SAGRARIO MONTERO MATE

530956750UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

IMPLICACION DEL SISTEMA NORADRENERGICOCENTRAL EN LARESPUESTAHIPERTENSIVA AL ESTRESPOR DEPRIVACION SOCIAL

DIRECTORA: Dra. PAZ FERNANDEZTOME

UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

1992

ESTETRABAJO HA SIDO REALIZADO EN EL DEPARTAMENTO DEFARMACOLOGíA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA

UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID

Fdo. SAGRARIO MONTERO MATE

<Cc cQ~Fdo. DRA. PAZ FERNANDEZTOME

Directoradel trabajo

A mis padres

AM8Mar

A Tofio

Deseo expresarmi agradecimientoa la Dra. Paz FernándezTomé por suestímuloe interésen la dirección de la presentetesis doctoral, por prestarmesuexperiencia.

Al DepartamentodeFarmacologíade la Facultadde Medicina de la UniversidadComplutensede Madrid y, en panicular,a su Director, Dr. PedroLorenzo,por suacogiday apoyodurantela elaboraciónde esteproyecto.

A la Dra. M8 PazNava por haberaceptadogentilmenteactuarcomoponentede estaTesisDoctoral y a] Departamentode Fisiología de la Facultadde CienciasBiológicasde la UniversidadComplutensede Madrid por permitir la lecturacte lamisma.

Quiero darlasgraciasal Dr. JoséAngelFuentespor su inestimablecolaboraciónen todo momento,por compartirsu tiempo y sus consejosconmigo.

A la Dra. AngelaAlsasua,queha trabajadoestosañosenel mismo laboratorio.

Al Dr. Juan Tarnargopor ayudarmea salvar las dificultades de los <fltimos

momentos.

Mi mássinceray cariñosagratitud a Carmen,Eva y Nesí, queme escucharon,me alentaron y me echaron una mano siempre que lo necesitaba.Por sucolaboraciónen las laboresreprográficasde estetrabajo.

A M~ Jesús,Luis, Fernandoy Paco,con quienes,a pesardel poco tiempo quehemoscoincidido,he compartidobuenosmomentosen el laboratorio.

Y, muy especialmente,quiero manifestar, no sólo mi agradecimientosinotambiénmi cariño, a mis compañerosde equipo: Isabel, Lucía, Teresay Antonio,por estarsiemprea mi lado,por su pacienciaal escucharme,por sualiento y apoyo,por su disposición,sus consejosy cooperaciónen todo momento, por dejarmecompartircon ellos risasy amistad.

Por último, deseoagradecera mi familia el esfuerzocontinuo de todos estosaños graciasal cual he podido formarmecientíficamente,su comprensión,firmeestimuloy constanteayuda.Por su confianzaen mi, gracias.

Graciasa todos.

UVICE

RESUMEN

INTRODUcCION 1

1. Estrés 2

1.1. Evolución y definición de estrés 2

1.2. Respuestafisiológica al estrés 4

1.2.1. Activación del sistemasimpatoadrenal 4

1.2.2. Activación del eje hipotélamo-hipófisis-adrenal 5

1.3. Modelos experimentalesde estrés 6

1.3.1. Seleccióne interésdel modelo de deprivaciónsocial 7

2. Hipertensión 7

2.1. Hipertensiónesencial:Etiopatogénesis 8

2.2. Hipertensiónprovocadapor estrés 11

3. Sistemacatecolaminérgico 13

3.1. Aspectosgeneralesde la síntesis,liberacióne inactivación

de las catecolaminas 143.2. Receptorescatecolaminérgicosy mecanismode acción 17

4. Regulacióndel sistemacardiovascular 19

4.1. Sistemanerviosocentraly control cardiovascular 20

4.1.1. Sistemascatecolaminérgicosimplicadosen la regulación

de la presiónarterial 24

4.1.1.1.Sistemanoradrenérgico 25

i

4.1.1.2.Sistemaadrenégico 28

4.1.1.3.Sistemadopaminérgico 29

OBJETIVOS 31

MATERIALES Y METODOS 34

1. Fármacosy productosquímicos 35

2. Animalesde experimentación 35

3. Técnicasquirúrgicas 36

3.1. Lesión con 6-hidroxidopaminadel haz noradrenérgicoventral 36

4. Modelo de estrés 37

5. Método de medidade la presiónarterial 38

5,1. Medida indirecta (tail-cuff) 38

6. Determinacionesbioquímicas 39

6.1. Determinaciónde catecolaminasy metabolitoscentralesporcromatografíalíquida de alta presión 39

6.1.1.Fundamentode la técnicacromatográfica 39

6.1.1.1. Detecciónelectroquímica 40

61.1.2.Detecciónfluorimétrica 40

6.1.2. Determinaciónde catecolaminasy metabolitoscentrales 41

6.1.2.1.Preparaciónde las muestras 41

6.1.2.2. Condicionescromatrográficasparala determinaciónde noradrenalina,adrenalinay dopamina 42

ji

6.1.2.3.Condicionescromatográficaspara la determinación

de MHPG 42

6.1.3. Cuantificacióny expresiónde los resultados 43

6.2. Determinaciónde los nivelesplasmáticosde corticosteronaporradioinmunoensayo 44

6.2.1. Obtenciónde las muestrasy separacióndel plasma 44

6.2.1.1. Liberaciónde corticosteronade proteinasplasmáticas 44

6.2.2. Radioinmunoensayode corticosterona 45

7. Tratamientoestadísticode los resultados 47

RESULTADOS 48

1. Destrucciónselectivadel haz noradrenérgicoventral mediantelaadministraciónde 6-hidroxidopamina 49

1.1. Efectode la administracióncon 6-hidroxidopaminaen el haznoradrenérgicoventral sobrela presiónarterial 49

1.2. Efectode la administracióncon 6-hidroxidopaminaen el haznoradrenérgicoventral sobrela actividadcatecolaminérgicacentral 49

1.2.1. Niveles de catecolaminasen distintasestructuras 52

1.2.2. Velocidadde renovaciónde noradrenalinaen distintas

estructuras 55

2. Estudiosobrela participacióndel sistemanoradrenérgicocentralen la

respuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocial 61

2.1. Modelo de estréspor deprivaciónsocial: caracterizaciónde larespuestahipertensivay validación comomodelode estrés 61

iii

2.2. Efecto de la lesión con 6-hidroxidopaminadel haz noradrenérgicoventral sobrela respuestahipertensivainducidapordeprivaciónsocial. 66

2.2.1. Efecto de la lesión con 6—hidroxidopaminadel haznoradrenérgicoventral duranteel desarrollode la respuestahipertensiva 66

2.2.2. Efectode la lesión con 6-hidroxidopaminadel haznoradrenérgico

ventral duranteel mantenimientode la respuestahipertensiva 69

3. Actividad catecolaminérgicacentral 69

3.1. Efecto del estréspor deprivaciónsocial sobrela actividadde los

sistemascatecolaminérgicoscentrales 723.1.1. Nivelesde catecolaminasen distintasestructuras 72

3.1.2. Velocidad de renovaciónde noradrenalinaen distintasestructuras 76

3.2. Actividad de los sistemascatecolaminérgicoscentralesen animaleslesionadosen el haznoradrenérgicoventral con 6-hidroxidopaminay deprivadossocialmente 83

3.2.1. Nivelesde catecolaminasen distintasestructuras 83

3.2.2. Velocidad de renovaciónde noradrenalinaen distintasestructuras 90

3.3. Actividad de los sistemascatecolaminérgicoscentralesen animalesdeprivadossocialmentey posteriomentelesionadosen el haznoradrenérgicoventral con 6-hidroxidopamina 95

3.3.1. Nivelesde catecolaminasen distintasestructuras 100

3.3.2. Velocidad de renovaciónde noradrenalinaen distintasestructuras 109

iv

DISCUSION 116

1. Caracterizaciónde la respuestahipertensivaen el modelode deprivaciónsocial y validación delmismo comomodelo deestrés 117

2. Modificación de la actividadnoradrenérgicacentralen el transcursodelestréspor deprivaciónsocial 118

3. Efecto de la administraciónde 6-hidroxidoparninaen el haznoradrenérgicoventral sobre los sistemascatecolaminérgicoscentrales 120

4. Implicación del sistemanoradrenérgicocentralen la respuestahipertensivaal estréspor deprivaciónsocial 123

4.1. Prevenciónde la respuestahipertensivainducida por deprivaciónsocial en animaleslesionadosen el haz noradrenérgicoventral 123

4.2. Inalterabilidadde la presiónarterial por la lesión de] haznoradrenérgicoventral en animaleshipertensospor deprivaciónsocial 124

5. Correlaciónentrela variación de la presiónarterialy la modificaciónde la actividadnoradrenérgicacentral inmediatamentedespuésde laadministraciónde 6-hidroxidopaminaen el haz noradrenérgicoventral 125

CONCLUSIONES 127

BIIBUOGRAFIA 129

~/

RESUMEN

Se han demostradoasociacionesentreel estrésy una amplia variedaddepatologíasen humanos(Canalda,1988),desdela psiquiétricahastala cardiovascular,sugiriendoseque áquelpodría ser el causantede la hipertensiónarterial (Galosiycols., 1981)

Parale]amente,en los últimos años,seha consolidadola ideadequeel estréses capaz de producir una elevación de la presión arterial vía mecanismosneurogénicosu hormonalesquedependende!sistemanerviosocentral(Brodyycols.,1987).

La importanciade lascatecolaminascerebralesen la regulacióncardiovascularseapoyaen el hecho de que las principalesáreasdel cerebrocon influenciasobrela presión arterial y la frecuencia cardíaca estan inervadasprofusamenteporneuronascatecolaminérgicas(Van de Bunsey Head, 1989).Además,en el estudiode lasalteracionesneuroendocrinasproducidascomoconsecuenciadel estrés,se haconcedido gran importancia al papel de este sistema de neurotransmisión,identificándolocomoel posible sustratoneuroquimicoresponsablede la activacióninicial del sistemanerviosocentrala nivel hipotalámico(Spinediy cols,, 1988).

En el modelo de estréspor deprivaciónsocial> descritopor primeravez porGardiner y Bennet (1977) y modificado posteriormentepor Naranjo y Fuentes(1985), se genera una respuestahipertensivaen la que se ha demostradolaparticipacióndel sistemaopiode (Jiménezy coN,, 1990). Al mismo tiempo sehanestablecidointerrelacionesentreestesistemay las catecolaminascentrales,hechoque pareceestar bien documentadodesde 1976 en que fue descrito por DetlefTaubey colaboradores.

Todas estas consideracionespermitieron plantear la posibilidad de que elsistema catecolaminérgicocentral estuviera implicado en la génesis y/o en elmantenimientode dicha respuestahipertensivacaracterísticade estemodelo deestrés.Así, procedimosa analizarel estadofuncional de los diferentes sistemascatecolaminérgicoscentralesen los animalesaisladoshipertensosy, al mismotiempo,a administrarla neurotoxina6-hidroxidopaminaconla finalidad de destruirunadelas vías noradrenérgicasascendentesde mayor importancia, aproximaciónfarmacológicaque ha sido notablementeutilizada en el estudiode los posiblesmecanismosimplicados en el desarrollo de la hipertensión en otros modelosexperimentales.

Las evidenciasque sehanobtenidoapoyandola hipótesisanteriorincluyenlaimposibilidad que presentanlos animales, previamente lesionados en el haznoradrenérgicoventral con 6-hidroxidopamina,para desarrollar la respuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocial, así como la inalterabilidadde dicharespuestacuandola lesión seefectúaunavez quelos animalesmanifiestanlecturaselevadasde la presiónarterial,consecuenciadel sometimientoal modelo de estrés,Estos dos acontecimientosparecen indicar que la integridad de este hazcatecolaminérgicoascendentees crítica para el desarrollo, pero no así para elmantenimiento,del estado hipertensivo característicodel modelo de estrésenestudio.

Adicionalmente,el hecho de que la destrucciónde estavía noradrenérgicacentralprovoquealteracionesen la presiónarterialdeanimalesnormotensos,esunaevidenciamásdelpapelqueestesistemadeneurotransmisiónjuegaen la regulacióncentralcardiovascular.

La disminuciónde la velocidadde renovaciónde noradrenalinahipotalámicaobservadaenratasaisladashipertensas(reflejadaen un descensosignificativode losniveles de MHPG) podría estarrelacionadacon el aumentode la presiónarterialquemanifiestanesosanimales.Estehechopuedeexplicarsesi seconsideraal sistemanoradrenérgicohipotalámicocomo sistemavasodepresorque, a su vez, provocarauna atenuaciónde] reflejo barorreceptorcuya reducidasensibilidadpareceser lacausade numerososcasosde hipertensiónen humanos(Sleight y cols., 1970) y enel animal deexperimentación(Tsyrlin y cols., 1988).La imposibilidadde los animaleslesionadosparapresentarla elevaciónde la presiónarterialinducidapor deprivaciónsocial sugierequela integridaddeestavía ascendenteseríacrítica pararestablecerel reajustedel sistemabarorretiejo.En vista deestosdatos,sepuedeespecularquela acción inhibitoria sobreel reflejo barorreceptorrequierede la accióntónica delas víasascendentesnoradrenérgicas.

Sin embargo,cuandola lesión se efectúaen animaleshipertensosel tononoradrenérgicohipotalámicose mantienedeprimido sin que se origine ningunaalteraciónde la presiónarterial. Del mismo modo,enotros modelosanimales,sehadescritoun papel preventivode la lesión con 6-ORDA antesdel desarrollode lahipertensióny su ineficaciaunavez quedichoestadohipertensivoestabaestablecido(Hauslery cols., 1972; Ikeday cols., 1976).Estehechoreflejaríaquelos mecanismosresponsablesde la elevaciónde la presiónarterialy los de sumantenimientoson, sinduda, diferentes.

Por otro lado, se han puestode manifiesto algunasmodificacionesen latransmisión catecolaminérgicacentral, producidas por la lesión de este haznoradrenérgicoascendente,causantesde un estadohipertensivo transitorio quepodríaserconsecuenciade unaumentopasajerodel tononoradrenérgicoenel bulboraquídeo y en la médula espinal, hecho que constituiría, según los resultadosobtenidos, el evento final que en el sistema nervioso central contribuiría aldesencadenamientode eseestadohipertensivoefímero.

INTRODUcDCION

1. E~RES

1.1. EVOLUCION Y DEFINICION DE ESTRES

En la segundamitad del siglo XIX, el fisiólogoClaudeBernardfue el primeroen reconocerla importanciade los mecanismosde adaptaciónpara mantenerlaconstanciadel medio internoy asegurarla existencia.

A partirde los trabajosdeBernard,Walter Canonconcibióel estréscomounaalteraciónde la homeostasis,términoqueintrodujo en 1926y quedefinió como elconjunto de diversas funciones, no todas bien conocidas,que permitiría unacomposiciónconstantede las característicasfisico-quimicasdel mediointernocomofactor primordial del mantenimientode la vida. Sus experienciasdemostraronlaimportancia del sistemanervioso simpático y de la Iteración de catecolaminasmeduloadrenales,tantoen la respuestaa estímulosfísicoscomoa sucesospsíquicoso emocionales.Observóqueestosestímulosnocivosproducíanla liberaciónde unasustanciaa la que denominó ‘sinipatina”, identificadamás tardecomo adrenalina(AD) y noradrenalina(NA), queeraesencialparadesarrollarla estrategiade “luchao huida” antelas situacionesde emergencia(Cannon,1914; 1935).

Unosañosmástarde,el endocrinólogoHansSelye (1936)amplió el conceptodeestrés,agrupandoenun todo el conjuntode reaccionesinespecíficasgeneralesdelorganismotendentesa mantenerla homeostasisfrente a los agentesagresoresexternosy al cual denominó‘SíndromeGeneralde Adaptación”,caracterizandoenél tresfasesdiferentes:

- Reacciónde alarma,provocadapor la presenciamismadel estímulo,

- Fasede resistenciao adaptación,esdecir, la respuestafrentea la agresión.

- Fasedeagotamientode la respuestay disminuciónde la resistencia,queaparece

si la duracióno intensidaddel estrésesexcesiva.

En 1946,estemismoautor,define “las enfermedadesde adaptaciónhaciendoreferenciaa los desajustessufridosen un organismopor carecerde una buenarespuestaadaptativay entre las que incluía la alergia, el insomnio y los trastornoscardiovasculares.

2

Laslíneasde investigaciónactualespartendelos trabajosde Lazarusiniciadosen los sesentay configuranun modelo en el queel estrésviene definido por sucarácterde amenazaparael individuo. Dicha amenazaes función de la percepcióny evaluaciónque éste realiza de estímulosprovenientesde su interaccióncon elambiente y de sus propios recursos para el afrontamientode tales estímulos(Lazarus,1966). Se tratade unaperspectivacognitivo-conductuale interactiva,algoqueya había indicadoWolff en la décadaanterior (Wolff, 1950).

Siguiendoen la mismalínea,y enunaprofundarevisiónde la caracterizaciónde la respuestafrente al estrésaportadapor Selye en 1936, J.W. Mason(1971)debate>por primeravez, la inespecificidaddedicharespuestadefendidaporel autorpionero,reseñandola capacidadcomúna todos los agentesestresantesde incidirsobrela esferapsicológicadel individuo y poniendode manifiestola importanciadelcomponentepsicológicodel estrés,Estudiosmuy recientesen sereshumanosy enanimaleshan corroboradola hipótesissegúnla cual las característicaspsicológicasy sociales (comportamientoemocional, personalidad,posición en la sociedad)influyen deforma determinanteen la respuestafisiológicaal estrés(Sapolsky,1990).

Algunosautoreshanindicadotambiénla relaciónexistenteentrela naturaleza,intensidado duracióndel agenteestresantey la respuestaque éste desencadena(Goldstein,1987),estableciendoseesamisma relacióncuandointervienenfactorestalescomo la especieanimal,hora del día, etc. (Kant y cols., 1986).

Por tanto,y a pesarde la dificultad que entrañael estableceruna definiciónprecisadel términoestrés,podríaconsiderarsecomo tal el conjuntode alteracionesqueaparecenen el organismoal hallarsefrente a unasituaciónagresivacompleja.Esta respuesta,que permite afrontar las amenazasque se producencontra elequilibrio fisiológico del organismo,puede desencadenarseante una agresióndeíndolepuramentefísica, patológicao psíquica.

El estrésviene definido, así, comoun procesodinámicoen el que intervienenvariablesdel propioorganismo,queinteractúanentresí, antela apreciaciónde unasituación como amenazantey la propia capacidadde afrontamientoante talcircunstancia.Es un fenómenogenéricoque agruparíatodas las variablesqueintervienenen el procesoadaptativodel individuo.

3

1.2. RESPUESTAFISIOLOGICA AL ESTRES

Será la duración del estrés la que determinará,en primera instancia, larespuestafisiológica que se desencadenaráa continuaciónponiendoen marchamecanismosmuy diferentes(Vogel, 1987).

Ante la apariciónde un estimulo imprevisto,se produceuna reaccióninicialde alarma que, asociadaa las formas de estrés agudo, intentaré recobrar lahomeostasisoriginal y consistirá en la activación de funciones nerviosas yneuroendocrinasde acción inmediata.Pero,si e! estímulopersisteenel tiempo, unnuevoequilibrio biológico de adaptacióna la recientesituaciónseestablecerá,parapermitir la supervivenciadel individuo (Selye, 1976), lo que coincide con la fasederesistenciadel SíndromeGeneral de Adaptacióndescrito por Selye, asociadoaformasde estrésdenominadascrónicasy caracterizadopor unaaccióna largoplazollevadaa cabopor la activacióndel sistemaendocrino.

En cualquier caso, el motor que dará lugar a la sucesiónde los distintosmecanismosdescritosante la presenciadel estímuloestresanteseráuna activacióndel sistemanerviosocentral(SNC). El sustratobioquímicode esaactivaciónno seconoce con exactitud hastael momento, pero pareceque existe una evidenteimplicaciónde los sistemascatecolaminérgicoscentralesy se han descritocambiosen el metabolismode todas las aminascerebralesasociadosa la reacciónfrente alestrés(Hedgey cols., 1976; Richardsony cols., 1990).

1.21. Activación del sistemasimpatoadrenal

La activación del sistemasimpatoadrenales la primera reacción que tienelugar tanto ante la aplicación de un estrés agudo y puntual (siendo la únicarespuesta)como anteun estrésmásprolongadoen el tiempo.

Dicha respuestaes debidaa una estimulaciónsimpáticageneralizaday a lasimultánea liberación al torrente circulatorio desde el tejido cromafín decatecolaminasmeduloadrenales,NA y AD, cuyaacción,siendosemejantea la de laNA liberada de los terminalessimpáticos,es másexiguadadasu cortavida media(Natelsony cols., 1987; McCartyy cols., 1990).

Algunas de sus manifestacionesmássignificativas son el aumentodel tonovasomotory de la frecuenciacardiaca,el incrementode la capacidadrespiratoria,la erecciónpilosa y sudoración,reducciónde la secreciónsalivar, aumentode lasecrecióny motilidad gástricay de la actividaddel sistemainmune,

4

1.2L Activación del eje hipotéiano-hipóflsis-adrenal

La activacióndeleje hipotálamo-hipófisis-adrenal(HHA) (Selye, 1937)esunsucesoligado a la aplicaciónde cualquierforma deestrés,a excepciónde aquellasagudasy muy puntualesen las quela únicarespuestaqueseoriginaesla activacióndel sistemasimpatoadrenalqueha sido descritaen el apartadoanterior,y conduce,en último término, a un aumentode la secreciónde glucocorticoides(GC) de lacortezaadrenal(Armario y cols., 1981; Smythey cols., 1983).

Las accionesdirectasprovocadaspor la activación de este eje, reflejo endefinitiva del incrementode los niveles de GC circulantes,son entre otras ladisminución de las respuestasinflamatoriase inmunológicas,de la producciónhipofisariade CH y TSRy susefectossobreel crecimientoy el metabolismo,de laactividaddel eje hipotálamo-hipófisis-gonadaly alteracionesen el pesoe ingesta.

El procesose inicia a nivel del hipotálamo,regióncerebralquejuegaun papelcrítico en la coordinación de las respuestas autónomas, endocrinas ycomportanientalesque mantienenla homeostásisdel medio interno (Morgane yPanksepp,1980).En concreto,en la división parvocelulardel núcleoparaventriculardonde existenneuronasque sintetizan el factor de liberación de corticotropina(CRF) (Swanson y Sawchenko,1983), que es liberado a la sangreportal paraaumentarla secreciónen la adenohipófisisde corticotropina(ACTH), responsable,a su vez, de la estimulación de la secreción de GC (cortisol en humanosycorticosteronaen rata)por la cortezaadrenal(Axerold y Reisine, 1984).

Estesistemaseautocontrolapor un mecanismoderetroalimentaciónnegativade modo que, cuando los niveles de GO son elevados, ellos mismos inhibensimultáneamentela liberaciónde CRF y ACTH (Keller-Woody Dalíman, 1984) e,incluso, de catecolaminascerebraJes(Rivier y Plotsky, 1986).

Tambiénsehapropuestoquelas catecolaminasde las terminalessimpáticasy de la médula adrenalpodríanestimular la secreciónde CRF al accedera lascélulas secretorasparvocelulareshipotalámicas(Plostky y cols., 1989) e, incluso,pareceser quediferenteshormonasy neuropéptidosparticiparíanen la regulaciónde la liberacióntanto de CRF comode ACTH.

Portanto,el estrésestimuladiversasrespuestashormonalescomo: la secreciónde catecolaminasdesdela médulaadrenal,ACTH de la adenohipófisisy CC de lacorteza adrenal; y la regulación de estas hormonasestá sujeta a numerosasinteraccionesque parecendeterminarlas complejasrespuestasfisiológicasque sedesencadenanante la variedadde estímulosestresantes.

5

1.3. MODELOSEXPERIMENTALESDE ESTRES

Exiten numerososagentes capacesde generar estrés en el animal delaboratorio, lo que permite encontrar una amplia variedad de modelosexperimentalescuya elección, sin embargo,deberá estar condicionadapor lascaracterísticaspeculiaresdel modelo a elegiren relacióncon la finalidad perseguidaen la investigación.

A pesarde quelos modelosanimalesson unaherramientamuy útil paraelinvestigador,parecenecesarioseñalaralgunade las limitacionesquesubyacena suutilización si se tiene encuentaqueel fin último esobtenerresultadosextrapolablesal ser humano:en primer lugar, la difícil similitud entrela situacióna la que se vesometidoel ser humanoy a la quese someteal animalen el modeloexperimentaly, en segundo lugar, el tiempo de exposición al agenteestresante,que esnormalmentesuperioren el caso de los humanos.

La clasificaciónde los modelosdeestrésexperimentalesesbastantecomplejadado quelos criterios quese siguenno son siempreexcluyentes.Tradicionalmentese hanclasificadoen estrésfísico, como la inmobilización (Brodiey Hanson,196V),nataciónforzada(McCarty, 1985), exposiciónal frío (Inabay cols., 1981) o choqueeléctrico(Bliss y cols., 1968) y estréspsíquico o emocional,como el hacinamiento(Armario y cols., 1984), la deprivación social (Gardiner y Bennett, 1977) o laestimulaciónaudiovisual(Galenoy cols., 1984).Entre ambascategoriasexistenotrosmodelosresultadode la combinaciónde los anteriores(Senayy Levine, 1967).

Teniendoen cuentala duracióndelestímuloaversivo,y sin excluir la divisiónantesmencionada,sedenominaestrésanudoa aquellostratamientosqueseaplicanunasolavez a los sujetosde forma máso menospuntual,y a~nirn a aquellosqueafectan de manera más prolongada, de modo intermitente o continuado,conociendoseentre ambascategoriasnumerosasformas intermediasdifíciles declasificar.

Por último, y segúnla capacidadde control que el individuo puedaejercersobre el estrésal que essometido,se definen situacionesde estrés£QnIrQ1nbk~ elnnzdabka y, atendiendoa la capacidadde evitación del daño, encontramosmodelos de estrésescapableso evitables en contraposicióna los denominadosinescapableso inevitables

,

6

13.1. Seleccióne interés del modelode depilvación social

En la elaboracióndelpresentetrabajoseha escogidocomomodelo deestrésla deprivaciónsocial en la rata (Qardinery Bennet,1977).

Losroedoressonanimalesdemarcadocaráctersocial,conun comportamientorespectoal control de su territorio semejanteal observadoenprimates(Brain,1985)lo que hace que el desarraigode su grupo origine alteracionesconductuales,fisiológicas y bioquímicaspropiasde la respuestaal estrés.

La utilización de este modelo de estrésposibilita ademásla aplicaciónhomogéneadel estimuloa todos los individuosy al tenercaráctermoderado,cuyocomponenteesencia)espsicológico,permitecompararlocon situacionesde estrésqueafectanal ser humano.

Dado que en la actualidad se ha consolidado la idea de que eldesencadenamientode la hipertensiónesencialesconsecuenciade una disfunciónneurogénicay que dicha alteración puede ser ocasionadapor la exposicióndelorganismoa estímulosambientalesde carácter aversivo, considerandoel estrésmental comoel candidatomásprobablepara desencadenareste tipo de respuestahipertensiva(Harriet y Dustan,1987), la deprivaciónsocial resultaser doblementeinteresantepuestoque es al mismo tiempo modelo de estrésy de hipertensiónexperimental.

2. HIPERTENSION

La hipertensiónarterialesuna de las patologíasde mayor relevanciaen lassociedadesdesarrolladas,constituyendoel principal factor de riesgode numerosasenfermedadescardiovascularescomoel infarto de miocardio,la insuficienciarenal,la ateroesclerosisy los accidentescerebrovasculares.Estasconsecuenciashacenquetengauna extraordinariaincidenciasobre la morbilidad y mortalidaden los paisesoccidentales(Langford, 1986).

7

De acuerdocon los criteriosestablecidospor la OMS (1978) se consideralimite máximo depresiónnormalen humanoslos valoresde 140y 90 mm Hg parala presiónarterialsistólicay diastólicarespectivamente,mientrasque seconceptúacomo hipertensiónpropiamentedicha a los valores de presión arterial sistólicasituadospor encima de los 160 mm Hg y de los 95 mm Hg de diastólica. Ladenominadahipertensiónttborderlinell(enel límite) sesituaríaenvaloresde presiónsistólicay diastólicaintermediosa los anteriores.

Losindividuosconpresiónarterial(PA) elevadano representan,sin embargo,una poblaciónhomogénea.La hipertensiónpuedeser el resultadode etiologíasdisparesy, así, de mecanismosfisiopatológicosdiferentes.Cuando la causaqueorigina la elevaciónde la PA estábien identificadase denominaa la hipertensiónsecundariamientras que, si esa causa primaria es desconocida,se diagnosticahipertensiónprimariao esencial(HE), grupo al quecorrespondenmásdel90 % dela poblaciónhipertensaglobal.

2.1. HIPERTENSIONESENCIAL: ETIOPATOCENESIS

La etiologíade la HE continuasiendoun enigma.Una de las dificultadesparaidentificar el mecanismoanómaloresponsablede esahipertensiónesla lentitud enel desarrollodel desorden,normalmenteaños,quecontrastamarcadamentecon lamayoríade lascausaspotenciales(disfuncióndelsistemanerviososimpático,cambiosen la distribución de electrolitosentrelos compartimentoscorporaleso actividadalterada de hormonas presoras o depresoras),que actuarían rápidamente,provocandocambiosen la homeostasiscardiovascularen un períodode días.

Al mismo tiempo,debido a la complejidadde los circuitosqueparticipanenla regulaciónde la PA, esposible queno seaun único factor el involucradoen elorigen de la anomalíay éstoha permitidogenerardiversashipótesisqueimplican laacción de diferentes mecanismos,no excluyentes entre si, que interviniendolentamente,amplificaríansus acciones y conduciríanno sólo al desarrollosinotambiénal mantenimientode la hipertensión.

Es muy probable,además,que los sistemasactivadosen la faseinicial de lahipertensióndifieran de aquellos queactúenen una faseposterior,cuandola PAelevadaestá definitivamenteestablecida.Así se asentaríala hipótesisde que uncomponentecentral o neurogénicosería el responsablede la inducción de lahipertensión,mientras que el mantenimientode la misma residiría en factoresperiféricosqueoperaríana nivel vascular(Connel!,1986).

8

Alteracioneshemodinámicasen la hipertensiónesencial

Comola PA vienedeterminadapor el gastocardíacoy la resistenciaperiféricatotal, esevidentequela HE será resultadode una anomalíaen una o en las dosvariablesconsideradas,

En algunos casos,durantee! desarrolloinicial de la hipertensión,el perfilhemodinámicode los pacientesse correspondecon un gastocardíacomuy elevadoy una resistenciavascularqueno aparecealterada(Julius y cols., 1971); mientrasque, cuando la hipertensión parece estar establecida,el perfil se modificanormalizandoseel gastocardíacoe incrementandosela resistenciaperiférica total(Weiss y cols., 1978). Una evolución similar en el patrón hemodinámicose hademostradoen ratasespontáneamentehipertensas(Pfeffer y cols., 1974) y enotrosanimalesde laboratorioen el cursodel desarrollode hipertensiónrenal(Bianchi ycols., 1970).

Sin embargo,no todos los individuos que desarrollanHE se ajustan a laevolución hemodinámicadescrita anteriormente(Hoffman y cols., 1981) y, enhumanosy enanimalesdeexperimentación,existencasosdonde,sin alteracionesdelgastocardíaco,la elevaciónde la PA se desarrollaa la mismavelocidady con lamismaseveridad(Pfeffer y cols., 1977).

Mecanismospatofisiolóaicosen la hipertensiónesencial

Con todaprobabilidad,la HE estansolo un desordenhomogéneoen cuantoa su manifestaciónclínica. De ahí que, como se ha citado previamente,se hayansugeridovariasposiblesrutas,conconsiderablespasosencomún,quepuedeninclusosolaparse,paraexplicarel inicio y desarrollode la enfermedad.

Una de las causaspotencialesde la HE podríaserunahiperactividaddel SNCqueconduciríaa un estadohiperadrenérgicoconsecuenciadel cual, tanto el gastocardíacocomola resistenciaperiféricatotal, severíanincrementadosprovocandounaumentode la PA. Existennumerosasevidenciasqueindican un estadohiperactivodel tono simpáticovasomotoren los primerosestadiosde la HE y en muchosdeellos se muestrasimultáneamenteun incrementode la frecuenciacardíacay de lacontractilidadmiocárdica(Ibrahim y cols., 1974).

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9

El hechode haberseencontradoen numerosospacienteshipertensosniveleselevados de catecolaminasplasmáticas(Goldstein, 1983), sucesoestrechamenteligado con unahiperactividadnerviosasimpática,o el que los agentesbloqueantesadrenérgicosseande los másefectivosen el tratamientode la hipertensiónarterial(Frolich, 1974) son indicios de que un mecanismoneural puede jugar un papelimportanteen el desarrollodel desorden,

La hiperactividadneural adrenérgicaaumentael gastocardíaco,la actividadde reninaplasmáticay produceconstriccióndelasarteriolasrenalesinterfiriendoconla actividadnatriurética(Hollenbergy cols., 1981).Cadauno deestosfactoresjuegaun papel importanteen otros conceptosde la patogénesisde la HE que serándescritosa continuación.

Numerosashipótesisasumencomosucesoinicial en la HE unadisfunciónenla excreciónrenalde Na~,provocandoun aumentodel volúmensanguíneo,delgastocardíacoy, consecuentemente,de la PA (Cuytony cols., 1972; Guyton,1986). Pero,al mismo tiempo,al alterarseel volumen sanguíneosemodifica la perfusióntisulary, puestoque los tejidos tienen la capacidadintrínsecade regularel flujo variandola resistenciaarteriolar, su autorregulaciónconduciría a un incrementode laresistenciaperiférica total lo que aumentaríaaúnmásla presiónsanguínea.

Recientementese ha propuestootro mecanismopara explicar como laretenciónde Na~ por una disfunción renal podría conducir a la hipertensiónsinimplicar procesosde autorregulaciónperiférica(De Wardenery cols., 1981).

La alteraciónde la excreciónrenal de Na~ aumentala secrecióndeL factornatriurético atrial que, al inhibir el transporte activo de Na~, promoveríaunaalteracióndel contenidocatiónicointracelular(aumentandoel Na~y disminuyendoel K~). El mecanismopor el cual esta perburbaciónes capazde provocar unincrementodela vasoconstricciónsedesconocepor el momento:una posibilidadesque el cambio en la distribución de K~ origine una depolarizaciónparcial de lamembrana.Alternativamente,Blaustein (1984) ha sugeridoque la activacióndelintercambiadorNa~/Ca2~ aumentaríael Ca2~ intracelular, lo que induciría unaumentode la contractilidaddel músculoliso vascular>de la constricciónarteriolar,de la resistenciaperiféricay de la PA.

Algunosautoreshansugeridoquelos cambiosestructuralesenla musculaturalisa vascular,consecuenciade la hipertensióny presentesenmodelosanimalesy enhumanos,podríanservir demecanismode amplificaciónpermitiendounasostenidaelevaciónde la presión(Folkow, 1977).

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Ampliando la hipótesisanterior,sehaseñaladoquela causade la hipertrofiavascularpodríaencontrarseenunaregulaciónanómaladel crecimientocelularporfactoresendocrinos,paracrinoso autocrinosy, de estamanera,pareceser que lainsulina o la hormona del crecimiento pueden provocar un aumento de lareabsorciónrenalde Na~, incrementandoa suvez el gastocardiacoy la resistenciavascularperiférica. Por otro lado, esa disfunción del crecimientocelular tambiénpodríaserel origende la hipertrofiacardíacapresenteennumerosossujetosconHE(Connell, 1986).

El eje renina-angiotensina-aldosteronaregula el balancede Na~ y K~ y laactividadpresora,factoresimportantesenel mantenimientode la homeostasisde laPA, habiendosediscutido su papel como origen de algunoscasos de HE. Lasinterrelacionesdel eje conlos otrossistemasdecontrol hacendifícil definir si setratade la causaprincipal o sencillamentede un efectoocasionadopor algún otro de losposiblesmecanismospatogénicosbásicos.A pesarde todo, esun hechocontrastadoque los pacienteshipertensosque coinciden con una elevadaactividad de reninaplasmática suelen desarrollar la enfermedad de forma más severa, concomplicacionescardiovascularesimportantes(Kaplan, 1975).

De lo anteriormentedescritose desprendeque existennumerosashipótesisparaexplicar la HE, quepuedenno ser contradicitoriasentresi. Cabríaseñalarquetodas ellas tratan de definir el conceptode hipertensión como el desarrolloymantenimientode un lento aumentode la PA, producidopor diferentescausasprimarias como la disminuciónde la excreciónrenal de Na~ o la disfunción delsistemanerviososimpático.

2.2. HIPERTENSIONPROVOCADA POR ESTRES

Fue Seley,en 1946,el primeroen reconocerlas consecuenciasperjudicialesdeuna activación crónica de la repuestaal estrásal definir “las enfermedadesdeadaptación”.

La respuestabiológica al estrás incluye una activación del eje HHA conparticipación del sistema nervioso simpático y del sistema inmunitario, quedeterminanuna liberaciónmultihormonal,siendodifícil de precisara partir de quémomentoes excesivay nociva para el organismo(Va]des y Flores, 1985). Se handemostradoasociacionesentreel estrásy una ampliavariedadde patologíasen eladulto,en el niño y en el adolescente(Canalda,1988),desdela psiquiátricahastalacardiovascular,infecciosa,inmunitaria,neoplásica,digestiva,etc,,y tambiénsobresuinfluenciaen la evoluciónde variasenfermedadescrónicascomola diabetes.

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Durantelos últimos añosse ha consolidadola ideade queel estrásmentalyambientalescapazdeproducirunaelevaciónde la PAvíamecanismosneurogénicosu hormonalesque dependendel SNC, hecho que está apoyado por distintasobservaciones:(1) una amplia gama de intervencionesambientales,tales comoestímulosaversivos,situacionesconflictivaso estrásmental,provocanun aumentodela PA, queenalgunoscasossemantieneenel tiempo;(2) pacientesconhipertensiónarterial presentanuna hiperrespuestaal estrás; (3) algunospacienteshipertensosmuestranseñalesde un estadohipersimpáticoal menosen los primerosestadiosdela enfermedad(Brody y cols., 1987, Julius y Johnson,1985).

Pareceno existir ningunadudadequeel estréspuedeprovocaruna elevaciónde la PA. Sin embargo,la controversiasurge al intentarestablecersi ese estrásescapaztambiénde mantenerdicha elevación.

En el campode la experimentaciónanimal, la hipertensiónsuelepresentaruncarácterlábil y desapareceral ausentarseel estimulo estresanteque la originaba,siendola excepciónde la regla los casos en los que la elevación de la PA semantieneen el tiempo. Los estudiosde Henry (1982), con un modelobasadoen lalucha por la posesiónde un congénerede distinto sexo en ratones,o de Forsyth(1969),conunmodelodecondicionamientoaversivoenmonos,apoyanla afirmaciónanterior.

En cuantoa los modelosde estrásfísico, a pesarde incrementarsela presión,nuevamenteéstase normalizaal cesarla sesión de estimulacióndiaria. En estesentido, se encuentran los resultados de Saavedra (1982) en estrás porinmovilización, de Censary cols. (1974)enestráspor frío o de Iomori y cols. (1982)trasaplicar un shocken las patasdel animal.

Los datosen humanos,desafortunadamente,son aúnmásdesconcertantes.Engran medida]a dificultad reside en la susceptibilidadindividual, másacusadaen elhombreque en los animales,quepermiteestablecernotablesdiferenciasentrelosindividuoshipertensoscorrespondientesa un mismo grupo, tal y como manifiestaGiaconiy cols. (1987)en susinvestigacionescon pacienteshipertensos“borderline”.

Otro factor de extraordinariaimportanciaesla escasezde estudiosa largoplazo, dondesea posible registrar la evolución de la hipertensióncon objeto deestableceruna correlaciónentreaquállay el impactode los factorespsicosocialesyambientalesenel transcursodel desarrollode la enfermedad(Langewitzy Rúddel,1987). Y

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Podemosencontraren la literaturaabundantesobservacionesdondeseapreciaunaelevaciónde la PA trás la exposicióna situacionesestresantesen el hombre,comoen el casode las tropasdurantelos combatesactivos, si bien pareceque lapresión se restablececuandoel soldadoregresadel campode batalla (Graham,1945). Por otro lado, es tambiénnotable la incidencia de hipertensiónentre loscontroladoresaéreos(Cobb y Rose,1973) o en trabajadoresexpuestosa ruidosintensosde maneraprolongada(Delin, 1984),así comoen individuossometidosafuertestensionesen su puestode trabajo(Siegrist, 1987).

En otro sentido,es interesanteresaltar la correlaciónexistente entre lahipertensióninducidapor estrásy determinadosfactoresdepredisposicióncomo losgenéticos (Falkner y cols., 1979), la ingestade sal (Falknery cols., 1981) o ladisminución de la función renal (Brody y cols., 1987) tanto en humanoscomo enmodelosexperimentalesanimales(Lundiny Thoren,1982; Sanders,1988).

En conclusión, los datos existenteshasta la fecha apoyan la hipótesismultifactorial de la HE basandoseen lasescasasevidenciasquese conocensobreelhechode queel estrásproduzcauna hipertensiónmantenida,si bién no hay dudade su accióndirectaen la inducciónde la elevaciónde la PA. Al mismo tiempo, sesugiere que ciertos factores de predisposiciónparecenser necesariospara laexpresiónde la hipertensiónproducidapor estrástanto en el humano,comoen elanimal de experimentación.

3. SISTEMA CATE~OLJ~MJ14ERGI~O

El estudio de las catecolaniinasen el SNC se ha visto facilitado por eldesarrollode diferentesmétodosquehan permitidosu deteccióny estimación.Noobstante, las dificultades han surgido al intentar esclarecerla función y lafarmacologíade estossistemasdeneurotransmisión,debidoa queel análisisdependesiempre de la disponibilidad de fármacos que incidan sobre su actividadespecíficamente,impidiendounacombinacióndeefectoscentralesy periféricosqueenmascarensu verdaderomecanismode acción,

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El cerebro contiene sistemas neuronales separadosque utilizan trescatecolaminas:NA, AD y dopamina (DA). Cada sistema es anatómicamentediferentey presumiblementetiene funcionestambiéndiferentes.Sin embargo,sipueden señalarse algunas características comunes a todas las neuronascatecolaminérgicas:(1) sus axonespartende cuerposcelularesque se localizanenpequeñosnúcleosconstituidospor unoscuantoscentenaresde neuronas;(2) esosaxones se ramifican extensamentepara inervar numerosasregiones del SNC,distantesde los núcleosde origeny (3) producenuna mezclade efectosexcitatoriose inhibitorios quegeneralmenteimplican a segundosmensajeros.

La localizacióndelos diferentesgruposcelularescatecolaminérgicos,asícomode susproyeccionesy las regionesdel SNC queéstasinervanserádetalladaen elcapitulosiguiente.

3.1. ASPECTOSGENERALES DE LA SíNTESIS,LIBERACION EINACTIVACION DE LAS CATECOLAMINAS

La rutabiosintética,comúna las tres catecolaminas,estáconstituidapor unasecuenciade reaccionesenzimáticasquetienenlugar en el terminal nerviosoy queseinician con la captacióndel aminoácidotirosina,presenteen la circulación(Fig.1).

Las enzimasqueintervienenen esteprocesoson transportadasdesdeel somaneuronal,dondese sintetizan,al terminal axónico.La tirosinahidroxilasa(TH) eslaenzimainicia! de la ruta biosintéticay catalizala conversiónde tirosinaen L-DOPA,siendoésteel pasolimitante de la velocidaddelproceso,utilizandoseconfrecuenciacomomarcadorde la síntesisde las tresaminasen general (Plotsky y cols., 1989).

El segundopasoen la cascadaenzimáticaes la transformaciónde L-DOPAen DA graciasa la intervenciónde la DOPA descarboxilasa.Peroaún serequierela presenciade otras dos enzimas para completar el proceso biosintético: ladopaminabeta-hidroxilasay la feniletanolamina-N-metiltransferasa(PNMT), quecatalizanel pasode DA a NA y de NA a AD, respectivamente.

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Fig. 1.- Síntesisenzimáticade las catecolaminas

La regulaciónde la síntesisde catecolaminasdepende,principalmente,de laactividad de la TH. A largo plazo, el proceso de regulaciónse asocia a unaalteraciónde la síntesisdel enzima.A corto plazoestáasociadoa unamodificaciónde la actividadde las moléculasdel enzimaya existente.En el procesoregulatoriointervienen los mismos productos finales (catecolaminas)que actúan comoinhibidores competitivosdel cofactor pterina en el sitio activo de la TH, o bienoxidandoa la propiapterinae impidiendola formación del enzimaactivo (Weinery cols., 1972).

En conclusión,las propiascatecolaminasparecenpoderregularla actividadde la TH como respuestaa alteracionesen los nivelesintraneuronalesde aquellas.Así, estos mecanismosserían los responsablesde que, cuandose produce unaumentode la actividad de las neuronascatecolaminérgicas,los nivelesendógenosdel neurotransmisorsemantenganconstantes,apesarde la pérdidadelmismo que,seasume,ocurre duranteel aumentode la liberación.Dicha situaciónhomeostáticaes posiblepor el incrementode la actividadde la enzima,quepermitemantenerunttp0011’ constantedel neurotransmisor,aúncuandoseverifiquencambiossustancialesen la utilización de las catecolaminas,

El mecanismode liberaciónde catecolamínasa nivel centralno seconoceenprofundidad,aunqueparecetratarsede un procesodependientede Ca

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La concentraciónlocal de las mismascatecolaminasen la sinapsisregulasupropia liberaciónmediante la interaccióncon los receptoresalfa-2 presinápticos(Langer,1981) pero, además,existennumerosasevidenciasque demuestrancomodiferentesneurotransmisoresy neuropéptidospodríantambiénmodularla liberacióncatecolaminérgicaa nivel central(Schoffelmeery cols., 1988).

La inactivaciónde las aminasbiógenas(Fig. 2) se lleva a cabomediante:(1)la recaptaciónfacilitadaporlas neuronasy célulasglialescircundantesa la hendidurasináptica (Iversen, 1978) y (2) la metabolizaciónenzimática dependientede lamonoaminooxidasa(MAO) y de la catecol-O-metiltransferasa(COMT) (Cooperycols., 1986).

La MAO se localiza fundamentalmenteen la membranamitocondrialy es laqueconvierte las catecolaminasen sus correspondientesaldehídos.Por su parte laCOMT, muchomásabundanteen el SNC, pareceactuarpreferentementea nivelextraneuronal,estandounida a la membranaplasmáticay esla responsablede laformación de los metabolitosmetilados.

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Fig. 2.- Metabolismode las catecolaminas

La participaciónmayoritariaen el metabolismocentral de las catecolaminascorrespondea la COMT, como se deducedel hecho de que la proporción demetabolitosmetiladosenel SNC esligeramentesuperioral resto de los mismos.

El principal metabolitode la NA y AD en el SNC es el 3-metoxi-4-hidroxi-feniletilenglicol (MHPG), mientrasque en la periferia lo es el ácido 3-metoxi-4-hidroxi-mandélico, también denominado vainillil mandélico (VMA). Al mismotiempo,existendiferenciasacusadasen cuantoa la forma químicaque presentaelMHPG en las diversasespeciesanimales:en rata aparececonjugadoen forma desulfato casi en su totalidad, en ratón y en primates predomina la forma libre(Elsworthy cols., 1983).

Aunqueel MHPQ esmetabolitocomúna lasdos catecolaminas,seconsideramarcadorexclusivode la actividadcentralnoradrenérgicadadoquesólounafracciónmuy pequeñade MHPG en el cerebrocorrespondea la actividad de neuronasadrenérgicas,hecho que estáde acuerdocon su menor concentracióncerebral(Kopin, 1985).

Los metabolitosde DA en el SNC son los ácidos homovanílico (HVA) ydihidroxifenilacético (DOPAC). El primero de ellos se utiliza como índice de laactividadfuncional de las neuronasdopaminérgicasen primates.Sin embargo,sehademostradoqueen el caso de la rata es el segundometabolito el marcadormásprecisode la actividad del neurotransmísor(Kopin, 1985).

Es interesantehacer incapie en el concepto del término velocidad der~nDyani~n, medianteel cual se define el ritmo al que un neurotransmisoralmacenadoen un tejido es reemplazado.Portanto, esreflejo de la sumaconjuntadelos procesosdebiosíntesis,liberacióny degradacióny, consecuentemente,describeel estadofuncional y la actividadde las neuronasenunapoblacióndeterminada.Seconsidera que dicho parámetro esté sintonizado con el grado de actividadbioeléctricaneuronal.

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3.2. RECEPTORESCATECOLAMINERGICOSY MECANISMO DE ACCION

Receptoresadrenérgicos

En 1948, Ahlquist fue el primero en distinguir dos tipos de receptoresadrenérgicosperiféricos a los que denominó alfa y beta, los cuales han sidoposteriormentesubdivididosen alfa-1, alfa-2, beta-1y beta-2.

Los receptores alfa-1 median la mayoría de los efectos excitatoriospostsinápticosde las catecolaminasy su estimulación provoca la formación deinositol-1,4,5-trifosfatoen relación íntima,y quiza causal,con la liberaciónde Ca24de las reservasintracelulares.Sin embargo, los receptoresalfa-2, consideradosclasicamentemediadoresde la inhibición presináptica,estanligados a la adenilatociclasay, a su vez, al AMPc comosegundomensajero.

Los receptoresbeta-1 se localizan preferentementeen el corazón y suestimulaciónprovoca un efectocardioexcitatorio.Por el contrario, los receptoresbeta-2sueleninterveniren respuestasinhibitorias.En amboscasosel sistemaefectoracopladoal receptoresla adenilatociclasa,siendoel segundomensajeroel AMPc.

Estos cuatro subtiposhansido identificadosen diferentesregionesdel SNC.Estudios de fijación de radioligandosy de autorradiografíahan localizado losreceptoresalfa-1 principalmenteen áreasde la corteza,en el tálamoy enel núcleodorsaldel rafe y los receptoresalfa-2 en los cuerposcelularesnoradrenérgicosdellocus coeruleus(LC) y, también,en diferentesnúcleospontinosy bulbares,como elnúcleo del tracto solitario. Con relación a los receptoresbeta-1, éstos parecenencontrarsepreferentementeen la corteza,mientrasquelos beta-2se disponenenel cerebelo (Uprichardy cols., 1980; Palacios,1984).

En cuantoal papelfuncional de esosreceptores>continúasiendodesconocidoen muchos casos.Los adrenoceptoresalfa-2 son el blanco de acciónde fármacosantihipertensivosclásicoscomo la clonidina o alfa-metildopa,que operana nivelcentral.La estimulación(probablementepostsináptica)dedichosreceptorespor losagonistasantesmencionadosinduciría, vía activaciónde una neuronainhibitoriabulboespinal,una reduccióndel tono simpático periférico, reduciendola PA y lafrecuenciacardíaca.Estepareceserel mecanismodeacciónde los antihipertensivosde accióncentral(Van Zwieten, 1988).

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Los receptoresalfa-1 podrían relacionarsecon el reflejo barorreceptor,deprimiendosu actividad, tal y como sugierenHuchet y cols. (1981, 1982). Estefenómenoexplicaríacomo el prazosín,un bloqueantealfa-1 adrenérgíco,causaunreflejo taquicárdicomuchomenordel esperadodadasu actividadvasodilatadora.

Receptoresdopaminérgicos

Los receptoresdopaminérgicosse clasifican, al menos,en dos subtiposque

fueron denominadosDl y D2 por Kebabiany CaIne (1979).El receptorDl está asociadoa la activación de la adenilato ciclasa y la

formaciónintracelularde AMPc mientrasque algunosautoreshan sugeridoque elreceptorD2, queenprincipioseconsideróindependientede la enzima,pudieraestarasociado negativamentea ella. No obstante,es probable que éste no sea sumecanismode acción(Kelly y Nahorski,1986).

En cuanto a su localización en el SNC, los receptoresDl se sitúanpreferentementeen los cuerposcelularesdel estriadomientrasque los receptoresD2 se disponentanto sobre e] soma de neuronasestriatalescomo sobre lasterminalesde célulasnerviosasqueproyectana estaestructuracerebral.Asimismo,receptoresD2 han sidoidentificadosen cuerposcelularesde la sustancianigra y,también,enotraszonasdel SNC, comoen el hipotálamoy el septum(Crossy Owen,1989).

La importanciade la DA comoneurotransmisorcentralradicaenel papelqueparecedesempeñaren ciertos desórdenesneuropsiquiátricosy , por tanto, en laaplicaciónclínica de agonistaso antagonistasdopaminérgicosen la enfermedaddeParkinson,Huntington o en la esquizofrenia.Sin embargo,la manipulaciónde lossistemasdopaminérgicoscentralesocasionatan solo una mejoría temporalen lasintomatología,lo quepermitepensarquetal vez otros neurotransmisorespodríanestaradicionalmenteimplicados en la patofisiologíade los anterioresdesórdenes.

Una de las principalesdificultadesresideen la escasainformación que seposeesobre el papel fisiológico que desempeñanlos receptoresdopaminérgicos,particularmentepara los receptoresDl.

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Los receptores estriatales D2 inhiben la liberación de acetilcolina,presumiblementepor unaaccióndirectasobre las neuronascolinérgicasestriatales.Al mismo tiempo,parecequeestosmismosreceptorespuedenmodulartambiénlaliberación de glutamato, e incluso, de colecistoquininaen el estriado. En elhipotálamo los receptoresD2 modularíanla liberación de beta-endorfinay deprolactina,y enel septumla actividadde neuronascolinérgicascon proyeccionesalhipocampo(Stoofy Kebabian,1984).

En conclusión,podemosafirmar quees necesariocontinuarla investigaciónen profundidadcon el fin de conseguirunamayor informaciónsobre la función yfarmacologíade estossistemasde neurotransmisiónparaasípoderobteneragentesterapéuticosmáseficacesy seguros.

4. REGULXCION DEL SISTEMACARDIOVASCUI~AR

El sistemacirculatorio comprendelos mecanismosprincipalesde regulaciónhomeostáticaque mantienen el equilibrio entre el aporte metabólico y lasnecesidadesmetabólicastisulares.Seencuentraenrelacióníntimaconotrossistemas:respiratorio, renal, nervioso y endocrino, que intervienen en el mismo procesoregulatorio;por ello, los mecanismosreguladoresde la PAson complejosy resultande la integraciónde varioscircuitosqueactúansimultáneamentey cuyo objetivo esmantenerla constanciafrente a las variacionesque puedasufrir el organismoporperturbacionesinternaso externas.

El estudio de los mecanismos reguladores debe incluir tres circuitosfundamentales:hemodinámico,metabólicoy plasmático.El circuito hemodinámicocomprendela trilogía,gastocardíaco-resistenciavascular-presiónarterial,siendoesteúltimo factor detectadopor los barorreceptores.Desde allí la información setransmitey elaboracentralmente(bulboy médula)y la respuestaefectoratienelugara nivel cardíacoy vascular.

El circuitometabólicoestáligadoa las necesidadestisularesrepresentadasporel intercambio02-C02,cuya perturbaciónes detectadapor los quimiorreceptores.La respuestaa la informacióneslocal o general,con intervencióndel hipotálamo,bulbo y médula y la respuestaefectoraes, por tanto, también local o general,participandopulmón,corazóny vasos,siendolos dos últimos puntosde enlaceconel circuito anterior.

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El volumen sanguíneodependedel equilibrio entreel aportede aguay sueliminación,determinandola presiónvenosaquees factor de enlacecon el circuitohemodinámico.Son en estecaso los osmo- y volorreceptoreslos encargadosdedetectarla perturbacióncuya información,elaboradaen el hipótalamo,provocalarespuestaefectorapor el riñón.

Los dos objetivosprincipalesde la regulaciónde la circulación sanguíneasonel mantenimientode la PA y el control del flujo sanguíneopara mantenerelmetabolismotisulary la temperaturacorporaldentro deunoslímites adecuados.Yello lo consiguegraciasa la operaciónde mecanismosreguladoresextrínsecoseintrínsecos.Los controles intrínsecos son la regulación cardiaca, la regulaciónvascular local del flujo sanguíneoy la regulación del volumen sanguíneo.Loscontrolesextrínsecos,superpuestosa los anteriores,son los sistemasnervioso yendocrino.Por otraparte, esosmismossistemasreguladorespuedenser de acciónrápida(sistemanervioso),intermediao a largo plazo (sistemadecontrol del riñón).

4.1. SISTEMA NERVIOSOCENTRAL Y CONTROLCARDIOVASCULAR

El SNC representael punto de integración de todos los sistemasqueparticipanen el control cardiovasculary que han sido descritosen el apartadoanterior.De hecho,el SNC actúa integrandolos mecanismosreflejos, regulandoeltono simpáticode las neuronasque inervanlos vasossanguíneosy controlandolaliberaciónde hormonasvasoactivas,ademásde acoplarel sistemacardiovascularalos cambioscomportamentales(Ferrarioy cols., 1985).

Es, por tanto, la regulacióncentraldel sistemacardiovascularunade las máscomplejas del organismo: el SNC recibe información de diferentes puntos(consecuenciade la activaciónde baro-, quimio-, volo- y osmorreceptores)que sedistribuye ampliamentea través de una red de circuitos nerviosospor el cerebro(especialmenteafectandoa núcleospontinos, bulbarese hípotalámicos,así comoalgunasestructurasmásrostrales),desdedondeseenvíana su vez mensajesparaelcontrol de los órganos efectores (por ejemplo, vía neuronas eferentespreganglionaresdel sistemaautónomolocalizadasen el bulboraquídeoy la médulaespinal).

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El factor responsabledel avanceenel estudiode la organizacióncentraldelcontrolcardiovascularhasidoel desarrollodelas técnicasneuroanatómicas,quehanpermitido evidenciar las conexionesentre las regiones cerebralesclaves para laregulaciónde la PA (Heimery Rodbards,1982).

El mantenimientotónico y reflejo de la PA dependede sistemascentralessituadosen la zona inferior del tronco cerebral,mientrasque la integraciónde loscambiosde la PA asociadosa modificacionesen el comportamientopareceresidiren regionescerebralesmásrostrales,en concretoregionesdel prosencéfalobasalydel sistemalimbico. Todosestoscentrosactúanconcertadamente(Reis y Ledoux,1987).

El arco reflejo cardiovascularoperaa travésde la activaciónde los baro- yquimiorreceptoreslocalizados en los senoscarotideosy en el cayado aórtico,recogiendoinformaciónsobreel gradodedistensiónde la paredvascularproducidapor la PA y el contenido de gasesde la sangre en un momento dado. Esainformación se canalizaa través del IX y X par craneal(glosofaríngeoy vago)efectuandosu primerasinapsisen la zona comisuraly mediadel núcleodel tractosolitario(NTS) (Onaiy cols,, 1987),dondeselocalizan neuronascatecolaminérgicascomolos gruposcelularesA2 noradrenérgicoy C2adrenérgico(Sumaly cols., 1983).Desde allí se emiten proyecciones que inervan a las neuronas eferentespreganglionaresautónomasdispuestasen el bulbo raquídeoy en la médulaespinal.

Peroaúnse puededistinguirun segundoarco reflejo, de mayorlongitud queel descritoanteriormente,dondelas proyeccionesde quimio- y barorreceptoresquehacenestaciónen el NTS se dirigen a diferentesestructurascerebrales,entreotras:la región ventrolateraldel bulbo raquídeo(centrovasomotory vasodepresor),elnúcleoparabraquial,el núcleoparaventriculardelhipotálamo,el núcleocentral dela amígdalay áreascorticales(cortezafrontal), todasellasa su vez interconectadas,de dondepartenlargasvíasdescendentesquealcanzanla médulaespinaly el bulboraquídeopara entrar en contactocon las neuronaseferentespreganglionaresdelsistemaautónomo.Existentambiéncolateralesquesonemitidasdesdeesasmismasvíasy queterminanen neuronaslocalizadasen el NTS (Palkovits, 1989).

En cualquiercasoesevidentela trascendenciadelNTS, quepodríafuncionarcomouna estaciónde reléen la regulacióncentralde mecanismosautónomostalescomoel cardiovascularo respiratorio.

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21

La respuestade la activacióndel arco reflejo cardiovascular(cualquieraqueseasu longitud) es ejecutada,en último término, por las neuronaspreganglionareseferentesquese localizanenel bulboraquídeoy en la médulaespinalEl origendelas fibras preganglionaressimpáticasestá localizadoenel núcleointermediolateralde la médulaespinale inervan el músculoliso vasculary el corazón.Por su parte,esteúltimo órganorecibetambiéninervaciónparasimpáticaa travésde los axonescardioinhibitoriosquesesitúanen dos nucleosbulbares,el núcleomotor dorsaldelvago y el núcleo ambiguo.

El mantenimientotónico de la PA resideen el denominadocentrovasomotorlocalizadoen el bulbo raquídeo.Su concepcióncomo un centroespecíficoy biencircunscritoqueregularala actividadtónicasimpáticaha sidoampliamentediscutida,sobretodoa raizdeldescubrimientodezonaspresorasdispuestasdifusamentey muypróximasa regionesantagónicasdepresoras(Brody, 1986).

El áreapresorasesitúa en la regiónrostral ventrolateraldel bulbo (RVLB);de hecho,lesioneselectrolíticaso químicasen esazonaprovocanunacaídade la PA(Granatay cols., 1985). La RVLB estáconstituidaprincipalmentepor el grupodeneuronasadrenérgicasCl y noradrenérgicasAS (Kalia y cols., 1985), pero tambiénincorporaneuronasno catecolaminérgicascomocélulasgabaérgicasy peptidérgicas(Palkovits,1988).Desdela RVLB seemitenaxonesqueinervanel núcleointermediolateral de la médulay allí hacensinapsisconlos cuerposcelularesde las neuronaspreganglionaressimpáticas.

Existe ciertacontroversiaa cercade si el neurotransmisorresponsablede laexcitaciónde las neuronasmedularesseríala adrenalinacorrespondientea neuronasdel grupoCl o bien cualquierotro transmisor,aúnno identificado,pertenecientealas muchasproyeccionesy células nerviosas,antesmencionadas,que se localizantambiénen la RVLB (Granata,1990).

El NTS recibeinervacióndesdeestecentroy, viceversa,neuronasdel NTSproyectana la RVLB y hacensinapsiscon las células adrenérgicasdel grupo Cl(Rossy cols., 1985).

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El áreadepresorase localiza en la región ventrolateralcaudal del bulboraquídeo (CVLB). Las acciones de las neuronas situadas en esta zona,principalmentenoradrenérgicasdel grupoAl, sonopuestasa las ocasionadasporlaactivaciónde la RVLB y, así, la estimulaciónde la CVLB produceunadisminucióndrástica de la PA (Imaizumi y cols., 1985).Pareceser que las accionesdepresorasinducidaspor la CVLB dependende la integridadde las neuronasCl dispuestasenla RVLB de modo queunavía, queseproyectaríadeAl a Cl (Rossy cols., 1985),sería la responsablede la disminuciónde la actividad de las neuronasdel núcleointermediolateralen la médulaespinaly, por tanto, del tonovasomotorsimpático.El centrovasodepresor,y en concretolas neuronasdel grupoAl, proyectatambiéna zonasmásrostrales,especialmenteal hipotálamo.

Existeotravía depresoraparalelaa la anteriordependiente,en estecaso,delreflejo barorreceptor.Ya se ha mencionadoque se conocen proyeccionesdesdezonas del NTS, donde terminan las aferencias de quimiorreceptores ybarorreceptores,que inervanel área Cl de la RVLB. Ese grupo de neuronasadrenérgicasejerceríasuaccióna travésde un control tónico de carácterinhibitorioy seríacrítico en la mediaciónde la respuestabarorrefleja.De acuerdocon ello seencuentranlos resultadosde Granatay cols, (1984> y Benarrochy cols. (1986)quienesobservaroncómo lesionesen esta zona bloqueabancompletamentelarespuestavasodepresorarefleja inducidapor estimulacióndel senocarotídeo.

En cuantoal hipotálamose trata de una región crítica en el SNC para laorquestaciónde las funcionessomáticas,autónomasy endocrinas,relacionandoloscontroleshumoral y nervioso de los procesoscorporales.El hipotálamoprovocarespuestascardiovascularesque forman parte de una constelaciónde efectosencuadradosdentrode las reaccionesdel organismoal estrésy a las emociones,

Son dos las zonas hipotalámicas con participación en la regulacióncardiovascular:el hipotálamoanterior,cuya estimulaciónproduceunadisminuciónde la PA (Hilton y Spyer,1971)y el hipotálamoposterior,decarácterpresor.Desdeestaúltima zona se emitenproyeccionesal bulbo raquídeoy al NTS (Spyer,1989).Además,poseeproyeccionesrecíprocasconla zonaCl bulbarquede allí sedirigenal núcleodorsalmotordelvagoy al núcleointermediolateralde la médulaespinal,indicandounaposibleaccióndirectahipotalámicasobrelasneuronaspreganglionaressimpáticas.

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No sólo el hipotálamosino tambiénla cortezacerebraly el sistemalímbicodesencadenanunaseriede efectoscirculatoriosantela amenazade un peligro o deunasituaciónemocionalintensae intervienenasíen los componentescirculatoriosde la reacción de defensa.Son numerososlos estudios que determinan lasinterconexionesexistentesentreestasregionesy, por ejemplo, el NTS (Grayy cols.,1986,Ruggieroy cols., 1987).A suvez,esasmismasestructurasestánconectadasconotras regionesque tienenproyeccionesdirectasconel bulbo raquídeoy la médulaespinal.

4.1.1. Sistemascatecolaminérgicasimplicadasenla regulacióndc la presiónarteria]

La importanciade las catecolaminascentralesen la regulacióncardiovascularseapoyaen el hechode quelas principalesáreascerebralescon influencia sobrelaPA y la frecuenciacardíacase encuentraninervadasprofusamentepor neuronascatecolaminérgicas.

Desde los añossesenta,se conocequeel cerebrocontienedistintos gruposcelulareslos cualessintetizanNA, AD y DA. Los axonesde esascélulasproyectana todaslas regionesdelSNC, llegandoa formarhacesen algunasocasiones(Fig. 3).Estos descubrimientoshan sido posiblesgraciasa la aplicación de técnicastalescomo la utilización de neurotoxinasque permiten la destrucciónselectiva de unsistemadeneurotransmisión,Tal esel casode la 6-hidroxidopamina(6-ORDA),unade las másempleadasa nivel central.

6-Hidroxidopamina

El interés de la 6-OHDA surgió al observarcomo causabauna prolongadadisminución del contenido de catecolaminasdel corazón (Porter y cols., 1963),comprobandosemás tarde que este efecto se debía a la destrucciónde lasterminacionesnerviosassimpáticas.

La 6-OHDA no atraviesala barrerahematoencefálicaen animalesadultos,pero puedeactuarsobrelas neuronascentralesdespuésde su administraciónlocalo intraventricular.

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Fig. 3.- Vías de la noradrenalina(panelsuperior),dopamina(panel(panelinferior) en un cortesagital.Tomadode Bradford (1986).

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La acciónde la neurotoxinadependede suacumulaciónpor la bombaanímicade la membrananerviosa,y puedeimpedirsecon drogascomola desipraminaquebloquean este proceso. En el terminal nervioso es rápidamenteoxidada acompuestosquecausanla degeneracióndelmismo en un períodode días.Mientrasque a nivel periférico hay regeneraciónprácticamentetotal en casi todas lasocasiones,enel SNCexistemuy pocaregeneración.Aunquela 6-ORDAescaptadapor gránulos de almacenamientointraneuronales,no parece ser requisitoimprescindible para provocar el daño nervioso ya que la toxina es efectiva enanimalesreserpinizados(Kostrzeway Jacobowitz,1974).

4.1.1.1. Sistemanoradrenérgico

La implicación del sistemanoradrenérgicocentralen el control de la PA estáavaladapor diferentes hechos: (1) el paralelismo entre la distribución de víasnoradrenérgicasy los centrosdel SNC con un papel confirmadoen la regulacióncardiovascular,talescomohipotálamoy bulbo; (2) los conocidosefectoscentralescardiovascularesde la NA y otros agonistasadrenérgicosy (3) la conversiónde lasdrogas noradrenérgicasde acción central en uno de los principales agentesterapéuticosutilizadosen la hipertensión.

Las neuronasquesintetizanNA se localizana nivel bulbary pontino.Fuerondescubiertasen el SNC de roedorespor Dahlstrom y Fuxe (1964), quienesdesignarona los principalesgruposcelularesnoradrenérgicosdesdeAl hastaA7, dela zonacaudala la rostral.

El grupo de células Al en la CVLB y el A2 del NTS, junto con unacontribuciónrelativamentemenorde los gruposA5 y A7, danlugar a unade lasdosvíasnoradrenérgicasascendentesdemayor relevancia:el haznoradrenérgicoventral(HNV) quese dirige rostralmenteinervandoel hipotálamo(núcleoparaventricular,supraóptico,arcuado,dorsomedial,periventricular).Además,sehandescritotambiénproyeccionesdescendentesbulboespinalesdesdelos gruposAl y A2 (Ungerstedt,1971).

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25

Uno de los núcleosnoradrenérgicosmástrascendenteses el LC constituidopor el grupo celular A6. Estenúcleo,con una aportaciónmenor de los gruposA4y A7, origina otra granvía ascendentenoradrenérgica:el haz noradrenéwicodorsal(HND) quecursarostralmenteemitiendoproyeccionesal hipotálamolateral,núcleostalámicos, amígdala,hipocampoy cortezafrontal. Las proyeccionesdescendentesdesdeel LC inervanalgunasestructurasdel tronco encefálicoy la médulaespinal(Nygren y Olson, 1977).

En la literatura existennumerososestudiosque no dejan duda de que elsistemanoradrenérgicoenel NTS(A2) modulala actividaddel reflejobarorreceptor,si bienno seha esclarecidototalmentesu papeldadala controversiaqueencierranestosdatos.

Algunos estudioshan demostradoque la NA del NTS permite el correctofuncionamientode la respuestabarorreflejahipotensora(Kobilansky y cols,, 1988).En esa misma línea encontramosque la administraciónlocal de NA en el NTSproducehipotensión(De Jongy cols., 1980),mientrasque la lesión de estenúcleoprovocael desarrollodeunahipertensiónde carácterneurogénico,queseoriginaríacomo consecuenciade la ausenciade la actividad inhibitoria ejercida por lasneuronasNA aesenivel (Pately Schmid,1987).

Ahorabien, otrosdatosapuntanaquela inyecciónde la neurotoxina6-OHDAen estamismazona producelabilidad y unahipertensióntransitoria,sin destruirelreflejobarorreceptor(Snydery cols., 1978). Todosestosresultadosparecenindicar,en su conjunto,que la NA puedeno ser crucial parala funcionabilidaddel NTS, sibien juega un papel facilitador o modulador.

Se ha sugeridopara el grupo Al en la CVLB un papel inhibitorio sobre eltono vasoconstrictorsimpático, al proyectara la zonaRVLB del bulbo raquídeomodulandola actividadde las neuronasCl adrenérgicas.

26

Lesioneselectrolíticasde neuronasAl coincidencon estehechoal causarhipertensión(Blessingy Reis, 1982)y unaatenuaciónde la sensibilidadbarorrefleja(West y cols., 1981). Por el contrario, la estimulaciónquímica o eléctrica en esemismo áreaproduceun descensode la PA (Willette y cols., 1984). Tambiénse hadescritoquela lesión de lascélulasAl causaun aumentodevasopresinaplasmática,efectoquepodría contribuir a la severidadde la hipertensiónobservada(Imaizumiy cols., 1985).Peroestudiosmásexhaustivoshansugeridoqueel efectovasodepresordescritoenlasexperienciasanterioresdependíade lascorrienteseléctricasaplicadasy no de la lesión de las células Al (Heady cola., 1987), insinuandosela posibilidadde que existanneuronasvasodepresorasen la región Al pero que éstasno seannoradrenérgicas(Wen-Li y Blessing,1990; Bonhamy Jeske,1989).Así, el papeldeestaregión en la regulaciónde la PA pareceno estartodavíamuy definido.

Se ha descritoun aumentode la PA y de la liberaciónde vasopresinatras laestimulacióneléctricadel LC (Sved,1986).Sin embargo,la implicaciónde la NA endichas respuestasno ha sido determinada y pudiera ser que los efectoscardiovascularesy hormonalesmencionadosse debierana la estimulaciónde fibrasque pasarana travésde estenúcleo.

Los estudiosde Korner y cols, (1987) sugieren que el grupo A6 (más elcomplejoAY) esté implicado en un circuito queseríaresponablede cambiosen laPA debidosa la alteraciónde la actividaddeunavía presoraqueascenderíadesdeestenúcleo.Así, el LC participaríaen la modulacióndifusade respuestassomáticas,comportamentalesy cardiovascularesmás que teneruna papel específicoen elcontrol central de la PA (Morilak y cols., 1987).

La relevanciacardiovascularde las víasascendentesnoradrenérgicasno tienedudadada la profusainervaciónque desdenúcleospontinosy bulbaresrecibe, atravésde esoshaces,el hipotálamo(Van denBuusey cols., 1989).De estamanera,áreasimplicadasen la regulaciónbásicadelsistemacardiovascularseunenacentrosenvueltos en la respuesta comportamental-emocional-hormonala estímulosambientales.Pero, a su vez, núcleos hipotalámicos proyectan densamenteaestructurascaudalescomo el NTS, de maneraque también el hipotálamopodríajugar un importantepapel en la modulaciónde la actividadbarorrefleja(Simon ycols., 1985).

27

La inyecciónde NA enel hipotálamoanteriorproduceun descensode la PA(Struykery cols., 1975), postulandoseque los mecanismosnoradrenérgicosen estazonaestaríanrelacionadoscon el desencadenamientode unarespuestadepresora,con objetode amortiguar las elevacionesfisiológicasde la PA Por el contrario,laestimulacióneléctrica del hipotálamoposterior produce una respuestapresora,debida a la liberación de NA y la subsiguienteactivaciónde los receptoresalfa(Philippu y cols., 1981) lo que sugeriría que el aumento de la actividadnoradrenérgicaenesteáreaestaríaligada a la respuestacompensatoriaen estadoshipotensivos(Philippu y cols., 1979).

Así pues, existe una influencia recíprocaentre el arco barorreflejo y laactividad noradrenérgicadel hipotálamo, posibilitando la hipótesis de que losmecanismosnoradrenérgicosenesenúcleopuedenserimportantesenla regulacióndel reflejo barorreceptor.

4.1.1.2. Sistemaadrenérgico

Los grupos celulares que contienenAD son tres: Cl, C2 y C3 y estánrestringidosal bulboraquídeo(Hókfelt y cols., 1973).

El grupoCl se localizaen la RVLB, regiónde trascendenciaen la regulacióncentral de la PA. Estasneuronasadrenérgicasproyectansusaxonesparainervarrostralmentediversosnúcleos hipotalámicosy caudalmenteel núcleo intermediolateral de la médulaespinal(Fuller, 1982). El segundogrupo más importantedeneuronasadrenérgicas(C2) se sitúa en el NTS, proyectandosea los núcleossupraópticoy paraventriculardel hipotálamoy al LC.

Laslesionesen la RVLB, dondesesitúael grupoCl, causanunacaidade laPA semejantea la originada por transecciónespinal,mientrasque su estimulaciónprovoca un aumentode la misma. Sin embargo,el papel de dichas neuronasadrenérgicasen la mediaciónde los efectoscardiovascularesobservadosno estáaúnbien definido ya que la inhibición de la actividad de la PNMT pareceno alterar laPA en respuestaa la estimulaciónde esteárea(Heady Howe, 1987). Así, se hapostuladoqueel tono simpáticocardioaceleradory vasoconstrictorestaríamediadopor un grupo deneuronas,de neurotransmisorno identificado,pero cuyaactividadsi podría ser moduladapor las neuronasadrenérgicasCl (Suny cols., 1988).

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11Por lo querespectaal hipotálamo,Routledgey Marsden(1988)handescrito ~H’•~

la existenciade un tractoadrenérgico,procedentede la región Cl en la RVLB, queinterviene en el control de la PA, y cuya estimulación eléctrica a nivel bulbar, ‘

incrementala liberaciónde AD hipotalámica.

En cuantoal grupoC2 del NTS,es posiblequemodule la expresiónfuncionalde los centros presor y depresordel bulbo raquídeo, o integre la respuestabarorrefleja (Kobilansky y cols., 1988). En esta línea se ha afirmado que una 114.>

disminucióndel tono vasodepresoradrenérgicoenel NTS puedeconsiderarsecomoindicadorbioquímicode la reducciónde la funciónreflejabarorreceptora(Yukimuray cols., 1981). Otras evidenciasque apoyan la anterior hipótesisprocedende lasexperienciasde Struyker-Boudier(1975), donde la microinyección local de ADdisminuía la PA, siendo bloqueadoese efecto hipotensor por el antagonistaadrenérgicofentolamina(De Jong y Nijkamp, 1976). 4

Confirmandola idea de quelas neuronasadrenérgicasen el bulbo raquídeo 4’representanun sistemavasodepresor,encontramoslos estudiosde Fuxe y cols.(1980). Estos autoresinyectabanintracerebroventricularinhibidores de la PNMT, 4afectando selectivamentelas neuronasadrenérgicassin alterar otros sistemas ycatecolaminérgicos,observandoun incrementode la PA.

Por otro lado, es probableque las neuronasC2, al inervar el LC, tambiénparticipenen el control de la actividadde los cuerposcelularesnoradrenérgicosa =4travésde señalesinhibitorias (Sawchenkoy Bohn, 1988).

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4.1.1.3. Sistemadoparninérgico

El papel del sistema dopaminérgicocentral en el mantenimientode lahomeostasiscardiovascularha sidosubestimadodurantemuchotiempo,quizádebido

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a la contradicciónque reflejaban los resultadosobtenidosde la microinyección (central de DA y otros agonistasdopaminérgicossobre la PA. Este hecho ha ,1

permitidoquela investigaciónen estecamposecentraraen los sistemasadrenérgicoy noradrenérgicoantesmencionados.

Los gruposcelularesdopaminérgicosdescritosen el SNC sedesignandesde.4

AS hastaA15 y estánconfinadosfundamentalmenteal mesencéfalo,con pequeñosgruposquesesitúan en diencéfaloy telencéfalo(Dahlstromy Fuxe, 1964).

29

La sustancianigra (A9) es el núcleo mesencefálicomásimportante.Otrasneuronasdopaminérgicasse localizanen la formación reticular mesencefálica(AB)y en el área tegmental ventral (Ala). Al igual que sucedía en el sistemanoradrenérgico,desde algunos de estos núcleos celulares se forman hacesascendentesde gran trascendencia,como el sistemadopaminér2iconigroestriatal

.

constituidopor los gruposAS y A9 quellegaa inervarel núcleoputameny el núcleocaudado,mientras que el grupo AlO origina otro haz ascendente,d.jiU~m~.dopaminérgicomesolímbico.que inerva diferentesestructuraslímbicasy corticales(Ungerstedt,1971).

Los grupos celularesdopaminérgicosdel diencéfalose circunscribena dosnúcleoshipotalámicos,el núcleoperiventricular(Ah) y el núcleoarcuato(A12 y suprolongaciónrostral A14). Este último núcleodarálugar al sistemadopaminérgicotuberoinfundibular,queinerva la eminenciamedia.Paraterminar,el grupoA13 selocaliza en la zonaincertay el A15 en el bulbo olfatorio (Bjorklund y Nobin, 1973).

Comoya seha mencionadoantes,la intervencióndel sistemadopaminérgicoen la regulaciónde la PA no ha sidodeterminadahastael momento.Sin embargo,algunosautoreshan descrito alteracionesautónomasen enfermosde Parkinson,como por ejemplo hipotensión ortostática (Turkka y cols., 1986). Dichasobservacionesestánde acuerdocon un posible papel, en particular del sistemanigroestriatalA9, en la modulacióndel control cardiovascular.

Spring y Winkemiiller (1973) muestranque la estimulacióneléctrica de lasustancianigra provocauna respuestapresoraen el gato.Además,se ha postuladounaposibleimplicación delsistemadopaminérgicosobreel reflejobarorreceptor.Enesta línea se encuentranlas experienciasde Alexander y cols. (1988) en ratasdenervadasseno-aórticamente,las cualespresentabanunadisminucióndel 50% enlos niveles de DA y susmetabolitosen el núcleo estriado.

La implicación de otros sistemas dopaminérgicos en la regulacióncardiovasculartambién ha sido estudiada y, así, se ha comprobadoque laestimulacióneléctricadel áreategmentalventral (grupoAlO) induceun aumentodela PAfrecuencia-dependientequepuedeserbloqueadomediantepretratamientoconhaloperidol(Van de Buusey cols., 1988). De la mismamanera,el grupoM2 situadoen el hipotálamopodríaser relevanteen el control de la PA debidoa su influenciasobre la liberación de hormonas hipofisarias, como prolactina y ACTH, o deendorfinas.

30

OBJETIVOS

Una de las múltiples respuestasfisiológicas que el organismoexperimentafrente al estrásesun incrementode la PA (Brodyy cols., 1987).El modelode estráspor deprivaciónsocial induceun estadohipertensivoen la rata(Gardinery Bennet,1977) presentandoun doble interésal permitir asociarestráse hipertensión.

El sistemacatecolaminérgicocentral juega un papel preponderanteen elcontrol cardiovascular.En particular,el NTS y diferentesnúcleoshipotalámicos,endondela activaciónde receptoresadrenérgicosorigina cambiosen la PA (Van deBuusey Head,1989).

Teniendoencuentalas anteriorespremisasconsideramosla posibilidadde queel sistemacatecolaminérgicocentralestuvieraimplicado en la elevaciónde la PAgeneradatras la aplicacióndel estráspor deprivaciónsocial.

En primer lugar, intentamos caracterizar convenientementeel modeloexperimentalelegido llevando a cabo el seguimientode la PA, constatandoeldesarrollode la respuestahipertensivadescritapor primeravezen animalesadultospor Gardinery Bennet (1977)y, posteriormente,en animalesjóvenespor Naranjoy Fuentes(1985).

Al mismo tiempo,sevalidó dicho paradigmaexperimentalcomo fuente deestrásen términosde la actividadadrenocorticalmediantela medidadirectade losniveles de corticosteronaplasmáticospor radioinmunoensayo.

La funcionalidaddel sistemacatecolaminérgicocerebralseestimómediantela determinaciónde los niveles de aminas (NA, AD y DA) y de metabolitos(MHPG) por HPLC en distintasestructurascerebraleselegidasen función de suconocidopapelen la respuestafisiológica al estrásy/o en la regulacióncentral de laPA (hipotálamo,bulbo raquídeoy médulaespinal).

Se evaluaron los cambios temporales en los parámetros bioquímicosconsideradosrelacionadoscon modificacionesen la PA duranteel periodoen quelos animalesestuvieronsometidosa estrás,comparandolos índices de actividadcatecolaminérgicaen lasdiferentesregionescerebralesentreanimalesnormotensose hipertensos.

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32

Comosegundaaproximaciónfarmacológicaseprocedióa la administraciónde6-ORDA en el HNV. La utilizacióndeunaneurotoxinaque, comoennuestrocaso,es capazde destruirselectivamenteun sistemade neurotransmisiónes unade lasherramientasde trabajomásfrecuentesenla investigaciónfarmacológica,puestoquepermite dilucidar algunosaspectosde la función a desempeñarpor dicho sistema.

En primer término,se estudiaronlos efectosdirectosde la administracióndela neurotoxinasobre la PA y la actividad catecolaminérgicacentral en animalesnormotensos.

Y, por último, se analizaronlas consecuenciasde la destrucciónselectivadelos sistemascatecolaminérgicoscentralessobrelos mismosparámetrosconsideradosanteriormenteen animalesantesy despuésde desarrollarla respuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocial.

33

MATERIALES Y METODOS

>4.1,

1~

1. FARMACOS Y PRODUCTOSQUIMICOS

Los fármacosy productosquímicosempleadosen los experimentosque sedescribenen el capítuloposterior fueronlos siguientes:

Pentobarbital sódico, ácido etilendiaminotetracético(EDTA) sal sódica,octilsulfatosádico,bisulfito sádico,NA bitartrato, AD, DA clorhidrato,6-OHDA,MHPG sulfato, MHPG hemipiperazina, 3-4-dihidroxibencilamina(3-4.DHBA),seroalbúminabovina,tripsina, inhibidor de tripsina,hidroxiapatitay corticosteronaqueprocedíande Sigma.

La gamma-globulinaseobtuvo de Serva,el anticuerpoparacorticosteronadeBioclin y la 3H-corticosteronade Amersham.

El ácido cítrico, ácido ascórbico, acetatosádico, fosfato disódico, sulfatomagnésico,ácido perclóricoy etanolabsoluto procedíande Merck. El hidrato decloral y el cloruro sádicofueronde Panreac,mientrasqueel propilenglicol fue deProbusy el metanolpara HPLC, así como el Cocktail 22-Normascint-líquidodecentelleode Scharlau.

L ANIMALES DE EXPERIMENTACION

Duranteel desarrollodel presentetrabajoseutilizaron ratasWistarmachode90-100gramosde peso(aproximadamente6 semanasde edad).

Los animales procedían de Interfauna Ibérica (San Feliu de Codines,Barcelona)y semantuvierona temperaturaconstante (219 C) y luz controlada(12 hr luz!12 hr oscuridad),disponiendoen todo momento de accesolibre a lacomiday a la bebida,permaneciendoen nuestroestabuladopor un períodode almenos5-6 díasantesde su utilización.

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414-

35

3. TECNICASQUIRURUICAS

3.1. LESION CON 6-HIDROXIDOPAMINA DEL HAZ NORADRENERGICO

VENTRAL

La lesión del HNV se llevó a cabo estereotáxicamentepor inyecciónbilateralde la neurotoxina 6-OHDA en ratas previamente anestesiadascon Equitesín(3 ml¡kg), cuya composiciónse indica a continuación:

PentobarbitalsódicoSulfato magnésicoHidrato de CloralPropilenglicolEtanol90 %Agua

0.4 mM&6 mM2.5 mM

56.0 mM11.5 %c.s.

Unavez anestesiadas,sefijaron a un aparatoestereotáxico(David Kópf) y seefectuó una pequef4ia incisión en la piel craneal, limpiandoseperfectamentelasuperficieexpuestadel cráneoconel fin de dejarlas suturasvisiblesy asi procedera la localizacióndel puntoexactade la lesión segúnlas coordenadassiguientes:

Ratasjóvenes(90-100g):

Antero-posteriorLateralProfundidad

Angula de incisivos

— 5.9 mm con respectoa la bregma+ 1.2 mm desdela línea media

— 6.5 mm desdela duramadre

2.0

Ratasadultas(240-250 g):

Antera-posteriorLateralProfundidad

Angula de incisivos

— 7.3 mm con respectoa la bregma±1.3 mm desdela línea media— 7.4 mm desdela duramadre

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Las coordenadasde la lesión, así comolas correccionespertinentessegúnelpesodel animaldeexperimentaciónencadacaso,sedeterminaronutilizandoel atlasde Paxinosy Watson(1986).

Unavez localizadoel puntode la lesión, y con un tornodental,sepracticarondos pequeñosorificios en el cráneoa travésde los cuales seprocedióa efectuarlainyecciónde 2 pl (ratasjóvenes)ó 3 pl (ratasadultas)de unasolución de 3 pg/pl de6-OHDA en ácido ascórbico0.2 % ó de vehículo sólo con un jeringa Hamilton (Hamilton CO. Mod. 701 ). La inyección se realizó lentamente,a 0.5 IflImin.

4. MODELO DE ESTRES

El modelode estrésutilizado fue el de la deprivaciónsocial, Las condicionesexperimentalespara la inducción del estréspor estemétodo fueron descritasporprimeravez porGardineryBennet(1977)y posteriormentemodificadasporNaranjoy Fuentes(1985).

En estemodelo,cadaanimalse sitúa individualmenteen unajaula standard(25x25x14cm) de paredesopacas,manteniendoseen estascondicionesduranteunperiodode tiempo de 15-20 días, hastaque seobtienela respuestahipertensiva.Seconsideraque dicha respuestase producecuando los valores de presiónarterialsistólicase sitúan unos15-20 mm de Hg por encimade los valoresde los animalescontrol. Estegrupo,siempreparaleloal de animalesaislados,estáformadopor ratasque permanecenagrupadasde 5 en 5, duranteel mismo tiempo y en las mismascondiciones, en jaulas de mayor tamaño (40x33x16 cm). En todos los casos, alcomienzodelperíodode aislamiento,seutilizaron animalesde seissemanasde edad(90-100 g) que habíansido habituadospreviamentea la medidaindirecta de lapresiónarterial.

37

5. MEDIDA DE LA PRESION ARTERIAL

5.1. MEDIDA INDIRECTA DE LA PRESIONARTERIAL

La medidade la presiónarterialseefectuépor el métodoindirecto (tail-cuff)descritopor Buñag(1973), utilizando un aparatoW+W B.P. Recordery Letica(LE-5100).

En esteprocedimientose aplica en la coladel animalun manguitounido aundispositivo neumáticogeneradorde unapresiónquevaríacíclicamente.La presióndel manguitoesproducidapor un motor queaccionaun pistónalojadoen el interiorde un cilindro, de dimensionestalesque la presión mínima es O mm de Hg y lamaxima290 mm de Hg. Asimismo,el sistemacuentacon un transductor,acopladopreviamentea la coladel animal, quedetectala pulsaciónde la arteriacaudalcuyaseñalesamplificaday registradapor unaplumilla sobreun papel calibradoen mmde Hg.

Cuandola presióndel manguito iguala la presióndiastólica, la amplitud deltrazadocomienzaadescender,anulandosecompletamentecuandoalcanzala presiónsistólica. Ello es debido a que la arteria caudalse colapsainterrumpiendoselatransmisiónde la pulsacióna la parteperiféricade la cola. Cuandola presióndelmanguitodesciende,la pulsaciónretorna.

Para obtenerun registro estable de la presión es necesarioprovocar lavasodilataciónde la arteriacaudalde la ratapara lo cual se colocaal animalbajounalámparade luz infrarroja durante5-10 minutos.

La escasareproductibilidaden los valores de la presión arterial diastólicaobtenidascon el aparatoW+W B.P. Recorderobligarona utilizar exclusivamentelas medidasde presiónarterial sistólica durantela iniciación del presentetrabajo.Posteriormentesepudodisponerde un aparatoLetica (LE-5100), cuyo fundamentoes semejanteal descritoanteriormente,pero dispuestode un lector digital queregistraba con fiabilidad tanto la presión arterial sistólica como diastólica,procediendosea la repetición de los experimentosya realizadoscon objeto deestimar los valores de presión arterial diastólica que anteriormentehabíansidodesestimados.

38

Todaslas ratasfueronsometidasa dicha medidadurantetresdíaspreviosalinicio del aislamientocon el fin de favorecersu acostumbramiento,eliminandoseautomáticamenteaquellos animalescuyos valores de presión arterial no fueronestablesduranteesteperíodo.Los valoresfinalesde presiónarterial correspondena la media de, al menos,ocho medidasconsecutivas.La frecuenciacardíacaseobtuvo medianteun tacómetroacopladoal sistema.

& DETERMINACIONESBIOQUIMICAS

6.1. DETERMINACION DE CATECOLAMINAS CEREBRALESY SUSMETABOLITOS POR CROMATOGRAFíALIQUIDA DE ALTAPRESION

6.1.1. Fundamentode la técnicacromatográfica

La técnicade cromatografíalíquida de altapresión(HPLC) y de fasereversa,depar iónicoesunavariantede la cromatografíaclásicadefasenormal,quepermitela separaciónde mezclascompuestaspor sustanciaspolares,incorporandoa estaúltima la ventaja,por un lado, de reducir el tiempo de análisis y la cantidad deeluyente empleado,y por otro, permitir manipular selectivamentelos tiempos deretención de moléculas ionizadas, cuando el formador de par iónico (un ácidosulfónico en estecaso)seañadea la fasemóvil, e interaccionacon el grupoNH4~de las catecolaminas,suprimiendosu ionizacióne incrementandola retenciónde lasmismasen la faseestacionaria,sin afectarselos componentesácidoso neutrosde lamuestra.

El pH y la concentracióndel solventeorgánico son otros de los factoresfrecuentementemanejadospara obtenerunaresoluciónadecuada.

39

6.1.1.1. Detecciónelectroquímica

Solamenteaquelloscompuestoscapacesde sufrir procesosdeóxido-reducciónpuedenserdetectadoselectroquimicamente,dentrodelos límitesdepotencialfijadospor el tipo de materialdel electrodode trabajo.Todaslas catecolaminasson, portanto, susceptiblesde ser detectadaselectroquimicamentepor oxidación a suscorrespondientesortoquinonasen la superficiede dicho electrodo.

La selectividadde este métodode detecciónse logra ajustandola diferenciade potencialentre el electrodode trabajo y el de referenciaa un valor justo porencimadel potencialde oxidación de los compuestosde interés.En el casode lascatecolaminasse requierenpotencialesdel orden de 0.60-0.70V, mientrasque losmetabolitos0-metiladosdeestasaminas,comoel MHPG, precisanunaenergíadeactivación máselevaday, por tanto, requierenpotencialesde oxidaciónmásaltos.El empleodel detectorelectroquímicoparala determinaciónde MHPQen nuestrascondiciones no permitió obtenerni la resolución ni la sensibilidad adecuadas,utilizandoseotro sistemade deteccióndiferenteparasu análisis.

6.1.1.2.Detecciónfluorimétrica

Los detectoresde fluorescenciason los máscomrnunmenteutilizados en ladeterminacióndecompuestosquepresentanfluorescencianatural,asícomoparalosque puedenconvertirseen fluorescentespor simple derivatización.

La fluorescenciatiene lugar cuandocompuestosque poseendeterminadosgruposfuncionalesse excitancon energíade una ciertalongitud de onda y emitenradiaciónde mayorlongitud de onda,la cuales medidagraciasa la presenciade unfotomultiplicador.Normalmentela emisiónsedeterminaendirecciónperpendiculara la excitación,y la capacidadrealde la fluorescenciade gruposquímicosespecíficoses función de las longitudesde ondade la excitacióny de la emisión.

Este sistema de detección permite la separacióny cuantificación decatecolaminas,quepor su estructurafenólicapresentanfluorescencianatural paraunalongitud de onda de 200-300 nm, pero con unasensibilidadmuy inferior a laobtenidacuandoseempleala detecciónelectroquímica.Sin embargo,medianteelempleode estatécnica de detecciónfluorimétrica,seobviaron los inconvenientesderivadosde la escasaresoluciónquese obteníapara la identificación del MHPGcuandose utilizabala detecciónelectroquímica.

40

Nuestro sistema constabade un monocromadorpara la selecciónde lalongitud de onda de excitacióny un filtro de emisiónde pasode bandapara lalongitud de ondade emisión.

6.1.2. Determinaci6n de catecolaminascerebralesymetaboitas

6.1.2.1. Preparaciónde las muestras

Les animales fueron sacrificados por decapitación, procediendoseinmediatamentea la extracción del cerebroy disección de las distintas áreascerebrales de interés, según el método de Glowinski e Iversen (1966). Acontinuación,todas las estructurasse pesarony congelaronen nieve carbónica,manteniendosea .3Q9 C hastael momentode su procesamiento.

Homogeneización

El líquido de extraccióndondese realizó la homogeneizaciónconteníaácidoperclórico0.4 M y además3-4 DHBA comostandardinternoparala cuantificaciónde NA, AD y DA. El procesofue llevado a cabo en un homogeneizadordeultrasonidos(Labsonic1510,Braun).A continuación,secentrifugóel homogeneizadoa 18.000g., durante30 minutos,en una minifuga HerausMod.B, recogiendoseelsobrenadantepara efectuar,en el caso de NA, AiD y DA, el análisis directo delmismopor HPLC con detecciónelectroquímica,o bien,en el casodel MHPG, unahidrólisis ácida previa a su determinaciónfluorimétrica. El volumen para lahomogeneizaciónfue variable, dependiendode la concentraciónestimadade cadasustanciaen el tejido concretoa analizar.

Hidrólisis ácida

Puesto que el MHPG en cerebro de rata se encuentraen su mayoríaconjugadoen forma de sulfatoy que la presenciade estegruposulfato imposibilitasudetección,fue precisorealizarunahidrólisispreviaa sudeterminaciónconobjetode dejarel MHPG en forma libre. Así, se tomaron200 ~xldel sobrenadanteen tubosde cristal de 3 ml y se introdujeron en un bañodeaguaa 1OO~ C durante4 minutos.Despuésde neutralizarlos mismoscon NaOH y trás sometera las muestrasa unacentrifugaciónleve pararecolectartodoel líquidodel fondode los tubos,seprocedióal análisis cuantitativode MI-TPO. El rendimientode la hidrólisis no fue nuncainferior al 70 %.

41

6.1.2.2. Condicionescromatográficasparala determinacióndenoradrenalina,adrenalinay dopamina

La determinaciónde las tres aminasse realizó inyectandodirectamenteelsobrenadantede la homogeneizaciónenun equipode HPLCacopladoaun detectorelectroquímico.El equipodecromatografíaconstabadeunabomba(WatersM-510),un inyectorautomático(SparkHolland, Mod. PromisII), un detectorelectroquímico(Waters M-40) y un integrador (Spectra Physics, Mod, SP-4290).La columnautilizada fue una ResolveC-18 (Waters)de 15 cm de longitud, 4.6 mm de diametroy 5 p de tamañode partícula,de fasereversa.La composiciónde la fasemóvil era:

Acetatosódico 0.1 MAcido cítrico 0.1 MEDTA 0,15 mMOctilsulfatosódico 1.2 mMMetanol 10%pH=3.7

circulando a un flujo de 1 mí/mm, aplicandose una diferencia de potencial de0.65 y entreel electrodode trabajo y el de referencia.El volumen de la muestrainyectadafue de 20 pl.

6.1.2.3. Condicionescromatográficasparala determinaciónde MHPO

Parala determinaciónde MHPG se utilizaron dos alícuotasdel sobrenadantede la homogeneizaciónde 200 pl cadauna, segúnel métododescritopor Artigasycols. (1986).Unade las alícuotasllevabaunasobrecargade 10 pl deMHPG-sulfato(600 pg/pl), y a la segundaalícuota se le añadieron10 pl de agua destilada.Acontinuación,ambasalícuotasfueron sometidasa la hidrólisis, tal y como se hadescrito anteriormente,y los sobrenadantesfueron inyectadosen un equipo deHPLC acopladoa un detectorfluorimétrico.

El equipo de cromatografíautilizado en la determinaciónde MHPG fuesimilar al descritoen el apartadoanteriora excepcióndel detectorque,en estecaso,eraun detectorfluorimétrico(Applied Byosistem,980).La columnautilizadafue unaODS-1 Spherisorb(Brownlee)de 15 cm de longitud, 4.6 mm de diametro y 5 p detamañode particula,de fasereversa.

42

La fasemóvil estabaconstituidapor:

Acido cítrico 0.03 MFosfatosódico 0.06 MMetanol 5.5%

circulandoa un flujo de 1.2 mí/mm. La longitud de ondaempleadaen la detecciónfue de 236 nm (excitación)y 350 nm (emisión). El volumen inyectadofue de50 ¡ily la cuantificaciónseefectuópor el métodode adición externa.

61.4. Cuantificacióny expresiónde lasresultados

Los standardsempleadosparala identificacióny cuantificaciónde los distintoscomponentescte las muestrasseprepararonen ácido perclórico0.4 M paraNA, AIDy DA y enmetanolabsolutoparael MHPG-sulfatoy MHPG-hemipiperazina.Estassolucionesalmacenadasa -2O~ C se mantienenestables duranteun mes. Lassolucionesde trabajo(50-200 pg/pl) se prepararondiariamentepor dilución de lassolucionesmadre (100-200ng/ixl) en ácido perclórico.

La calibración del sistemase efectuó por inyección del standardexternocorrespondiente.El DREA y el MHPG-sulfato se emplearoncomo standardsinternosparala cuantificaciónde NA, AD, DA y de MHPO, respectivamente,parade estemodosalvar las pequeñasvariacionesquepudieranproducirseal prepararlas muestraso enel volumende inyeccción.Siempreseinyectaronlosstandardscada5-6 muestrascon el fin decompensarla pérdidagradualdesensibilidaddeldetectorcon el uso continuado.

La concentraciónde las catecolaminasen las muestrasse determinóporcomparaciónde las áreasde suspicos con las áreasde los picos obtenidosparalosstandards,despuésde aplicar la correccióncorrespondienteuna vez evaluadalarecuperaciónparael standardinterno. El valor obtenidofue de nuevocorregido,enfunción de los volúmenesde homogeneizaciónde cada tejido, para expresarlasconcentracionesen pg/mg de tejido.

43

En el casodel MHPG, la concentraciónen las muestrasseobtuvo deacuerdocon la siguientefórmula:

h/c = hs/(c + es)

siendo: h la alturadel pico de MHPG en la alícuotasin sobrecarga

hs la altura del pico de MHPG en la alícuotasobrecargada

c la concentraciónreal de MHPG

cs la concentraciónde MHPG-sulfatoañadidoa la alícuota

sobrecargada

6.2. DETERMINACION DE LOS NIVELES PLASMATICOS DECORTICOSTERONAPORRADIOINMUNOENSAYO

62.1. Obtenciónde las muestrasy separacióndel pluma

Tras decapitarpor la mañana(08.00-11.00h) a los animalesse recogió lasangretroncularen tubosheparinizadosen frío (02~4fl C). Para la separacióndelplasma,la sangrese centrifugóa 1000 g, durante10 minutos, a 4~ C. Se recogióelplasmay se mantuvo a -20~ C para la posterior determinaciónde los nivelescirculantesde corticosterona.

6.2.1.1.Liberaciónde corticosteronade proteinasplasmáticas

La mayoría de las moléculas de corticosteronase encuentranunidas aproteinasplasmáticasy sólo un bajo porcentajese presentaen forma libre. Paraevaluarlos nivelesde estahormonaesnecesarioqueestépresenteen su forma libre,lo que requiere un proceso de extracción previo a la realización delradioinmunoensayo(RIA).

44

En lugar de realizar la extracción de la hormona utilizando disolventesorgánicos,se procedió a la digestión de las muestrascon tripsina, enzima quehidrolizala transcortinaasícomootrasproteinasconaltaafinidadpor corticosterona,deteniendosela digestiónpor incubacióncon un inhibidor de tripsina, siguiendoelmétododescritopor Armario y Castellanos(1984).La tripsina y el inhibidor de lamisma fueronpreparadasen un buffer RíA queestabaconstituidopor:

Buffer fosfato 5 mM pH=7.4Seroalbúminabovina 0.06%Gamma-Globulina 0.02%Cloruro sódico 0.9 %

El ensayose realizópor duplicadopartiendode 2 ~l de plasmaa los quese lesañadió100 pl de unasolución de tripsina (1 pg/pl). Trás agitar ]os tubos1 minutoe incubar 1 hora a temperaturaambiente,se detuvo la reacción añadiendo100 plde una solución del inhibidor de tripsina (1.25 pg/pl). Se repitió el procesodeagitación e incubación,en este caso 30 minutos a temperaturaambiente,y seprocedióa realizarel RíA.

6.2.2. Radioinmunoensayode corticosterona

Fundamento

El RIA está basadoen la unión específicade un antígeno(Ag) con su

anticuerpo(Ac) correspondientesegúnla siguientereacción:

Ag + Ac < > Ag-Ac

Siunacantidaddeterminadade Ac seexponea unacantidadconstantede Agmarcadoradiactivamente(Ag*), seestableceun equilibrio deuniónAg*~Ac que,enpresenciade cantidadescrecientesde Ag frío, severáafectado,ya queambos(Ag*y Ag) competiránpor los mismossitios de unión del Ac:

Ag* + Ag + Ac < > Ag~-Ac + Ag-Ac

45

Mediantela realizacióndeunacurvastandardconconcentracionescrecientesde Ag, se irá produciendoun desplazamientoprogresivo del Ag* del complejoAg*~Ac, de tal modo que se puedeestableceruna relaciónentre la cantidaddecomplejo Ag*~Ac y la concentraciónde Ag de la muestra. Esta última serádeterminadamediantecontajedel radioisótopoquepermaneceunido al complejode tal modoque, cuantomenorseala formacióndel complejoAg*~Ac, mayorserála cantidadde Ag presenteen la muestra.

Realizacióndel RíA

El RíA se realizó por combinaciónde dos métodosdiferentesdescritosporVillanúa y Gamallo(1985) y Armario y Castellanos(1984).

La curvastandardse preparódiariamenteapartir de unasoluciónmadredecorticosteronaen etanolde 500 p.g,/pl, llevandosepuntosde 0, 15, 31, 62, 125, 250,500, 1000, 2000, 4000y 8000 pg de corticosterona,El punto O de la curva , que sólocontiene Ag* y Ac, será el indicador de la unión máxima Ag*~Ac, Esta curvastandardse completó con dos tubos: un primer tubo, denominadoN, que dabacuentade la captacióninespecíficade Ag* por la hidroxiapatitay cuyasc.p.m.fueronsustraidasde todos los tubos ensayadosy, un segundotubo, el de las c.p.m. totales,que indicabala radiactividadtotal quehabía sido añadidaen cadatubo.

Tantoa las muestrascomoa los diferentespuntosde la curvase les anadió100 pl de 1,2 3H-corticosterona(60 Ci/mmol), aproximadamenteunas4.000c.p.m.,y 100 pl de antisueroanticorticosteronade dilución 1/10000(concentraciónnecesariaparaobteneraproximadamenteun 50 % deuniónAg*~Ac) enbuffer RIN Trás unaincubaciónde 16-18horasa 0~-4~ C, seprecipitaronlos complejosAg-Ac formadoscon 200 pl de hidroxiapatita al 2.5 % en buffer fosfato 1 mM, pH 7.4, porcentrifugaciónen frío, a 1000 g, durante10 minutos. A continuaciónseañadieron2 ml de líquido de centelleoy seprocedióa su contajeenun contadorbeta(LKB).Paraevitar posiblesvariacionesintra e interensayosecorrió siempreunamuestradel mismo ‘pool” de plasmacada25 tubosde RíA, asícomoen todoslos diferentesRíA de corticosteronarealizadosen distintasocasiones.

46

El contenido de corticosteronaen las muestrasbiológicas se obtuvo porinterpolaciónde sus valores,en c.p.m., en la curva standardde concentracionesconocidasde la hormona,representadaenporcentajede complejoAg*~Ac (c.p.m.)en ordenadasfrentea concentracionescrecientesde corticosterona(pg) en abcisas.Los valoresfueronexpresadosen pg de corticosterona/100ml de plasina.

7. TRATAMIENTO ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS

El valor de las variablesestudiadasse expresamedianteun parámetrodecentralización(media aritmética)y otro de dispersión(error standardde la media)(ESM).

Paraanalizarlas diferenciasentre los gruposexperimentalesseutilizó el test

“t” de Student,una vez comprobadala viabilidad de su aplicación (ajustede los

gruposexperimentalesa una distribuciónnormal).

47

RESULTADOS

1. DESTRUCCION SELECTIVA DEL HAZ NORADRENERGICO VENTRALMEDIANTE LA ADMIINISThACION DE 6-HIDROXIDOPAMINA

1.1. EFECiFODELAADMINISTRACIONDE6~H1DROXIDOPAMINAENELHAZ NORADRENERGICO VENTRAL SOBRE LA PRESION ARTERIAL

Los animaleslesionadosen el HNV con 6-OHDA presentaronun aumentotransitoriode la presiónarterialsistólicay diastólica24 horasdespuésde realizarsela lesión (FíO 4) conrespectoa los valores,paraambosparámetros,de los animalessometidosa la mismaoperaciónquirúrgicapero a los que seles administróvehículoen lugar de la neurotoxina (Sham). Estos animales sham no experimentaronalteracionesenla presiónarterialporefectodel sometimientoal simulacrode lesión.Las lecturasde pre~ión arterial, tanto sistólica como diastólica, de los animaleslesionadosvolvieron a sersimilaresa lasde los animalesshamtranscurridostresdíasdespuésde la lesión (Tabla 1).

No se apreciaronvariacionesni en la frecuenciacardíaca(sham, 430±13;lesión, 423±12)ni en el pesocorporal(sham,297+6 lesión,304±5)de los animaleslesionadosrespectoa sus controlessham-operados.(Los valoresque se muestrancorrespondenal día 30 de aislamiento).

12. EFECTODE LA ADMIINISTRACION DE 6-HIDROXIDOPAMINA ENEL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL SOBRELA ACTIVIDADCATECOLAMINERGICA CENTRAL

Se determinaronlos niveles de NA, AD y DA, asícomode MI-IPO, en tresdiferentes estructuraselegidas en función de su conocida participación en laregulacióncentraldel sistemacardiovascular(hipotálamo,bulbo raquídeoy médulaespinal)en animaleslesionadosmediantela inyección de la neurotoxina6-OHDAen el HNV, con el fin de examinarla posible alteraciónque la lesión produciríasobreel contenidode catecolamiriasy la actividadneuronalde estossistemasdeneurotransmisión.

49

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Fig. 4.- Efecto de la administración de 6-hidroxidopamina en el haz noradrenérgicoventral sobre la presión arterial sistólica y diastólica.

La medidadela presiónarterialsellevó a cabopor el métodoindirecto ‘tail-cuff” 1 día antes(-1) y a diferentesdías despuésde la administración bilateral de6 ug/ratade la neurotoxina(Lesión)o vehículo(SImm). Los datosseexpresancomola media±ESM en gruposde 16-18 animales.** pcO.Ol respectoa los valoresde los animalessham(testde la ItIt de Student).

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Las determinacionesbioquímicas se efectuaron a diferentes tiemposcoincidiendocon aquellosa los que sebabiarealizadoel seguimientode la presiónarterial.

1.2.1. Nivelesde catecolanxinasen distintas estructuras

Hipotálamo

Se llevó a cabo la medida de los niveles de los tres neurotransmisoresencuestiónen hipotálamoprocedentede animalesshamy lesión,

Bajo estas condiciones experimentales se encontró una disminuciónsignificativa de los niveles de NA (60-70%)y AD (35-60%) hipotalámicaen losanimales lesionadosa los 12, 20 y 30 días después de producirse la lesión,disminuciónqueno tuvo lugaren el grupocontrol de animalessham(FM. 5).

El sistema dopaminérgico,en cuanto a los niveles de DA se refiere, noaparecíaalteradopor efectode la administraciónde la neurotoxinasiendosimilareslos niveles del neurotransmisoren los animaleslesionadosy sham-operados.

Bulbo raquídeo

La Figura6 muestralos niveles de los tres neurotransmisoresanalizadosenel bulbo raquídeode animales lesionadosy sus controles sham.En esta regióncerebralla lesión no alteró los nivelesde ningunade las catecolaminasa 1, 12, 20ó 30 díastranscurridosdesdela administraciónde la neurotoxina.

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Dado quelos niveles de AD en médulaespinalfueronen muchasocasionesindetectables,hubo queprescindirde ella ennuestravaloración.Lesnivelesde lasotras dos catecolaminas-NA y DA- se reflejan en la Figura 7, no habiendoseencontradoalteracionesen ningunade ellas por efectode la lesión.

1.2.2. Velocidad de rencwación de noradrenajina en distintas estructuras

En la Tabla II sepresentanconjuntamentelos nivelesde NA y de MHPG enhipotálamode animaleslesionadosy suscorrespondientescontrolessham-operados,mientrasque la Figura8 muestrael contenidodel metabolitoen dicha estructuraalo largo del tiempo. En esta región cerebral,la lesión produjo un descensode losnivelesdel neurotransmisor(70%)y de su metabolito(30-40%)a los 12, 20 y 30 díasdespuésde la inyección de 6-OHDA, disminución queera significativa cuandosecomparócon los nivelesde los animalessham-operados.

Bulbo raquídeo

La lesión no produjo alteracionesen los niveles de NA en ninguno de lostiemposanalizados(TablaIII), como sededucede la similitud de los contenidosdelneurotransmisorobservadaentre los animaleslesionadosy los sham-operados.

Sin embargo,si se aprecióun aumentosignificativo (20%) de los nivelesdeMHPG enestaestructuracerebralen los animaleslesionadosconrespectoal grupocontrol de animalessham-operadostansolo 1 día despuésde la administracióndela neurotoxina(FIG. 9), incrementoque, no acompañadode ningunamodificaciónde los niveles de NA, indica consecuentementeun aumentode la velocidad derenovaciónnoradrenérgicaanivel del bulboraquídeo24 horasdespuésdeproducirsela lesión.

55

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TABLA II

EFECTO DE LA ADMINISTRÁCION DE 6-HIDROXIDOPAMINA EN EL HAZNORADRENERGICO VENTRAL SOBRE LA VELOCIDAD DE RENOVACION DE

NORÁDRENALINA EN HIPOTÁLAMO

MHPG(pg/mg tej)

TIEMPO(días)

11

GRUPO

ShamLesión

NA

15071300

± 75±66

213189

+21+24

1473473

1600490

± 66± 64 **

±96± 72 **

1697 ± 80510 ± 65 **

232 ± 22167 ± 19 *

226 ± 23132 ± 20 **

235 ± 19146 ± 18 **

Ratas Wistar macho jóvenesfueron lesionadas mediantela administraciónde6 ug/ratade 6-ORDA. Los animalesshamrecibieronvehículo. El sacrificio de losanimalesse llevó a caboa diferentesdíasdespuésde la lesión. Los nivelesde NAy MHPG fueron determinadosposteriormentepor HPLC, considerandoalmetabolito de NA como indice de la velocidad de renovaciónde la amina. Losvaloresde la tablaesténexpresadoscomola media±ESMde 9 animales por grupo.* pcO.05y ** p<0.Ol respectoa los valoresde los animalessham(testde la ‘t” deStudent).

ShamLesión

12

20

30

ShamLesión

ShamLesión

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TABLA III

EFECTO DE LA ADMINISTRACiXON DE 6.HIDROXIDOPAMINA EN EL HAZNORADRENERGICO VENTRAL SOBRELAVELOCIDAD DE RENOVACION DE

NORADRENALINA EN BULBO RAQUIDEO

MHPG(pg/mg tej)

655 ± 38600 ± 17

627 ±26671 ± 28

600 ± 29638 ± 37

650 ±31627 ± 23

190 ± 10225 ± 10 *

163 ± 16159 ± 12

188 ±20179 ± 13

172 ± 19181 ± 14

(Para detalles metodológicos ver leyenda de la Tabla II).

TIEMPO(días)

GRUPO NA

1

12

20

30

ShamLesión

ShamLesión

ShamLesión

ShamLesión

* pcO.05respectoa los valoresde los animalessham(test de la “t” de Student).

Médula esp mal

En la medula espinal no se encontraron variaciones en los niveles de NAentreanimaleslesionadosy sham-operados(Tabla IV); pero si se observóun aumentosignificatico(30%) delos nivelesde sumetabolitosólo24horasdespuésde la lesión,tal y como muestra la Figura 10, indicando un incremento de la velocidad derenovaciónnoradrenérgicaen la médulaespinal1 díadespuésde la administraciónde la neurotoxina.

2. ESTUDIO SOBRE LA PARTICIPACION DEL SISTEMANORÁDRENERGICO CENTRAL EN LA. RESPUESTAHIPERTENSIVA INDUCIDA POR DEPRIVACION SOCIAL

2.1. MODELODEESTRESPORDEPRIVACIONSOCIAL:CARACTERIZACION DE LA RESPUESTAHIPERTENSIVA YVALIDACION DEL MODELO DE ESTRES

La deprivación social prolongada de ratasjóvenes ocasionó un aumentoprogresivotanto de la presión arterial sistólicacomodiastólica (FíO 11), que fuesignificativo antes de las dos semanasde aislamiento.Este estadohipe.rtensivollegabaa ser máximoy practicamenteestableen la tercerasemanade aislamiento.

Los animales aislados hipertensos no presentaban modificaciones apreciablesen la frecuencia cardíaca con respecto a sus controles agrupadosnormotensos(agrupados,460±18;aislados,457±11, en el día 30). Sin embargo> si se observarondiferenciasen el peso corporal de los animales agrupados y aislados al final delperiodo de aislamiento, aunque no llegaron a ser significativas (agrupados, 295 ±8;aislados, 314±5).

La determinación de los niveles plasmáticos de corticosteronafue laaproximaciónutilizadacomoindicadorde estrés.Los animalessometidosaestréspordeprivación social presentabanuna incremento significativo en el contenidoplasmáticode estahormonacorticoideduranteel aislamiento.Los valoresobtenidosaparecenen la Tabla V.

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TABLA IV

EFECTO DE LA ADMINISTRACION DE 6-HIDROXIDOPAMINA EN EL HAZNORADRENERGICO VENTRAL SOBRELA VELOCIDAD DE RENOVACION DE

NORADRENALINA EN MEDULA ESPINAL

GRUPO NA MHPG(pg/mg tej)

210 ±20203 ±17

230 ±26218 ± 16

215 ± 16222 ± 12

219 ±15226 ± 9

30 ± 143 ±1 **

31 ± 133 ± 2

35 ± 234 ± )~

31 ± 233 ± 1

(Para detalles metodológicos ver leyenda de la Tabla II).

TIEMPO(días)

1

12

20

30

ShamLesión

ShamLesión

ShamLesión

ShamLesión

** p-cO.0í respectoa los valoresde los animales sham (test de la “t” de Student).

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TIEMPO (dtas>

Fig. 11.- Desarrollo de la respuesta hipertensiva inducida por deprivación social:presión arterial sistólica y diastólica.

La presión arterial se determinó en animal conscientepor el métodoindirecto ‘ttail-cuff u (Buf¡ag 1973), Las ratas fueron acostumbradasa la medida depresión arterial durante tres días previos al aislamiento que se inició en el día 0. Losdatos se expresan como la media±ESMen grupos de 16-18 animales.* pcO.O5y ** p-C0.O1 respecto a los valores de los animalesagrupados(testde la “t’de Student).

*

30

TABLA V

EFECTO DE LA DEPRIVACION SOCIAL SOBRE LOS NWELES DECORTICOSTERONA PLASMÁTICOS

CORTICOSTERONA

(ug/dl>

TIEMPO

(días)

GRUPO

1 Agrupadas 4.9 ±1.2Aisladas 7.2 ±2.4

20 Agrupadas 4.1 ±1.2Aisladas 8.6 ±0.9 *

Los animalesfueronsacrificadospor la mañana(00.08-00.09h) y la sangrerecogidapara determinar posteriormentelos niveles de corticosteronaplasmáticosporradioinmunoensayo(paradetallesmetodológicosver apartado6.2. de métodos)1 y20 díastranscurridosde aislamientocontinuado.Los datosde la tabla se expresancomola media±ESM de gruposde 8 animales.* pcO.05 respectoa los valoresde los animalescontrolesagrupados(test de la “t’de Student).

2.2. EFECTO DE LA LESION CON 6-HIDROXiIDOPAMINA DELHAZ NORADRENERGICO VENTRAL SOBRELA RESPUESTAHIPERTENSIVAINDUCIDA PORDEPRIVACIONSOCIAL

fi. Efectode la lesióncon6-hidraddopamina delhaznoradrenérWcoventraldurante el desarroflo de la respuesta hipertonsiva inducida pordeprivación social

Con el fin de averiguarel posiblepapelquelos sistemascatecolaminérgicoscentralespodríandesempeñaren el desarrollode la respuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocial, se procedióa aislar a animaleslesionadoscon 6-OHDA enel HNV inmediatamentedespuésde producirsela lesión.

Como se observaen las Figuras 12 y 13 los animales lesionadosfueronincapacesde desarrollarla respuestahipertensivacaracterísticade la aplicacióndeestemodelo de estrés.Porotro lado,el estadohipertensivotransitorioquesehabíadetectadoen animaleslesionadosagrupados,y al que se hacía referenciaen elapartado1.1. de resultados,semanifestótambiénen los animaleslesionadosaisladosrecuperandoselas lecturasbasalesde presión arterial sistólica y diastólicaen unperiodode tiempode 72 horas.

No se apreciarondiferenciassignificativas en la frecuenciacardíacaentreningunode los cuatrogruposexperimentalesa lo largo del periodode aislamiento(shamagrupados,438±13; shamaislados,443±15; lesiónagrupados,435±12;lesiónaislados,446±15;en el día 30). Por otro lado, los animalesaislados,tanto simm-operados como lesionados,presentaronpesoscorporalessuperioresa los de susrespectivoscontroles agrupadostan solo a los treinta días de aislamiento;noobstante,esasdiferenciasencontradasentrelos distintos grupos no llegaron a sersignificativas (sham agrupados276~10; sham aislados,290±8;lesión agrupados,286±10;lesión aislados299+16).

66

SHAM

TIEMPO (dlas)

LESION

TIEMPO (Cas)

•1*

Aisladas

Agrupadas

Z Agrupadas

I Aisladas

30

Fig. 12.- Bloqueo de la respuesta hipertensiva inducida por deprivación social enanimales lesionados con 6-hidroxidopamina en el haz noradrenérgicoventral: presión arterial sistélica.

Los animales fueron aisladosinmediatamentedespuésde la inyecciónbilateralde 6 ug/rata de la neurotoxina(LESION) o vehículo(SHAM). La presiónarterial sistólica se determinó1 día antes (-1) y a diferentes días despuésde laoperaciónpor el métodoindirecto tttail~cuff . Los datosde la figura se expresancomola media±ESM engniposde 16-18 animales.* p.cO.OS y ** p.c0.01 respecto a los valores de tos animales sham agrupados;* pcO,01respectoa los valoresbasalesde los animaleslesión agrupadoso aislados(test de la ‘t’ de Student).

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LESION

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TIEMPO (dlas)

Fig. 13.- Bloqueo de la respuesta hipertensiva inducida por deprivación social enanimales lesionadoscon 6-hidroxidopamina en el haz noradrenérgicoventral: presión arterial diastólica.

(Paradetallesmetodológicosver leyendade la Fifura 12).

* pcO.O5 y ** p.c0.01 respecto a los valores de los animales sham agrupados;

* p.c0.01 respecto a los valores basales de los animales lesión agrupados o aislados(testde la ~fI de Student).

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Operaciónquirúrgica

2.2.2.Efectodelalesi6ncon6-hidroxidapaminadelhaznoradrenérgicovcfltrfliduranteel mantenimientode la respuestabiperteilafra inducida pordeprivaclánsocial

Dado quelos animaleslesionadosen el HNV y deprivadossocialmenteeranincapacesde desarrollar el estado hipertensivo inducido por el aislamientocontinuado, se procedió a la administraciónde la neurotoxina en animales yahipertensos,prolongandosu aislamientodespuésde la lesión por un períododetiempo de 20 días, con el objeto de evaluarsi los sistemas catecolaminérgicosafectadospor la lesión participaban no solo en la génesis sino también en elmantenimientode la respuestahipertensivaasociadaa la deprivaciónsocial.

Los animalesaisladosy lesionadospresentaronlecturasde presión arterialsistólica y diastólicasimilaresa los animalesaisladosshain (FIG. 14 y 15), lo quereflejaba que la lesión con 6-OHDA en el HNV era incapaz de producirmodificacionesen la respuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocialunavezqueaquellaestabaperfectamenteestablecida.

Tampocose apreciarondiferenciasni en la frecuenciacardíaca(agrupadossimm, 460±10;aisladossham,464±9;agrupadoslesión, 467±15;aisladoslesión,457+12 en el día 40) ni enel pesocorporalentreningunode los cuatrogrupos,sibien los animalesaislados(shamy lesión)poseíanciertatendenciaapresentarpesoscorporalessuperioresa susrespectivoscontrolesagrupadosal final del períododeaislamiento,sin quelasdiferenciasobservadasfueransignificativas(agrupadossham,395±14;aisladossham 418~14; agrupadoslesión,394±16;aisladoslesión,437±17).

3. ACTIVIDAD CATECOLAMINERGICACENTRAL

La determinaciónde losnivelesde catecolaminEis,asícomode susmetabolitos,en las diferentes estructurasanalizadas(elegidas en función de su conocidaparticipaciónen la regulacióncentral del sistemacardiovasculary en la respuestafisiológica al estrés), se llevaron a cabo a diferentes tiempos coincidiendo conaquellos en los que se había realizado el seguimientode la presiónarterialy queseconsideraronrelevantesen el desarrollo de las alteracionescardiovascularesobservadas.

En el caso del metabolito de NA, y como ya se ha explicadoen el apartado1.2. de resultados, se consideró a áquel como indice de la actividad neuronalnoradrenérgicaen las diversasregionesconsideradas.

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LESION

Aisladas

Agrupadas

**

Aisladas

Agrupadas

Fig. 14.- Efecto de la lesión con 6-hidroxidopamina en el haz noradrenérgicoventralsobre la presión arterial sistólica de animales hipertensos por deprivaciónsocial.

Los animalesfueron aisladosen el día 0. La administraciónde 9 ug/ratade6-OHDA (LESION) o vehículo(SHAM) se llevó a caboen el día 21 de aislamiento,prolongandoseéste por un períodode 20 díasmás, La presiónarterial sistólica sedeterminóporel métodoindirecto “tail-cuft”. Los datosde la figura seexpresancomola media±ESM en gruposde 16-18 animales.* p.cO.OS y ** pcO.01 respecto a los correspondientesvalores de los animalesagrupadosshamo agrupadoslesión (testde la ‘t” de Student).

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*

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Operaciónquirúrgica

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Operaciónquirúrgica

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Opera clOnquirurgica

TIEMPO (dias)

Fig. 15.- Erecto de la lesióncon 6-hidroxidopamina en el haz noradrenérgico ventralsobre la presión arterial diastólica de animales hipertensospor deprivaciónsocial.

(Para detalles metodológicos ver leyenda de la Figura 14).

* P<0~05 y ** pCO.Ol respectoa los correspondientesvalores de los animales

agrupadosshamo agrupadoslesión (test de la “t” de Student).

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Agrupadas

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3.1. EFECTO DEL ESTRES PORDEPRIVACION SOCIAL SOBRELA ACTIVIDAD DE LOS SISTEMAS CATECOLAMINERGICOSCENTRALES

Conobjetodepoderdeterminarsilosanimalessometidosal modelodeestréspor deprivación social presentabanmodificacionesen el contenidoendógenodecatecolaminasy/o en la actividadde estosmismossistemasde neurotransmisiónseprocedióa la determinaciónde los niveles de NA, AD y DA, asícomode MHPG,en diferentesestructuras,comosedescribeen el apartado6.1. de métodos.

3.1.1. Nivelesde catecolandnasendistintasestructuras

Hipotálamo

En la Figura16 semuestrademodoconjuntolosnivelesde NA, AID y DA enhipotálamo de animales aisladoshipertensosy sus correspondientescontrolesagrupadosnormotensos.En esta región cerebralno se observaronalteracionesenlos niveles de ningunade las tres aminasanalizadasa lo largo del tiempo comoconsecuenciadel aislamiento.

Bulbo raquídeo

Los resultados obtenidos en bulbo raquídeo para los mismos gruposexperimentalesaparecenen la Figura17. De manerasemejantea lo quesucedíaenel hipotálamo,el aislamientono produjovariacionessignificativasenel contenidodeNA, AD y DA a lo largodel períodoen quelos animalespermanecierondeprivadossocialmente.

Médulaespinal

Al igual queen el casode la determinacióndecatecolaminasenmédulaespinalde animalesshamy lesión (apartado1.2.1.> solamentese pudieron detectarsinningún problemalos nivelesde NA y DA que aparecenreflejadosen la Figura18,no encontrandosevariacionesen el contenidodeestasdosaminasentrelosanimalesaisladosy su respectivogrupo control de animalesagrupados.

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3.1.2. Velocidad de renovacián de naradrenalina en distintas e¡tn¡cttras

Mientras que los niveles de NA en el hipotálamono se alterabancomoconsecuenciade la deprivación social (TablaVI), los niveles de su metabolito-MHPG- aparecíansignificativamentedisminuidos(27%) en los animalesaisladoshipertensos,a partir de los 20 díasde aislamiento,conrelacióna] grupo control deanimalesagrupadosnormotensos(HG. 19), produciendoseconsecuentementeunadisminución de la velocidad de renovaciónnoradrenérgicaa nivel hipotalámicodurantela deprivaciónsocial.

En el casodel bulbo raquídeo,no se apreciaron variacionessignificativas enlos niveles de MHPG entre animalesaisladoshipertensosy animalesagrupadosnormotensos a lo largo del período de aislamiento (FIO. 20), así como tampocosehabíanapreciadomodificacionesen los niveles del neurotransmisorNA en estaestructuraduranteesemismo período(TablaVII).

La Figura21 refleja losnivelesdeMHPG en médulaespinaldurantelos treintadíasde aislamientoy, de modoconjunto,losnivelesde NA y su principal metabolitosemuestranen la TablaVIII. Paralelamentea lo quesucedíaen el bulbo raquídeo,no se observaron variaciones significativas en la velocidad de renovaciónnoradrenérgicade los animalesaisladoshipertensoscon relación a sus controlesagrupadosnormotensosen estaregión.

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TABLA VI

EFECTO DE LA DEPRIVACION SOCIAL SOBRE LA VELOCIDAD DERENOVACION DE NORADRENALINA EN HIPOTALAMO

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AgrupadasAisladas

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1678 ± 731599 ±65

216 ± 22224 ± 18

236 ± 20196 ± 16

240 ± 17170 ± 15 **

242 ±14179 ± 15 **

Los animalesfueron sacrificadostranscurridos0, 12, 20 y 30 díasde aislamientocontinuado, determinandosecon posterioridadlos niveles de NA y MHPG porHPLC,considerandoal metabolitodeNA comoíndicede la velocidadderenovaciónde la amina.Los valoresde la tabla estánexpresadoscomola media±ESM de 9animalespor grupo.** pcO.Ol respectoa los valoresde los animales agrupados(test de la “t” deStudent).

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TABLA VII

EFECTO DE LA DEPRIVACION SOCIAL SOBRE LA VELOCIDAD DERENOVACION DE NORADRENALINA EN BULBO RAQUíDEO

MHPG(pg/mg te»

AgrupadasAisladas

AgrupadasAisladas

AgrupadasAisladas

AgrupadasAisladas

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TABLA VIII

EFECTO DE LA DEPRIVACION SOCIAL SOBRE LA VELOCIDADRIENOVACION DE NORADRENALINA EN MEDULA ESPINAL

MHPG(pg¡mg tej)

AgrupadasAisladas

AgrupadasAisladas

AgrupadasAisladas

AgrupadasAisladas

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GRUPO NA

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(Ver leyendade la Tabla VI paradetallesmetodológicos).

3.2. ACTIVIDAD DE LOS SISTEMAS CATECOLAMINERGICOSCENTRALES EN ANIMALES LESIONADOS EN EL HAZNORADRENERGICOVENTRAL CON 6-HIDROXIDOPAMINAY DEPRIVADOS SOCIALME.NTE

Se lesionaronanimalesjóvenese, inmediatamentedespuésde llevarsea cabola lesión, los animales fueron distribuidos en cuatro grupos diferentes: shamagrupados,shamaislados,lesión agrupadosy lesión aislados,Los resultadosquesemostrarána continuaciónreflejan el contenidode catecolaminasy susnietabolitosde esoscuatro grupos,en distintasestructurasy procesadosa diferentestiempos.

3.2.1. Nivelesde catecolanjinasen distintasestructuras

Hipotálamo

Mientras que el aislamiento no produjo variaciones significativas en elcontenidode ningunade las trescatecolaminasen estaestructuracerebral,comosededucede los nivelessimilaresquepresentaronlos animalesshamagrupadosy shamaislados,la lesióncon6-OHDA disminuyósignificativamentelos valoresdeNAy AiD(FIG. 22 y 23), encontrandoseun descensode hastaun 70% en el caso deNA, y un65% en el de AD, tanto en los animales lesionadosagrupadoscomo en loslesionadosaislados a los 12, 20 y 30 días después de la lesión y simultáneoaislamiento.

Los nivelesde DA (FíO. 24) permanecieroninalteradosen los cuatrogruposanimalesdurantetodo el períodode tiempo observado.

La determinaciónde los niveles de catecolarninasen el bulbo raquídeonoseñalódiferenciasapreciablesen el contenidode los tresneurotransmisoresentreningunode los cuatro grupos consideradosy en ningtin momentoa lo largo deltiempo (FíO. 25, 26, y 27).

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3.2.2. Velocidadde renovaciánde noradrenallinaen distintas estructuram

La TablaIX refleja los nivelesdeNA y de MI-TPO enhipotálamodeanimalessham agrupados,sham aislados, lesión agrupadosy lesión aisladosa diferentestiempos.

A pesarde quelos nivelesde NA de animalesshamaisladosno diferían dclos de su correspondientegrupo control de animales sham agrupados,si seencontrarondiferenciassignificativasen el contenidode MHPG de estosmismosanimalesshamaisladoshipertensosdespuésde la segundasemanade aislamientocon respecto a los animales sham agrupadosnormotensos (FIEl. 30). Estadisminuciónsignificativaenel metabolitodeNA enel hipotálamodeanimalesshamaisladosindica una manifiesta disminución de la velocidad de renovacióny, portanto,de la actividadnoradrenérgicaa nivel hipotalámicoen animalessometidosadeprivaciónsocial.

Por lo querespectaa]os animaleslesionados,tantoagrupadoscomoaislados,se aprecióuna disminuciónconsiderable(70%) de los niveles delneurotransmisorhipotalámicocomo consecuenciade la destrucciónde aferenciasnoradrenérgicasmediantela aplicaciónde 6-OHDA, disminuciónque fue significativa apartir de los12 díasposterioresa la lesión, perono antes.De maneraparalelaa lo quesucedíacon el contenido de NA, su metabolito sufrió unaimportantedisminución en losanimaleslesionados,bien agrupados,bienaislados,a los 12, 20 y 30 días(FIEl. 30).

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TABLA IX

VELOCIDAD DE RIENOVACION DE NORADRENALINA EN HIPOTALAMOPROCEDENTE DE ANIMALES LESIONADOS CON 6-HIDROXIIDOPAMINA EN

EL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL Y DEPRIVADOS SOCIALMENTE

MHPG(pg/mg tej)

TIEMPO(días)

GRUPO NA

Sham agrupadasaisladas

Lesiónagrupadasaisladas

Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

1470 ± 701438 ±451291 ± 601285 ± 56

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Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

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126 ±21

Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

1623 ±531617 ±65480 ± 68 **

466 ± 73 00

La lesión se realizó mediantela inyección bilateral de 6 ug/rata de 6-ORDA ovehículoenanimalesjóvenesquefueroninmediatamenteaislados.Los nivelesdeNAy MHPG fueron determinadospor HPLC a distintos tiempos despuésde la lesióny aislamientoconsecutivo,considerandoal metabolitode NA como índice de lavelocidadde renovaciónde la anima.Lesvaloresde ¡a tabla estánexpresadoscomola media±ESM de 8 animalespor grupo.* pscO.O5 y ** p<0.Ol respectoa los valores de los animalesshamagrupados;00 p-cO.0l respectoa los valoresde los animalesshamaislados(testde la V deStudent).

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El contenidode MHPG en bulbo raquídeono difería significativamentealcompararanimalesshamaisladosconanimalesshamagrupadosa lo largodel tiempo(FIEl. 31). Sin embargo,se encontróuna aumentosignificativo en los nivelesdelmetabolitoen los animaleslesionados,tanto agrupadoscomo aislados,tan solo a 1día despuésde la administraciónde la neurotoxina(FIEl. 31).

Médulaespinal

La TablaXI refleja los niveles de NA y su metabolitoen médulaespinaldelos cuatro gruposexperimentales.No se apreciarondiferenciassignificativasen elcontenido de este neurotransmisorentreningunode los grupos establecidosa lolargo del tiempo.

Tampocoseencontraronvariacionesen los nivelesde MHPG entreanimalesshamagrupadosy shamaislados;pero si seobservóun aumentosignificativo en elcontenidodel metabolitode animaleslesionados,tanto agrupadoscomoaislados,24horasdespuésde la lesión;mientrasquea 12, 20 y 30 díaslos nive]esde MHPG nodiferíanentrelos cuatrogruposconsiderados(FIEl. 32).

3.3. ACrIVIDAD DE LOS SISTEMAS CATECOLAMINERGICOSCENTRALES EN ANIMALES DEPRIVADOS SOCIAl-aMENTE YPOSTERIORMENTELESIONADOS CON 6..HIDROXIDOPAMINAEN EL HAZ NORADRENERGICOVENTRAL

Habiendoseobservadorespuestascardiovascularesmuy diferentesen el casode que la lesión con 6-OHDA en el HNV se llevara a caboanteso despuésdesometera los animalesa un aislamientocontinuadoy, ya quese habíarealizadoelestudio de la actividad catecolaminérgícacentral cuandola lesión precedíaa ladeprivaciónsocial, parecíaoportunoel analizar también las alteracionesde lossistemasaminérgicoscentralesen animalesdeprivadossocialmenteque,unavez quehabían desarrolladola respuestahipertensiva,fueran lesionadostal y como sedescribeen el apartado3.1. de métodos.

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TABLA X

VELOCIDAD DE RENOVACION DE NORADRENALINA EN BULBO RAOUIDEOPROCEDENTE DE ANIMALES LESIONADOS CON 6-IIIDORXIDOPAMINA EN

EL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL Y DEPRIVADOS SOCIALMENTE

MHPG(pg/mg tej)

TIEMPO(días)

GRUPO NA

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Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

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(Paradetallesmetodológicosver leyendade la Tabla IX).

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la tV de Student).

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TABLA XI

VELOCIDAD DE RENOVACION DE NORADRENALINA EN MEDULA ESPINALPROCEDENTE DE ANIMALES LESIONADOS CON 6-HIDROXIDOPAMINA EN

EL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL Y DEPRWADOS SOCIALMENTE

MHPG(pg/mgtej)

Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

Sham agrupadasaisladas

Lesión agrupadasaisladas

(Paradetallesmetodológicosver leyendade la Tabla IX).

** pcOOlrespectoa los valoresde los animalessimm agrupadoso aislados(testdela “t1’ de Student).

TIEMPO(días)

GRUPO NA

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226 ±231 ±

215 ±

227 ±

218 ±

233 ±

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39 ± 140 ± 237 ± 236 ±1

211 ±219 ±

220 ±

223 ±

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3.3.1.Niveles de catacalaminasen ditintas estructuras

Hipotálamo

El análisisde NA y AD en estaestructuracerebralreveló unadisminuciónestadísticamentesignificativa en los nivelesde los dos neurotransmisoresen el casode los animalesagrupadoslesión y aisladoslesión cuandose compararoncon losanimalesagrupadosshamo aisladossimm respectivamente(FIG.33 y 34).

Enel casode la DA no seobservóningunamodificaciónensu contenidoentreningunode los gruposconsideradosy en ningunode los tiempos analizados,tal ycomo semuestraen la Figura 35.

Bulbo raquídeo

Por lo querespectaa estaestructuracerebral,no se apreciaronalteracionesen los nivelesde ningunade las tres catecolaminasanalizadasni antes,ni despuésde la lesión con 6-OHDA entreninguno de los gruposconsiderados(FIEl. 36, 37 y38).

Médulaespinal

Las Figuras 39 y 40 reflejan el contenidode NA y DA respectivamentedeanimalesagrupadosy aislados,tanto sImm comolesión, no habiendoseencontradodiferenciassignificativas entre ninguno de los cuatro gruposy en ningunode lostiempos analizados.

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3.31. Velocidad de renovaciónde noradrenaflnaendistintasestructuras

Los animalesaisladospresentaronunadisminuciónsignificativade los nivelesde MHPG en hipotálamoa los 20 días desdeel inicio del aislamientocuandosecomparécon los nivelesdel metabolitoen el grupo de animalesagrupados.Estadisminución semanteníaa lo largo del períodode aislamientosin afectarsepor elhechode versesometidosa la operaciónquirúrgica(similar a la de los animaleslesionados)dondese les administrévehículo(FíO. 41).

Por otro lado, la lesión con 6-01-IDA en los animalesagrupadosindujo unadisminuciónsignificativa en el contenidodel metabolitoen estaestructuracerebralmanifiestaya a los 10 díastrasla administraciónde la neurotoxina.En el casode losanimalesaisladosy lesionadostambiénse observéun descensoen los niveles deMHPG queeraestadísticamentesignificativo cuandosecomparéconel valor de losanimalesaisladossham(FíO. 41).

En cuantoa los nivelesde NA queaparecenen la TablaXII junto a los de sumetabolíto, sólo la lesión produjo una disminución en el contenido delneurotransmisormanifiestaa partir de los 10 díasdespuésde la administracióndela neurotoxinatanto en los animalesagrupadoscomo aislados.

La TablaXIII muestraconjuntamentelos nivelesdeNA y MHPO en el bulboraquídeode los cuatrogruposexperimentalesconsiderados,mientrasque la Figura42 representaúnicamentelos valoresdel metabolito.No se apreciarondiferenciassignificativasni en el contenidode la amina,ni de su metabolito,entreningunodelos gruposy en ningunode los tiemposconsiderados.

No seobservaronvariacionesen el contenidode NA, ni de MHPO,en médulaespinal antes o despuésde la lesión, como tampoco en ningún momento delaislamientode los animales.Estos resultadosaparecenconjuntamenteen la TablaXIV y tan sólo los nivelesdel metabolitosemuestranen la Figura43.

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TABLA XIII

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AISLADOS HIPERTENSOS

MHPG(pg/mg tej)

TIEMPO(días)

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GRUPO

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AgrupadasAisladas

AgrupadasAisladasAgrupadasAisladas

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322 ±224 ±

179 ±

162 ±

1612 **

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318 ± 24205 ± 13 **

176 ± 19 **

155 ± 15 o

Se estudióel efecto de la lesión con 6-OHDA (9 ug/rata)o vehículoen animalessometidosa deprivaciónsocial durante20 días. Despuésde la lesión,efectuadaenel día 21 de aislamiento,los animalespermanecieronaisladosdurante20 díasmás.Los niveles de NA y MHPG fueron determinadospor HPLC a distintos tiemposantesde la lesión (1 y 12 díasde aislamiento)y despuésde la misma(30 y 40 díasde aislamiento),considerandoal metabolitode NA como índicede la velocidadderenovaciónde la amina.Los valoresestánexpresadoscomo la media± ESM de 8animalespor grupo.* p<0~0S y ** pc0.01 respectoa los valoresde los animales agrupadossham;O p<O.OS y 00 p’CO5Ol respectoa los valoresde los animalesaisladossham(testde la “tY de Student).

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TABLA XIII

EFECTO DE LA LESION CON 6-HIDROXIDOPAMINA SOBRE LA VELOCIDADDE RENOVACION DE NORADRENALINA EN BULBO RAOUIDEO DE

ANIMALES AISLADOS HIPERTENSOS

MHPG(pg/mg tej)

TIEMPO(días)

GRUPO

AgrupadasAisladas

AgrupadasAisladas

AgrupadasAisladasAgrupadasAisladas

AgrupadasAisladasAgrupadasAisladas

660±29654 ± 17

649 ± 21655 ± 18

673 ± 24680 ±31668 ± 27674 ± 20

234 ± 23245 ± 19

246 ± 15251±17

255 ±21269 ±13243 ± 16264 ± 23

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654 +

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248 ±253 ±265 ±

260 ±

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(Ver leyendade la Tabla XII paradetallesmetodológicos)5

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TABLA XIV

EFECTO DE LA LESION CON 6.HIDROXIDOPAMINA SOBRE LA VELOCIDADDE RENOVACION DE NORADRENALINA EN MEDULA ESPINAL DE

ANIMALES AISLADOS HIPERTENSOS

TIEMPO GRUPO NA MHPG(días) (pg/mg tej)

1 Agrupadas 235 ±18 35 ±2Aisladas 243 ±15 39 ±2

20 Agrupadas 223 ±22 38 ±2Aisladas 230±15 40±1

30 Agrupadas sham 230 ±16 41 ± 2Aisladas sham 237 ±27 42 ±1Agrupadas lesión 241 ±11 39 ±2Aisladas lesión 233 ±19 37 ±3

40 Agrupadas simm 227 ±23 42 ±1Aisladas sham 239 ±14 44 ±3Agrupadas lesión 242±12 39 ±2Aisladas lesión 226 ±18 40 ±3

(Ver leyendade la TablaXII paradetallesmetodológicos).

DISCUSION

1. CARAGrERIZACION DE LA RESPUESTAHIPERTENSIVA EN ELMODELO DE DEPRJVACION SOCIAL Y VALIDACION DEL MISMOCOMO MODELO DE ESTRES

La premisa inicial en esteestudiosobre los mecanismoscatecolaminérgicoscentralesimplicadosen los efectoscardiovascularesinducidospor deprivaciónsocialfue la convenientecaracterizacióndel modeloexperimentalelegido.

Así, en primer lugar, se procedió a determinarla respuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocial,replicandolos hallazgosdeNaranjoy Fuentes(1985)quienesobservaronque el aislamientode ratasjóvenesproducíaun incrementodela presión arterial sistólica. Efectivamente, los animales jóvenes deprivadossocialmente presentaronlecturaselevadasno solamentede la presión arterialsistólica, sino también de la presión arterial diastólica, incrementoque alcanzóvaloresmáximosy prácticamenteestablesen la tercerasemanade aislamiento.

La discrepanciade nuestrosresultadosy los de Naranjoy Fuentes(1985)enrelacióna la frecuenciacardíaca,que no seve modificadaduranteel períodoen quelos animalesfueron sometidosa deprivación social en este trabajo, puedeestarfundamentadaen las distintasestirpesde ratas Wistar empleadasen cadacasoy,consecuentemente,en la diferentereactividadde cadauna de ellasal someterseala misma situación. De acuerdocon la hipótesisanterior, algunos autoreshanexplicadola diversidadde las respuestasobservadaspara distintosgrupos de ratasSI-IR y ratas Sprague-Dawleyante un mismo estímulo en función de lascaracterísticasgenéticaspropiasde cadagrupoanimal(Trippodoy Frohlich, 1981).

En una segundaaproximaciónal modelo de deprivaciónsocial, se trató devalidar dicho paradigmaexperimentalcomo modelode estrés.

Definir con precisiónmarcadoresbiológicospara el estrésentrañauna grandificultad debido a la especificidaddel efectoqueproducecadamodelo sobre losdistintosparámetrosfisiológicos.A pesarde ello, escierto queen todoslos casosseverifica una activacióndel eje HHA (Selye, 1976; Reisine,1986) que conlíeva, enúltimo término, un aumentode los nivelesde OC circulantes.En este sentido,seencuentranlos trabajosdeTakahashiy cols, (1992),Vogel y Jensh(1988)y Natelsony cols. (1981) indicando que, mientraslos niveles de catecolaminasplasmáticasexpresanla intensidaddel estréspercibidocuandola naturalezade aquéles aguda,laconcentracióndecorticosteronaenplasmareflejamásadecuadamente¡a magnituddel estréscuandoéste presentaun caráctercrónico o senncrónico.Por lo tanto,estaríajustificada la determinaciónde corticosteronaplasmáticacomo índice delestrésinducidopor deprivaciónsocial,

117

Así, los niveles plasmáticos de corticosteronase elevaron de manerasignificativa comoconsecuenciadel aislamiento,coincidiendoconlas observacionesde Bennety Gardiner(1978) empleandoel mismo modeloexperimentalen ratasadultas.Sin embargo,las variacionesdetectadasen los niveles de corticosteronaplasmáticosaunquesignificativasson,ennuestrocaso,sensiblementeinferioresa lasdescritaspor aquellosautores.Estasdiferenciaspodríanexplicarseen función de ladistintaedadde los animalesempleadoso de la horadel día a la queseefectuólatoma demuestras,ya quepuedemodificarde forma radical los resultadosdebidoalritmo circadiano de la corticosterona(Shimoda y cols., 1988). Cabe tambiénlaposibilidad de que se trate de diferenciasmetodológicasdel radioinmunoensayoempleadoen cadacaso.

a MODIFICACION DELA ACTIVIDAD NORADRENERGICACEN’IXAL ENEL TRANSCURSODEL ESTRESPORDEPRIVACION SOCIAL

Son numerososlos estudiosque revelanmodificacionesde la actividadde lasneuronascatecolaminérgicasen respuestaa una gran variedad de estímulosestresantes.Con esta premisa, y conocida la manifiesta contribución de lascatecolaminasen la regulacióncardiovascular,seplanteabala posibilidadde que larespuestahipertensivaobservadaen el transcursodel estréspor deprivaciónsocialestuvieramediadapor alteracionesde la transmisióncatecolaminérgicaen el SNC.

En nuestras condiciones experimentales,la modificación más relevanteencontradadespuésde sometera los animalesal modelo de deprivaciónsocial fueunadisminucióndel tononoradrenérgicohipotalámico,reflejadoporel descensodelos nivelesdel metabolitode NA (MHPG) en estaestructuraa los 20 díasdesdeelinicio del aislamiento.Tanto el sistema adrenérgicocomo dopaminérgicono semodificó en el transcursodel estrésen ningunade las estructurasanalizadas.

118

Sí la mencionadavariaciónen el tono noradrenérgicoduranteel aislamientoestácorrelacionadaconel aumentode la PA es,porel momento,sólounahipótesis,puestoque también es posible que dicha variación sea reflejo de otros eventosfisiológicosque acompañanal estrés(Weissy cols., 1989)y que han sido asociados,igualmente, con modificaciones del tono catecolaminérgico central. Estaconsideraciónalcanzamayor relevanciaal tratarsedel hipotálamo,región cerebralque juega un papel fundamental en la coordinación de las respuestascomportamentalesy neuroendocrinas(Swansony Sawchenko,1983).Porel contrario,el bulbo raquídeo y la médula espinal, son zonas que desempeñan,casiexclusivamente,funcionesautónomas,comoel controlcardiovascular,sin aparentesimplicacionesen el funcionalismoendocrino.

La reducción de la velocidad de renovaciónde NA en hipotálamoque seobservaen las ratas aisladascoincide con los resultados obtenidospara otrosmodelosexperimentalesde hipertensión.Así, Sautely cols. (1988a)encontraronunadisminución de la actividad de este sistema de neurotransmisiónen diferentesnúcleoshipotalámicosde ratasgenéticamentehipertensasde la razaLyon, resultadosque son coincidentescon los de Wijnen y cols. (1980) en ratasSHR.

Mitchell y Lawler (1989)hansugerido,del mismo modo,la participacióndelsistemanoradrenérgicohipotalámicoen la génesisde la hipertensión,al observarqueratas BHR (con hipertensiónlábil y sometidas a un modelo de estrés quepreviamentesehabíademostradoinduciaunaelevaciónde la PA) presentabanunadisminución de la velocidadde renovaciónde NA en los núcleosventromedialyparaventriculardel hipotálamo.

Pareceser quela reducidaactividadde las terminalesnoradrenérgicasen laregión anterior hipotalámica en los casos antes mencionadospodría estarestrechamenterelacionadacon el desarrollode la hipertensión,ya que a estazonase le atribuyeunafunciónvasodepresora(Philippuy cols., 1979)y, al mismotiempo,moduladoradel reflejo barorreceptor(Hilton y Spyer, 1977) por medio de laestimulaciónde receptoresalfa-adrenérgicosa travésde la liberación local de NA(Sautely cols., 1988b).

Igualmente,seha encontradounadisminuciónde la velocidadde renovaciónde NA asociadaa otros modelosexperimentalesde hipertensiónno genéticos.Talesel casode De Champlainy Van Amerigen(1981) en ratasDOCA-saly de Wijneny cols. (1980)en ratascon hipertensiónrenal.

119

Es preciso señalarque, por e] contrario, durante el estrésagudo sueleverificarseunaactivacióndel sistemanoradrenérgicoen distintasregionescerebrales,necesariapara respondera las demandasmás inmediatasdel organismo(Dunn,1988).

En relación a la inalterabilidadde la actividadadrenérgicay dopaminérgicahipotalámica se encuentranlos resultadosde Fuxe y cols. (1975) en ratasSI-IRrespectoa sus controlesWKY. Al mismo tiempo, la ausenciadeefecto sobreesteúltinio sistemade neurotransmisiónen nuestromodelono excluiría, totalmente,suparticipaciónen el desarrollode la hipertensión.Las terminalesdopaminérgicasenel hipotálamo no sólo desempeñan funciones vasculares, sino tambiéncomportamentalesy neuroendocrinas(I-Iókfelt y cols., 1973), queestánpatentesenel transcursodel estrés, y que podrían contrarrestarel efecto cardiovascularintrínsecode las mismas.

Analizando los resultadosen las otras dos estructuras,bulbo raquídeoymédulaespinal, es posible que la similitud encontradaen los diferentessistemascatecolaminérgicosconsideradosentre animalesaisladosy agrupadosno refleje,exactamente,la refractariedadde dichos sistemasanteel estrés.Puedeser que,debido a la disposición de los neurotransmisoresen diferentesnúcleosdentro deestasregiones,la ausenciaaparentede efecto representeel resultadoneto de laactivacióno inhibición simultáneade diversaspoblaciones,cuyosefectos,por lo quese refiereal control cardiovascular,seancontrapuestos(Pately Schmid,1987; Reisy cols., 1987). Esto sucedería, por ejemplo, en el caso de las poblacionesnoradrenérgicasdel bulbo raquídeoAl en la CVLB y A2 en el NTS, así como paralas poblacionesadrenérgicasC2 y Cl localizadasen esta misma región cerebral(Louisy cols., 1987).

3. EFECTODE LA ADMINISTRACION DE 6-HIDROXIDOPÁMINA ENEL HAZ NORADRENERGICO VENTRAL SOBRE LOS SISTEMASCATEcOLAMINERGIcOSCENTRALES

Parecenecesario,antesde valorar las consecuenciasde la administracióndela neurotoxinasobrelos sistemascatecolaminérgicoscentrales,justificar el empleode 6-OHDA, así como la elección del HNV para su administración,comoaproximaciónfarmacológicaque nos permitiera confirmar la hipótesis de trabajoplanteadaal inicio de esteestudio.

120

La importanciade la 6-ONDA comoagenteneurotóxicoradicaen que esteanálogode NA dirige sus accionescitotóxicasselectivamente,al acumularseconexclusividadenneuronascatecolaminérgicas.Estehechohapermitidoqueseaunade lasherramientasde trabajomásutilizadasen la investigaciónbásicade la funciónde los sistemas de neurotransmisión monoaminérgicos en la regulacióncardiovascular,comportamentalo endocrina(Van denBuusey cols., 1984; Cole yRobins, 1987; Haasy George,1989).

Son numerososlos trabajos que utilizan 6-ONDA en el estudio de losmecanismospatogénicosqueoriginan un aumentode la PA en diferentesmodelosde hipertensiónanimal. En relacióna lo anteriormenteexpuestoencontramoslostrabajosde Dargie y cols. (1976)en ratascon hipertensiónrenovascular,donde laadministraciónintracisterna] de 6-ONDA previenela elevación de la PA y elincrementode los niveles de NA plasmáticoscaracterísticosde este modelo dehipertensión.Del mismo modo, Van den Buusey cols. (1986) observaronque lalesión conestamismaneurotoxinaatenuabael desarrollode la hipertensiónenratasespontáneamentehipertensas.

La relevanciacardiovascularde las vías noradrenérgicasascendentesestábasadaen la profunda inervación queestructurastales como el hipotálamoo lacorteza cerebral reciben desdeneuronasnoradrenérgicassituadasen regionespontino-bulbares (Lindvall y Bjñrklund, 1974). Del mismo modo, núcleoshipotalámicosproyectandensamenteal NTS dondetiene lugar la primerasinapsisde las aferenciasbarorreceptoras(Palkovits1980).De estamanera,áreasimplicadasen la regulación básica del sistema cardiovascularestán ligadas a centrosrelacionadosconlas respuestascomportamentales,emocionalesy hormonalesfrentea estímulosambientales(Kornery cols., 1972; Van den Buuse,1990).

Teniendoen cuentaestasconsideraciones,la eleccióndelHNV comolugar deadministraciónde la neurotoxinase realizó en basea que este tractoascendenteproporcionala principal inervación noradrenérgicadel hipotálamodesdegruposcelularessituadosen regionespontino-bulbaresde reconocidaparticipaciónen laregulación cardiovascular(Ungerstedt,1971) y, asimismo,el hipotálamoes unaestructuracuya intervenciónen muchasde las respuestasfisiológicas al estrésnoadmiteningunaduda(Swansony Sawchenko,1983; Spyer, 1989).

En general,existe unabuenacorrelaciónentrela reducciónen el contenidode catecolaminasy la accióndegenerativade la neurotoxinaa nivel centralcomoperiférico(Kostrzeway Jacobowitz,1974; Sudo,1985),de tal modoquelos nivelesdeaminaspuedenserconsideradosun bueníndicebioquímicodelgradode la lesiónocasionadapor 6-ONDA (Jonsson,1980).

121

La administraciónde la neurotoxinaproduceunadisminucióndel contenidohipotalámicode NA y de su metabolitoMHPG, asícomode AD a partir de los 12días, sin originar ninguna modificación en la actividad de estos dos sistemasdeneurotransmisiónen el bulboraquídeo,ni en la médulaespina].De modoanálogo,los nivelesde DA tampocose modifican por efectode la lesión en ningunade lasestructurasanalizadas.

La inervaciónnoradrenérgicahipotalárnicaseoriginaen gruposcelularesdelbulboraquídeoquecorren,preferentemente,atravésdel HNV (Palkovits,1981).Laslesionescon 6-OHDA en este tractonoradrenérgicoprovocanuna disminucióndelos niveles de NA hipotalámica(Mitchell y cols., 1990; Cole y Robbins, 1987),manteniendointactala inervacióndopaminérgica.Ello concuerdaperfectamenteconnuestros resultados,donde encontramostras la lesión una disminución en elcontenidode NA enel hipotálamo(70%), mientrasquelos nivelesde DA no sevenmodificados.

Paralelamente,la pérdidade neuronasnoradrenérgicas,asícomo la posiblealteraciónde las enzimasde síntesisy, tal vez, del metabolismodeestamonoaminapor efectode la neurotoxina,originan tambiénuna disminuciónen la velocidadderenovaciónde NA trasla administraciónde 6-01-IDA, queviene reflejadapor losniveles de su principalmetabolito: MHPG (Kostrzeway Jacobowitz,1974).

Por otro lado, se hanencontradoevidenciassobre la existenciade un tractoadrenérgicoqueascenderíadesdela región Cl bulbarenviandoproyeccioneshaciael hipotálamo(Fuller, 1982). La estimulacióneléctrica de esta región aumentalaliberacióndeAD hipotalámica,mientrásquela estimulacióncercana,perofueradeella, no afectaríaa la liberaciónde catecolaminasenel hipotálamo(Ward-Routledgey Marsden,1988). Así, en nuestrocaso, la administraciónde 6-OHDA en el HNVproduceuna marcadadisminución de los niveles de AD hipotalámicaque podríadebersea un deteriorosimultáneoocasionadoa dichasproyeccionesadrenérgicasalefectuarsela lesión.

Bajo nuestrascondicionesexperimentales,la lesión con 6-OHDA no tieneefectosobre los niveles de catecolaminasen el bulbo raquídeo.Paraexplicarestafalta de degeneraciónretrógrada,sepuedeespecularqueel períodoenel quesehaflevado a cabo el seguimientode las variacionesbioquímicasconsecuenciade lalesión con 6-OHDA seainsuficienteparaobservardichasalteracionesya que,segúnalgunosautores,pareceser queesteprocesoen el SNCes lento y progresivo,y loscuerposcelularesno sedegeneranhastavarios mesesdespuésde la administraciónde la neurotoxina(Thoeneny Tranzer,1973).

122

4. IMPLICACION DEL SISTEMA NORADRENEROICO CENTRAL EN LARESPUESTAHIPERTENSIVA AL ESTRES POR DEPIUVACION SOCIAL

4.1. PREVENCION DE LA RESPUESTAHIPERTENSIVA INDUCIDA PORDEPRIVACION SOCIAL EN ANIMALES LESIONADOS EN EL HAZNORADRENERGICOVENTRAL

El papeldel sistemanoradrenérgicocentral en el desarrollode la respuestahipertensivaal estréspor deprivaciónsocial sepusodemanifiestomediantela lesióndel HNV por administraciónde 6-OHDA previa al aislamiento.

La administración de la neurotoxina induce un descensoen los niveleshipotalámicosde NA, AD y MHPG, sin que se observaranalteracionesen esosmismossistemasen las demásregionesanalizadas,asícomotampocoen los nivelesde DA. Estareducciónen el contenidode catecolaminascentralesestáde acuerdoconel procesodegenerativoocasionadopor la neurotoxina(Sudo, 1985).

Los animaleslesionadosy aisladosson incapacesde generarla respuestahipertensiva,en contraposicióna lo queocurreen la rata con su SNC intacto queregistralecturaselevadasde la PA sistólicay diastólica a partir de los 12 díasdeaislamientocontinuado.

Por tanto, la integridaddel HNV pareceser crítica para el desarrollodc larespuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocial,De acuerdocon estehecho,la destrucciónde terminalesnerviosascatecolaminérgicasen el hipotálamopor 6-01-IDA no alterala presiónarterial basalpero si antagonizala elevaciónde la PAprovocadapor estimulacióneléctrica(Przunteky cols., 1971).

Cabeañadiraquí quepara el casode la rataSI-IR seha puestode manifiestoque la lesión intracerebroventricular(i.c.v5) con 6-ORDA previeneel desarrollodela hipertensión(Erinoff y cols., 1975; Kubo y Hashimoto,1978). Contrariamente,cuandola lesión seefectúapor microinyecciónde la neurotoxinaen las principalesbandasnoradrenérgicasascendentesventraly dorsal,el desarrollode la hipertensiónno seve afectadopor la lesión (Van de Buusey cols., 1984).Las diferenciaspuedendeberseal efectode la neurotoxinasobre los distintos sistemascatecolaminérgicossegúnla vía de administraciónutilizadaencadacaso,Mientrasquela administraciónlocal de 6-OHDA producela destrucciónde NA, enel casode la ruta i.c.v. tambiénseafectanlos sistemasDA y AD.

123

En conclusiónpodemosafirmar que,mientrasqueen la respuestahipertensivaal estrésla inervaciónprosencefálicanoradrenérgicapareceser trascendente,encambio no desempeñael mismo papel preponderanteen otros modelos dehipertensiónno relacionadosconla aplicaciónde un estímuloaversivo,

4.2. INALTERABILIDAD DE LA PRESIONARTERIAL PORLA LESIONDELHAZ NORADRENERGICOVENTRAL EN ANIMALES HIPERTENSOSPORDEPRIVACION SOCIAL

Con el fin de determinarsi la integridaddel HNV eracrítica no sólo en eldesarrollo,sinotambiénen el mantenimientode la respuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocial se procedió a lesionar con 6-OHDA animalesdeprivadossocialrnentepor un períodode tiempo de 20 díasqueya hubierandesarrolladolarespuestahipertensivacaracterísticadeestemodelo de estrés.

La administraciónde la neurotoxinaproduceuna disminuciónde los niveleshipotalámicosde NA, MHPGy AD transcurridos10 díasde la lesión,sin observarsemodificacionesen estos sistemasde neurotransmisión,así como tampocoen losnivelesde DA, en ningunadelasotrasdosestructurasanalizadas.Las modificacionesencontradasen los sistemas catecolaminérgicoscentrales son similares a lasregistradascuandola lesiónerapreviaa la deprivaciónsocial,indicandounaestrechacorrelaciónentrelas alteracionesbioquímicasobservadasy la administraciónde laneurotoxina.

Las lecturasde PA, tanto sistólicacomodiastólica, semantienenelevadasenel caso de que la lesión sucedaal aislamiento, contrariamentea lo que sucedíacuandolos animaleseran lesionadosantesde la aplicacióndel modelo de estrés.

Hauslery cois. (1972a, 1972b)obtuvieronunos resultadosmuy similaresenratas SHR. Así, la inyección de 6-OHDA en ratas espontáneamentehipertensasantesdel desarrollode la hipertensiónpreveníala progresivaelevaciónde la PA,mientras que la administración de la neurotoxina en ratas adultas SHR conhipertensiónestablecidacausabasolamenteunacaidade PAde caráctertransitorioy débil. Un efecto preventivo, análogo al mencionado,ha sido observadopordiferentesinvestigadoresenotro tipo de ratashipertensas(Ikeday cols,, 1976;Clarky cols., 1972).

124

El análisis de los últimos resultadosexpuestossugiereque el HNV puededesempeñarun papelen el inicio, pero no en el mantenimiento,de la hipertensiónobservadaen el transcursodel estréspor deprivación social. De este modo, losmecanismoscentralesregidospor neuronasmonoaminérgicasson importantes,almenosen parte,en el desarrollode dicha respuestahipertensiva.No obstante,elmantenimientode las lecturaselevadasde PA dependeríade otros procesos,tal vezperiféricos, que se activarían en un segundo lugar, permitiendoque el estadohipertensivopersistieraen el tiempo.

5. CORRELACIONENTRE LA VARIACION DE LA PRESIONARTERIAL YLA MODIFICACION DE LA ACIIVIIDAD NORADRENERQICACENTRALINMEDIATAMENTE DESPUESDE LA ADMINISTRACION DE6-HEDROXIDOPAMINA EN EL HAZ NORADRENERQICO VENTRAL

Cuandolesionamosel HNV en animalesjóvenesobservamosqueseproducíaun estadohipertensivotransitorioa las 24 horas despuésde la administraciónde laneurotoxina,recuperandoselas lecturasbasalesde PA sistólica y diastólicaen unespaciobrevede tiempo (3-4 días). Dicho incrementode PA era efectodirecto dela lesión y no del aislamiento,ya que se presentabaen animaleslesionados,tantoagrupadoscomoaislados,y no teníalugaren los animalessometidosa la operaciónficticia (Sham).

Por otro lado, las variacionesen la neurotrasmisiónnoradrenérgicacentralocasionadaspor la administraciónde 6-01-IDA, a las quesehahechoalusiónen losapartadosanteriores,no sepodíancorrelacionarconla modificaciónen la PA un díadespuésde la inyección de la neurotoxina puesto que no existía simultaneidadtemporalentreambossucesos,

Sin embargo,se encontraronalgunoscambiosen la actividadnoradrenérgicacentral se encontraronen esemismo períodode tiempo en dos de las estructurasanalizadas.El aumentode los niveles del metabolito de NA (MHPG) en bulboraquídeoy médulaespinalsí parecíapoderestarsintonizadocon la elevaciónde laPA que acontecíaen esemismo momento.

125

Resultadifícil el determinarsi el aumentodeltono noradrenérgicoobservadoen estasestructurases causao consecuenciadel estadohipertensivotransitorio,Nomuray Okamura(1989)describenquelosnivelesdeMHPG enel bulboraquídeoson más elevados en ratas SHR que en sus controles normotensosWKY,correlacionandola alteraciónde esteparámetrobioquímicoen dicha regióncerebralcon la hipertensiónquepresentanlas ratasSHR.

Enotromodeloexperimentaldehipertensión,Shalitay cois. (1982)relacionan,de nuevo,el aumentode la velocidadde recambiode NA enbulboraquídeocon laslecturaselevadasde presiónarterialmanifiestaen las ratasDOCA-sal.

En cuantoa la médulaespinal,algunosautoreshandescritoun incrementodela actividad noradrenérgicaen esta estructura en animales genéticamentehipertensos,sugiriendo su implicación, de algún modo, en el dasarrollode lahipertensiónen estosanimales(l-lowe y cols., 1981).

Nuestrosresultados,de acuerdocon lo anterior,permitiríanespecularqueelincrementode la actividad noradrenérgicaen el bulbo raquídeoy en la médulaespinal pudiera constituir el suceso final que en el SNC contribuiría aldesencadenamientode eseestadohipertensivoefímero.

126

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CONCLUSIONES

1.-. Los animalesjóvenesdeprivados socialmentepresentanlecturaselevadasdepresiónarterialsistólicay diastólica.Desdeel puntocte vistaneuroquimico,el estréspor deprivación social produce una disminuciónde la actividad noradrenérgicahipotalámica,que se refleja en un descensoen los niveles del me-tabolito denoradrenalina(MHPG), hechoprobablementerelacionadocon el incrementode lapresiónarterial manifiestoen los animalesaislados.

2.- La respuestahipertensivageneradaen animalesjóvenessometidosa estrésporde-privación social no se desarrolla en ratas previamentelesionadasen el haznoradrenérgicoventral con 6-hidroxidopamina.Tal circunstanciadenotael papelcrítico desempeñadopor estavía noradrenérgicacentralen la generacióndelestadohipertensivoduranteel aislamiento.

3~- Los animalesdeprivadossocialmentee hipertensosno modifican las lecturaselevadasde presiónarterialsistólicay diastólicapor efectode la lesión en el haznoradrenérgico ventral con 6-hidroxidopamina. Por lo tanto, este tractonoradrenérgicono pareceser imprescindibleen el mantenimientode la respuestahipertensivainducidapor deprivaciónsocial.

4.- La administraciónde la neurotoxina6-hidroxidopaminaen el haznoradrenérgicoventral origina alteracionesen la presión arterial de animales normotensos,modificaciónquesetraduceen un estadohipertensivotransitoriomanifiesto24horasdespuésde la inyección de la neurotoxina.

5.- El aumento directoe inmediato de la presiónarterial por administraciónde6-hidroxidopaminaen el haz noradrenérgicoventral podríacorrelacionarsecon elincrementode la actividad noradrenérgicaobservadoen el bulbo raquídeoy en lamédula espinal, constituyendoel suceso final que en el SNC contribuiría adesencadenareseestadohipertensivoefímero.

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