta “marchitez”, pero nunca se

observó el daño en el cultivo completo. El productor del cultivo, reiteró en distintas

oportunidades que los síntomas de marchitez solo se observan en las regiones

más bajas del valle del Río Chama y no en las zonas más altas de la región.

Se colectaron hojas con sintomatología de marchitez bacteriana de las dos

ubicaciones: 5 hojas de la ubicación WP 310: 2274 msnm, 8°41‟47,3” N,

70°59´44,9” O y 6 hojas de la ubicación WP 311: 2269 msnm, 8°41‟40,6” N,

70°59´47,0” O y no se observó diferencia en la sintomatología presente en las

hojas (Fermin, comunicación personal).

Resultados y Discusión

70

70

2. Obtención de aislamientos bacterianos

Se obtuvieron un total de 30 cepas bacterianas purificadas y aisladas, de

las cuales 10 procedían de la ubicación WP 310 y 20 de la ubicación WP 311. De

cada hoja con y sin lesión se extrajeron las colonias que tenían una morfología

diferente y se purificaron hasta obtener cepas puras, de morfología colonial

diferente. Cabe destacar, que la hoja 1 (WP 310. 1), perteneciente a la ubicación

WP 310, a la hora de realizar la desinfección presentaba hongo y por ende fue

descartada para esta investigación, para evitar posible contaminación de las otras

muestras con hongos.

Las colonias se visualizaron bajo el microscopio estereoscópico, y se les

realizó una tinción Gram, para así, observar con más detalle la integridad de las

mismas. Las características morfológicas descritas de cada aislado, se encuentran

en la tabla 8.

Resultados y Discusión

71

71

Tabla 8. Características morfológicas de los aislados obtenidos de las hojas de papa con

sintomatología de bacteriosis.

Ubicación Aislado Morfología de la colonia Tinción Gram

WP 310

310.2

1 Lisa, brillante, color crema, 1mm Bacilo Gram negativo

2 Lisa, brillante, color crema a rosa, 1mm Bacilo Gram negativo

3 Rugosa, color blanco, seca 5mm Bacilo Gram positivo

310.3

4 Lisa, brillante, color crema, 2mm Bacilo Gram negativo

5 Lisa, brillante, color crema, 1mm Bacilo Gram negativo

6 Lisa, color blanco con centro amarillo, 1mm Bacilo Gram negativo

310.4

7 Lisa, color amarillo, 4mm Bacilo Gram negativo

8 Rugosa, color blanco, seca 5mm Bacilo Gram positivo

9 Lisa, color crema, 1mm Bacilo Gram negativo

310.5 10 Lisa, color crema, 2mm Bacilo Gram negativo

WP 311

311.1 11 Lisa, color blanco con centro amarillo, 1mm Bacilo Gram negativo

12 Lisa, color crema, 1mm Bacilo Gram negativo

311.2

13 Lisa, color blanco con centro amarillo, 1mm Bacilo Gram negativo

14 Rugosa, color blanco, seca 3mm Bacilo Gram positivo

15 Lisa, color crema, 1mm Bacilo Gram negativo

311.3

16 Lisa, color crema, 1mm Bacilo Gram negativo

17 Lisa, color blanco con centro amarillo, 3mm Bacilo Gram negativo

18 Lisa, color blanco, seca, 2mm Bacilo Gram negativo

311.4

19 Lisa, color crema, 1mm Bacilo Gram negativo

20 Lisa, color blanco con centro amarillo, 1mm Bacilo Gram negativo

21 Lisa, color blanco con centro amarillo, 5mm Bacilo Gram negativo

311.5

22 Lisa, color crema, 1mm Bacilo Gram negativo

23 Lisa, color blanco, seca, 2mm Bacilo Gram negativo

24 Lisa, color blanco, seca, 5mm Bacilo Gram negativo

25 Lisa, color blanco con centro amarillo, 1mm Bacilo Gram negativo

26 Rugosa, color blanco, seca 3mm Bacilo Gram positivo

311.6

27 Lisa, color amarillo, 4mm Bacilo Gram negativo

28 Lisa, color blanco con centro amarillo, 5mm Bacilo Gram negativo

29 Rugosa, color blanco, seca 3mm Bacilo Gram positivo

30 Lisa, color blanco con centro amarillo, 1mm Bacilo Gram negativo

310.1 = Hoja 1 coordenadas WP310 (eliminado por presencia de hongos)

Resultados y Discusión

72

72

310.2 = Hoja 2 coordenadas WP310

310.3 = Hoja 3 coordenadas WP310

310.4 = Hoja 4 coordenadas WP310

310.5 = Hoja 5 coordenadas WP310

311.1 = Hoja 1 coordenadas WP311

311.2 = Hoja 2 coordenadas WP311

311.3 = Hoja 3 coordenadas WP311

311.4 = Hoja 4 coordenadas WP311

311.5 = Hoja 5 coordenadas WP311

3. Prueba de patogenicidad en tubérculos comerciales

Una vez que se obtuvieron cepas puras, se realizó una prueba de

patogenicidad preliminar utilizando rodajas de papas obtenidas de tubérculos

comerciales, con la finalidad de elegir las cepas bacterianas con capacidad de

provocar pudriciones. La sintomatología de ennegrecimiento y pudrición

blanda, se comenzó a observar a las 24 hpi, pero fue después de 6 días post

inoculación, cuando se determinó y se corroboró cuáles de esos 30 aislados

eran cepas patogénicas (figura 1).

Los aislados identificados como patogénicos corresponden a las cepas

número 09, 12, 15, 16, 19 y 22 (tabla 8). El aislado N° 09, se seleccionó por

presentar pudrición blanda en la cámara húmeda a 32 °C y no a temperatura

ambiente, característica única de este aislado. La cepa N° 12 causó pudrición

blanda y ennegrecimiento en el sitio de inoculo con afección posterior del 100%

de la rodaja de papa (figura 1).

El aislado N°15, causó ennegrecimiento y pudrición blanda en el sitio de

inoculo, además de formación de un hueco de aproximadamente la mitad de la

rodaja y la afección en un 100% de las rodajas, pero sólo a temperatura

ambiente ya que a 32 °C las rodajas permanecieron intactas. De forma

análoga, el aislado N° 16 presentó una sintomatología similar al N°15, pero no

Resultados y Discusión

73

73

tan severa; 70% de afección de las rodajas a temperatura ambiente y pudrición

también a 32°C en el sitio de inoculación.

En este mismo orden de ideas, el aislado N°19 causó 100% de infección

con una sintomatología diferente a las descritas anteriormente, presentando

pudrición acuosa de coloración rojiza; además, a los 6 dpi la placa de Petri

contenía un líquido rosado- rojizo en el fondo y las rodajas se tornaron de color

rosado (figura 1).

En cuanto al aislado N° 22, se observó afección en un 100% de las

rodajas a ambas temperaturas estudiadas, con sintomatología diferente a las

antes descritas, porque se formaron burbujas y el tejido estaba completamente

húmedo con una capa blanca- cremosa y espesa sobre las mismas. Cabe

destacar que esta última, es la sintomatología más severa pues se evidenció

una disminución significativa en el grosor de las rodajas a ambas temperaturas.

En contraposición a las cepas patogénicas, las cepas N° 08 y 29 (fig. 1a

y 1h), no presentaron ningún síntoma de pudrición ni ennegrecimiento de la

rodaja de papa en el sitio de inoculación, denominando a estos aislados como

no patogénicas; además, se observa el control positivo obtenido al inocular las

rodajas de papa con la cepa LMV24 (Ralstonia solanacearum) y el control

negativo al ser inoculadas con caldo LB (figuras 1j y 1i).

Es importante resaltar que a pesar de que se realiza la desinfección de

las rodajas y se mantienen en condiciones de asepsia, son tejidos que

estuvieron expuestos al ambiente, y con ese método de desinfección no se

garantiza la eliminación completa de otros patógenos. Estos otros patógenos

pueden ser los responsables de las distintas sintomatologías observadas. Sin

Resultados y Discusión

74

74

embargo, todas las sintomatologías tienen en común que son pudriciones

blandas y húmedas, característica clave de pudrición ocasionada por bacterias

patógenas de papa.

Figura 1. Ensayo de patogenicidad en tubérculos comerciales a los 6 dpi. A la

izquierda en cada fotografía, la cámara húmeda a temperatura ambiente y a la derecha a 32

°C. a) Aislado bacteriano N° 8. b) Aislado bacteriano N°09. c) Aislado bacteriano N° 12. d)

Aislado bacteriano N°15. e) Aislado bacteriano N°16. f) Aislado bacteriano N°19. g) Aislado

bacteriano N° 22. h) Aislado bacteriano N° 29. i) Control negativo caldo LB. j) Control positivo

LMV24 (Ralstonia solanacearum).

Resultados y Discusión

75

75

Los aislados identificados como patogénicos corresponden a las cepas

número 09, 12, 15, 16, 19 y 22, a las cuales se les asignó código LMV, por ser

aisladas en el Laboratorio de Mejoramiento Vegetal (tabla 9).

Estos aislados patogénicos, causantes de la pudrición blanda en rodajas

de tubérculos comerciales, son los que fueron caracterizados mediante las

pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares, además de probar la

resistencia o susceptibilidad ante dos variedades de papa, siguiendo el

esquema planteado en la metodología

Tabla 9. Ubicación y código de los aislados patogénicos.

Ubicación Aislado Código

WP 310.4 9 LMV27

WP 311.1 12 LMV28

WP 311.2 15 LMV29

WP 311.3 16 LMV30

WP 311.4 19 LMV31

WP 311.5 22 LMV32

WP 310.4 = Hoja 4 coordenadas WP310

WP 311.1 = Hoja 1 coordenadas WP311

WP 311.2 = Hoja 2 coordenadas WP311

WP 311.3 = Hoja 3 coordenadas WP311

WP 311.4 = Hoja 4 coordenadas WP311

WP 311.5 = Hoja 5 coordenadas WP311

4. Identificación morfológica de los aislados bacterianos patogénicos

El desarrollo de colonias sobre las superficies de un agar permite la

identificación de las bacterias, ya que, las especies forman a menudo colonias

con una forma y aspecto característicos. Las cepas purificadas y seleccionadas

como patogénicas se observaron en placas de agar nutritivo LB bajo el

Resultados y Discusión

76

76

microscopio estereoscópico describiendo su color, tamaño, forma, borde,

superficie, levantamiento, consistencia y transparencia de las colonias según

Rivera (2014) (figura 2, tabla 10). A cada cepa se les realizó la tinción Gram,

mediante la cual se pudieron observar bacilos Gram negativos como se

muestra en la figura 3.

Tabla 10. Morfología de las colonias de las cepas bacterianas patogénicas en agar LB.

Aislado Color Tamaño Forma Borde Superficie Levantamiento Consistencia Transparencia

LMV27 Crema-

blanco

Pequeña

1 mm Circular Entero Lisa Convexa Mucoide Traslucida

LMV28 Crema Pequeña

2 mm Circular Entero Lisa Convexa Mucoide Traslucida

LMV29 Crema-

blanco

Pequeña

1mm Circular Entero Lisa Convexa Mucoide Traslucida

LMV30 Crema Pequeña

1-2 mm Circular Entero Lisa Convexa Mucoide Traslucida

LMV31 Crema Pequeña

1 - 2 mm Circular Entero Lisa Convexa Mucoide Traslucida

LMV32 Crema Pequeña

2 mm Circular Entero Lisa Convexa Mucoide Traslucida

Resultados y Discusión

77

77

Figura 2. Colonias de los aislados bacterianos patogénicos en placas de agar LB de 24

horas de crecimiento. a) LMV27. b) LMV28. c) LMV29. d) LMV30. e) LMV31. f) LMV32.

Figura 3. Tinción Gram de los aislados bacterianos patogénicos. a) LMV27. b) LMV28.

c) LMV29. d) LMV30. e) LMV31. f) LMV32 (100X).

Resultados y Discusión

78

78

Estos resultados, demuestran que todos los aislados patogénicos,

causantes de la pudrición en las rodajas de tubérculos comerciales, son Gram

negativo, lo cual nos permite ya restringir y descartar los géneros donde las

bacterias sean Gram positivas. Según Shaad y colaboradores (2001), en su

clave para diferenciar los géneros de fitobacterias, los Gram negativos son:

Erwinia, Panthoea, Acidovorax, Pseudomonas, Ralstonia, Burkholderia,

Xanthomonas y Xylophilus, de los cuales reportados en la bibliografía como

causantes de la pudrición blanda en papa son: Erwinia, Ralstonia y

Burkholderia. Restringiendo así, nuestra investigación a estos 3 géneros.

5. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias causantes de

la pudrición en tubérculos de papa

La identificación bioquímica de las especies bacterianas corresponde a

un conjunto de pruebas y no a una específica ya que puede cambiar entre

individuos de una misma especie dependiendo del metabolismo de la bacteria

(Fonseca 2014).

Usualmente, se requieren muchos caracteres para la identificación de

géneros en bacterias patógenas de plantas. Ellas convencionalmente se

dividen en, aquellas que son de fácil aislamiento y crecimiento en medios

bacteriológicos estándares y aquellas que no.

En la tabla 11, se muestran las cepas bacterianas y los resultados de las

pruebas bioquímicas para identificación de géneros realizadas según lo

propuesto por Schaad y colaboradores en el 2001.

Resultados y Discusión

79

79

Tabla 11. Pruebas bioquímicas para la identificación de géneros en bacterias patógenas de

papa.

Pruebas

Bioquímicas Aislados Bacterianos

LMV27 LMV28 LMV29 LMV30 LMV31 LMV32

Coloración Gram - - - - - -

Crecimiento anaeróbico + + + + + +

Crecimiento aeróbico + + + + + +

Oxidasa - - - - - -

Colonias amarillas o

naranjas en Agar YDC - - - - - -

Colonias mucoides en

Agar YDC - - - - - -

Según las pruebas realizadas para la identificación de género, las 6

cepas aisladas de hojas de papa, pertenecen al género Erwinia, y su diferencia

principal está relacionada con la coloración de las colonias en el Agar YDC

como se observa en la figura 4. Cabe destacar que aunque las colonias de

todos los aislados, son de apariencia húmeda, esto no implica que sean

mucoides.

Resultados y Discusión

80

80

Figura 4. Aislados bacterianos patogénicos sembrados por agotamiento en Agar YDC.

a) LMV27. b) LMV28. c) LMV29. d) LMV30. e) LMV31. f) LMV32.

Tomando en cuenta que para las pruebas bioquímicas se utilizaron

como controles positivos cepas de Ralstonia solanacearum (LMV24) y

Burkholderia gladioli (LMV01) identificadas por Fonseca (2014) y reportadas

como patógenos de papa en Venezuela, los resultados bioquímicos obtenidos

en esta investigación permiten descartar en primera instancia que los aislados

estudiados pertenezcan a los géneros Ralstonia o Burkholderia. Estos

controles positivos no tienen crecimiento anaeróbico facultativo (tabla 12), a

diferencia de los aislados bacterianos obtenidos como se evidencia en la figura

5.

Resultados y Discusión

81

81

Tabla 12. Pruebas bioquímicas realizadas a los controles positivos Ralstonia solanacearum y

Burkholderia gladioli.

Pruebas Bioquímicas R. solanacearum B. gladioli

Coloración Gram - -

Tipo Bacilos Bacilos

Catalasa + +

Oxidasa + +

Motilidad en fresco + +

Colonias en YDC Húmeda Crema Húmeda Amarilla

MacConkey Lac - -

Simmons Citrato + +

Fermentación de Lactosa en Kliger - -

Fermentación de Glucosa en Kliger - +

Producción de gas en Kliger - -

Gelatina + +

Agar Almidón - -

Indol - -

KOH 3% + +

Esculina + -

Reducción de nitrato + +

OF Glucosa Oxidación Oxidación

OF Lactosa - -

Con base en las pruebas bioquímicas hasta las bacterias más

relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes. La prueba de OF,

permite determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de

carbono o su falta de utilización. La utilización del hidrato de carbono puede ser

mediante dos procesos metabólicos, fermentativo u oxidativo. Algunas

bacterias pueden metabolizar el hidrato de carbono solo en condiciones

aerobias, y otras en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas. En esta

prueba, se encuentra la gran diferencia entre los 3 géneros de fitobacterias

causantes de podredumbre en papa, ya que las Erwinias presentan

Resultados y Discusión

82

82

metabolismo anaeróbicos facultativos, mientras que los géneros Ralstonia y

Burkholderia, son aeróbicas estrictas.

Schaad y colaboradores en el 2001, definen a las bacterias

pertenecientes al género Erwinia como, Bacilos Gram negativos, anaerobias

facultativas, no presentan mucosidad ni coloración amarilla o naranja en agar

YDC y son oxidasa negativa. Visto esto, los aislados bacterianos causantes de

pudrición en tubérculos comerciales pertenecen al género Erwinia.

En la tabla 13, se muestran las cepas bacterianas patógenas y los

resultados de las pruebas bioquímicas realizadas para la identificación de

especies perteneciente al género Erwinia.

Resultados y Discusión

83

83

Tabla 13. Resultado de las pruebas bioquímicas realizadas a los aislados bacterianos

patogénicos.

Pruebas

Bioquímicas

Aislados Bacterianos

LMV27 LMV28 LMV29 LMV30 LMV31 LMV32

Coloración Gram - - - - - -

Tipo Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos

Catalasa + + + + + +

Oxidasa - - - - - -

Motilidad en

fresco + + + + + +

Colonias en YDC

Húmeda

Blanca a

crema

Húmeda

Crema

Húmeda

Blanca a

crema

Húmeda

Crema

Húmeda

Blanca

Húmeda

Crema

MacConkey Lac - - - - - -

Simmons Citrato + + + + + +

Fermentación de

Lactosa en Kliger - - - - - -

Fermentación de

Glucosa en

Kliger

+ + + + + +

Producción de

gas en Kliger + - - - - -

Gelatina + + + + + +

Agar Almidón - - - - - -

Indol - - - - - -

KOH 3% + + + + + +

Esculina + + + + + +

Reducción de

nitrato + + + + + +

OF Glucosa Fermentación Fermentación Fermentación Fermentación Fermentación Fermentación

OF Lactosa - - - - - -

Uno de los primeros resultados de relevancia encontrados en estos

aislados corresponde a las características microbiológicas en medios sólidos

nutritivos. Pese a que casi todos los resultados concuerdan como se observa

Resultados y Discusión

84

84

en la tabla 10, el crecimiento en agar YDC a 28 °C fue determinante para estos

aislados como se ve en la figura 4; los aislados bacterianos LMV27 y LMV29

presentaron coloración y humedad similares en el Agar YDC, pero el aislado

LMV27 es el único en presentar producción de gas a partir de glucosa en el

medio Kliger (tabla 13).

La prueba de oxidasa es una prueba usada en microbiología para

determinar si una bacteria produce alguna de las citocromo C oxidasas por

tanto no es determinativa de especie (Fonseca 2014). Esta enzima es una

proteína transmembrana que se encuentra incluida en bicapas lipídicas de

bacterias y es la última enzima de la cadena de transporte de electrones,

recibiendo un electrón de cada una de las cuatro moléculas de citocromo c que

los transfiere a una molécula de oxígeno, reduciéndola a dos moléculas de

agua (Mathews y col. 2003).

Los individuos anaerobios carecen de la actividad oxidasa, no pueden

vivir en presencia de oxígeno atmosférico y no poseen sistema de citocromo

oxidasa. Este sistema varía entre las especies bacterianas; algunos

microorganismos poseen sólo una oxidasa mientras que otros pueden producir

dos o tres y es bien conocido que la producción de estas enzimas difiere en los

diversos géneros (Fonseca 2014). Como se observa en la tabla 10, los aislados

bacterianos de hojas de papa, son anaerobios facultativos por su crecimiento

en el tubo con medio OF (Hugh y Leifson, 1953) suplementado con Glucosa,

cerrado con parafina (figura 5), y son negativos tanto a la prueba de la oxidasa

como a la prueba del indol (figura 6).

Resultados y Discusión

85

85

Figura 5. Prueba de óxido – fermentación, 48 hpi medio Hugh & Leifson suplementado

con glucosa de las 6 cepas patogénicas y los aislados control. Se muestra, de izquierda a

derecha para cada aislado, el tubo control sellado, el tubo control abierto, el tubo inoculado

sellado y el tubo inoculado abierto. a) LMV27. b) LMV28. c) LMV29. d) LMV30. e) LMV31. f)

LMV32. g) Ralstonia solanacearum (LMV24). h) Burkholderia gladioli (LMV01).

Los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas y el crecimiento a

altas temperaturas en las rodajas de papa comerciales, concuerdan con los

reportados por García (2000). Así, las cepas hidrolizan la gelatina, son

positivas a la prueba de Gram KOH al 3%, pudren la papa con reacción positiva

total para la especie E. carotovora subsp. carotovora y E. carotovora subsp.

atroseptica y reacción positiva pero no daño total del tubérculo para E.

chrysanthemi. Cabe destacar que la misma autora reporta que para E.

carotovora subsp. atroseptica y E. chrysanthemi, se encuentra una reacción

positiva a la producción de gas a partir de Glucosa, lo cual concuerda con lo

obtenido para el aislado patogénico LMV27 en esta investigación.

Resultados y Discusión

86

86

Figura 6. Prueba de Indol. a) Escherichia coli (CVCM76). b) Ralstonia solanacearum

(LMV24). c) Burkholderia gladioli (LMV01). d) LMV30. e) LMV29. f) LMV27. g) LMV32.

h) LMV31. i) LMV28.

Como se menciono anteriormente, las diferencias que se encuentran en

las pruebas bioquímicas, se originan porque las bacterias presentan distintos

tipos de metabolismos, esto da respuesta a la diferencia encontrada en la

prueba triple agar hierro Kliger, donde el aislado LMV27, es el único en

presentan producción de gas.

Tomando como referencia las pruebas bioquímicas empleadas por

Barrios (2015), para la identificación de las especies pertenecientes al género

Erwinia, se pudo concluir que bioquímicamente los 6 aislados bacterianos

causantes de marchitez en hojas de papas, pertenecen a este género.

Basándonos en el amplio rango y divisiones que se han realizado a éste

género, del género Pectobacterium, según la bibliografía consultada, existen 3

especies que destacan y que son las causantes de pudrición en tubérculos de

Resultados y Discusión

87

87

papa, y se presume que estamos en presencia de esas especies, por ende se

plantea el análisis molecular con el fin de corroborar su identificación.

Se destaca a Pectobacterium carotovorum subsp. atroseptica,

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum y Dickeya chrysanthemi (Syn.

Erwinia chrysanthemi), dentro de las principales causantes de la pudrición

blanda en tubérculos de papa, así como en la pudrición o marchitez de los

tallos en plantas de papa en crecimiento, enfermedad conocida como pierna

negra y la marchitez bacteriana en hojas (García, 2000). Estas bacterias

causan problemas en la producción de papa en todo el mundo.

Noval (1991) señala que mientras algunos miembros del género Erwinia

se limitan a vivir sobre las superficies vegetales o a ejercer un papel secundario

en diversas infecciones, otros, verdaderos patógenos, desencadenan

enfermedades de gran interés para la agricultura, como es el caso del tizón del

fuego de las rosáceas, cuyo agente productor (Erwinia amylovora) merece

destacarse por las medidas de lucha adoptadas en su contra, reflejo de su

importancia, y también por la curiosidad histórica de constituir el punto de

partida de la bacteriología vegetal. En este género figuran también organismos

de menor renombre histórico, pero más devastadores e importantes por el daño

que ocasionan a los cultivos y a los productos hortícolas, tales como las

Erwinias que producen pudriciones blandas, donde se destacan principalmente

E. carotovora y E. chrysanthemi (ahora Pectobacterium carotovora subsp.

carotovora, Pectobacterium carotovorum subsp. atroseptica y D.

chrysanthemi), cuya importancia se incrementa por el amplio rango de

Resultados y Discusión

88

88

hospedantes y su distribución mundial, así como sus mecanismos de

sobrevivencia y dispersión (Perombelon y Kelman, 1980).

En Venezuela (Trujillo, 1996) este género ha venido adquiriendo

importancia en los últimos años, sobre todo el grupo causante de pudriciones

blandas. Integrantes del género Erwinia han sido señalados en cultivos y

plantas ornamentales, entre ellos, la papa (Solanum tuberosum L.; Faría y col.,

1993).

Como se conoce sobre la cantidad de cultivos atacados por integrantes

del género antes denominado como Erwinia, cobra importancia establecer en el

país nuevos métodos de identificación o diagnóstico, ya que el método

convencional que contempla el aislamiento del patógeno, y su caracterización

fisiológica y bioquímica, consume mucho tiempo y reactivos, siendo estos

últimos cada vez más difícil de conseguir y con costos crecientes en el tiempo.

En resumen, las reacciones bioquímicas aplicadas a los 6 aislados no

fueron contundentes; sin embargo, todas ellas apuntan a que pudieran

pertenecer a Pectobacterium carotovorum, por lo cual se plantea hacer pruebas

moleculares para su identificación.

6. Identificación molecular de los aislados patogénicos

Una vez realizadas las pruebas morfológicas y bioquímicas, se procedió

a la confirmación de la identidad de los aislados mediante PCR especie-

específica empleando iniciadores previamente reportados para Ralstonia

solanacearum, Burkholderia gladioli y Pectobacterium carotovorum.

Resultados y Discusión

89

89

6.1. Extracción de ADN bacteriano.

El método empleado para la extracción del ADN bacteriano descrito por

Gomes y colaboradores (2000), resultó ser eficiente y efectivo, tanto por la

integridad del ADN aislado como por su concentración (Figura 7). Sin

embargo, se observó contaminación con ARN, evidenciado por la presencia de

bandas inespecíficas de menor peso molecular y el degradado que se observa

en todos los carriles. Esto coincide con lo observado por Barrios (2015), donde

la autora probó la eficiencia de tres métodos de extracción de ADN para

escoger entre ellos el más apropiado y luego realizar el diagnóstico molecular,

obteniendo con el método de Gomes y colaboradores (2000) suficiente

cantidad de ADN cuyos valores de pureza son cercanos a 1.8.

Al momento de realizar la extracción del ADN ya se había re-aislado el

LMV30 a partir de microtubérculos de la variedad Granola a temperatura

ambiente, para comprobar de manera simultanea los postulados de Koch, por

lo que se aisló y analizó el extracto de ADN de este re-aislado, junto con todas

las otras muestras problema.

6.2. Calificación y cuantificación del ADN

Cuando se trabaja con ADN es importante realizar una cuantificación de

la cantidad con la que se dispone. La cuantificación del ADN se puede llevar a

cabo por estimación de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el

que el ADN es tratado con algún colorante como Bromuro de Etidio, o bien

mediante técnicas de espectrofotometría de luz ultravioleta.

Resultados y Discusión

90

90

6.2.1. Espectrofotometría

La concentración de ADN en el extracto se determinó usando la relación

260/280 D.O, dicha relación indica la pureza de la muestra en cuanto al

contenido de material genético libre de proteínas y otros compuestos (tabla

13).

Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que

los ácidos nucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción

característico de ácidos nucelicos, presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien

el coeficiente de extinción de un ácido nucleico en particular depende de la

secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la

concentración a partir del valor de A260 nm. Así, una unidad de absorbancia a

260 nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 µg/mL de

ADN doble hebra (Sambrook y Rusell, 2001).

Tabla 14. Valores de D.O y concentración de ADN en los extractos de los aislados bacterianos

patogénicos.

Aislado D.O A260 nm D.O A280 nm Relación

A260/A280 [ADN] ng/µL

LMV27 0,065 0,039 1,667 2,685

LMV28 0,046 0,028 1,643 1,885

LMV29 0,062 0,031 2,000 2,784

LMV30 0,360 0,184 1,957 1,602

LMV31 0,054 0,028 1,929 2,389

LMV32 0,132 0,069 1,913 5,819

LMV30 Koch 0,039 0,025 1,560 1,553

LMV11 0,059 0,033 1,788 2,523

CVCM76 0,060 0,034 1,765 2,550

LMV24 0,026 0,013 2,000 1,167

LMV01 0,186 0,114 1,632 7,595

Resultados y Discusión

91

91

En las preparaciones de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas

de naturaleza proteica. Se sabe, que los aminoácidos aromáticos, absorben

luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración

de ácidos nucleicos (Sambrook y Rusell, 2001). Dado que el máximo de

absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es posible estimar el

grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La

presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260 /A280 sea

menor que el esperado para ácidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra

en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1,8 (Zarate y col., 2009).

Debido a lo antes expuesto y a las bandas observadas en el gel de

electroforesis de la figura 7, la relación de A260/A280 en alguno de los casos

es menor a 1,8; (tabla 14), sin embargo, estos extractos resultaron de calidad

adecuada para los ensayos de PCR, como se muestra en la figura 8.

6.2.2. Electroforesis en Gel de agarosa

Se observó una banda de alto peso molecular, de buena calidad e

integridad del ADN, en el gel de Agarosa al 0,8% (figura 7). A pesar de que se

observa contaminación con ARN, al realizar las PCR siguientes, no se observó

inhibición o ineficiencia en las mismas, por lo tanto, ese ADN fue el que se

empleó para los ensayos posteriores.

Resultados y Discusión

92

92

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % de los productos de la extracción

del ADN bacteriano. Carriles 1, 3, 10 y 15 vacíos. Carril 2: marcador de peso molecular

Lambda HindIII/EcoRI (PROMEGA). Carril 4: LMV27. Carril 5: LMV28. Carril 6: LMV29. Carril

7: LMV30. Carril 8: LMV31. Carril 9: LMV32. Carril 11: Postulado de Koch LMV30. Carril 12:

Pectobacterium spp. (LMV11). Carril 13: R. solanacearum (LMV24). Carril 14: E. coli

(CVCM76).

6.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

En algunos casos es relativamente fácil hacer el diagnóstico de la

enfermedad debido a que los síntomas de la misma son tan característicos y

exclusivos, que no hay posibilidad de error, pero en el caso de la marchitez

bacteriana en hojas no, porque la sintomatología es la misma, y la pueden

causar 3 géneros de fitobacterias diferentes.

Actualmente, existen técnicas que permiten identificar prácticamente a

todos los organismos patógenos de plantas, una de estas técnicas es la PCR.

Para llevar a cabo esta técnica con éxito, debemos obtener un material

Resultados y Discusión

93

93

genético libre de contaminantes proteicos y mantenerlo estable para evitar que

se degrade.

6.3.1. PCR empleando iniciadores universales bacterianos

En la actualidad, las asignaciones taxonómicas en microbiológia se

realizan empleando las secuencias de los genes de la subunidad 16S del ARN

ribosomal. La comparación de las secuencias de estas regiones o de los genes

que las codifican permiten establecer las relaciones filogenéticas existentes

entre los organismos procariotas. Este hecho ha tenido una enorme

repercusión en taxonomía bacteriana, dando lugar al sistema de clasificación

vigente y permitiendo la identificación rápida, precisa de las bacterias, a través

del empleo de iniciadores universales dirigidos a sitios específicos de las

secuencias conservadas, y que amplifican una gran cantidad de grupos

taxonómicos (Soergel y col., 2012).

En la figura 8, encontramos la amplificación de la banda de 996 pb

correspondiente al ADN procariota, empleando los iniciadores universales U1 y

U2, además de una banda inespecífica de 150 pb (en los carriles 3 y 5),que

también reportan los investigadores, que en algunos de los casos se puede

evidenciar (Lu y col., 2000).

Resultados y Discusión

94

94

Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa al 1,6% de los productos de PCR para la

amplificación de la banda de 996 pb correspondiente a ADN procariota, empleando iniciadores

específicos U1 y U2. Carril 1: Marcador de peso molecular 1 kb de la casa comercial

PROMEGA. Carril 2: LMV30. Carril 3: LMV30 postulado de Koch. Carril 4: Agua control de

reactivos – control negativo. Carril 5: LMV01. Carril 6: LMV11

Al observarse, bandas inespecíficas de alto peso molecular en la figura

8, la temperatura de anillamiento del ciclado, se modificó de 48 ºC a 50 ºC, y

en la figura 9, se puede observar como esas bandas no se evidencian tan

claramente.

Resultados y Discusión

95

95

Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa al 1,6% de los productos de PCR para la

amplificación de la banda de 996 pb correspondiente al ADN procariota, empleando los

iniciadores U1 y U2. Carril 1: Marcador de peso molecular 1 kb de la casa comercial

PROMEGA. Carril 2: LMV27. Carril 3: LMV28. Carril 4: LMV29. Carril 5: LMV30. Carril 6:

LMV31. Carril 7: LMV32. Carril 8: postulado de Koch. Carril 9: LMV11. Carril 10: LMV24. Carril

11: LMV01. Carril 12: CVCM76. Carril 13: control de reactivos, control negativo.

En la figura 9 se detalla el registro fotográfico de la electroforesis de las

amplificaciones por PCR, observándose la banda de 996 pb de la misma

intensidad en todas las muestras, la cual corresponde al gen de la subunidad

ribosomal menor 16S corroborando así que se trata de organismos

procariotas. Cabe destacar que con esta PCR se corroboró la calidad

adecuada del ADN, que se empleó para los sucesivos ensayos, y como se

hace notar, no existen inhibidores de la reacción en ninguno de los extractos.

6.3.2. Identificación mediante PCR especie – específica

Durante el desarrollo de toda esta investigación, se ha resaltado la

necesidad del establecimiento de una metodología, combinando pruebas

microbiológicas, bioquímicas y moleculares para la caracterización de estos

Resultados y Discusión

96

96

aislados bacterianos patogénicos del cultivo de papa, con el fin de ser

implementada como estudio o sistema de referencia para la identificación de

estas especies, ante la escasez de investigaciones de este tipo en el país.

Fonseca (2014) estableció un procedimiento para la identificación

diferencial de R. solanacearum y B. gladioli bacterias patógenas que causan

síntomas similares de pudrición blanda en tubérculos de papa. El diagnóstico

diferencial se basó en pruebas microbiológicas, bioquímicas y moleculares,

estableciendo el uso de iniciadores específicos para diagnosticar estas

bacterias usando PCR.

Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR para la

detección de R. solanacearum, empleando iniciadores específicos OLI1 y Y2. Carril 1:

Marcador de peso molecular 50 pb de la casa comercial PROMEGA. Carril 2: LMV24. Carril 3:

LMV01. Carril 4: CVCM76. Carril 5: libre. Carril 6: control de reactivos, control negativo.

Resultados y Discusión

97

97

Con el propósito de estandarizar el método para la detección R.

solanacearum (LMV24) como control positivo, se realizó una PCR empleando

los iniciadores OLI1 y Y2, esperando una banda de 292 pb, como se observa

en el carril 2 de la figura 10.

Para la realización de la amplificación se emplearon las condiciones

descritas por Seal y colaboradores (1992), modificadas por Fonseca (2014),

pero cambiando los tiempos de extensión en el ciclo de 1 minuto a 30

segundos y de extensión final de 10 minutos a 5 minutos.

Una vez estandarizado el método para la detección de R. solanacearum

se realizó la amplificación del ADN de los aislados problemas y el del

postulado de Koch, obteniéndose el fragmento esperado de 292 pb, solo en el

aislado control, descartando así que los aislados patogénicos de hojas de papa

del Rio Chama, correspondan a cepas de R. solanacearum (figura 11).

Resultados y Discusión

98

98

Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR para la

detección de Ralstonia solanacearum, empleando iniciadores específicos OLI1 y Y2. Carril 1:

Marcador de peso molecular 50 pb de la casa comercial PROMEGA. Carril 2: LMV27. Carril 3:

LMV28. Carril 4: LMV29. Carril 5: LMV30. Carril 6: LMV31. Carril 7: LMV32. Carril 8: postulado

de Koch. Carril 9: LMV11. Carril 10: LMV24. Carril 11: LMV01. Carril 12: CVCM76. Carril 13:

control de reactivos, control negativo.

Ahora bien, con el propósito de detectar la presencia de ADN

correspondiente a B. gladioli como control positivo (LMV01), se realizó la

amplificación empleando los iniciadores Gla-f y Gla-r, esperando una banda de

300 pb, como se observa en el carril 4 de la figura 12. Para ello se emplearon

las condiciones descritas por Furuya y colaboradores (2002), modificadas por

Fonseca (2014).

Resultados y Discusión

99

99

Figura 12. . Electroforesis en gel de agarosa al 1,8% de los productos de PCR para la

estandarización del método de detección de Burkholderia gladioli, empleando iniciadores

específicos Gla-f y Gla-r. Carril 1 Marcador de peso molecular 50 pb de la casa comercial

PROMEGA. Carril 2 LMV30. Carril 3 LMV24. Carril 4 LMV01. Carril 5 CVCM76. Carril 6 control

de reactivos, control negativo.

Una vez estandarizado la metodología, se realizó la PCR empleando los

aislados problemas y el ADN correspondiente al postulado de Koch,

obteniéndose la amplificación del fragmento esperado de 300 pb, sólo en el

aislado control, descartando así que los aislados patogénicos de hojas de papa

del Rio Chama, correspondan a cepas de B. gladioli (figura 13).

Resultados y Discusión

100

100

Figura 13. Electroforesis en gel de agarosa al 1,8% de los productos de PCR para la

detección de B. gladioli, empleando iniciadores específicos Gla-f y Gla-r. Carril 1 Marcador de

peso molecular 50 pb de la casa comercial PROMEGA. Carril 2 LMV27. Carril 3 LMV28. Carril

4 LMV29. Carril 5 LMV30. Carril 6 LMV31. Carril 7 LMV32. Carril 8 postulado de Koch. Carril 9

LMV11. Carril 10 LMV24. Carril 11 LMV01. Carril 12 CVCM76. Carril 13 control de reactivos,

control negativo.

Dado estos resultados y lo obtenido en las pruebas bioquímicas, se

enfocó la atención ahora con más énfasis en el diagnóstico de P. carotovorum

que es otra bacteria patógena de papa que causa síntomas de pudrición blanda

en tubérculos y marchitez bacteriana en hojas.

Para detectar la presencia de ADN de P. carotovorum (LMV11), se

realizó la amplificación empleando los iniciadores Y1pel y Y2pel, esperando

una banda de 434 pb, como se observa en el carril 2 de la figura 14,

correspondiente al aislado LMV30. Se demuestra además que el aislado

LMV11, empleado en un principio como control positivo para la identificación

Resultados y Discusión

101

101

de P. carotovorum, no pertenece a esta especie bacteriana, pero si al género

Pectobacterium, de acuerdo con la identificación basada en los resultados de

las pruebas bioquímicas realizadas por Barrios (2015).

Las condiciones empleadas para la amplificación del gen pel fueron las

descritas por Golkhandan y colaboradores (2013), modificando la temperatura

de anillamiento en el ciclado de 52 a 60 ºC, logrando así una estandarización

del método sin obtención de bandas inespecíficas (figura 14).

Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa al 1,2% de los productos de PCR para la

estandarización del método de detección de P. carotovorum, empleando iniciadores

específicos Y1pel y Y2pel. Carril 1: Marcador de peso molecular 1 kb de la casa comercial

PROMEGA. Carril 2: LMV30. Carril 3: LMV11. Carril 4: LMV01. Carril 5: libre. Carril 6: control

de reactivos, control negativo.

Entonces, utilizando esta metodología se logró amplificar sólo en los 6

aislados patogénicos y en el postulado de Koch (LMV30) la banda de 434 pb

esperada. Nuevamente los resultados demuestran que el aislado LMV11

definitivamente no pertenece a la especie Pectobacterium carotovorum, ya que

Resultados y Discusión

102

102

no se observa ninguna banda en el carril correspondiente a esta muestra.

(figura 15, carriles del 2 al 9).

Figura 15. Electroforesis en gel de agarosa al 1,2% de los productos de PCR para la

detección de P. carotovorum, empleando iniciadores específicos Y1pel y Y2pel. Carril 1:

Marcador de peso molecular 1 kb de la casa comercial PROMEGA. Carril 2: LMV27. Carril 3:

LMV28. Carril 4: LMV29. Carril 5: LMV30. Carril 6: LMV31. Carril 7: LMV32. Carril 8: postulado

de Koch. Carril 9: LMV11. Carril 10: LMV24. Carril 11: LMV01. Carril 12: CVCM76. Carril 13:

control de reactivos, control negativo.

En este sentido, Darrase y colaboradores (1994) usando el gen que

codifica para una pectatoliasa (gen pel) desarrollaron una prueba de PCR con

un par de iniciadores que amplifican un fragmento de 434 pb en cepas de

Erwinia carotovora. De las 89 cepas de E. carotovora analizadas, solamente

las cepas de E. carotovora subsp. betavasculorum y E. chrysanthemi no eran

detectadas por esta técnica. Basándonos en este resultado, utilizamos los

iniciadores para amplificar esta banda en los aislados problema.

Resultados y Discusión

103

103

Como se mencionó anteriormente, la única especie de Pectobacterium

que no amplifica esta banda es E. carotovora subsp. betavasculorum o

E.chysanthemi, posiblemente, LMV11 sea alguna de estas dos especies,

además, este protocolo se realizó en diferentes oportunidades modificando una

variable a la vez, como ajuste en la temperatura de anillamiento, cambio en la

concentración de los iniciadores, así como en la concentración del ADN y no se

obtuvo de ninguna manera la banda esperada para el aislado LMV11 (Barrios,

2015).

6.3.3. Amplificación mediante regiones repetitivas

Para el establecimiento de un protocolo de identificación molecular

capaz de discriminar entre las sub especies de P. carotovorum, se probaron

los iniciadores G1 y L1, con esto se obtiene un patrón de bandas para cada

subespecie. Como se observa en la figura 16, se obtuvo el mismo patrón de

bandas para los aislados bacterianos patogénicos y para el postulado de Koch

y un patrón de bandas diferente para el aislado LMV11 (carril 9). Además estos

iniciadores no amplifican para los controles LMV24 y LMV01, carriles 10 y 11

respectivamente. Esto último, es un aporte para los laboratorios de diagnóstico

en enfermedades bacterianas en papa, ya que se puede descartar la presencia

de R. solanacearum y/o B. gladioli, por la ausencia de bandas empleando

estos iniciadores. Se emplearon las condiciones de amplificación siguiendo la

metodología descrita por Golkhandan y colaboradores (2013).

Resultados y Discusión

104

104

Figura 16. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR de la

región ITS 16S – 23S RNAr, empleando los iniciadores G1 y L1. Carril 1: Marcador de peso

molecular 1 kb de la casa comercial PROMEGA. Carril 2: LMV27. Carril 3: LMV28. Carril 4:

LMV29. Carril 5: LMV30. Carril 6: LMV31. Carril 7: LMV32. Carril 8: postulado de Koch. Carril

9: LMV11. Carril 10: LMV24. Carril 11: LMV01. Carril 12: CVCM76. Carril 13: control de

reactivos, control negativo.

También, se observa en la figura 16, la amplificación de dos bandas

especificas en el control CVCM76 (E. coli), las cuales coinciden con las

reportadas por Jensen y colaboradores (1993) de 480 y 540 pb; además los

investigadores reportan 3 bandas secundarias más débiles, las cuales también

se observan en la electroforesis de 590, 1100 y 1440 pb. Esto permite

corroborar la investigación, al observar que los patrones de bandas obtenidos

para los 6 aislados patogénicos y el postulado de Koch son ciertas, ya que no

se cuenta con un control positivo Pectobacterium carotovorum, como se creía

al principio de este trabajo.

Resultados y Discusión

105

105

Las bandas para los 6 aislados problema y el postulado de Koch, tienen

un tamaño molecular de 540, 575 y 740, solo se tomaron estas 3 bandas, ya

que Toth y colaboradores (2001), no reportan como fragmentos principales las

bandas de mayor tamaño molecular como la de 800 pb en los patrones de

bandas similares (figura 17, carriles 1 y 3), se podría descartar esas bandas y

decir que son fragmentos secundarios de la amplificación, como lo hace el

autor. Pero solo reportan una banda de 1170 pb para E. chrysanthemi, dicho

patrón de bandas es similar al obtenido en el aislado LMV11, donde se

obtuvieron los fragmentos de 480, 590, 740 y 1110 pb (figura 17, carril 17).

Aunado a ello, dado que las bacterias presentan una amplia diversidad

fenotípica y genotípica, para ello es necesario realizar la identificación no solo

bioquímica y fisiológica (que por los resultados de esta investigación son

idénticos los 6 aislados problema con el aislado LMV11), sino también

molecular basada principalmente en la secuencia del gen 16S ARNr.

El uso de los iniciadores G1 y L1 diseñados en 1993 por Jensen y

colaboradores, los cuales amplifican la región intergénica espaciadora entre el

16S y 23S, permiten la amplificación de un patrón de bandas distinto para cada

Erwinia. Estos iniciadores fueron además utilizados por Toth y colaboradores

en 2001, para amplificar esta región en distintas cepas de Erwinia, logrando

clasificarlas en tres grandes grupos. Los resultados de esta amplificación se

muestran en la Figura 17, y el tamaño de los fragmentos encontrados se

observan en la tabla 15 (tomado de Toth y col., 2001)

Resultados y Discusión

106

106

Figura 17. Patrones de amplificación ITS- PCR de especies pertenecientes a Erwinia,

Pantoea,Enterobacter, y otros géneros de enterobacterias . carril 1, E. carotovora subsp. atroseptica

SCRI 1039; 2, E. Carotovora subsp. betavasculorum SCRI 479; 3, ECCa, E. carotovora supsp. carotovora

SCRI 244; 4, ECCb, E. carotovora subsp. carotovora SCRI 167; 5, ECOa, E. carotovora subsp. odorifera

SCRI 914; 6, ECOb, E. Carotovora subsp. odorifera SCRI 915; 7, E. carotovora subsp. Wasabiae SCRI

481; 8, E. cacticida SCRI 484; 9, Enterobacter cancerogenus SCRI 489; 10 and 11, E. cypripedii SCRI

478 and SCRI 440; 12 and 13, E. rhapontici SCRI 421 and SCRI 472; 14, ECHa, E. chrysanthemi SCRI

418; 15, ECHb, E. chrysanthemi SCRI 4071; 16, ECHc, E. chrysanthemi SCRI 4004; 17, ECHd, E.

chrysanthemi SCRI 4037; 18, ECHe, E. chrysanthemi SCRI 4044; 19, ECHf, E. chrysanthemi SCRI 409;

20 and 21, Pantoea ananatis SCRI 485 and SCRI 922; P. stewartii SCRI 475; 23 and 24, P. agglomerans

SCRI 435 and SCRI 459; 25, Enterobacter nimipressuralis SCRI 491; 26, Enterobacter dissolvens SCRI

921; 27, Erwinia uredovora SCRI 433; 28, E. quercinia SCRI 442; 29, E. Rubrifaciens SCRI 445; 30, E.

nigrifluens SCRI 476; 31 and 32, E. amylovora SCRI 444 and SCRI 906; 33, E. tracheiphila SCRI 493; 34,

E. Mallotivora SCRI 490; 35, E. salicis SCRI 474; 36, E. psidii SCRI 492; 37, E. persicinus SCRI 480. M,

1-kb Plus ladder (Life Technologies). (Tomado de Toth y colaboradores, 2001).

Tabla 15. Tamaño de bandas para las distintas Erwinias, causantes de pudrición blanda, por

amplificación de PCR 16S-23S ITS (ITS-PCR). (Tomado de Toth y colaboradores, 2001).

Resultados y Discusión

107

107

Tomando en cuenta lo reportado por Toth y colaboradores (2001), con

la similtud en el patrón y el tamaño de las bandas observados al realizar la

amplificación con los iniciadores G1 y L1, podemos concluir que los aislados

problemas pertenecen a alguna de estas especies: E. carotovora subsp.

carotovora, E. carotovora subsp. wasabiae, E. cacticida, E. carotovora subsp.

Aaroseptica y E. chrysanthemi, por su similitud con el patrón de bandas

encontrado. De todas estas, las reportadas en el estado Mérida según García

(2000), E. carotovora subsp. carotovora, E. carotovora subsp. atroseptica y E.

chrysanthemi, son las que coinciden con el patrón de bandas. Sin embargo, al

observar la PCR, empleando los incidadores Y1pel y Y2pel (Darrase y col.,

1994) recordemos que en los extractos de ADN de los aislados problema si se

amplifica la banda de 434 pb que permite discriminar a P. carotovorum subsp.

betavasculorum y E. chrysanthemi, que no amplifican la banda específica; por

tanto se pueden descartar estas dos especies y concluir que los aislados

problema pertenecen a E. carotovora subsp. carotovora o subsp. atroseptica

(por no descartar a ninguna de las dos) y el aisaldo LMV11 a E. chrysanthemi;

discrepando entonces con lo reportado por Barrios (2015), quien identificó el

aislado LMV11 presumiblemente como P. carotovorum subsp. betavasculorum.

También los resultados concuerdan con lo reportado por Nazerian y

colaboradores (2011), quienes encontraron manchas de color café oscuro con

lesiones acuosas extensas causadas por bacterias patógenas en plantas de

okra, que fueron colectadas en diferentes campos de Malasia en el 2010.

Mediante la amplificación por PCR del gen de pectato liasa (pel) y la

Resultados y Discusión

108

108

amplificación del 16S-23S ARNr (ITS) con los iniciadores G1 y L1 obtuvieron

fragmentos de 434, 535 y 570 pb, respectivamente. A partir de la similitud entre

los resultados de las pruebas bioquímicas y su equivalencia con las bandas

encontradas del gen pel basada en PCR, y el análisis de RFLP de los

productos de la PCR de la ITS, coinciden las bandas encontradas por los

autores con las obtenidas en la fígura 16, todos sus aislamientos fueron

identificados como Pectobacterium carotovorum.

En este trabajo, los 6 aislados problemas son identificados como

Pectobacterium carotovorum, siendo este el primer reporte de identificación

molecular de esta especie en el país, aisladas de plantas de papa.

6.3.4. Genotipificación

Los métodos genotípicos epidemiológicos están basados en el estudio

del ADN, cromosómico o extracromosómico. En la tipificación molecular se

comparan las secuencias nucleotídicas de los microorganismos de manera

directa e indirecta, permitiendo determinar la relación clonal entre cepas de

una misma especie bacteriana. Una alternativa para genotipificar son las

técnicas basadas en la amplificación de secuencias de ADN mediante la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Fonseca, 2014). Usando las

secuencias ERIC, ha sido posible discriminar serotipos estrechamente

relacionados de la misma especie y grupos de cepas no relacionadas

clonalmente ya que poseen un gran poder discriminatorio (Rivas y col., 2006).

En este sentido, la técnica ERIC-PCR permitió corroborar, lo que las pruebas

Resultados y Discusión

109

109

moleculares anteriores determinaron, que las 6 cepas patogénicas aisladas de

hojas de papa son genéticamente idénticas debido a la similitud en la cantidad

y el tamaño de los fragmentos amplificados, y que el postulado de Koch se

cumple a cabalidad, puesto que su patrón de bandas es idéntico al aislado

original (figura 18).

Se emplearon las condiciones de amplificación siguiendo la metodología

descrita con los iniciadores ERIC propuestos por Lópes y colaboradores

(2001).

Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % de los productos de PCR de la

amplificación de las regiones repetitivas del genoma bacteriano, mediante ERIC – PCR,

empleando los iniciadores ERIC1 Y ERIC2. Carril 1: Marcador de peso molecular 1 kb de la

casa comercial PROMEGA. Carril 2: LMV27. Carril 3: LMV28. Carril 4: LMV29. Carril 5:

LMV30. Carril 6: LMV31. Carril 7: LMV32. Carril 8: postulado de Koch. Carril 9: LMV11. Carril

10: LMV24. Carril 11: LMV01. Carril 12: CVCM76. Carril 13: control de reactivos, control

negativo.

Las bandas encontradas para los 6 aislados patogénicos, tienen un

peso molecular de 4300 pb, 2610 pb, 2200 pb, 1540 pb, 1080 pb, 620 pb, 300

Resultados y Discusión

110

110

pb, similares en los 6 aislados patogénicos y el postulado de Koch (figura 18,

carriles del 2 al 8).

7. Prueba de patogenicidad de los aislados bacterianos en

microtubérculos y hojas de las variedades de papa (Solanum

tuberosum L.) ‘Arbolona Negra’ y ‘Granola’. Postulados de Koch

7.1. Propagación in vitro de plantas y microtubérculos

Las plántulas obtenidas inicialmente en medio líquido, coincidiendo con

lo reportado por Alva y Oropeza (2013), presentaron vigorosidad y el desarrollo

de raíces, tallos y hojas, adecuados para ser empleados como explantes para

la regeneración de las plántulas a emplear en los ensayos siguientes.

Se validó la producción de microtubérculos propuesta por Moreno

(2012), suplementando el medio de cultivo con sacarosa (50 g/L) y BA (5

mg/L). Se se observó que al aumentar el tiempo de crecimiento de las

vitroplantas durante 2 meses en medio de crecimiento MS, y 2 meses en medio

para inducir microtuberización en condiciones de fotoperiodo de días cortos (8

horas), se obtienen microtubérculos de buen tamaño y en cantidad suficiente

en las dos variedades „Arbolona Negra‟ y „Granola‟. En este sentido, estas dos

variedades, se han venido trabajando y estudiando en el Laboratorio de

Mejoramiento Vegetal, donde 'Arbolona Negra' es una variedad nativa la cual

se pretende con todas estas investigaciones, caracterizar su comportamiento

ante las principales enfermedades que atacan el cultivo de papa.

Resultados y Discusión

111

111

Con estas condiciones se lograron producir, a partir de 28 vitroplantas de

cada variedad distribuidas en 14 fiolas, 81 microtubérculos de „Granola‟ y 57

microtubérculos de „Arbolona Negra‟, en un rango de 0,5 cm a 1,5 cm de

diámetro, tamaño adecuado y establecido para realizar las inoculaciones con

los aislados patogénicos. Con este material se pudieron obtener muchos

segmentos, lo cual fue representativo para diseñar el experimento de

patogenicidad y representar la sintomatología de la bacteriosis.

Moreno (2012) obtuvo un promedio de microtubérculos por planta

producidos en „Granola‟ de 3,8 y de 1,9 en „Arbolona Negra‟ a los 2,5 meses de

crecimiento;mientras que en esta investigación los promedios fueron de 2,9 y

2,0, respectivamente.

Con relación a las dos variedades, se estableció que aumentando el

tiempo de crecimiento a 4 meses (2 meses en medio de inducción + 2 meses

en medio para tuberización), es posible obtener suficientes microtubérculos,

resultando ser un tiempo relativamente rápido, teniendo en cuenta que

„Arbolona Negra‟, es conocida por su maduración lenta (9 meses) y

corroborando la hipótesis propuesta por Moreno (2012) quien propone que el

estímulo de fotoperiodo de días cortos, puede resultar más efectivo cuando la

planta es más desarrollada. Se recalca así, la efectividad del método para la

obtención en corto tiempo de microtubérculos de las dos variedades que puede

ser empleado tanto para la comercialización y establecimiento de semilla

certificada, como en la aplicación de los postulados de Koch, sistemas de

patogenicidad controlados, estudios de la interacción planta – patógeno, entre

otros.

Resultados y Discusión

112

112

Del mismo modo, se validó la producción de vitroplantas con el protocolo

propuesto por Alva (2014), observándose que al suplementar el medio con

nitrato de plata, y en condiciones de fotoperiodo de días largos (16 horas), se

obtuvieron plantas con hojas robustas y de buen tamaño que permitieron la

descripción de la sintomatología, incidencia y severidad, de los aislados

patogénicos en las dos variedades de plantas estudiadas.

El óptimo desarrollo de las plantas in vitro, no sólo depende de la

consistencia y composición del medio de cultivo, sino también de la atmósfera

gaseosa, el incremento de oxígeno y la acumulación de gases que puedan

resultar tóxicos para la planta, entre ellos el etileno, el cual en envases

cerrados puede afectar al crecimiento normal de las plantas. Por esta razón,

numerosas investigaciones, han reportado que el nitrato de plata inhibe la

acción del etileno y favorece el crecimiento de las plantas, principalmente el

incremento del área foliar (Moreno, 2012).

7.2. Establecimiento del patosistema

Con el objeto de determinar la susceptibilidad y/o resistencia de las

variedades de Solanum tuberosum in vitro y estudiar la virulencia de los

aislados bacterianos a diferentes temperaturas, se realizó un ensayo de

patogenicidad en microtubérculos y hojas a temperatura ambiente

(aproximadamente 26 ºC) y a 32 ºC.

Teniendo en cuenta que las dos bacteriosis más importantes del cultivo

de papa que están presentes en el país, son ocasionadas por las especies R.

solanacearum y Pectobacterium sp., fue posible comparar la sintomatología in

Resultados y Discusión

113

113

vitro de los aislados bacterianos patogénicos identificados como

Pectobacterium carotovorum, y la ocasionada por Burkholderia gladioli en

microtubérculos y hojas de las dos variedades de papa estudiadas, ya que se

empleó como control positivo en los siguientes experimentos una cepa de B.

gladioli, caracterizada e identificada por Fonseca (2014).

7.2.1. Incidencia y severidad en microtubérculos

Se encontraron diferencias en la sintomatología ocasionada por P.

carotovorum, la cual induce el ablandamiento severo de los tubérculos, desde

las 24h. Los microtubérculos se ennegrecen y cuartean al paso de las horas

con la presencia de exudado y la formación de burbujas. Por el contrario, la

sintomatología causada por B. gladioli es menos severa y corresponde a

pudrición y/o ennegrecimiento, pero con el 100% de presencia de los síntomas

en ambas variedades a 32 ºC.

Se logró determinar y corroborar los resultados obtenidos por Fonseca

(2014), donde, B. gladioli, es capaz de inducir pudrición en tubérculos con una

sintomatología de pudrición blanda similar a P. carotovorum. Adicionalmente,

claramente se puede observar que a temperatura ambiente tanto la incidencia

de la enfermedad, como la severidad son iguales en ambas variedades, pero al

aumentar la temperatura, la incidencia y la severidad aumentan, tanto así que

las 10 rodajas de ambas variedades presentan síntomas de bacteriosis. Cabe

destacar que la mayor severidad de la enfermedad se observó a 32 ºC en la

variedad 'Granola' (figura 20).

Resultados y Discusión

114

114

Respecto a la incidencia de la enfermedad (tabla 16), se determinó que

P. carotovorum ocasionó en 'Granola' la pudrición a las 24 hpi, pero es a las

144 hpi donde el porcentaje de incidencia es del 100% a 32 ºC, con todas las

cepas menos con la LMV27 con la que se alcanza 80% de incidencia; mientras

que los microtubérculos inoculados con B. gladioli, tardaron 48 hpi en presentar

los primeros síntomas de enfermedad.

Tabla 16. Incidencia de la enfermedad en microtubérculos a las 144 hpi.

Aislado Temperatura ambiente Temperatura a 32º C

Granola Arbolona Negra Granola Arbolona Negra

LMV 27 90% 70% 80% 30%

LMV28 60% 40% 100% 90%

LMV29 100% 90% 100% 80%

LMV30 100% 70% 100% 100%

LMV31 70% 70% 100% 70%

LMV32 100% 80% 100% 91%

LMV01 60% 50% 100% 100%

Caldo 0% 0% 0% 0%

Sin inóculo 0% 0% 0% 0%

LMV01 = B. gladioli

Resultados y Discusión

115

115

Figura 19. Incidencia de la enfermedad en microtubérculos a las 144 hpi a) 'Granola' b)

'Arbolona Negra'

En la variedad 'Granola', los aislados LMV29, LMV30 y LMV32,

presentan en todas las rodajas síntomas de pudrición (100% de incidencia de

la enfermedad) a ambas temperaturas.

Resultados y Discusión

116

116

En cuanto a los aislados LMV28, LMV31 y LMV01, presentan un mayor

% de incidencia de la enfermedad a altas temperaturas con respecto a la

temperatura ambiente en la variedad 'Granola'; el único en diferir estos

resultados es el aislado LMV27, que de igual manera, sucede en la variedad

'Arbolona Negra', donde presenta una mayor incidencia de la enfermedad a 26

°C (figura 19). La matriz de datos para el cálculo de la severidad de la

enfermedad se encuentra en el anexo 5.

Tabla 17. Severidad de la enfermedad en microtubérculos a las 144 hpi.

Aislado Temperatura ambiente Temperatura a 32º C

Granola Arbolona Negra Granola Arbolona Negra

LMV 27 76% 50% 48% 22%

LMV28 32% 28% 98% 54%

LMV29 66% 30% 94% 66%

LMV30 48% 38% 98% 58%

LMV31 70% 48% 98% 46%

LMV32 80% 54% 100% 80%

LMV01 36% 32% 80% 58%

Caldo 0% 0% 0% 0%

Sin inóculo 0% 0% 0% 0%

LMV01 = B. gladioli

Resultados y Discusión

117

117

Figura 20. Severidad de la enfermedad en microtubérculos a las 144 hpi. a) 'Granola'

b) 'Arbolona Negra'.

De igual forma que ocurre con la incidencia, en cuanto a la severidad de

la enfermedad, se observa un aumento en ambas variedades a 32 ºC, y solo el

Resultados y Discusión

118

118

aislado LMV27 difiere donde se observa un mayor % de severidad de la

infección a temperatura ambiente (tabla 17).

A pesar de que todos los aislados son identificados por las pruebas

anteriores como P. carotovorum, cabe destacar que el aislado LMV27 fue el

único encontrado en la ubicación WP310 de mayor altitud, puede que esta

cepa responda mejor a temperatura ambiente que a temperaturas más cálidas,

difiriendo en cuanto a los otros aislados obtenidos de la coordenada WP311,

que responde mejor a 32 °C, concordando así con los resultados obtenidos en

las pruebas bioquímicas, donde su metabolismo era diferente a los otros 5

aislados, ya que, fue el único en presentar pudrición en el agar Kliger.

Respecto al progreso de la enfermedad causada por los aislados

identificados como P. carotovorum, se encontró que tanto para las dos

variedades de papa, como para las dos temperaturas, la aparición de los

síntomas comenzó a las 24hpi; sin embargo, la severidad de los síntomas en

'Arbolona Negra', no fue tan alta como en 'Granola'.

En las figuras comprendidas de la 21 a la 29 se puede observar la

sintomatología causada por los distintos aislados en las dos variedades y en

ambas temperaturas, además de los controles, donde los síntomas más

severos se observan a 32 ºC y en la variedad 'Granola'.

Pareciera que 'Arbolona Negra' presenta una cierta resistencia a

temperatura ambiente, lo cual concuerda con los resultados obtenidos por Alva

(2014), Fonseca (2014), Marin (2015) y Barrios (2015), donde esta variedad es

resistente a distintos patógenos, pero al aumentar la temperatura, se observa

una disminución de la resistencia de la planta a los fitopatógenos, este

Resultados y Discusión

119

119

aumento en la temperatura pareciera, potenciar la enfermedad y agravar los

síntomas en las rodajas de ambas variedades estudiadas.

La temperatura es de los factores ambientales que más influye en el

crecimiento de los microorganismos. Al aumentar la temperatura, aumenta la

velocidad de las reacciones enzimáticas hasta una cierta temperatura a la cual

las proteínas, DNA y otras macromoléculas son sensibles y se desnaturalizan.

Cada microorganismo tiene una temperatura mínima, óptima y máxima de

crecimiento. La temperatura óptima siempre está más cerca de la temperatura

máxima que de la mínima. Por ende, podemos decir que la temperatura optima

de crecimiento para los aislados LMV28, LMV29, LMV30, LMV31 y LMV32 está

más cerca de los 32 °C, en cambio para el aislado LMV27 la temperatura

óptima para su crecimiento está más cercana a los 26 °C.

Las altas temperaturas a las cuales están expuestas las plantas son una

limitante para que las hojas y tallos puedan mantener la estructuración de sus

proteínas y enzimas requeridas para mantener el crecimiento y mecanismos de

ataque contra patógenos. La necesidad de realizar reacciones químicas,

metabolismo y construcción de estructuras celulares, implica estabilidad de

mecanismos bioquímicos, por lo cual deben ser temperaturas iguales o

parecidas a las ambientales (temperatura optima). Es por esto, que son más

susceptibles los tejidos vegetales a altas temperaturas por los patógenos

vegetales.

Otra característica observada fue la producción de exudado en algunos

microtubérculos, principalmente en los segmentos inoculados con los aislados

problema de esta investigación identificados como P. carotovorum.

Resultados y Discusión

120

120

De este modo, se determinó que la variedad 'Granola', es altamente

susceptible a los aislados estudiados, mientras que 'Arbolona Negra', es

probablemente menos susceptible o tolerante a estas bacterias fitopatógenas.

Figura 21. Sintomatología inducida por el aislado LMV01 (B. gladioli) a las 144 hpi en

a) 'Granola' a temperatura ambiente. b) 'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. c) 'Granola'

a 32 ºC. d) 'Arbolona Negra' a 32 ºC.

Figura 22. Sintomatología inducida por el aislado LMV27 a las 144 hpi en a) 'Granola' a

temperatura ambiente. b) 'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. c) 'Granola' a 32 ºC. d)

'Arbolona Negra' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

121

121

Figura 23. Sintomatología inducida por el aislado LMV28 a las 144 hpi en a) 'Granola' a

temperatura ambiente. b) 'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. c) 'Granola' a 32 ºC. d)

'Arbolona Negra' a 32 ºC.

Figura 24. Sintomatología inducida por el aislado LMV29 a las 144 hpi en a) 'Granola' a

temperatura ambiente. b) 'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. c) 'Granola' a 32 ºC. d)

'Arbolona Negra' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

122

122

Figura 25. Sintomatología inducida por el aislado LMV30 a las 144 hpi en a) 'Granola' a

temperatura ambiente. b) 'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. c) 'Granola' a 32 ºC. d)

'Arbolona Negra' a 32 ºC.

Figura 26. Sintomatología inducida por el aislado LMV31 a las 144 hpi en a) 'Granola' a

temperatura ambiente. b) 'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. c) 'Granola' a 32 ºC. d)

'Arbolona Negra' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

123

123

Figura 27. Sintomatología inducida por el aislado LMV32 a las 144 hpi en a) 'Granola' a

temperatura ambiente. b) 'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. c) 'Granola' a 32 ºC. d)

'Arbolona Negra' a 32 ºC.

Figura 28. Rodajas de microtubérculos control, inoculadas con 10 µL de caldo estéril

LB a las 144 hpi en a) 'Granola' a temperatura ambiente. b) 'Arbolona Negra' a temperatura

ambiente. c) 'Granola' a 32 ºC. d) 'Arbolona Negra' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

124

124

Figura 29. Rodajas de microtubérculos control, sin inóculo a las 144 hpi en a) 'Granola'

a temperatura ambiente. b) 'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. c) 'Granola' a 32 ºC. d)

'Arbolona Negra' a 32 ºC.

7.2.2. Incidencia, severidad y sintomatología en hojas

En cuanto a las hojas, la incidencia de la enfermedad no tuvo

variaciones significativas en la variedad 'Granola', independientemente de la

temperatura de incubación, mientras que en la variedad 'Arbolona Negra' si;

con un desarrollo de la enfermedad en mayor porcentaje a 32 ºC, aunque los

síntomas son poco agresivos en comparación con la otra variedad (tabla 16).

Tabla 18. Incidencia de la enfermedad en hojas a las 144 hpi.

Aislado

Temperatura ambiente Temperatura a 32 ºC

'Granola' 'Arbolona Negra' 'Granola' 'Arbolona Negra'

LMV 27 83,30% 22,22% 100% 62,50%

LMV28 87,50% 37,50% 62,50% 50%

LMV29 75% 44,44% 87,50% 62,50%

LMV30 87,50% 62,50% 100% 62,50%

LMV31 62,50% 12,50% 75% 33,33%

LMV32 71,43% 22,22% 88,89% 66,67%

LMV01 87,50% 11,11% 62,50% 44,44%

Caldo 0% 0% 0% 0%

Sin inóculo 0% 0% 0% 0%

LMV01 = B. gladioli

Resultados y Discusión

125

125

Figura 30. Incidencia de la enfermedad en hojas a las 144 hpi, ambos tratamientos a)

'Granola' b) 'Arbolona Negra'.

Como se observa en las gráficas de la figura 30, y la tabla 18 la

incidencia de la enfermedad es mayor a 32 ºC para ambas variedades, excepto

Resultados y Discusión

126

126

en 'Granola' inoculada con los aislados LMV27 y LMV01, donde la aparición y

presencia de síntomas es mayor a temperatura ambiente (figura 30.a)

El índice de la enfermedad permitió determinar que la severidad es

mucho más significativa dependiendo de la temperatura en 'Arbolona Negra'.

Una observación interesante, es que independientemente del tratamiento, la

aparición y desarrollo de síntomas en 'Arbolona Negra', en ningún caso se hizo

evidente a las 24h. La matriz de datos para el cálculo de la severidad se

encuentra en el anexo 6.

La resistencia se define como la habilidad de la planta para prevenir,

restringir o retardar el desarrollo de una enfermedad causada por el ataque de

un patógeno (Jaramillo, 2003). Las plantas tienen muchas líneas de defensa

contra patógenos invasivos, incluyendo barreras preformadas y respuestas

inducidas. La interacción planta-patógeno implica una compleja red de eventos

moleculares y citológicos, la cual define la susceptibilidad o resistencia de la

planta huésped. La resistencia se manifiesta en plantas que poseen muchas

barreras y “armas químicas” pre-existentes, las cuales se suman a las

estrategias de defensa físicas y químicas inducidas por el patógeno

(Hammond-Kosack y Parker, 2003).

Muchas veces resistencia y susceptibilidad dependen del tiempo que

tarda la planta en responder al patógeno con su arsenal de defensa. Marín

(2015), describe que la actividad de proteasas (Cisteín Proteasa y Serín

proteasa) presente en hojas de vitroplantas de papa, a diferentes tiempos

después de la inoculación con el patógeno en geles de SDS-PAGE con

Resultados y Discusión

127

127

gelatina, permite evidenciar una respuesta de defensa en la variedad resistente

variedad „Arbolona negra‟, que no se logró observar en „Granola‟ y que los

compuestos fenólicos solubles y compuestos fenólicos ligados a la pared

presentes en hojas plantas de papa a diferentes tiempos después de la

inoculación in vitro del patógeno, indicaron que existe una respuesta defensiva

dado el aumento de estos compuestos en la variedad „Arbolona negra‟ la cual

no es evidente en „Granola‟. Por todo esto, se puede dar respuesta a la cierta

resistencia de esta variedad al patógeno inoculado.

Un estudio realizado por Jiménez (2008), sobre el impacto potencial de

la temperatura sobre la fisiología de las interacciones entre la planta y el

patógeno, encontró que uno de los efectos más negativos de la mayor

frecuencia de temperaturas elevadas sobre las interacciones planta-patógeno

concierne a la supresión de la expresión de genes de resistencia

termosensibles.

Investigaciones recientes demuestran que la resistencia conferida por

oligogenes que regulan la expresión de mecanismos defensivos contra la

infección, puede resultar comprometida por ligeros incrementos de la

temperatura, y que tal fenómeno ocurre de forma inespecífica en la resistencia

contra hongos, bacterias y nematodos. Por ejemplo, el incremento de 24ºC a

27ºC en la temperatura de incubación de plantas de garbanzo inoculadas

artificialmente con la raza 1A de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, convierte en

completamente susceptible la reacción altamente resistente del cv. PV-1, e

incrementaba la respuesta moderadamente susceptible del cv. Ayala, a dicha

Resultados y Discusión

128

128

raza a 24ºC hasta determinar la muerte de las plantas a 27ºC (Landa y col,

2006).

El fenómeno de supresión de resistencia conferida por genes termo-

sensibles puede ser complejo y depender de la naturaleza de los patosistemas

en las interacciones entre las plantas y sus patógenos. De hecho, en la

resistencia de cultivares de trigo a Puccinia recondita (Roya de la hoja),

distintos genes de resistencia pueden ser comprometidos por diferentes

intervalos térmicos; y en arroz, algunos genes de resistencia (ej., Xa7) a

Xanthomonas oryzae (“Blight” del arroz) son eficientes a temperaturas elevadas

mientras que la eficiencia de otros es disminuida por tales temperaturas (Garret

y col., 2006).

Se puede decir que a altas temperaturas, 'Arbolona Negra', pierde la

resistencia moderada que tiene ante los patógenos reportado por Alva (2014),

Fonseca (2014), Marín (2015) y Barrios (2015) a temperatura ambiente.

Tabla 19. Severidad de la enfermedad en hojas a las 144 hpi.

Aislado Temperatura ambiente Temperatura a 32º C

Granola Arbolona Negra Granola Arbolona Negra

LMV 27 62,50% 11,11% 100% 43,75%

LMV28 81,25% 28,13% 43,75% 43,75%

LMV29 56,25% 38,89% 87,50% 40,63%

LMV30 81,25% 62,50% 100% 53,13%

LMV31 62,50% 9,38% 75% 30,56%

LMV32 67,86% 22,22% 88,89% 66,67%

LMV01 81,25% 5,56% 50% 33,33%

Caldo 0% 0% 0% 0%

Sin inóculo 0% 0% 0% 0%

LMV01 = B. gladioli

Resultados y Discusión

129

129

Figura 31. Severidad de la enfermedad en hojas a las 144 hpi, ambos tratamientos a)

'Granola' b) 'Arbolona Negra'.

La severidad de la enfermedad en hojas, también depende de la

temperatura como en el caso de los microtubérculos, donde se observa un

incremento a 32 ºC de la severidad de la infección, y la variedad 'Arbolona

Resultados y Discusión

130

130

Negra', muestra una cierta resistencia a la incidencia y aparición de los

síntomas a temperatura ambiente (tabla 19).

Estrada (2000) reporta que las variedades de papa con alta resistencia

en el follaje generalmente, son de bajo rendimiento, pues usan toda su reserva

metabólica en la defensa del follaje y dejan muy poca reserva para la

tuberización, esto puede ser una característica de la variedad 'Arbolona Negra',

que tiene un período de tuberización más largo y menor cantidad de tubérculos

que otras variedades como 'Granola'.

Una observación interesante, es que independientemente del

tratamiento, la aparición y desarrollo de los síntomas en 'Arbolona Negra', en

ningún caso se hizo evidente a las 24 hpi, incluso en el tratamiento a 32 ºC

donde se observa la mayor severidad, estas tardaron 28 h en mostrar los

síntomas confinados en el sitio de la infección.

En las siguientes figuras se puede observar la sintomatología causada

por los distintos aislados en las dos variedades y a ambas temperaturas,

además de los controles, donde los síntomas más severos se observan a 32 ºC

y en la variedad 'Granola' (figuras de la 32 a la 40).

Resultados y Discusión

131

131

Figura 32. Sintomatología inducida por el aislado LMV01 (B. gladioli) a las 144 hpi en

a) 'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. b) 'Granola' a temperatura ambiente. c) 'Arbolona

Negra' a 32 ºC. d) 'Granola' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

132

132

Figura 33. Sintomatología inducida por el aislado LMV27 a las 144 hpi en a) 'Arbolona

Negra' a temperatura ambiente. b) 'Granola' a temperatura ambiente. c) 'Arbolona Negra' a 32

ºC. d) 'Granola' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

133

133

Figura 34. Sintomatología inducida por el aislado LMV28 a las 144 hpi en a) 'Arbolona

Negra' a temperatura ambiente. b) 'Granola' a temperatura ambiente. c) 'Arbolona Negra' a 32

ºC. d) 'Granola' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

134

134

Figura 35. Sintomatología inducida por el aislado LMV29 a las 144 hpi en a)

'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. b) 'Granola' a temperatura ambiente. c) 'Arbolona

Negra' a 32 ºC. d) 'Granola' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

135

135

Figura 36. Sintomatología inducida por el aislado LMV30 a las 144 hpi en a)

'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. b) 'Granola' a temperatura ambiente. c)

'Arbolona Negra' a 32 ºC. d) 'Granola' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

136

136

Figura 37. Sintomatología inducida por el aislado LMV31 a las 144 hpi en a)

'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. b) 'Granola' a temperatura ambiente. c)

'Arbolona Negra' a 32 ºC. d) 'Granola' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

137

137

Figura 38. Sintomatología inducida por el aislado LMV32 a las 144 hpi en a)

'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. b) 'Granola' a temperatura ambiente. c)

'Arbolona Negra' a 32 ºC. d) 'Granola' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

138

138

Figura 39. Hojas control inoculadas con 10 µL de caldo LB esteril a las 144 hpi en a)

'Arbolona Negra' a temperatura ambiente. b) 'Granola' a temperatura ambiente. c) 'Arbolona

Negra' a 32 ºC. d) 'Granola' a 32 ºC.

Resultados y Discusión

139

139

Figura 40. Hojas control sin inóculo a las 144 hpi en a) 'Arbolona Negra' a temperatura

ambiente. b) 'Granola' a temperatura ambiente. c) 'Arbolona Negra' a 32 ºC. d) 'Granola' a 32

ºC.

En cuanto al desarrollo de síntomas en hojas, se determinó que en

ambas variedades de papa pero con una mayor intensidad en 'Granola', el

desarrollo de los síntomas correspondió a manchas necróticas y/o cloróticas,

clorosis generalizada, marchitamiento, perforación en sitio de inóculo y

aparición de puntos negros en toda el área foliar (figura 41).

Resultados y Discusión

140

140

Figura 41. Detalle macroscópico de las distintas sintomatologías observadas en hojas.

a) Clorosis generalizada, causada por el aislado LMV01 en la variedad 'Granola' a 32 ºC. b)

Manchas cloróticas y necróticas, causadas por el aislado LMV29 en la variedad 'Arbolona

Negra' a temperatura ambiente. c) Aparición de puntos negros y marchitamiento, causado por

el aislado LMV29 en la variedad 'Granola' a temperatura ambiente. d) Perforación en sitio de

inóculo causado por el aislado LMV01 en la variedad 'Granola' a temperatura ambiente. e)

Clorosis y perforación en sitio de inóculo causado por el aislado LMV27 en la variedad 'Granola'

a temperatura ambiente. f) Marchitamiento y manchas cloróticas, causado por el aislado

LMV30 en la variedad 'Granola' a temperatura ambiente. g) Clorosis y perforación en sitio de

inoculación, causado por el aislado LMV01 en la variedad 'Arbolona Negra' a temperatura

ambiente. h) Clorosis y necrosis, causado por el aislado LMV01 en la variedad 'Granola' a

temperatura ambiente.

Según CABI (2011), la enfermedad causada por D. chrysanthemi y P.

carotovorum generalmente se presenta en forma severa en órganos de plantas

suculentas con altas temperaturas, alta humedad y altos niveles de nitrógeno,

esto pudiera explicar lo encontrado en este estudio, donde las bacterias crecen

a altas temperaturas y donde la adición de la solución nutritiva basada en

nitratos potenció el crecimiento del aislado en medio líquido e incrementó la

expresión de la enfermedad, como se observa en las pruebas de

patogenicidad. Otro factor importante es el exceso de agua ya que permite que

Resultados y Discusión

141

141

las bacterias se muevan fácilmente a través de los tejidos de la planta, además

de llevar a una disminución en la disponibilidad de oxígeno, lo que crea un

ambiente anaeróbico dentro de la planta, limitando sus defensas dependientes

de oxígeno (Toth y col., 2003), esto se consigue con las cámaras húmedas,

que resultan idóneas para reproducir los síntomas causados por los aislados.

Los autores también indican que los síntomas son destructivos a temperaturas

iguales o por encima de 28 ºC y que las plantas pueden permanecer

asintomáticas o con síntomas leves a temperaturas inferiores a 20 ºC.

Las bacterias fitopatógenas en el momento de contacto con la planta

ponen en marcha un abanico de propiedades que contribuyen al éxito de la

invasión final. Estos factores influyen en la virulencia (capacidad de

incrementar la severidad de la enfermedad de la planta), que no se debe

confundir con la patogenicidad (capacidad de producir la enfermedad).

Así, los factores de virulencia son importantes para que las bacterias invadan y

colonizen rápidamente el tejido, alcanzando unos altos niveles de población

antes de que la respuesta de la planta limite el crecimiento bacteriano.

La comprensión y manipulación de la resistencia en las plantas es

extremadamente importante. La resistencia puede estar dada por uno o varios

genes de resistencia (o genes R) a patógenos específicos que tienen genes de

virulencia. Si los genes de virulencia disparan una respuesta de defensa por

parte del hospedante, se les llama genes de avirulencia (avr). Si la resistencia

es más general, pueden estar involucrados una variedad de mecanismos de

defensa preformados, estructurales y químicos, incluyendo también productos

Resultados y Discusión

142

142

químicos inducidos (resistencia local o sistémica adquirida) (Phuntumart,

2003).

Bocsanczy y colaboradores (2014), identificaron las proteínas

expresadas en cepas virulentas y no virulentas a bajas y altas temperaturas,en

Ralstonia solanacearum, donde, las proteínas relacionadas con los procesos

metabólicos no disminuyeron en cepas virulentas, más si en cepas no

virulentas a bajas temperaturas, lo que puede conferirle una ventaja en el

crecimiento y colonización de los tejidos. Las proteínas son dependientes de la

temperatura y por eso las cepas responden diferente a altas y bajas

temperaturas.

En la literatura especializada, las temperaturas optimas reportadas para

P. carotovorum y su desarrollo son de 28 a 35 ºC y tanto la temperatura como

la humedad son dos factores críticos para el inicio y el desarrollo de la

pudrición blanda (Pérombelon, 2002). Dada la importancia de la temperatura

demostrada también en ambos experimentos, podría esperarse que, cuando

está por debajo de la temperatura ambiente (26 ºC), no predominará la

infección del patógeno en el cultivo, que es lo observado en campo por los

agricultores, sabiendo que Mérida es el estado de Venezuela que registra la

temperatura más baja al año.

Resultados y Discusión

143

143

7.3. Postulados de Koch

Los postulados de Koch exigen que el organismo sospechoso se

encuentre permanentemente asociado con la enfermedad en cuestión; que sea

aislado, cultivado y purificado para poder ser inoculado en plantas susceptibles;

que se reproduzcan los síntomas de la enfermedad en las plantas inoculadas

artificialmente, y que pueda ser nuevamente aislado el mismo organismo

patógeno de los tejidos enfermos (Sosa – Moss y col. 1997).

En esta investigación se corroboró que el patógeno que infectó y causó

la sintomatología en las rodajas era el mismo por su similitud en la morfología

de las colonias, crecidas en placas de agar LB durante 48 h; además se

evidenció la presencia de una sola morfología colonial en cada una de las

placas, y como se trataba de la misma colonia, se realizaron punciones de los 3

aislamientos.

De estas punciones, se tomó una al azar y se reactivó, se le extrajo el

ADN y se le realizaron las pruebas moleculares descritas en la sección anterior,

con el fin de corroborar la Reidentificación del aislado, y que fuera idéntico al

patógeno LMV30 aislado original (ver sección 6). Los resultados de la

identificación molecular comprueban a cabalidad el cumplimiento de los

postulados de Koch para el aislado LMV30.

Resultados y Discusión

144

144

En resumen, en el Laboratorio de Mejoramiento Vegetal, se ha venido

estudiando y caracterizando la resistencia de las dos variedades a los

principales patógenos, estos los identificamos tanto por técnicas bioquímicas

como por pruebas moleculares. Con esto, seguimos avanzando en la

identificación de patógenos de papa en el país, ya que pertenecemos a un

laboratorio de diagnóstico. Aunado a esto, proponemos el cultivo in vitro como

herramienta para pruebas de patogenicidad, ya que con esto se obtienen

plantas libres de patógenos, lo cual permite reproducir los síntomas

ocasionados solo por el patógeno a estudiar y si la población es clonalmente

idéntica (como es el caso), se comportan igual. Por ende una de las fortalezas

de este trabajo es la caracterización de la papa nativa 'Arbolona Negra'.

Es de suma importancia, que conociendo estas herramientas para

producir microtubérculos en poco tiempo y con una mayor producción, se

obtengan semillas certificadas sanas, libres de patógenos que puedan dañar el

cultivo, para ser entregada a los agricultores.

Tradicionalmente, esta pruebas de patogenicidad descritas

anteriormente se realizan en el campo, donde las condiciones ambientales

pueden interferir en el ensayo, es por esto que se ha promocionado y validado

en el laboratorio el cultivo in vitro que permite en una pequeña área y bajo

condiciones controladas, reproducir los síntomas que se observan en campo.

Se cumplieron los postulados de Koch y se realizaron las pruebas de

patogenicidad tanto en tubérculos como en hojas, ya que si observamos

marchitez bacteriana en las hojas, muy probablemente el patógeno este

dañando toda la planta. La mayoría de las bacterias patógenas de papa, lo que

Resultados y Discusión

145

145

causan es marchitez en las hojas (el mismo síntoma pero diferentes

patógenos), en cambio, en tubérculos aunque todas causen pudrición, se

observan distintas pudriciones, es decir son sintomatologías distintas. Cabe

destacar que en la hoja se encuentran todos los procesos fotosintéticos, pero

es el tubérculo el órgano de interés de esta planta.

El aislamiento y las pruebas de patogenicidad previas son herramientas

útiles y económicas que funcionan perfectamente para aislar de tejidos

infectados el patógeno causante de la enfermedad y corroborar los síntomas

observados en campo.

El país, no cuenta con laboratorios de diagnóstico de patógenos

vegetales, en este trabajo se propone el método de identificación bacteriana

con pruebas bioquímicas y moleculares de fácil realización, que permiten la

rápida identificación de Pectobacterium carotovorum, diferenciándola de otras

bacterias causantes de pudrición en papa, las cuales están afectando al cultivo

en Venezuela.

Conclusiones

146

146

VI. CONCLUSIONES

1. Se logró aislar y purificar cepas bacterianas, obteniéndose 30 aislados

bacterianos de hojas de plantas de papa con sintomatología de bacteriosis,

colectadas en el Río Chama, Estado Mérida. La prueba preliminar de

patogenicidad en tubérculos de papa permitió identificar 6 aislados patogénicos

causantes de pudriciones en tubérculos de papa comerciales, de entre estos 30

aislados.

2. Los 6 aislados problema denominados LMV27, LMV28, LMV29, LMV30,

LMV31 y LMV32, resultaron ser positivos a la prueba de KOH 3% al igual que

los controles LMV24 y LMV01, confirmando de esta manera que las bacterias

son Gram negativas. Solo el aislado LMV27 es capaz de producir gas en el

medio Kliger. Los 6 aislados crecen de color blanco a crema en medio YDC,

son anaeróbicos facultativos, catalasa positiva y oxidasa negativa.

3. La caracterización morfológica y bioquímica permitió ubicar a los 6 aislados

bacterianos patógenos, dentro del género Erwinia (=Pectobacterium).

4. El método propuesto por Gomes y colaboradores (2000) para la extracción de

ADN de bacterias Gram negativas, resulta ser altamente eficiente tanto en

calidad como en la concentración a partir de pequeñas cantidades de cultivos

bacterianos.

Conclusiones

147

147

5. La amplificación del gen 16s ARNr mediante el uso de iniciadores universales

permitió corroborar la naturaleza procarionte del ADN de los 6 aislados

bacterianos patogénicos.

6. Los iniciadores específicos OLI1 y Y2, resultan ser altamente confiables para la

detección especie – específica de Ralstonia solanacearum ya que no

amplifican el ADN de otras bacterias fitopatógenas del cultivo de papa y

filogenéticamente cercanas.

7. Los iniciadores específicos Gla –f y Gla- r, resultan ser altamente específicos,

para la detección especie – específica mediante PCR de B. gladioli.

8. La amplificación mediante PCR especie - específica tanto para Ralstonia

solanacearum como para Burkholderia gladioli, confirmó lo obtenido en las

pruebas bioquímicas, descartando la posibilidad de que alguno de los aislados

patogénicos perteneciera a estas especies bacterianas.

9. Se logró la amplificación del gen pel con los iniciadores específicos Y1pel y

Y2pel, por lo que los 6 aislados problema se identifican como Pectobacterium

carotovorum.

10. La amplificación de la Región Espaciadora Intergénica Transcrita (ITS) 16S –

23S, con iniciadores universales G1 y L1, permiten concluir que los 6 aislados

problemas pueden ser E. carotovora subsp. carotovora o subsp. Atroseptica

Conclusiones

148

148

(por no descartar a ninguna de las dos) y el aislado LMV11 usado como

control, puede ser E. chrysanthemi.

11. Las amplificaciones de regiones repetitivas tales como ITS y ERIC, permitieron

demostrar que los 6 aislados son clonalmente idénticos, por presentar gran

similitud entre ellos en el número y tamaño de las bandas obtenidas.

12. El uso de cultivo in vitro resulto ser un sistema apropiado para el desarrollo y

establecimiento de las pruebas de patogenicidad tanto en hojas como en

microtubérculos y para el cumplimiento de los postulados de Koch. Los

resultados de incidencia y severidad permiten concluir que la variedad Granola

es altamente susceptible a P. carotovorum a 26 y 32 °C mientras que la

variedad Arbolona es tolerante a 26 °C y medianamente susceptible a 32 °C.

13. La metodología empleada para el cumplimiento de los postulados de Koch,

resultó ser altamente efectiva, pues se cumplen a cabalidad los postulados,

corroborando así que las bacterias estudiadas causan el síntoma que

presentaban las hojas de las que fueron aisladas, en hojas y microtubérculos

sanos de Solanum tuberosum (L.).

Recomendaciones

149

149

VII. RECOMENDACIONES

Tomando en cuenta que los aislados problemas fueron identificados como

P. carotovorum, y se presume que puedan pertenecer a la subsp. carotovorum o a

la subsp. atroseptica, para discriminar entre estas y las otras subsp, se

recomienda, realizar la secuenciación del gen 16S región altamente conservada y

que permite relacionar filogenéticamente a los organismos procariotas.

Para corroborar que los 6 aislados sean clonalmente idénticos, se deben

realizar otras pruebas de Genotipificación como BOX – PCR y REP- PCR.

Además, se recomienda completar la prueba de patogenicidad con

temperaturas inferiores a la ambiente, para así completar el estudio y la

caracterización de la papa nativa 'Arbolona Negra' y la papa comercial 'Granola'

Referencias bibliográficas

150

150

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Anexos

164

164

IX. ANEXOS

ANEXO 1

PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA TINCIÓN GRAM

Soluciones empleadas

Compuesto [ ] Solución

Cristal Violeta 1 % A1

Yodo y Yoduro Potásico 1% y 2% B

Safranina 2% C

Alcohol: Acetona 70:30 Decolorante

Se preparan frotis bacterianos colocando sobre un portaobjetos una muestra de

bacterias bien extendidas.

1.) Teñir con la solución A durante 1 minuto, después lavar con abundante agua

destilada el exceso de colorante.

2.) Cubrir con la solución B durante 1 minuto, después lavar el exceso con

abundante agua destilada.

3.) Decolorar con la solución decolorante (se puede emplear etanol 95%), hasta

que la preparación deje de perder color.

4.) Lavar con abundante agua para eliminar el resto del disolvente.

5.) Teñir con la solución C durante 1 minuto, después lavar con agua destilada

para eliminar el resto de colorante.

6.) Secar la preparación

Anexos

165

165

7.) Visualizar al microscopio óptico con el objetivo de 100X

Recomendación: Hacer paralelamente a la muestra problema, muestras patrón

con una bacteria Gram + y una Gram -, para hacer las comparaciones y el control

del procedimiento.

Anexos

166

166

ANEXO 2

FUNDAMENTOS DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS EMPLEADAS

(MacFaddin, 2003)

Citrato: El agar citrato de Simmons es un medio diferencial utilizado para el

estudio de bacilos Gram negativos, sobre la base de la utilización del citrato como

una fuente de carbono, y la utilización de sales de amonio inorgánico como única

fuente de nitrógeno. Estas reacciones metabólicas son dependientes del aporte de

oxígeno. El sulfato de magnesio aporta el cofactor magnesio para diversas

reacciones enzimáticas, en tanto que el fosfato de potasio actúa como tampón.

Los cambios en pH se verifican gracias al indicador azul de bromotimol.

Solamente los microorganismos que pueden utilizar el citrato como fuente de

carbono presentarán desarrollo. El medio cambiará de verde a azul.

Agar Hierro de Kliger: En presencia de tiosulfato en el medio o la

degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos

microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato

reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H2S se forma en condiciones

ácidas y reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado

negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.

•Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que

alcalinizan todo el medio.

Anexos

167

167

• Las bacterias que sólo fermentan la glucosa, inicialmente también utilizan

aeróbicamente la glucosa. Debido a la baja concentración de glucosa (0.1%),

metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio.

• Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y

al término de ésta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la acidificación completa

del medio.

Hidrólisis de gelatina: La gelatina es una proteína que tiene la capacidad

de gelificar. Cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los aminoácidos que la

componen, pierde su característica de gelificar. Se pueden emplear varios medios

que permiten la visualización macroscópica como la gelatina adherida a carbón

activado.

Reducción de Nitratos: El nitrito reacciona con dos reactivos: ácido

sulfanílico y dimetil-a-naftilamina (o a-naftilamina). La reacción de color se debe a

la formación de un compuesto diazonio, p-sulfobenceno-azo-α-naftilamina.

Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba del zinc para

reducir químicamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los reactivos de

Griess el compuesto indicador.

Prueba de O/F (oxidación y fermentación): se usa el medio básico de

Hugh y Leifson (1953) con un pH de 7,1. Es un medio semisólido de color verde

que contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%.

Como indicador de pH tiene Azul de Bromotimol. - Se inoculan los dos tubos con

la bacteria por picadura. - Uno de los tubos queda sin aceite o parafina y otro con

Anexos

168

168

aceite o parafina sellándolo, para crear un ambiente anaeróbico. Se lee la reacción

según la siguiente tabla:

TIPO METABOLISMO TUBO SIN PARAFINA TUBO CON PARAFINA

oxidador fermentador amarillo amarillo

oxidativo amarillo en superficie verde sin viraje

Inactivo verde sin viraje verde sin viraje

Anexos

169

169

ANEXO 3

PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS EMPLEADOS PARA LA IDENTIFICACIÓN

DE LOS AISLADOS PATOGÉNICOS

Agar LB

Bacto-Triptona 10 gr

Ext. de levadura 5 gr

NaCl 5 gr

Agar 6 gr

Agua destilada 1 L

Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión y 120°C.

El caldo nutritivo LB se prepara de la misma manera pero sin añadirle los 6 gr de

Agar

Agar MacConkey

Digerido Pancreático de Gelatina 17.0 gr

Sales Biliares 1.5 gr

Digerido Péptico de Tejido Animal 1.5 gr

Cloruro de Sodio 5.0 gr

Digerido Pancreático de Caseína 1.5 gr

Cristal Violeta 0.001 gr

Lactosa 10.0 gr

Agar Bacteriológico 13.5 gr

Rojo Neutro 0.03 gr

pH 7.1 ± 0.2

H2O esteril 1L

Anexos

170

170

Simons Citrato

Citrato de sodio 2 gr

Cloruro de sodio 5 gr

Fostatodipotásico 1 gr

Fosfato moniamónico 1 gr

Sulfato de magnesio 0.2 gr

Azul de bromotimol 0.08 gr

Agar 15 gr

H2O estéril 1L

Hugh y Leifson

Tripteína 2 gr

Cloruro de sodio 5 gr

Fostatodipotásico 0.3 gr

Azul de bromotimol 0.03 gr

Agar 2.5 gr

pH 7.1

H2O estéril 1L

Suspender 9.8 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar. Calentar con

agitación frecuente y hervir 1 minuto. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. A

100 ml de base estéril, agregar 10 ml de la solución estéril del hidrato de carbono

al 10% (alternativamente agregar el hidrato de carbono antes de esterilizar y

autoclavar a 118°C durante 10 minutos).

Anexos

171

171

Hidrólisis de Almidón

Peptona de Gelatina 5 gr

Extracto de Carne 3 gr

Agar Bacteriológico 15 gr

pH 6.8 ± 0.2

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar y suplementar con almidón

al 0.2%.

Agar YDC

CaCO3 20 gr

Glucosa 20 gr

Extracto de levadura 10 gr

Agar 15 gr

pH del medio 7.0 - 7.1.

H2O estéril 1L

Mezclar bien los componentes calentando el medio y autoclavarlo a 15psi

de presión 121oC durante 15 minutos. A la hora de servirlo en placa se debe

agitar para resuspender el carbonato de calcio.

Anexos

172

172

ANEXO 4

PREPARACIÓN DE MEDIO MURASHIGE Y SKOOG (1962) SÓLIDO (MS)

Al medio no se le añaden hormonas vegetales y se le ajusta el pH a 5.6. Posteriormente,

el medio se esteriliza en autoclave a 120Oc, 15 libras de presión, durante 20 minutos.

NOMBRE CONSTITUYENTE CONCENTRACION

DEL STOCK g/l

VOL. DEL STOCK. PARA 1 lt

DE MEDIO

CONCENTRACIÓN

FINAL EN EL

MEDIO mg/l

A NH4NO3 82,5 20 1650

B KNO3 95,2 20 1900

C

H3BO3

KH2PO4

KI

Na2Mo4.2H2O

CoCl2. 6H2O

1,24

34,0

0,166

0,050

0,005

5

6,2

170,0

0,83

0,25

0,025

D CaCL2.6H2O 88 5 440

E

MgSO4.7H2O

MnSO4.4H2O

ZnSO4. 7H2O

CuSO4.5H2O

74,0

4,46

1,72

0,005

5

370,0

22,3

8,6

0,025

F

Na2EDTA

FeSO4.7H2O

3,72

2,76

10

37,2 27,8

G Tiamina 0,08 5 0,4

Mio-inositol

8 g/l

Agar o GELRITE

8 o 2 g/l

Anexos

173

173

ANEXO 5

MATRIZ DE DATOS DE LA SEVERIDAD EN MICROTUBÉRCULOS

Temperatura ambiente

LMV27 LMV28 LMV29 LMV30 LMV31 LMV32 LMV01 Caldo

LB Sin

inóculo

G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN

4 5 1 5 4 1 5 1 5 5 5 5 5 0 0 0 0 0

4 0 1 5 4 1 5 1 5 0 5 5 5 0 0 0 0 0

4 1 1 3 4 1 1 5 5 0 5 0 2 0 0 0 0 0

4 1 3 0 1 1 1 0 0 1 4 1 2 1 0 0 0 0

4 3 0 0 1 1 1 0 0 1 1 4 2 1 0 0 0 0

5 5 5 0 4 0 1 5 5 5 4 5 0 0 0 0 0 0

5 5 5 0 4 1 1 5 5 5 4 5 0 0 0 0 0 0

4 5 0 0 4 5 5 1 5 4 4 0 0 1 0 0 0 0

4 0 0 0 4 2 2 1 5 3 4 1 0 5 0 0 0 0

0 0 0 1 3 2 2 0 0 0 4 1 2 5 0 0 0 0

Temperatura 32 ºC

LMV27 LMV28 LMV29 LMV30 LMV31 LMV32 LMV01 Caldo

LB Sin

inóculo

G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN

2 0 5 3 5 5 5 0 5 0 5 5 5 4 0 0 0 0

4 0 5 3 5 5 5 1 5 0 5 5 5 4 0 0 0 0

0 0 5 3 5 0 5 1 5 5 5 4 5 2 0 0 0 0

0 0 5 3 5 4 5 3 5 5 5 1 4 2 0 0 0 0

1 0 5 4 5 4 4 3 4 5 5 0 4 2 0 0 0 0

4 5 5 4 5 5 5 5 5 0 5 5 1 5 0 0 0 0

4 5 5 4 5 4 5 5 5 1 5 5 1 5 0 0 0 0

3 1 5 1 4 4 5 4 5 1 5 5 5 1 0 0 0 0

3 0 4 0 4 2 5 4 5 3 5 5 5 2 0 0 0 0

3 0 5 2 4 0 5 3 5 3 5 5 5 2 0 0 0 0

4 AN = 'Arbolona Negra'

G = 'Granola'

Anexos

174

174

ANEXO 6

MATRIZ DE DATOS DE LA SEVERIDAD EN HOJAS

Temperatura ambiente

LMV27 LMV28 LMV29 LMV30 LMV31 LMV32 LMV01 Caldo

LB Sin

inóculo

G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN

4 3 4 0 3 0 4 0 4 0 4 0 0 0 0 0 0 0

4 0 3 0 2 0 4 0 4 0 4 0 3 0 0 0 0 0

2 0 3 0 2 0 4 0 4 0 0 0 4 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 4 4 0 0 3 0 3 0 0 0 0 0

0 1 4 3 4 4 4 4 4 0 4 4 4 0 0 0 0 0

4 0 4 3 4 4 4 4 4 0 4 0 4 0 0 0 0 0

0 4 3 3 0 0 4 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0

0 4 0 0 3 2 4 0 3 0 4 0 0 0 0 0

0 3 4 2 0

Temperatura 32 ºC

LMV27 LMV28 LMV29 LMV30 LMV31 LMV32 LMV01 Caldo

LB Sin

inóculo

G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN G AN

4 1 0 0 4 3 4 0 4 0 4 4 3 0 0 0 0 0

4 1 0 0 4 3 4 0 4 0 4 4 4 0 0 0 0 0

4 4 1 0 4 3 4 0 4 0 4 4 0 0 0 0 0 0

4 4 1 0 0 1 4 1 4 0 0 4 1 3 0 0 0 0

4 4 4 4 4 0 4 4 0 3 4 0 4 0 0 0 0 0

4 0 4 4 4 0 4 4 0 0 4 4 4 0 0 0 0 0

4 0 4 3 4 0 4 4 4 0 4 0 0 4 0 0 0 0

4 0 0 3 4 3 4 4 4 4 4 0 0 4 0 0 0

4 4 4 1

AN = 'Arbolona Negra'

G = 'Granola'