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Aspectos técnicos de los ensayos relacionados con la inocuidad de los alimentos para animales
1
Sección de Microbiología
2
Ensayos para medir inocuidad
Escherichia coli O157:H7, RT mesófilo aerobio, RT
hongos/levaduras, Salmonella, Escherichia
coli NMP, serotipificación de
Salmonella, Clostridium
Aflatoxinas (B1, B2, G1, G2 y M1); DON;
Fumonisina (B1 y B2); Ocratoxina A; T-2;
Zearalenona
Monensina, narasina, tilosina, tetraciclinas
(tetraciclina, oxitetraciclina, clortetraciclina,
doxiciclina, minociclina, 4-epitetraciclina)
Como realizar el muestreo
Cliente responsable
Homogeneidad de la muestra.
Esterilidad◊
Muestras secas almacenar y transportar a
temperatura ambiente
Muestras con ↑ % humedad almacenar y transportar a 4 °C
Traer al laboratorio máximo dentro de las 24 horas inmediatas a la toma de la muestra ◊
◊ Aplica muestras microbiológicas
3
Microorganismos de interés en
alimentos para animales
Detección de
Salmonella
RT mesófilo aerobio
Escherichia coli NMP
Detección Escherichia
coli O157:H7
Clostridium perfringens
en rendering
Serotipificación
Salmonella
RT hongos/ levaduras
Aplicaciones
Recuentos
(bacterias, hongos y levaduras)
Carga de microorganismos
Deterioro/Caducidad del producto
Estabilidad del producto
en condiciones de almacenamiento y transporte
LMP no se han definido
5
Aplicaciones Escherichia coli (NMP/g)
Presencia indica contaminación fecal
Alerta sobre posibles patógenos en muestra
LMP no se han definido
6
Aplicaciones Detección de Salmonella
Vigilancia epidemiológica Inocuidad en materias primas y alimento terminado para consumo animal LMP Ausencia en 25 g muestra
7
Para que serotipificar?? Prevalencia de serotipos de Salmonella
8 Salmonella serovars isolated from table eggs: An overview. Francesca Martelli , Robert H. Davies. Food Research International 45 (2012) 745–754
Porcentaje de muestras de huevo positivas para Salmonella Enteritidis, S.Typhimurium, y otras serovariedades de Salmonella sobre el número total de muestras analizadas
Salmonella en alimento para animales en Costa Rica
Serovariedad Tipo de alimento Salmonella Anatum 3,(10)(15)(15,34):eh:1,6
Salmonella Manchester 6,8:I,v:1,7
Salmonella Rissen 6,7,14_:f,g:-Negativo
Salmonella Soerenga 30:i:Iw
Salmonella Give 3(10)(15)(15,34):I,v:1,7
Salmonella Rissen 6,7,14:f,g:-Negativo
Salmonella Brandenburg: 1,4(5),12:I,v:e,n,z15
Salmonella Mbandaka 6,7,14:z10:e,n,z15
Salmonella Havana 1,13,23:f,g,(s):-Negativo
Salmonella Muenster 3,10(15)(15,34):e,h:1,15
Salmonella Yoruba 16:c:I,w
Salmonella Montevideo 6,7,14:g,m,{p},s: {1,2,7}Negativo
Salmonella entérica subespecie O3,10:z10:-Negativo
Salmonella Infantis 6,7,14:r:1,5
Harina de carne y hueso
Salmonella Soerenga 30:i:Iw
Salmonella Orannienburg 6,7,14:m,t:(z57) Negativo
Salmonella Alachua 35:z4,z23:-Negativo
Salmonella Amsterdam 3,(10)(15,34):g,m,s:-Negativo
Salmonella Rissen 6,7,14:f,g:-Negativo
Salmonella Yoruba 16:e:I,w
Salmonella Havana 1,13,23:f,g,(s):-Negativo
Salmonella Havana 1,13,23:f,g:-Negativo
Salmonella Yoruba 16:c:I,w
Salmonella I:O15 pendiente completar
Salmonella Mbandaka 6,7,14:z10:e,n,z15
Salmonella Anatum 3,(10)(15)(15,34):eh:1,6
Salmonella entérica I,O rugoso:f,g:-Negativo
Salmonella Senftenberg O 1,3,19 positivo, H fase 1:g,(s)t: positivo, H fase 2 -Negativo
Salmonella Anatum O3,(10)(15)(15,34) Positivo, H fase 1e,h:positivo, H fase 2 1,6 positivo
Salmonella Berta O1,9,12 positivo; H fase 1f,g positivo; H fase 2 -negativo
Salmonella Schwarzengrund O 1,4,12,27: Positivo, H fase 1 d:positivo, H fase 2 1,7 positivo
Salmonella Havana O 1,13,23: positivo, H fase 1 f,g,(s): Positivo, H fase 2 - negativo
Salmonella Rissen O 6,7,14: positivo, H fase 1 f,g: positivo, H fase 2 - negativo
Alimento para pollo
Salmonella Heidelberg 1,4,(5),12:r:1,2 Carne para perro
Salmonella Soerenga 30:i:Iw Alimento para pescado
Salmonella Molade 8,20:z10:z6 Alimento para cerdo
Salmonella I:O35 Pendiente completar Harina de tilapia 10
21
Metodología
11
Método de oro
Ventajas
Desventajas
Métodos rápidos
Ventajas
Desventajas
Sensibilidad método (porque algunos laboratorios detectan y otros no?? CINA detecta ≥ 2,8 UFC/25 g
Serie 1 + medidas correctivas Serie 2 + Suspensión de certificado de exportador y medidas correctivas Serie 3 + Retiro del CVO indefinidamente y medidas correctivas
Legislación LMP Ausencia en 25 g de muestra (matriz o alimento terminado para consumo animal)
Nº 37548-MAG, 12/09/2012, La Gaceta N° 46 del: 06/03/2013
Aplicaciones Clostridium perfringens
Vigilancia de infecciones en animales
Indicador de funcionamiento de cocinas rendering → priones (Encefalopatía espongiforme bovina)
13
¿Qué son las Micotoxinas?
14
Toxina Tipo micotoxina, dosis, duración
ingesta
Individuo Especie animal, género, edad,
raza, estado general nutricional y salud, estatus inmunológico
Ambiente Manejo en campo, higiene,
temperatura, humedad, otros agentes tóxicos
Humano Carcinogénica, teratogénica,
mutagénica, inmunosupresora, hepatotóxica, nefrotóxica,
neurotóxica, Síndrome de Reye, gastritis crónica, cirrosis infantil,
enfermedades respiratorias ocupacionales.
Animales Gastroenteritis, diarrea, hemorragia
intestinal, fallo en función rumen, cetosis
↓ producción
Infertilidad
Mastitis
Contaminación de leche
15
Toxina Hongo productor Alimentos donde se
encuentra
Especie más
susceptible
Principales efectos sobre el sistemas de
los mamíferos
Referencia
Toxina T2 y HT2 Especies de Fusarium F.sambucinum, F. venenatum, F. camptoceras, F. poae, F. sporotrichioides, F.acuminatum, F. graminearum, F. culmorum, F. crookwellense, F. equiseti, F. lateritium y F. solani
Cereales, harina, arroz Humanos, ganado bovino, pollos, pavos, ratas, ratones, caballos
Inhibidor de la síntesis de proteínas y función mitocondrial tanto in vivo como in vitro, inmunosupresor y citotóxico, efectos tóxicos sobre la piel y membranas mucosas. Hemorragia estomacal, intestinal, pulmonar, en riñón y vejiga Bloqueo de la síntesis de proteínas por inhibición de la enzima peptidil trasferasa
Cano-Sancho et al 2012; Desjardins and
Proctor 2001 Seo, J & Yu, J 2005
Fumonisina B1 y B2
Fusarium moniliforme Fusarium verticillioides y Fusarium proliferatum; Alternaria alternata f.sp. lycopersici
Maíz, alimentos a base de maíz, sorgo, cerveza
Humano, caballos, cerdos, ratas, ratones
Leucoencefalomacia equina, edema pulmonar e hipertrofia de arterias pulmonares en porcinos, nefrotoxicidad y cáncer hepático en ratas, Inmunosupresión en pollos, hemorragia cerebral en conejos, cáncer hepático y esofágico en humanos. Inhibición de la enzima ceramida-sintasa
Soriano et al 2004 Seo, J & Yu, J 2005
Deoxinivalenol (DON)
Fusarium culmorum Fusarium graminearum Especies de Stachybotrys
Cereales Humanos, ganado bovino, pollos, pavos, ratas, ratones, caballos
Inhibe síntesis de proteínas. Gastroenteritis, Náusea, diarrea, vómito, rechazo del alimento, anorexia, alteración de la función inmune. Cerdos son los más sensibles. Hemorragia estomacal, intestinal, pulmonar, en riñón y vejiga Bloqueo de la síntesis de proteínas por inhibición de la enzima peptidil trasferasa
Pestka, 2007 Seo, J & Yu, J 2005
Zearalenona Fusarium graminearum(Gibberella zeae), F culmorum, F. crockwellense, F. avenaceum, F.tritinctum, F. equiseti, F. oxysporum F. cerealis, F. semitectum
Granos, Maíz, cebada, trigo, cebada, avena, soya, cerveza, alimento para animales(pollo,
vacas), frutas y vegetales deshidratados
Cerdos, ganado lechero, pollos, ratas, ratones, humanos
Disruptor endocrino, propiedades estrogénicas. Problemas reproductivos en animales, infertilidad, abortos. infertilidad, abortos afecta principalmente cerdos. En humanos causa síndrome hiperestrogénico , Carcinogenica, hepatotóxica, hematotóxica, inmunotóxica y genotóxica. Unión a receptores de estrógenos.
Döll y Dänicke 2011 Zinedine et al 2007 Seo, J & Yu, J 2005
Ocratoxina A (OTA)
Aspergillus ochraceus, Aspergillus melleus, Aspergillus sulphureus, Aspergillus nigri. Aspergillus lanosus, Aspergillus alliaceus, Aspergillus carbonarius yAspergillus awamori, Penicillium verrucosum, Penicillium chrysogenum y Penicillium nordicum
Cereales, cerveza, vino, cacao, café, uvas pasas, especias, frutas
deshidratadas, productos cárnicos
Humanos, patos juveniles, cerdos, perros, ratas,
Carcinogénica, nefrotóxica, hepatotóxica, teratogenica e inmunosupresora., nefropatía porcina Inhibición de la enzima fenilalanina hidroxilasa
Aish et al 2004Pattono et al 2013
Turner et al 2009 Maff, 1993
Seo, J & Yu, J 2005
Citrinina Penicillium expansum Penicillium citrinum, otras especies de Penicillium , Aspergillus y Monascus
Granos, cereales, maíz, arroz, trigo, cebada, avena, frutas, maiz
fermentado, queso, manzana, cerveza, carne, ensilajes, alimentos
para animales y humanos, fluido biológicos
Humanos, aves, cerdos, roedores
Nefrotóxica (daña los túbulos proximales del riñón) , hepatotóxica, afecta síntesis de macromoléculas Carcinogénica, mutagénica, neurotóxica, genotóxica, inmunosupresora
Bao-jun et al 2006 Sanzani et al 2012 Seo, J & Yu, J 2005
Patulina Aspergillus clavatus, Penicillium expansum, Penicillium clavigerum, Penicillium griseofulvum , Byssoclamys nivea y Byssoclamys fulva.
Manzana, productos de manzana, albaricoque, pera, uvas, fresas,
arándanos y duraznos
Humanos, ganado bovino Citotóxica, genotóxica, mutagénica, carcinogénica, teratogénica inmunosupresora, neurotóxica. Causa lesiones intestinales, degeneración celular epitelial, inflamación, ulceración, hemorragias. Síntomas de intoxicación aguda: Agitación, convulsiones, edema, ulceración y vómito. Los efectos crónicos incluyen genotoxicidad, inmunotoxicidad y neurotoxicidad. Inhibición de la función de la barrera epitelial por inactivación de la enzima tirosina fosfatasa
Sanzani et al 2012 Al-Hazmi, N.A, 2010 Pattono et al 2013 Moukas et al 2008 Seo, J & Yu, J 2005
Aflatoxina B1, B2, G1 y G2
Aflatoxina M1 y M2
A. flavus, A. parasiticus, Aspergillus bombycis, Aspergillus ochraceoroseus, Aspergillus nomius y Aspergillus pseudotamari
nueces, granos, cereales, maíz y arroz
Humanos, ganado bovino, pollos, perros, gatos
Carcinogénicas/hepatitis aguda (tumores en hígado) trastornos del sistema inmunológico Hemorragia tracto intestinal y en riñones Epoxido-AFB1 bioactivo ataca macromoléculas y causa tumores por formación de aductos AFB1-ADN
Peraica et al 1999 Zain 2011; Turner et al
2009 Seo, J & Yu, J 2005
Micotoxinas en alimentos
Legislación de las MYC
¿Costa Rica?
AF total (20 µg/kg ) igual a FDA
Decreto N 27980-S; L Gaceta viernes 9 julio 1999 y martes 20 julio 1999.
17
• País de clima tropical
• Condiciones pobres de almacenamiento de granos
• Temperatura, precipitación y humedad relativa elevadas
○ Unión Europea (UE) * Food And Drug Administration (FDA)
Analito Límite de cuantificación
(LoQ) µg.kg-1
Límite máximo
permitido (LMP) µg.kg-1
Aflatoxina B1 0,015 12○
Aflatoxina B2 0,259 -
Aflatoxina G1 0,330 -
Aflatoxina G2 0,224 -
Aflatoxina total 0,1 15○ /20*
Aflatoxina M1 0,014 0,05○ / 0,5*
Fumonisina B1 50 5000
Ocratoxina A 0,011 10
Zearalenona 0,022 500
Deoxinivalenol 10 5000
Toxina T-2 5 -
Metodología ensayo MYC
• Preparación de la muestra con columnas de inmunoafinidad
Análisis por HPLC del extracto
Condiciones Valor óptimo
Sistema Agilent 1200 Series SL, Bomba cuaternaria
Tiempo balanceo luego de la corrida (min) 2 min
Presión (bar) 88max
Columna Zorbax Eclipse Plus C18 5 μm, 3.0 mm × 150 mm
OTA
Sistema Agilent 1200 Series SL, Bomba cuaternaria
Fase móvil A = ACN, D = H2O 0,2 mol/L TFA, pH = 2.1
Modo Isocrático 50% A y 50 % D
Volumen de inyección (μL) 20
Flujo (mL/min) 0,7
Ganancia del detector (PMT) 12
Detector de fluorescencia (nm) Excitación, 247; emisión, 480
Duración de la corrida (min) 10 min
ZEA
Sistema Agilent 1200 Series SL, Bomba cuaternaria
Fase móvil A = ACN, B = MeOH C = H2O
Modo Isocrático 40% A, 10% B, 50% C
Volumen de inyección (μL) 20
Flujo (mL/min) 0,7
Ganancia del detector (PMT) 12
Detector de fluorescencia (nm) Excitación, 236; emisión, 464
Duración de la corrida (min) 10 min
AFM1
Sistema Agilent 1200 Series SL, Bomba cuaternaria
Fase móvil A = ACN, B = MeOH C = H2O
Modo Isocrático 10% A, 35% B, 55% C
Volumen de inyección (μL) 10
Flujo (mL/min) 0,6
Ganancia del detector (PMT) 12
Detector de fluorescencia (nm) Excitación, 365; emisión, 455
Duración de la corrida (min) 10 min
AFB1, AFB2, AFG1, AFG2
Sistema Agilent 1200 Series SL, Bomba cuaternaria
Fase móvil A = ACN B = MeOH C = H2O
Modo Isocrático Isocrática 5% A, 30% B, 65% C
Volumen de inyección (μL) 10
Flujo (mL/min) 0,8
Ganancia del detector (PMT) 12
Detector de fluorescencia (nm) Excitación, 365; emisión, 455
Duración de la corrida (min) 17 min
20
Resultados de MYC por ELISA y HPLC de muestras de alimentos para animales
Toxina Muestras Positivas * Unidades Límite de
detección. ELISA
Aflatoxinas totales (n=133) 61 [2-285] µgkg-1 3
Zearalenona (n=78) 49 [21-726] µgkg-1 20
Ocratoxinas (n=84) 7 [2-36] µgkg-1 1,9
Fumonisinas (n=102) 58 [0,30-36] mgkg-1 0,25
Toxina T2 (n=107) 37 [39-761] µgkg-1 35 Deoxinivalenol (n= 91) 75[0,3-21] mgkg-1 0,25
HPLC Aflatoxinas totales** (n=114) 50[0,102-86,75] µgkg-1 0,0989*** Zearalenona (n=51) 25[1,56 - 434] µgkg-1 O,00 Ocratoxina A (n=54) 6[0,141 - 11,21] µgkg-1 0,0037 Fumonisinas (n=24) 6[0,3 - 31,88] mgkg-1 0,05 Toxina T2 (n=37) 21[35,24 - 434] µgkg-1 0,0042 Deoxinivalenol (n=21) 15[0,28-151,6] mgkg-1 0,05
* con concentraciones superiores al límite de detección. ** Sumatoria de las cuatro toxinas que se pueden detectar en caso de que la muestra tenga más de un tipo de Aflatoxina. ***Límite detección para micotoxinas Aflatoxina B1 0,0046 µg/kg, Aflatoxina B2 0,0777µg/kg ,Aflatoxina G1 0,0989 y Aflatoxina G2 0,0671
Algunos resultados… • Concentraciones elevadas suelen ocurrir
en materias primas como maíz Muestra 2113-12
21
AFB1
Estándar 20 µg/L en orden de salida AFG2, G1 ,B2 y B1
Resultados históricos AFB1 en alimentos para animales Costa Rica
ELISA entre el 2010-2011 (n= 133; 61[3-285] µgkg-1 ; 46%)
HPLC entre el 2011-2013 (n=114; 50 [0,102-86,75] µgkg-1 44% )
22
Antibióticos en alimentos
AB’s se usan en terapia o profilaxis sin saber si el alimento influencia la actividad biológica del AB (se analizan monensina, narasina, tilosina y familia tetraciclinas)
Tetraciclinas se unen fuertemente a proteínas y M2+
23 Government Accountability Office Antibiotic Resistance: Data Gaps Will Remain Despite HHS Taking Steps to Improve Monitoring. GAO-11-406. Washington, D.C.: June 1, 2011.
Análisis de Abs por CLAR (HPLC)
24
CLAR (Análisis multiresidual para 14 analitos incluyendo metabolitos y derivados epiméricos
Datos interesantes de ABs en alimento para animales
25 25
Rango de concentración (mg kg-1)
Tipo de alimento Oxitetraciclina
(No. de muestras positivas)
Tetraciclina
(No. de muestras positivas)
Clortetraciclina
(No. de muestras positivas)
Doxiciclina
(No. de muestras positivas)
Tilapia (n=21) 119.1 – 1922.5 (3) 5755.0 – 8365.0 (4) 140.0 – 612.2 (2) 31.4 (1)
Pollo (n=21) 78.3 – 190.9 (3) Not detected 135.8 – 438.6 (6) No detectado
Cerdo (n=21) 1076.3 – 47.2 (4) 74.65 (1) 1012.3 – 284.4 (5) 41.7 – 109.5 (3)
Camarón (n=21) No detectado No detectado No detectado 21.5 – 51.3 (6)
Número de muestras negativas para cualquiera de las tetraciclinas ensayadas
Tilapia Pollo Cerdo Camarón
4 12 11 15
Beneficios Acreditación. Que valor agregado nos aporta??
Competencia técnica demostrada
Uso materiales de referencia certificados
Comparaciones de pares
27
Análisis Valor z / resultado
Año
2014 2013 2012
RT mesófilo aerobio -0,70 -1,37 -0,22
RT hongos y levaduras 0,69 0,02 NR
RT hongos 1,80 0,09 0
RT levaduras 0,05 0 -0,17
Escherichia coli (NMP/g) 0,14 -0,81 1,65
Salmonella sp
(presencia/ausencia)
No
detectada+
No
detectada+
Detectada+
Escherichia coli O157:H7
(presencia/ausencia)
Detectada+ Detectada+ Detectada+
Aflatoxina total pendiente -0,79 -
Ocratoxina A pendiente -2,01 -
+ Valor congruente con el resultado esperado o aceptado como verdadero, NR no reportado
CINA… hacia donde vamos?
• Identificación de hongos toxigénicos en materias primas y alimentos para animales
• Ensayos de vida útil de materias primas y alimentos para animales
• Introducción medio cromogénico en Salmonella en lugar de SB
• Análisis de toxina HT-2 (metabolito toxina T-2; 2014)
• Patulina (CINA/CITA), jugos de frutos y citropulpa (2014)