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RESUMEN EJECUTIVO
En el Ecuador, las leguminosas (importantes fuentes de proteína) son generalmente cultivadas en
suelos pobres especialmente en nitrógeno, lo cual constituye un factor crítico de sus bajos
rendimientos. Para incrementar estos, una alternativa es el aprovechamiento de la fijación biológica
de nitrógeno al asociarse simbióticamente con microorganismos del suelo, concretamente con la
bacteria del genero Rhizobium. Este proyecto se inició solicitando a centros internacionales de investigación microbiológica, cepas
de la bacteria. Paralelamente se procedió al aislamiento de cepas nativas provenientes de suelos
ecuatorianos, para formar un banco germoplásmico del microsimbionte de los cultivos de fréjol,
arveja, alfalfa, soya y maní. A continuación se realizó la caracterización fenotípica y genética de la
bacteria asociada a los cultivos de fréjol y maní, por cuanto son leguminosas cuyos centros de
origen se encuentran en la región de Latinoamérica, siendo que en el caso del fréjol, uno de sus
centros de origen es precisamente el Ecuador. Esto permite suponer que la diversidad genética de la
bacteria en el Ecuador es amplia, lo que podría originar una especificidad simbiótica entre el
microorganismo y la planta. La caracterización de las cepas de fréjol fue complementada con un
estudio de compatibilidad genética entre Rhizobium y el cultivo. Posteriormente, el proyecto llevó a cabo el estudio de la estimación del potencial de fijación de
nitrógeno de las cepas de cada una de las leguminosas, bajo condiciones de invernadero y de
campo. En fréjol, se estudió también la competitividad de las mejores cepas por nodulación, para
conocer la cepa más competitiva y poder usarla como inoculante.
En una segunda fase, se recolectaron turbas y otros materiales (soportes): turba de Chimborazo,
turba de Lloa, turba de Alaska, capa rosa, ceniza, zeolita, y un sustrato a base de vaina seca molida
de fréjol mezclado con compost, para ser evaluados como potenciales portadores de Rhizobium en la elaboración de inoculantes. Los soportes fueron sometidos a un análisis físico, químico y
biológico, y evaluados en su capacidad de mantener viable a la bacteria por lo menos durante cuatro
meses.
La investigación de campo fue de carácter participativa conjuntamente con los agricultores quienes
desempeñaron un rol importante en la difusión de los resultados, con un efecto multiplicador. La
difusión sobre la tecnología de los inoculantes y el uso del producto generado por el proyecto fue
reforzada a través de medios como trípticos, días de campo, talleres, y programas de radio. Estos
últimos, en colaboración directa con miembros de la Fundación GAIA, quienes forman parte del
2
proyecto Comminandes, el mismo que tiene por objetivo generar tecnologías ambientalmente
amigables como el compost enriquecido con inoculantes microbianos, a fin de mejorar los
rendimientos de cultivos y la fertilidad de los suelos de la región Interandina.
Paralelamente al proceso de investigación, el proyecto ha ido implementando un laboratorio de
Microbiología de Suelos en el Departamento de Protección Vegetal de la Estación Santa Catalina,
del INIAP, con equipos, reactivo y material necesarios para el manejo de la bacteria y la
elaboración de inoculantes.
Como resultados, el estudio de caracterización de cepas de fréjol y de maní, demuestra la alta
heterogeneidad de la bacteria en suelos Ecuatorianos. El estudio de la compatibilidad genética entre
la bacteria y el cultivo de fréjol, encontró que la diversidad genética de la bacteria es mayor cuando
se asocia a cultivares “locales”. Esto implica que existe cierta especificidad entre los simbiontes y
por lo tanto se recomienda elaborar inoculantes con cepas aisladas de suelos pertenecientes a
regiones donde la variedad de leguminosa es predominante. Este mismo comportamiento de
especificidad simbiótica podría existir en la asociación maníBradyrhizobium, pero en este caso, se requiere de estudios complementarios para un mejor entendimiento de este fenómeno.
El proyecto seleccionó cepas eficientes en fijación biológica de nitrógeno. En fréjol las cepas UMR
1478 y UMR 1481, en maní: ECUMP86, ECUML102, en arveja ECUA –I1, ECUAZ2, en
alfalfa UMR 6008, TAL 380, y en soya: CIAT 151, UMR 6001, ECUS001, ECUS1SJ. Este banco
germoplásmico de la bacteria se encuentra almacenado en el laboratorio y bajo condiciones de
liofilización.
En cuanto a la competitividad de cepas asociadas al fréjol, el estudio logró conseguir antisueros de
calidad y en suficiente cantidad para las cepas estudiadas, permitiendo tener un stock suficiente de
antisueros para futuros estudios serológicos de Rhizobium. El INIAP dispone de un stock de turba de Chimborazo, que después de un análisis físico, químico y
biológico, se la identificó como un buen portador de Rhizobium, al compararla con otros siete materiales catalogados como potenciales portadores.
La difusión de los resultados del proyecto ha permitido que el número de agricultores que usan
inoculantes, incremente, comprobado mediante diagnósticos realizados en las Provincias del Cañar
(comunidad Virgen de la Nube) y de Pichincha (ChaupilomaTabacundo). La difusión también se
ha realizado a través de eventos nacionales e internacionales.
Sobre la base de los resultados de la investigación se recomienda: 1) complementar el estudio de
caracterización de cepas de maní, 2) una evaluación de campo de cepas representativas de cada uno
de los grupos obtenidos en el análisis genético de RFLP de las cepas de maní, 3) la evaluación en
experimentos demostrativos, y en varios sitios de una misma región, de varias cepas para
3
compararlas con las cepas “nativas”, 4) realizar un estudio sobre la respuesta de la inoculación al
fósforo, sus niveles, y formas de aplicación. El fósforo es un elemento esencial en el proceso de la
fijación del nitrógeno, y en los suelos andinos (Andisoles), éste elemento es adsorbido por las
partículas del suelo, dificultando la absorción por el cultivo, 5) mayor difusión de la tecnología en
otras regiones donde el proyecto no tuvo mayor presencia, especialmente en la Costa Ecuatoriana,
donde la implementación de un laboratorio para la elaboración de inoculantes es recomendable, ya
que los agricultores de la región necesitan proveerse fácil y constantemente de los inoculantes, al
momento preciso de la siembra.
La interacción directa con centros internacionales de investigación agrícola, permitió la
capacitación de personal del proyecto, especialmente en técnicas moleculares, como la
caracterización genética de “Bradyrhizobium” asociada al cultivo de maní. La capacitación incluyó cursos teórico práctico relacionados con Microbiología de Suelos, y visitas de investigadores
internacionales, permitiendo una estrecha interacción principalmente en el intercambio de
información científica. Los resultados del proyecto además han sido fundamentales como
antecedentes de propuestas de proyectos aprobadas por entidades como FUNDACYT.
Este proyecto sin duda, contribuirá con una agricultura de bajos insumos, caracterizada por la
reducción de la dependencia de los fertilizantes químicos, los cuales son costosos y representan
fuentes de contaminación de los recursos suelo y agua.
2. IDENTIFICACIÓN DEL PROYECTO
Código: PROMSA IQCV081
Titulo: “Selección de cepas de Rhizobium adaptadas a condiciones de campo, y su uso como
inoculantes de leguminosas de la Sierra y Costa Ecuatoriana”.
Duración: Agosto del 2001 al 31 de Diciembre del 2003.
Institución base: INIAP. Estación Santa Catalina.
Instituciones colaboradoras nacionales: Universidad Central, IASA.
Instituciones colaboradoras internacionales: Universidad de Minnesota, CIAT, Universidad de la
Plata.
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Investigadores: Dr. Gustavo Bernal, Ing. Alfonso Suárez, Ing. Diego Campaña, Ing. Mauricio
Jerez, Lic. Cristina Salvador, Dr. Peter Graham, Dr. Mario Aguilar.
Tema del proyecto: Microbiología de Suelos.
Rubro pr incipal: Arveja, fréjol, alfalfa, soya, maní.
Tipo de institución ejecutora: Centro de Investigación Agropecuaria.
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3. CUADRO DE CONTENIDO DEL INFORME
Justificación del proyecto .................................................................................................................. 6
Objetivos de la investigación .............................................................................................................. 10
Actividades desarrolladas .................................................................................................................... 11
Resultados obtenidos ........................................................................................................................... 30
Discusión de los resultados ................................................................................................................. 50
Situación inicial del grupo meta .......................................................................................................... 54
Estimación de efectos e impactos ........................................................................................................ 54
Producto del proyecto .......................................................................................................................... 56
Logros adicionales ............................................................................................................................... 58
Limitaciones en el desarrollo del proyecto .......................................................................................... 59
Conclusiones y recomendaciones ........................................................................................................ 60
Lecciones aprendidas .......................................................................................................................... 62
Bibliografía .......................................................................................................................................... 63
Anexos ................................................................................................................................................. 68
Fecha y firma del investigador principal ............................................................................................. 81
TABLA DE CONTENIDO CUADROS, FIGURAS Y ANEXOS
Cuadro 1. ......................................................................................................................................... 27
Cuadro 8.1 ....................................................................................................................................... 31
Figura 8.1 ........................................................................................................................................ 32
Figura 8.2 ........................................................................................................................................ 33
Figura 8.3 ........................................................................................................................................ 34
Figura 8.2 y Cuadro 8.2 .................................................................................................................. 35
Cuadro 8.3 ....................................................................................................................................... 36
Cuadro 8.4 y Cuadro 8.5 ................................................................................................................. 37
Fig. 8.5 ............................................................................................................................................ 39
Fig. 8.6 ............................................................................................................................................ 40
Cuadro 8.6 ....................................................................................................................................... 41, 42, 43
Cuadro 8.7 ....................................................................................................................................... 43, 44
Cuadro 8.8 y Cuadro 8.9 ................................................................................................................. 45
Cuadro 8.10 ..................................................................................................................................... 47
Cuadro 8.11 y Figura 8.7 ................................................................................................................ 48
Figura 8.7 ........................................................................................................................................ 49
ANEXOS, Cuadro 1 ....................................................................................................................... 67
Cuadro 2, Cuadro 3 y Cuadro 4 ...................................................................................................... 68
Cuadro 5 y Cuadro 6 ....................................................................................................................... 69
Cuadro 7 y Cuadro 8 ....................................................................................................................... 70
Cuadro 9 y Cuadro 10...................................................................................................................... 71
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4. JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO
El Ecuador ha experimentado un considerable incremento de su población con la mayor
concentración en áreas urbanas, con 7'196.000 habitantes versus 4'741.000 del área rural. Para el
año 2020 se estima que la población urbana aumentará a 12'269.000 mientras que la población
rural será de 4'635.000 habitantes (FAO, 1999). Esto implica que la producción de alimentos en el
Ecuador debe duplicarse para el año 2020, por lo que sin duda, el mayor reto será el de producir de
manera sustentable, cantidades de alimentos nutricionales y disponibles para la mayoría de la
población. Se estima que el 90% de las familias pobres del Ecuador carece de una adecuada
alimentación (UNICEF, 1999), y que el consumo de proteína en el país alcanza niveles de 50 85
g proteína/día, mientras que el de calorías varia entre 1800 a 2500/día con valores inferiores
asociados con las regiones más pobres. Bajo este contexto, las leguminosas como el fréjol, arveja,
soya, maní, etc., juegan un papel de relevancia en la seguridad alimenticia, como fuentes de
proteínas y calorías para la población ecuatoriana, mientras que otras leguminosas como la alfalfa
son pastos importantes en la producción pecuaria (carne y leche) de vastas zonas del país.
Las leguminosas en la región interandina son sembradas especialmente por el pequeño y mediano
agricultor en suelos bajos en contenido de nutrientes especialmente nitrógeno (INIAP, 1994) y
algunos micronutrientes. La mayoría de los suelos de la Sierra son además susceptibles a niveles
de erosión hídrica que en las partes altas estos son de magnitud considerable. La alfalfa, aunque
es sembrada en terrenos de menor inclinación y aptos para la producción pecuaria, sin embargo
sufre también de deficiencias nutricionales debido a las características de los suelos donde se la
cultiva, lo cual afecta directamente su rendimiento y consecuentemente el rendimiento animal.
Los suelos del litoral Ecuatoriano presentan también problemas nutricionales como por ejemplo en
regiones de las Provincias de Los Ríos y Manabí. Las constantes lluvias a las que son expuestos en
determinada época del año son la causa principal de la deficiencia de nitrógeno y otros elementos,
los cuales son lavados o lixiviados, disminuyendo considerablemente la fertilidad de los suelos. La
disminuida fertilidad viene a constituir un factor fundamental de los bajos rendimientos de las
leguminosas tanto en la Sierra como en la Costa Ecuatoriana, afectando la economía de los
agricultores. Para incrementar los rendimientos de las leguminosas, existen dos maneras de hacerlo:
1) Aumentando el uso de fertilizantes químicos nitrogenados. Lamentablemente, estos son causa de
la deterioración del suelo y del agua, contaminándolos y perjudicando la calidad y el uso de estos
7
recursos. Por otro lado, los costos elevados en el Ecuador de los fertilizantes nitrogenados, los
requerimientos altos de energía para su producción, o simplemente la dificultad de transportarlos a
las fincas de los pequeños agricultores, limitan el uso en la producción agrícola.
2) Aprovechando la fijación biológica de nitrógeno por parte de las leguminosas al asociarse
simbióticamente con las bacterias del género Rhizobium (rizobios). Estos organismos del suelo,
responsables del 80% de la fijación biológica del nitrógeno, tienen la capacidad de convivir
simbióticamente con la leguminosa en los nódulos radiculares, los cuales son órganos especiales de
las raíces, en los que tiene lugar el proceso biológico de la fijación del nitrógeno atmosférico. Las
leguminosas, dependiendo del cultivo y la variedad, y de los rizobios, son capaces de fijar hasta
300400 kg N/ha (Brockwell and Bottomley, 1995). Sin embargo, en áreas nuevas, las
leguminosas a ser sembradas requieren de la inoculación con Rhizobium específico y eficiente, que permita lograr incrementos significativos en sus rendimientos.
Identificado el problema de la deficiencia nutricional (especialmente N) de algunos suelos agrícolas
ecuatorianos, el INIAP a través de la Unidad de Microbiología del Departamento de Protección
Vegetal de la Estación Santa Catalina, inició hace aproximadamente 15 años, investigación en
fijación biológica de nitrógeno (FBN) en colaboración con la Facultad de Agronomía de la
Universidad Central. Las actividades comprendieron recolecciones de cepas (razas) a nivel
nacional, y evaluaciones de la capacidad fijadora en los cultivos de arveja, chocho, haba y fréjol.
Los estudios en su mayoría fueron llevados a cabo bajo condiciones de invernadero y en algunos
casos se probaron combinaciones de cepas y leguminosas. Adicionalmente, se recolectaron turbas
dentro del Callejón Interandino (Estévez y Constante 1993), seleccionándose algunas como
acarreadores potenciales de los rizobios.
Posteriormente, la Unidad responsable del proyecto llevó a cabo investigación colaborativa con
instituciones nacionales e internacionales. Así por ejemplo con el NifTAL de Hawai se evaluó el
medio selectivo BJSM (Bradyrhizobium japonicum selective medium) para verificar la calidad de inoculantes de Bradyrhizobium para soya. Los resultados mostraron que la mayoría de los
inoculantes evaluados y comercializados en el mercado ecuatoriano son de calidad extremadamente
baja, con poblaciones máximas de 1 x 10 2 bacterias/g de inoculante (Bernal y Estévez, 1994),
cuando el nivel permitido en países con sistemas de control de calidad (ej. Canadá) es de 10 8 10 9
bacterias/g de inoculante, o de 10 3 , 10 4 y 10 5 rizobios/semilla pequeña, intermedia y grande,
respectivamente (www.rhizobium.umn.edu). Además, algunos inoculantes evaluados mostraron
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niveles altos de contaminación (con hongos y otras bacterias) que afectan la sobrevivencia de los
rizobios en la turba (portador de la bacteria) y por lo tanto la validez del inoculante como una
alternativa de fertilización nitrogenada. Estos datos, indudablemente han sido causa para que los
agricultores, y algunos técnicos e investigadores agrícolas, hayan dado poco valor a la práctica de
la inoculación.
Con la experiencia e información acumulada en el INIAP, el grupo de microbiólogos de la Unidad
Responsable del Proyecto, a través del proyecto colaborativo CRSP (Universidad de Minnesota –
INIAP), inició en 1995 la producción a nivel experimental, del inoculante Rhizoiniap, para fréjol
arbustivo cultivado principalmente por pequeños y medianos agricultores de Carchi e Imbabura,
regiones donde el proyecto CRSP ha tenido sus mayores impactos. El inoculante ha sido elaborado
casi en su totalidad utilizando turba importada.
Los miembros de las UVTT (Unidades de Validación y Transferencia de Tecnología) del INIAP,
han sido los responsables de validar el inoculante en parcelas demostrativas y conjuntamente con
agricultores de ambas provincias. Se han reportado resultados positivos en el rendimiento de
algunas variedades de fréjol, siendo una de las razones precisamente la respuesta a la inoculación
con Rhizoiniap. Entre las variedades se encuentra la variedad JeMa, la cual fue introducida por el proyecto CRSP y entregada al agricultor por el Programa Nacional de Leguminosas (PRONALEG).
El incremento en rendimiento (70 kg/ha) debido a la inoculación en fréjol, reportado por pequeños
agricultores del Carchi, constituyo un importante precedente para iniciar esta investigación con el
fin de seleccionar cepas nativas y no nativas, genéticamente estables y adaptadas a condiciones
adversas de campo, que presenten respuesta a la inoculación. En este proyecto, se considero la
evaluación de cultivares de cada leguminosa, aptos en fijación bajo condiciones de campo, y la
búsqueda de materiales apropiados como portador de la bacteria y la evaluación de la esterilización
de los portadores. Posteriormente a la investigación, se ha institucionalizado un sistema de control
de calidad para la producción de inoculantes. Todos estos aspectos señalados son vitales como
componentes integrales de estrategias en el cultivo de las leguminosas, que optimicen su efectiva
nodulación, fijación de nitrógeno, y mayor rendimiento.
Existen estudios en el exterior que han demostrado muy claramente incrementos significativos en
rendimiento como resultado de la inoculación con Rhizobium. Así por ejemplo, en varias regiones frejoleras del Brasil se ha reportado incrementos de hasta 900 kg/ha (Hungria y Vargas, 2000). En
9
soya cultivada en el Estado de Wisconsin (Estados Unidos) se ha logrado incrementos de hasta
1060 kg/ha (Oplinger, 1998), en alfalfa sembrada en Texas 445 kg/ha (Evers, 1996), y en maní 170
kg/ha como media de 30 experimentos ejecutados por siete universidades norteamericanas
(www.histick.com).
Esta propuesta de investigación en el Ecuador incluyó las siguientes leguminosas: maní y soya en la
Costa, fréjol, arveja y alfalfa en la Sierra. La demanda de esta investigación se justificó
principalmente por los siguientes aspectos: a) las leguminosas: fréjol, maní, soya y arveja son de
gran importancia nutricional para consumo humano, en tanto que la alfalfa es para la producción
pecuaria. Estos cultivos tienen su relevancia económica para agricultores de la Sierra y Costa
Ecuatoriana. En esta última región, la leguminosa hortícola (ej. fréjol) están desarrollándose de una
manera considerable con fuerte inclinación hacia la agroindustria, y con la apertura del área de la
Península un mayor impulso de estos cultivos es evidente (Suárez 1999, comunicación personal).
b) Estas leguminosas constituyen rubros significativos tanto por la superficie cosechada, así como
su distribución geográfica. Por ejemplo, el fréjol seco cuya superficie cosechada es de 61.520
ha/año (FAO, 1999) abarca casi todas las provincias de la Sierra, y últimamente algunas provincias
de la Costa. El cultivo de la soya abarca 55.000 ha, especialmente en las Provincias de Los Ríos,
Manabí y Guayas.
c) A pesar de la importancia de estas leguminosas, los rendimientos siguen siendo bajos. Así por
ejemplo, se estima que para fréjol, a nivel nacional y de pequeños agricultores, el rendimiento es de
673,3 kg/ha en grano seco y de 1500 kg/ha en vaina (FAO, 1999). Otro ejemplo es la a soya, la cual
alcanza un rendimiento aproximado de 2 t/ha.
d) El uso del fertilizante nitrogenado, representa para la mayoría de los agricultores, un insumo muy
costoso en el mercado local, repercutiendo directamente en la baja productividad agrícola de estos
cultivos.
e) En el país, los estudios relacionados con el tema no han considerado aspectos integrales que
permitan desarrollar un programa continuo de selección de cepas genéticamente estables y
adaptadas a condiciones de campo. Tomando en cuenta un criterio “holístico”, se podría producir de
manera constante y racional inoculantes que garanticen el incremento de los rendimientos de las
principales leguminosas. Además, el proyecto consideró rubros nuevos e importantes como el maní.
10
f) Esta investigación constituye un complemento a los trabajos llevados a cabo por el PRONALEG
del INIAP, en el mejoramiento de rubros prioritarios para consumo humano y animal. Se trata de
incrementar los rendimientos de las leguminosas a través del aprovechamiento biológico de
nitrógeno, y como consecuencia también el de los cultivos asociados o subsecuentes, especialmente
en condiciones del pequeño y mediano agricultor. Con relación a la alfalfa, gran parte del nitrógeno
fijado por la planta, es retornado al ecosistema donde se convierte en disponible en la rotación con
cereales. Sin duda, ésta alternativa biológica de fertilización constituye un componente clave de la
agricultura sostenible y de los sistemas de manejo de suelos, contribuyendo con la protección del
medio ambiente y con el equilibrio del ecosistema.
Los beneficiarios del proyecto son directamente los agricultores principalmente de la Sierra y Costa
quienes disponen de cepas altamente fijadoras de N. Otros beneficiarios son los Centros de
Investigación y Universidades del Ecuador y algunos institutos internacionales, así como también
las empresas agrícolas comercializadoras de productos agropecuarios.
5. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN.
Objetivos generales
a) Contribuir con el incremento del rendimiento de importantes leguminosas de consumo humano y
animal a través de la selección de cepas de Rhizobium eficientes en fijación de nitrógeno y estables bajo condiciones de campo.
b) Contribuir con la conservación de los recursos naturales (suelo, agua) a través del uso de
leguminosas como componentes esenciales en el mejoramiento de la fertilidad de los suelos,
propiciando la disminución de fertilizantes nitrogenados.
Objetivos específicos (Investigación a desarrollarse)
1) Incrementar el banco germoplásmico de Rhizobium para leguminosas nativas y no nativas del
Ecuador, debidamente caracterizado (fenotípica y genéticamente).
2) Evaluar bajo condiciones de invernadero y campo, el potencial simbiótico (efectividad e
infectividad) de las cepas de Rhizobium, en cada leguminosa.
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3) Evaluar y seleccionar turbas y otros materiales como soporte de Rhizobium.
4) Evaluar la esterilización de los portadores.
5) Difundir los resultados obtenidos.
6) Institucionalizar un sistema de control de calidad de los inoculantes producidos por el INIAP.
6. ACTIVIDADES DESARROLLADAS.
Objetivo 1.
1a. Solicitud, recolección y caracterización de cepas
1b .Almacenamiento de las cepas.
Objetivo 2.
2 a. Estudio de la compatibilidad genética entre Rhizobium y el cultivo de fréjol.
2 b. Estimación del potencial fijador de nitrógeno de las cepas de Rhizobium en invernadero.
2 c. Estimación del potencial fijador de nitrógeno bajo condiciones de campo.
2 d. Estudio de la competitividad de las cepas por nodulación, en el cultivo de fréjol.
Objetivo 3.
3 a. Recolección de turbas
3 b. Análisis físico, químico y biológico.
3 c. Interacción rizobioturba (portador)
3 d. Evaluación de materiales alternativos
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Objetivo 4.
4 a. Evaluación de la esterilización de los portadores.
Objetivo 5.
5.1 Difundir los resultados y el uso de los productos generados por el proyecto.
Objetivo 6.
6.1 Institucionalizar un sistema de control de calidad de los inoculantes producidos.
7. DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES.
Actividad 1a. Solicitud, recolección y caracterización de cepas.
A través de solicitudes realizadas por el INIAP al Departamento de Microbiología de Suelos de la
Universidad de Minnesota, al Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), a la
Universidad de la Plata (Argentina) y otros centros internacionales de investigación en fijación
biológica del nitrógeno, se lograron incrementar el material genético de cepas de Rhizobium
pertenecientes a leguminosas no nativas del Ecuador. Entre estas están las de soya, alfalfa, y arveja,
cultivos que no son originarios de la Zona Andina. Para el caso del fréjol, y del maní, se realizó
recolecciones de suelos y de la leguminosa en varias regiones del país, para luego proceder al
aislamiento de las cepas asociadas con la leguminosa.
Es necesario enfatizar que en el cultivo haba pallar (Costa), en un inicio incluido en el proyecto para
la correspondiente selección de cepas de su microsimbionte Rhizobium, no se llevó a cabo ningún estudio por razones de presupuesto. Esta decisión fue informada verbalmente en Reunión de Grupo
de Referencia, al anterior Oficial de Proyectos del NRI (Dr. Francisco Muñoz), quien no objetó la
misma.
Para el aislamiento y purificación de la bacteria desde los nódulos radiculares de todas las demás
leguminosas involucradas en el estudio, se siguió la metodología de rutina utilizada por el INIAP.
Para esto, se utilizó el medio de cultivo a base de levadura, manitol, agar (LMA) con el indicador
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rojo congo (10 ml/L). Los aislamientos bacterianos fueron incubados a 26ºC durante 10 días, y
además fueron sembrados en medio conteniendo púrpura de bromocresol (10 ml/L) como indicador
de contaminación.
La conservación de las cepas bacterianas se realizó en tubos conteniendo medio de cultivo LMA
inclinado, y tubos liofilizados. En el primer caso las cepas fueron sembradas en el medio inclinado
contenido en tubos de vidrio con tapa rosca, incubados en estufa durante 57 días a 26 0 C, para
luego ser almacenados a 4 0 C.
Para la liofilización, los aislamientos puros se hicieron crecer en cajas Petri con LMA. Para esto, se
preparó una solución de peptona al 20%, y otra de sucrosa al 10%, para luego ser esterilizado por
separado (15 minutos a 121 0 C). Las soluciones estériles fueron mezcladas para luego vestirse sobre
la caja Petri y frotar la superficie del medio con la ayuda de un asa de platino, hasta formar una
suspensión bacteriana homogénea. Se tomaron alícuotas de 200 µl de la suspensión bacteriana en
tubos eppendorf (1.5 ml de capacidad) previamente esterilizados, y sellados cada uno con algodón
estéril.
Las bacterias fueron liofilizadas por 24 horas a 54ºC utilizando un liofilizador (marca Labconco), y
luego de lo cual fueron cerrados y almacenados en refrigeración (4 o C). Como procedimiento
complementario, se realizó recolección de suelos en regiones donde la leguminosa es predominante.
Las cepas fueron aisladas a través de la prueba de infección (Somasegaran y Hoben, 1994) usando
la leguminosa correspondiente (como planta huésped) a cada región de donde el suelo fue
recolectado. Se inoculó a cada hospedero, diluciones sucesivas del correspondiente suelo para
posteriormente proceder al aislamiento de la bacteria a partir de los nódulos formados en las raíces
de la planta.
Caracter ización de las cepas.
Caracter ización fenotípica
La caracterización fenotípica se realizó únicamente con el germoplasma de Rhizobium asociado con los cultivos de fréjol y de maní, por cuanto son simbiontes de cultivos cuyos centros de origen están
en América del Sur, lo que hace suponer la existencia de una gran diversidad de la bacteria en
suelos Ecuatorianos, por lo que se justifica la caracterización de la bacteria simbionte, en ambos
cultivos. En cuanto al germoplasma de Rhizobium asociado con arveja, alfalfa, y soya, éste fue ya
14
estudiado y documentado en trabajos previos realizados por la Facultad de Ciencias Agrícolas de la
Universidad Central del Ecuador, en colaboración con el INIAP. La caracterización de las cepas
asociadas al cultivo de fréjol se realizó en el Laboratorio de Microbiología de Suelos de la
Universidad de Minnesota, cuya descripción no se menciona en éste informe, ya que la misma se
encuentra detallada en el artículo de Bernal y Graham (2001). En cuanto a la caracterización de las
cepas asociadas al maní, ésta se realizó en el Laboratorio del Departamento de Protección Vegetal
de la Estación Experimental Santa Catalina –INIAP, siguiendo la metodología de Amarger et al.,
(1997). Se utilizaron noventa y tres aislamientos recolectados en las provincias de Manabí y Loja.
Además, se utilizaron cepas bien caracterizadas, fenotípica y genéticamente, como estándares o
controles.
Para la inoculación en los distintos medio de cultivo se utilizaron suspensiones fisiológicas frescas
de los aislamientos conteniendo 10 5 cel/ml; para lo cual, una colonia aislada fue transferida a medio
levadura manitol (LM), luego incubada por 26 0 C (12 días) hasta lograr una concentración de
10 9 cel/ml. Por dilución en agua estéril se llevó a una concentración final de 10 5 cel/ml. La
concentración de células fue determinada utilizando la metodología de Mac Farland sugerida por
Somasegaran y Hoben (1994).
A partir de las suspensiones bacterianas (10 5 cel/ml), se tomaron 50 µl y depositados dentro de un
alvéolo de un plato de ELISA. Con la ayuda de un inoculador multipunto de 48 descargas, los
aislamientos fueron transferidos sobre la superficie de cada uno de los distintos medios de cultivo.
Tiempo de crecimiento
Los aislamientos fueron sombrados en medio LMA. Se determinó dos rangos de crecimiento: 3 5
días para rizobios de crecimiento rápido, y de 712 días para rizobios de crecimiento lento. Los
aislamiento se incubaron a 26 0 C, y las lecturas se hicieron a los 5 y 12 días, respectivamente.
Morfología de las colonias
Las colonias formadas en los medios de cultivo fueron clasificadas en tres categorías: acuosas
translúcidas, acuosas blancas opacas, y cremosas opacas.
Acidificación o alcalinización del medio LMA
Los microsimbiontes de maní fueron sembrados en medio LMA conteniendo azul de bromotimol
(0.25 g/100ml). Las cajas de Petri fueron incubadas a 26 0 C determinándose la acidificación (color
amarillo) o alcalinización (color azul) producido por los microorganismos.
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Utilización de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno
Se siguió el método descrito por Bernal y Graham (2001). Se utilizaron soluciones de fuentes de
carbono y nitrógeno incluidos sorbosa, tartrato, Dglucoronic, eritritol, dulcitol, citrato, lactato,
glicina, triptófano, tirosina, cada una usada en una concentración final de 1g∙L 1 en un medio basal.
El crecimiento de los microorganismos fue determinado a los 7 días de incubación.
Resistencia a antibióticos
Los aislamientos fueron probados en su capacidad de resistir a los antibióticos: estreptomicina,
espectinomicina, kanamicina, ácido nalidíxico, contenidos en medio TYA (triptona, levadura, agar).
Toler ancia a metales pesados
Se probó la tolerancia a: AlCl3.6H2O (500 ug/ml), Pb (CH3COO)2 (500 ug/ml), CuCl2.2H2O (100
ug/ml), y ZnCl2 (100 ug/ml), contenidos en medio TYA. La presencia o ausencia de crecimiento de
los aislamientos fue determinado luego de ser incubados a 26 0 C durante 10 días.
Toler ancia a pH del medio
Los aislamientos fueron probados en su capacidad de crecer en medio TYA a pH 4.5; 5.0; y 8.5. El
crecimiento fue determinado luego de incubar los cultivos a 26 0 C durante 7 días.
Toler ancia a concentr aciones de NaCl
Se siguió el método descrito por Bernal y Graham (2001). Se probó el crecimiento de las cepas a
concentraciones de 0.5%; 1.0%; 2.0% NaCl en medio TYA. Las cajas fueron incubadas a 26 0 C
durante 7 días.
Las fuentes de carbono y nitrógeno, así como los antibióticos, metales pesados y cloruro de sodio
fueron esterilizados por filtración, utilizando filtros Acrodisc 13 (GelmanSciences) de 0.2 µm, para
luego ser añadidos a los distintos medios estériles.
Análisis estadístico
La presencia (1), o ausencia (0), de crecimiento de las cepas en los diferentes medios de cultivo, se
registró en una matriz de datos binarios en el programa NTEDIT del paquete estadístico NTSYSpc
versión 2,0 (Applied Biostatistics Inc, 1998).
16
La similitud entre cepas fue calculada de la matriz de datos binarios, entre pares de cepas, utilizando
la opción SIMQUAL, mediante el coeficiente de Simple Match Coeffient (SMC). Sobre la matriz
obtenida se aplicó la técnica de “cluster analysis” empleando el método de agrupamiento UPGMA
(Media Aritmética No Ponderada; Sneath & Sokal, 1973) mediante la opción SAHN
CLUSTERING del paquete NTSYS. Finalmente, mediante la opción TREE DISPLAY fueron
visualizados los agrupamientos o relaciones entre cepas, generándose el dendograma (fenograma)
mostrando las relaciones fenotípicas.
Caracter ización genética.
Por la razón anotada en la caracterización fenotípica, solo las cepas asociadas a los cultivos de fréjol
y maní, fueron caracterizadas genéticamente. Para esto, se seleccionaron cepas representativas de
cada grupo del dendograma generado en el análisis fenotípico. Las cepas de fréjol se caracterizaron
en el Departamento de Microbiología de Suelos de la Universidad de Minnesota (Bernal y Graham,
2001), y las cepas de maní se caracterizaron en el Instituto de Bioquímica y Biología Molecular
(IBBM) de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad de La Plata – Argentina. A
continuación se detalla únicamente la metodología utilizada en la caracterización genética de las
cepas de maní (Aguilar M. comunicación personal), ya que la descripción de la metodología para la
caracterización de las cepas asociadas al fréjol, se encuentra detallada en el artículo de Bernal y
Graham (2001).
Aislamiento de ADN genómico de las cepas.
Se utilizó el método de extracción con resina (Walsh et al. 1991). Tres colonias crecidas en medio
LMA, fueron suspendidas en 300 µl de ClNa (1M), dentro de un tubo eppendorf, y homogenizadas por
agitación. Después de incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, se centrifugó a 14000 rpm
por 3 minutos. El sobrenadante fue descartado para luego colocar en el tubo 300 µl de agua bi destilada
estéril. Se procedió a agitar y centrifugar en las mismas condiciones descritas anteriormente. Al pellet
obtenido se le adicionó 150 µl de una suspensión acuosa (6% p/v) de resina (Chelex 100, BIORAD)
en agitación, se dejó incubar 20 minutos a 56 0 C, y posteriormente 8 minutos a 99 0 C. Las muestras se
conservaron a 20 0 C hasta el momento de ser utilizadas.
17
Análisis del genoma bacter iano
a. Condiciones generales de PCR y electroforesis
Todas las amplificaciones se realizaron en un termociclador (Biometra UNOThermoblock). Los
productos de amplificación, en alícuotas de 35 µl, fueron separadas mediante electroforesis horizontal
en geles de agarosa (0.8 2.5 %) conteniendo buffer TBE (trisboro, EDTA) (0.5X) y bromuro de etidio
(5x10 4 mg/ml) y visualizados en un transiluminador de luz ultra violeta (UV). Los geles fueron
preparados en recipientes de electroforesis de 7 x 10 cm o 15 x 10 cm (BIORAD), y las fuentes de
poder utilizadas fueron PowerPac 200 y 300 (BIORAD) y EC29050.
b. Digestión de fragmentos amplificados por PCR.
Las digestiones se realizaron a partir de alícuotas de 4 a 10 µl de la mezcla de reacción de PCR
incubadas con endonucleasas de restricción siguiendo las condiciones especificadas por el fabricante
(3 U por reacción). Se incubó toda la noche a 37 0 C (o a 65 0 C), de acuerdo a la temperatura óptima de
la endonucleasa utilizada. Los productos de las digestiones fueron separados por electroforesis en
geles horizontales de agarosa (2.5 %) en buffer TBE 0.5X. La electroforesis fue llevada a cabo a 80 V
durante 3h, en el mismo buffer.
c. Patrones de bandas (fingerprints) de ADN total usando los cebadores (primers) rep (ERIC y
REP).
Para conocer el grado de similitud entre los aislamientos, se realizó el análisis del genoma bacteriano
completo según De Bruijin, citado por Aguilar (2003), mediante el empleo de cebadores (primers) rep:
ERIC y REP. Para ERICPCR, se emplearon los cebadores E1 (5’
ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC3’) y E2 (5’AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3’).
El volumen de reacción fue de 10 µl conteniendo 2.5 µl de las preparaciones con resina, buffer de
polimerasa (10 mM TrisCl pH 9: 25 o C), 3 mM MgCl2 , 200 µM de cada dNTP, 1.5 µM de cada
primer y 0.55 U de Taq polimerasa. Las amplificaciones de ADN se llevaron a cabo con el siguiente ciclo de temperaturas:
18
95 0 C ⇒ 5 minutos
94 0 C ⇒ 1 minutos
52 0 C ⇒ 1 minutos X 35 ciclos
65 0 C ⇒ 8 minutos
68 0 C ⇒ 16 minutos
Para REPPCR se utilizo también la técnica sugerida por De Bruijin (1992). Para esto se empleó los
cebadores Rep1 (5’–IIIICGICGICATCIGGC3’) y Rep2 (5’–ICGICTTATCIGGCCTAC 3’). El
volumen de reacción fue de 15 µl, conteniendo la misma mezcla de reacción para ERIC, pero
utilizando 3.2 µl de DNA molde y 1 µM de cada primer. La amplificación se llevó a cabo con el
siguiente ciclo de temperaturas:
95 0 C ⇒ 5 minutos
94 0 C ⇒ 1 minutos
40 0 C ⇒ 1 minutos X 35 ciclos
65 0 C ⇒ 8 minutos
65 0 C ⇒ 16 minutos
Los perfiles (patrones de bandas) obtenidos después de la corrida de electroforesis y visualizados,
fueron analizados para su comparación, utilizando el programa GEL Compare.
d. Análisis por RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphism) de la región íntergénica 16S
23S rRNA.
La amplificación de la región íntergénica 16S23S rRNA se llevó a cabo en cada uno de los
aislamientos utilizando los primers FGPS1490 (16f) y FGPL 132’(23r) cuyas secuencias son 16f
5’TGCGGCTGGATCACCTCCTT3’, 23r 5’CCGGGTTTCCCCATTCGG3’. El primero deriva de
una secuencia conservada en el extremo 3’ del gen 16S rRNA y el segundo deriva del extremo 5’
del gen 23S rRNA próximo a la región intergénica (Laguerre et al. 1996).
Las reacciones comprendieron un volumen final de 25 µl. El contenido de ADN fue de 2.5 µl de las
preparaciones con resina, 10mM TrisCl pH 9: 25 o C de buffer polimerasa, 2.5 mM de MgCl2, 200 µM
19
de cada dNTP, 1 µM de cada primer, y 1 U de Taq polimerasa. Las amplificaciones se llevaron a cabo
con el siguiente ciclo de temperaturas:
95 0 C ⇒ 5 minutos
94 0 C ⇒ 1 minutos
55 0 C ⇒ 1 minutos 35 ciclos
72 0 C ⇒ 2 minutos
72 0 C ⇒ 3 minutos
El análisis de RFLP fue de dos grupos de aislamientos obtenidos por diferenciación en el tamaño
del producto de su PCR. Las digestiones se realizaron con las enzimas de restricción Msp1, TAQ I,
Hae III, RsaI, AluI. El volumen de reacción fue de 8 µl conteniendo: producto de PCR 6µl, BSA 0.1
µl, Buffer 10X 1X, Enzima 3 U.
Actividad 1b. Almacenamiento de las cepas.
Para ambos casos, solicitud de cepas, y selección (aislados del suelo o directamente de la
leguminosa), el material germoplásmico fue almacenada apropiadamente a través del proceso de
liofilización (secado en frío y al vacío) de cada cepa, o en glicerol bajo temperatura de –70° C. El
almacenamiento se realizó en el Laboratorio de la Sección de Microbiología del Departamento
Nacional de Protección Vegetal (DNPV) de la Estación Santa Catalina.
Actividad 2 a. Estudio de la compatibilidad genética entre Rhizobium y el cultivo de fréjol.
A través de evidencias arqueológicas, se afirma que el fréjol (Phaseolus vulgaris) tiene su origen tanto en Mesoamérica (México, Guatemala), como en los Andes de América del Sur, y estudios
moleculares realizados en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), identifican al
Ecuador y a la región norte del Perú como un tercer mayor acervo genético del fréjol (Tohme et al.
1995). Se conoce además, que el germoplasma de fréjol de Mesoamérica es genéticamente diferente
al de los Andes (Koinange and Gepts, 1992). Esto se ha comprobado a través de hibridaciones entre
cultivares de ambas regiones, dando como resultado deformaciones y letalidad en la F1. En base a
esto, se asume que a través de la coevolución del cultivo de fréjol y su Rhizobium, ésta bacteria también presenta diferencias en la asociación con hospederos pertenecientes a diferente región.
20
Por lo tanto, para conocer si la nodulación de fréjol por su respectivo Rhizobium es efectivo o inefectivo, lo cual depende de la compatibilidad genética entre ambos simbiontes, se llevó a cabo
una investigación de especificidad por nodulación en jarras Magenta (Vincent, 1970) conteniendo
arena estéril e irrigada con solución nutritiva modificada "Summerfield" (McDermott and Graham,
1990). Las variedades de fréjol común usadas fueron Bolón M6, Bolón Cañicapac y Bolón Mater.
Además se incluyó la variedad Puebla 152 de origen Mesoamericano, para la comparación. Cada
variedad fue inoculada con todas sus respectivas cepas consideradas en el estudio. Se usaron suelos
de Cotacachi (norte del Ecuador), Cañicapac, Mangucusana y Mater (sur del Ecuador), y de
Poconichim (México), para contrastar. Las plantas fueron colocadas por cinco semanas en una
cámara de crecimiento (Conviron PGW 36). A las cinco semanas, se evaluó el color
(verde/clorosis), el crecimiento de las plantas, el número más probable (NMP) de rizobios, y la
diversidad genética (usando la prueba Box A1RPCR). Así se determinó la combinación compatible
leguminosacepa de Rhizobium. Esta actividad se llevó a cabo en los laboratorios de Microbiología
de Suelos de la Universidad de Minnesota.
Actividad 2 b. Estimación del potencial fijador de nitrógeno de las cepas de Rhizobium en invernadero
Los experimentos fueron instalados en los invernaderos de la sección de Microbiología (DNPV) de
la Estación Experimental Santa Catalina del INIAP. Para fréjol se utilizó la variedad Bolon M6,
para arveja la variedad Roxana. Las variedades de soya y maní, fueron Vinceña y Caramelo
respectivamente. La actividad para estas dos últimas leguminosas se realizó en los laboratorios e
invernaderos de la Estación Pichilingue del INIAP. En alfalfa, esta actividad fue realizada hace 8
años por el Departamento de Protección Vegetal de la Estación Santa Catalina, por lo que las cepas
seleccionadas en ese entonces fueron utilizadas directamente en el experimento de campo. Con
relación a los tratamientos, éstos fueron el resultado de la combinación de la variedad por las cepas
de Rhizobium. Se incluyeron tratamientos sin inocular (control absoluto), y con nitrógeno (solución de NOK 0.05% (control fertilizado), utilizados para comparación de las cepas. Todos los ensayos de
invernadero se dispusieron en un diseño de bloques completamente al azar (DCA) con tres
repeticiones. La unidad experimental estuvo constituida por la unión de dos jarras Magenta
autoclavables, superpuestas una sobre la otra y comunicadas por una mecha de algodón. La jarra
superior sirvió de maceta para sembrar una semilla previamente esterilizada y germinada. La jarra
inferior sirvió de recipiente para colocar la solución nutritiva y agua, de acuerdo a los
requerimientos de cada cultivo. Las variables cualitativas y cuantitativas tomadas en consideración
21
para la evaluación de la capacidad simbiótica en invernadero fueron: coloración de la planta,
número y peso seco de nódulos (mg/100 nódulos), peso fresco (g/planta) y peso seco (g/planta). Se
utilizó un diseño completamente al azar y la selección de las cepas se realizó al nivel del 5%. Así
se conoció la efectividad fijadora de nitrógeno de las cepas de cada leguminosa, bajo condiciones
de invernadero.
Manejo del ensayo
Ester ilización y germinación de semillas.
Las semillas fueron esterilizadas superficialmente siguiendo el método sugerido por Vincent (1970).
La semilla fue tratada con etanol (96%) durante tres minutos, hipoclorito de sodio (5%) durante tres
minutos, y lavadas por ocho veces con agua destilada estéril. Posteriormente las semillas fueron
germinadas en placas de Petri conteniendo agar (1.5%) e incubadas a 26ºC durante 35 días
dependiendo de la leguminosa.
Siembra e inoculación.
Dos semillas germinadas fueron luego transferidas a jarras Magenta conteniendo turba y piedra
pómez (relación 3:1) estéril. El inoculante bacteriano se preparó a partir de una colonia aislada en
medio de cultivo LMA, y transferida a medio líquido (LM) e incubado a 26ºC. Los cultivos
crecidos conteniendo 10 8 cel/ml se diluyeron a 10 5 cel/ml, y se tomaron 10 ml para ser depositados
(10 6 cel/ml) sobre la corona de la raíz de la semilla germinada, evitando la dispersión del
inoculante. Las macetas fueron colocadas bajo invernadero a una temperatura de 1524 ºC
(dependiendo de la leguminosa), con una humedad relativa de 4550%.
Raleo, r iego y tutor eo.
Transcurridos 10 días después de la siembra, se procedió a dejar la planta más vigorosa por unidad
experimental (jarra). El riego se realizó cada vez que el cultivo lo requería, para esto se utilizó agua
destilada estéril y medio SomasegaranN aplicado en la jarra inferior, para que el agua suba por
capilaridad a la planta. Cuando las plantas tuvieron 15 días (caso maní), éstas fueron sujetadas con
hilo plástico a un soporte de alambre tendido en la parte superior del invernadero.
Actividad 2 c. Estimación del potencial fijador de nitrógeno bajo condiciones de campo.
22
Como en el ambiente natural (suelo) las raíces de las leguminosas interactúan con los rizobios en
presencia de otros microorganismos y en presencia del nitrógeno del suelo, las cepas previamente
evaluadas en invernadero, fueron probadas bajo condiciones de campo, en diferentes sitios de la
región donde predomina la leguminosa. La metodología seguida fue la recomendada por el CIAT
(1988).
Para fréjol, los experimentos fueron localizados en Tumbaco y Pifo (Provincia de Pichincha)
utilizando las variedades INIAP TOA 412, y la línea promisoria Canario SCC2 (del Programa de
Leguminosas del INIAP).
Los experimentos de arveja se llevaron a cabo en Cañar y Chimborazo, con la variedad Roxana. En
alfalfa, los experimentos se ejecutaron en Chimborazo, utilizando la variedad Abunda Verde. En
este último caso, las pruebas de campo se realizaron en colaboración con voluntarios del Cuerpo de
Paz. En soya, el trabajo de campo tuvo lugar en Los Ríos, usando la variedad Vinceña, y el estudio
de maní se realizó en Loja con las variedades Caramelo e INIAP 380 (del Programa de
Leguminosas, Estación BolicheINIAP).
Manejo del exper imento
Preparación del suelo
Con la maquinaria adecuada se procedió a preparar el suelo mediante una labor de arada y dos de
rastra para luego surcarla a 0.400.60 cm (de acuerdo a cada leguminosa) entre surcos. Se efectuó el
trazado de las parcelas (unidades experimentales) y bloques.
Fer tilización, e inoculación de la semilla.
Antes de la siembra se procedió a fertilizar todas las parcelas con fósforo, potasio, y micronutrientes
de acuerdo al análisis de suelos y requerimientos de cada leguminosa. Se aplicó urea (46%)
únicamente en las unidades experimentales del tratamiento nitrogenado. La semilla fue inoculada al
momento de la siembra usando las cepas en turba. Las dosis fueron de 10 g de inoculante por
kilogramo de semilla (soya, fréjol, maní, arveja), y 50 g por Kg de semilla en alfalfa.
Riego y siembra, y cosecha.
Antes de la siembra se realizó un riego ligero para garantizar el establecimiento de la bacteria y
buen crecimiento de la planta. La siembra se efectuó en forma manual con el sistema de golpes a
23
cada 30 cm de distancia entre plantas. En cada sitio se depositó cuatro semillas para seleccionar 3
plántulas a los 10 días. La cosecha se realizó en forma manual al estado de maduración del cultivo.
Cada tratamiento fue colocado en fundas previamente identificadas. En alfalfa, la siembra de la
semilla inoculada se realizó a “chorro continuo” inmediatamente después de la inoculación, y la
semilla fue cubierta con una ligera capa del suelo.
Factores, tratamientos, diseño exper imental.
Los factores en estudio fueron las variedades y las cepas. Los tratamientos resultaron de la
combinación de los factores en estudio, bajo un diseño experimental de bloques completos al azar
con arreglos factoriales de acuerdo al número de variedades y cepas en cada leguminosa. La unidad
experimental estuvo constituida por parcelas (68 m 2 ) de siete surcos conteniendo 1620 plantas
(dependiendo de la leguminosa). Las parcelas estuvieron separadas por un metro de distancia, y
entre bloques por 2 m. La unidad experimental neta consta de los surcos centrales de cada parcela.
Parámetros analizados.
Las variables a tomarse fueron: a) peso fresco del follaje (g/planta). Cuando el cultivo alcanzó 50%
de la floración se extrajo seis plantas tomadas al azar de los tres surcos centrales realizando un corte
en la base del tallo. b) peso seco del follaje. El mismo material indicado anteriormente fue secado
en una estufa a 70ºC durante 48 horas para luego determinar el peso seco en g/planta, c) peso seco
de nódulos después de ser mantenidos por 48 horas a 60º C, d) porcentaje de nitrógeno total. El
valor de nitrógeno se obtuvo por el método de Kjeldahl en los laboratorios del Departamento de
Suelos de la Estación Santa Catalina, e) rendimiento. Se pesó el número total de granos cosechados
en las plantas hechas un muestreo, y el dato obtenido se expresó en kg/ha.
Una variedad de cualquier leguminosa puede restringir la nodulación de determinada cepa o sero
grupos de rizobios, lo cual determina una especificidad entre la planta y el rizobio, repercutiendo en
el proceso simbiótico. Por esta razón, se realizó pruebas de campo en fréjol y maní, que incluyan
diferentes variedades por leguminosa. Así se logró identificar cepas efectivas en fijación biológica
de nitrógeno al hacer simbiosis con variedades utilizadas por el agricultor.
Actividad 2 d. Estudio de la competitividad de las cepas por nodulación en fréjol.
En fréjol se llevó a cabo un estudio de competición de las cepas por nodulación, para conocer la
cepa de mayor agresividad en formar nódulos en la raíz de la planta, y bajo condiciones de campo.
24
La identificación de las cepas se realizó utilizando sueros pertenecientes a las cepas seleccionadas
previamente. Para esto se siguió la metodología sugerida por Somasegaran y Hoben (1994). Como
alternativa pudo haberse utilizado la reacción BOXPCR de Versalovic et al. (1994), generando
"fingerprints" mediante electroforesis, pero la técnica utilizada en el proyecto fue la de serología,
por cuanto es una técnica más barata y sencilla que la técnica molecular.
Obtención de antígenos
Para la obtención de los antígenos, los cultivos bacterianos se hicieron crecer en LMA a 26ºC. La
pureza se verificó al final del tiempo especificado para el crecimiento (4 días). Se seleccionaron
colonias puras de las cepas y se hicieron crecer en medio líquido, hasta la concentración de 10 8
celulas/ml. La suspensión se distribuyó en pequeños viales estériles en proporciones de 2 ml para
inyecciones. A cada una de las muestras se agregó formol (1ml de solución al 1% para 100 ml de
suspensión) y se conservaron a 4º C.
Obtención de antisueros
Para la obtención de antisueros se usó una aguja de tamaño mediano (graduación 23, 0.5 mm) para
inocular en la gran vena marginal de la oreja de conejos de buen desarrollo. Las suspensiones
bacterianas fueron inoculadas de la siguiente manera: el primer día se inoculó 1 ml de suspensión
bacteriana inerte en forma subcutánea. A los 7 días se repitió el procedimiento y a los 14 días se
inoculó en forma intravenosa 1 ml de suspensión bacteriana viva. Siete días después de la última
inyección se recogió una muestra (2 ml) desde la vena de la oreja. La sangre se pasó a un tubo de
prueba con tapón de rosca estéril. Se dejó coagular la sangre a temperatura ambiente durante dos
horas, y se separó el coagulo introduciendo un aplicador de madera alrededor del mismo. Luego se
refrigeró durante toda la noche. El suero claro se decantó en un tubo de prueba evitando que las
células rojas de la sangre entren al tubo. Se determinó el título de aglutinación de la siguiente
manera: Se pipetearon 0.4 ml de antisuero patrón para pasarlos a un tubo de 16 x 125 mm
conteniendo 9.56 ml de solución salina (0.85%). Se mezclaron bien dando una dilución del
antisuero de 1/25. Se etiquetó el tubo con el número 1, y se utilizaron 10 tubos adicionales con 2.5
ml de solución salina cada uno. Los tubos fueron rotulados del 2 al 11. Usando pipetas nuevas se
prepararon diluciones hasta 1/25000. Los tubos 1 y 2 fueron conservados para usarlos
posteriormente en caso de ser necesario. Las diluciones se probaron con la cepa inoculada
(homóloga). La última dilución que presentó anticuerpos en reacción visible fue la que indicó el
título. Determinado el título, se procedió a sangrar el conejo mediante inyección cardiaca, retirando
lentamente 50 ml. La sangre se colocó en tubos de boca ancha para facilitar la separación del suero.
25
El suero se mantuvo a temperatura ambiente por una hora, y luego a 4ºC por 12 horas para la
coagulación. Por centrifugación (2000 rpm) durante 10 minutos se separó el suero del resto del
coagulo sanguíneo. El suero así obtenido fue preservado con una solución de mertiolato (0.1 ml de
una solución al 1% para cada 10 ml de suero) y bajo refrigeración.
Reconocimiento de antígenos homólogos por inmunodifusión.
Se colocaron 100 ml de una solución salina al 0.85% conteniendo azida de sodio ( 0.075%) en un
matraz Erlenmeyer de 250 ml, se agregaron 0.75 g de agar Noble y se sometió a ebullición en baño
María, para luego ser colocado en placas de Petri, para la solidificación. Se trazó el contorno de la
base de una placa Petri sobre un papel blanco. Se sacó una plantilla de 6 círculos equidistantes de
0.4 cm de diámetro en un patrón hexagonal en el centro del contorno de una placa. Un séptimo
orificio se hizo en el centro del patrón hexagonal y se pintaron los círculos. La placa Petri
(conteniendo agar) se colocó sobre la plantilla. El patrón de los círculos fue visible a través del agar.
Se cortaron los orificios dentro del agar usando un sacabocados de 0.4 cm, eliminando
cuidadosamente los tapones de agar con alfileres o cualquier otro implemento apropiado. Se colocó
una gota de agar fundido para sellar la base del orificio.
Para las reacciones de inmunodifusión, se prepararon las suspensiones de antígeno (1x10 10
células/ml). Las muestras fueron tratadas con calor por una hora a 100 °C, y dos gotas de cada
antígeno se colocaron en sus respectivos orificios. La suspensión estándar de las cepas conocidas
fue colocada en las cavidades superiores e inferiores, mientras que la de las desconocidas fue
colocada en las cuatro cavidades laterales. La cavidad central recibió el antisuero sin dilución. Las
cavidades fueron llenadas cuidadosamente hasta el tope, usando pipetas Pasteur de extremidades
finas y se volvieron a colocar las tapas de las cajas. La base de la placa de difusión fue marcada con
la identidad de cada antígeno. Las placas se incubaron a temperatura ambiente, en un ambiente
saturado de humedad, para luego realizar observaciones después de 24 y 48 horas.
Evaluación de la competencia entre cepas.
Determinación de la población de rhizobios nativos en el suelo.
La determinación de la población de Rhizobium nativo del suelo se realizó siguiendo la metodología sugerida por el CIAT (5). Para esto, se utilizó fundas plásticas de crecimiento conteniendo 20 ml de
solución nutritiva, por cada funda. La semilla de fréjol (variedad Yunguilla) se esterilizó usando
hipoclorito al 5% durante 5 minutos, para luego ser lavadas en agua estéril. Las semillas fueron
26
transferidas a placas con agar para la germinación, y una vez germinadas, fueron transferidas a las
fundas de crecimiento. Para la inoculación del suelo, éste fue diluido hasta 10 8 . Se inoculó el suelo
en cada una de las fundas con 4 repeticiones, incluyéndose fundas de crecimiento correspondientes
al testigo o control. A las tres semanas de crecimiento se cosecharon las plantas para proceder al
registro de nódulos, con presencia (+) o ausencia (). Utilizando las tablas estadísticas de Fisher, se
procedió a calcular la población rhizobiana del suelo.
Pr eparación del inoculante
Para la preparación del inoculante se tomaron colonias puras de las cepas UMR (1899, 1478 y
1481), para sembrarse en medio líquido levadura manitol. Cuando el crecimiento celular en los 3
diferentes medios fue suficiente (10 9 cel/ml), las cepas con una misma concentración celular fueron
mezcladas e inyectadas asépticamente a fundas auto clavadas estériles de polipropileno conteniendo
turba, de acuerdo a los tratamientos previamente establecidos. Los inoculantes fueron incubados a
25ºC durante una semana. La calidad del inoculante se evaluó mediante recuento de células en
placa.
Estudio de campo
El experimento de campo se realizó en un terreno de 500 m 2 localizado en Pifo (Provincia de
Pichincha), con un historial de potrero, sin uso de leguminosas, y deficiente en nitrógeno. El
experimento tuvo un diseño de bloques completos al azar con siete tratamientos y 4 repeticiones,
utilizándose la variedad Yunguilla, tipo arbustiva, precoz y probada en experimentos anteriores de
fijación biológica de nitrógeno. La inoculación de la bacteria se hizo al momento de la siembra de la
semilla. Se utilizaron además dos tratamientos de control: uno sin nitrógeno y sin inocular, y uno
con nitrógeno sin inocular.
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Cuadro 1. Tratamientos utilizados en el estudio de campo, para la evaluación de la competitividad
entre cepas, asociadas al cultivo de fréjol.
T1 UMR 1899
T2 UMR 1481
T3 UMR 1478
T4 UMR 1899 X UMR 1478
T5 UMR 1899 X UMR 1481
T6 UMR 1478 X UMR 1481
T7 UMR 1899 X UMR 1478 X UMR 1481
T8 Control –N
T9 Control +N
Prácticas cultur ales y manejo del cultivo.
Se prepararon surcos a una distancia de 60 cm. y se dividieron en 36 bloques de 2,40 m x 2,40 m
cada uno. Los bloques fueron marcados claramente con sus respectivos tratamientos, para
posteriormente dar un riego antes de la siembra. Se sembraron tres semillas por golpe, y a distancias
de 30 cm, y sembrándose primeramente los tratamientos no inoculados (N y +N). A los 15 días de
la siembra se realizó un raleo, dejando una sola planta por cada golpe.
Muestreo.
A la época de la floración, se cosecharon 3 plantas por bloque, para luego proceder a la extracción
de 50 nódulos. Estos fueron sometidos a un análisis de inmunodifusión para identificar las cepas de Rhizobium que habían colonizado y formado nódulos en las plantas de fréjol. Conociendo la capacidad competitiva de las cepas conjuntamente con la capacidad fijadora de nitrógeno, es posible
la elaboración de inoculantes.
Actividad 3 a. Recolección de turbas
Se consideró como base a los estudios de Constante (1993), y de Estévez y Constante (1993),
incluyéndose además otras turbas y materiales que presentaron propiedades que permitieron
considerarlas como acarreadores apropiados de la bacteria. Las turbas recolectadas fueron secadas,
molidas, tamizadas en una malla de 180 µm y posteriormente empacadas en fundas de polietileno
de baja densidad y humedecidas hasta el 50% de su capacidad de absorción.
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Actividad 3 b. Análisis físico y químico de los soportes.
Se realizó la caracterización física y química de los soportes: 1) turba de Chimborazo, 2) turba de
Lloa, 3) turba de Alaska, 4) capa rosa, 5) ceniza, 6) zeolita, y 7) sustrato a base de vaina seca
molida de fréjol mezclado con compost. Se dio énfasis al tamaño de las partículas y al contenido de
materiales no deseables que dificultan el normal procesamiento de extracción, secado y molienda
del material. También se determinó la capacidad de cada soporte en la retención de humedad para lo
cual se empleó la técnica de rutina usada en el Laboratorio de Suelos de la Estación Santa Catalina.
La caracterización química incluyó: contenido de amonio, nitrato, carbono, potasio intercambiable,
porcentaje de materia orgánica, fósforo, potasio y pH. Para la determinación de pH se prepararon
suspensiones en una relación 2:5 de la muestra en agua destilada y las medidas se registraron con la
ayuda de un pHmetro. El pH de los soportes se ajustó a 6.57.0 con CaCO3. Los análisis de P, K,
Ca, Mg, Cu, Fe, Mn, Zn, B fueron realizados por el método de Olsen modificado a excepción del
boro en donde se uso curcumina.
La determinación de la población microbiana se la realizó únicamente en turbas. Para esto, se
utilizó 50 gramos de turba y colocados en 450 ml de agua destilada estéril, para ser agitado
vigorosamente por 30 minutos. A continuación se procedió a realizar diluciones hasta 10 8 . De las
diluciones 10 3 hasta 10 6 se tomaron 100 ul y colocados en cajas Petri conteniendo medios de
cultivos apropiados para bacterias, hongos y actinomicetes. Los platos Petri fueron incubados a 25
30ºC por cinco días. Posteriormente se determinó las poblaciones de bacterias, hongos y
actinomicetes.
Actividad 3 c. Interacción rizobioturba (portador).
Se ha comprobado en experimentos llevados a cabo en otros países, que una cepa puede sobrevivir
bien en una turba y no en otra, u otro sustrato. Se consideró como parámetros, el crecimiento
(células/gramo de turba) y la sobrevivencia de la bacteria en determinados intervalos de tiempo. La
técnica utilizada estuvo basada en el procedimiento descrito por Gómez et al. (1997). Los
portadores (50 g) de cada uno fueron impregnados con 25 ml de suspensión bacteriana, a una
concentración de 10 9 ufc/ ml. El material inoculado se incubó por ocho días a 26 ºC de temperatura.
cada semana se homogenizó removiendo las fundas.
29
Actividad 3 d. Evaluación de materiales alternativos
Los soportes fueron inoculados después de la esterilización al vapor. La preparación del inoculante,
y la enumeración de los rhizobios se realiza siguiendo la metodología descrita por Chao y
Alexander (1984), GrahamWeiss et al. (1987), y la de Kostov y Lynch (1998). El estudio fue
llevado a cabo en el Departamento de Protección Vegetal de la Estación Santa Catalina.
Actividad 4 a. Evaluación de la esterilización de los portadores.
Con la colaboración de la Comisión Ecuatoriana de Energía Atómica (CEEA) se está ejecutando un
experimento que permita determinar el efecto de los métodos de esterilización de la turba y otros
soportes, en la sobrevivencia de los rizobios durante el proceso de almacenaje del inoculante. Sé
está evaluando los métodos de esterilización al vapor usando autoclave (15 psi durante 1 hora) y el
de irradiación. La metodología a seguirse fue la sugerida por Date y Roughley (1977). El material
plástico de empaque del inoculante también está siendo evaluado en éste estudio, para saber si el
material afecta o no la sobrevivencia de la bacteria durante el almacenamiento del inoculante.
Actividad 5.1 Difusión de resultados y productos generados por el proyecto.
La difusión de los resultados se ha dado principalmente a través de: 1) días de campo en fincas de
agricultores donde las leguminosas tienen su importancia, 2) trípticos, y 3) seminarios o talleres a
nivel nacional e internacional. Estos se describen en: “Productos del proyecto”. La difusión de los
resultados y productos se ha realizado siguiendo la metodología utilizada por la Fundación GAIA.
Es necesario enfatizar que la difusión se ha realizado conjuntamente con ciertos resultados
correspondientes al Proyecto Comminandes. Así por ejemplo, el uso de inoculantes de Rhizobium y el uso del compostaje en arveja y alfalfa en las Provincias del Cañar, Chimborazo y Pichincha. Se
ha elaborado adicionalmente documentos del proceso y uso del compost en leguminosas
conjuntamente con inoculantes de Rhizobium.
Actividad 6.1 Institucionalizar un sistema de control de calidad de los inoculantes.
Actualmente se apoya la institucionalización de un sistema de control de calidad de los inoculantes
a través del laboratorio destinado a su producción. El sistema de control de calidad está basado en
un programa que considera los siguientes factores:
30
a) Elaboración de antisueros para las cepas inoculantes. El uso de antisueros permite evaluar
periódicamente la pureza de las cepas. Se está usando la técnica serológica (ELISA) para la
identificación de las cepas.
b) Crecimientos de la bacteria en diferentes y apropiados medios de cultivo, y a través de
reacciones de autenticación (ej. tinción gram), y chequeos frecuentes del pH del medio de cultivo.
De esta manera se controla el crecimiento de contaminantes como otras bacterias u hongos, que
generalmente son rápidos en crecimiento generando acidez (pH bajo) del medio.
c) Viabilidad del producto. Antes de colocar en el mercado, la viabilidad del producto está siendo
analizada a través del número de células viables de la cepa específica en inoculante fresco.
d) El producto debidamente procesado y empaquetado lleva fecha de expiración y las
recomendaciones necesarias para el agricultor, con énfasis en el tipo de Rhizobium, su correspondiente leguminosa, la población bacteriana (células/gramo), y dosis de aplicación. El
producto listo para su distribución, es almacenado bajo refrigeración (5° C).
8. RESULTADOS OBTENIDOS.
Actividad 1a. Solicitud, recolección y caracterización de cepas.
El INIAP dispone de un banco germoplásmico de Rhizobium para fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní. Este material genético esta listo para la elaboración de inoculantes, y para el intercambio con
instituciones de investigación en fijación biológica de nitrógeno, nacionales e internacionales.
Los resultados de la caracterización genotípica y genética de las cepas asociadas al cultivo de fréjol
se encuentran detallados en la publicación de Bernal y Graham (2001). A continuación se describe
los resultados de la caracterización fenotípica y genética de las cepas asociadas al cultivo del maní.
El dendograma (fig.8.1), muestra la relación fenotípica de los 93 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní. El dendograma generado muestra la presencia de tres grupos bien
diferenciados de los cuales se seleccionaron 29 aislamientos representativos (Cuadro 8.1). Del
grupo uno fueron seleccionados 13, del grupo dos 7, y del grupo tres 9 aislamientos.
31
Cuadro 8.1. Aislamientos de Bradyrhizobium sp. recolectados en las provincias de Manabí y Loja representativos de los grupos generados por el análisis fenotípico.
No. Código de amplificación Cepa Origen 1 1 ECUML102 Loja 2 2 ECUMP5 Portoviejo 3 3 ECUMP72 Portoviejo 4 4 ECUMP23 Portoviejo 5 5 ECUMP222 Portoviejo 6 6 ECUMP201 Portoviejo 7 7 ECUML27 Loja 8 8 ECUML124 Loja 9 9 ECUMP11 Portoviejo 10 11 ECUMP132 Portoviejo 11 12 ECUMP134 Portoviejo 12 13 ECUML53 Loja 13 14 ECUMP12 Portoviejo 14 15 ECUML23 Loja 15 16 ECUML66 Loja 16 17 ECUML51 Loja 17 18 ECUMP151 Portoviejo 18 20 ECUML83 Loja 19 21 ECUML82 Loja 20 22 ECUMP17 Portoviejo 21 23 ECUML85 Loja 22 24 ECUML91 Loja 23 25 ECUML62 Loja 24 26 UMR 6011 Universidad de Minessota 25 28 CIAT 3550 Colombia 26 29 CIAT 5013 Colombia 27 30 CIAT 14 Colombia 28 31 ECUML105 Loja 29 32 ECUMP101 Portoviejo
32
Coefficient 0.29 0.47 0.64 0.82 1.00
L81 L91 L115 3080 P94 P151 L61 CIAT3825 L93 P61 P3L102 CIAT3555 CIAT3551 P103 L113 L36 P91 L42 L112 L45 P93 P12 L22 L96 P163 P21 L103 L125 L101 P85 L104 P82 L52 P21 L94 L15 P19 L116 P131 CIAT865 CIAT3548 P71 L55 L76 P1P161 L126 L95 P162 P133 P201 3077 CIAT14 P20 P92 CIAT6 P62 CIAT3824 P14 CIAT3550 P22 L51 CIAT5013 P11 L62 6011 P86 L124 L74 P84 L105 L82 3081 3079 P17 P23 P132 L83 L85 CIAT866 L53 L54 L63 L66 P102 L23 L27 P5P101 P134 P72 P222
3
1
2
Figura 8.1 Dendograma en base a la caracterización fenotípica de la colección de 93
aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní en el
Ecuador
33
Caracter ización molecular .
El patrón de bandas (fingerprint) de 29 aislamientos (Cuadro 8.1) representativos de los grupos de
la caracterización fenotípica, demostró una gran variedad de perfiles lo cuál sugiere que desde el
punto de vista del análisis general del genoma de cada aislamiento, las cepas de la bacteria asociada
al cultivo de maní en el Ecuador, son muy diversas. No se encontraron patrones de bandas
idénticos, y tampoco fue posible establecer una asociación entre los patrones (fingerprints) y lugar
de origen del aislamiento (Figura 8.2 y 8.3).
Figura 8.2. Dendrograma mostrando la relación de 29 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al maní. Los aislamientos fueron seleccionados de los grupos generados en el dendograma del análisis fenotípico. El método usado fue ERICPCR.
34
Figura 8.3. Dendrograma mostrando la relación de 29 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní. Los aislamientos fueron seleccionados de los grupos representativos del análisis fenotípico. El método utilizado fue REPPCR.
35
Análisis RFLP
De la amplificación de la región intergénica 16S23S rRNA de los 29 aislamientos, se obtuvieron
dos grupos que se diferenciaron por el tamaño del producto PCR. Los tamaños fueron de 950 y
1200 (Cuadro 8.2) 12 aislamientos no amplificaron y no se prosiguió con su análisis
Figura 8.2. Perfiles de la región intergénica 16S23S RNAr de 29 aislamientos de “Bradyrhizobium”.
Cuadro 8.2. Grupos diferenciados por el tamaño de pares de bases obtenidos del producto PCR de la región intergénica 16S23S rRNA.
No. CEPA Origen Tamaño de banda (bp) 1 ECUML102 Loja 950 2 ECUMP5 Portoviejo 1200 3 ECUMP23 Portoviejo 1200 4 ECUMP201 Portoviejo 950 5 ECUML27 Loja 1200 6 ECUML124 Loja 950 7 ECUMP134 Portoviejo 950 8 ECUMP12 Portoviejo 950 9 ECUML23 Loja 1200 10 ECUML51 Loja 950 11 ECUML83 Loja 950 12 ECUML91 Loja 950 13 UMR 6011 U. de Minnesota 950 14 CIAT 3550 Colombia 950 15 CIAT 5013 Colombia 950 16 CIAT 14 Colombia 950 17 ECUML105 Loja 950
36
El producto de la amplificación de los 17 aislamientos fue sometido al análisis RFLP con enzimas
de restricción. A cada perfil resultante de la incubación con una endonucleasa se le asignó una letra
distintiva (cuadros 8.3 y 8.4), y a partir de esa matriz se compararon los distintos aislamientos. Se
obtuvieron 10 grupos (cuadro 8.5), algunos de los cuales tuvieron mayor representación que otros;
así por ejemplo el grupo 1 comprendió a los aislamientos 1, 10 y 17 mientras que el grupo 10 comprendió cinco aislamientos: 6,11,14,15,16.
El análisis desde el punto de vista de los sitios de aislamiento indica que el grupo 1 tiene una buena representación en la colección de aislamientos de Loja ya que tres aislamientos comparten el grupo
1. Asimismo, el grupo 10 con dos aislamientos aparece como abundante en Loja. Examinando los asilamientos de Portoviejo, se observa que el grupo 6 tiene una mayor representación en la
colección de aislamientos analizada.
Cuadro 8.3. RFLP de la región intergénica 16S23S RNAr del producto de la amplificación de 17 aislamientos de Bradyrhizobium, asociados al cultivo de maní.
No. CEPA Alu I Hae III
Taq I Msp I Rsa 1
1 ECUML102 A A A A A 2 ECUMP5 B B A B B 3 ECUMP23 C C B C B 4 ECUMP201 D A B D C 5 ECUML27 B D C E D 6 ECUML124 D E D D C 7 ECUMP134 D F F 8 ECUMP12 D F E G C 9 ECUML23 E D E H E 10 ECUML51 A A E A A 11 ECUML83 D E E G C 12 ECUML91 D G F D F 13 UMR 6011 D A D I G 14 CIAT3550 D F D D C 15 CIAT5013 D E D H 16 CIAT14 D E D D H 17 ECUML105 E A D A A
37
Cuadro 8.4. Matriz obtenida a partir de perfiles de la incubación con endonucleasas de 17 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní.
Enzimas de Restricción Alu I Hae III Taq I Msp I Rsa 1
A = 11017 A = 14101317 A = 12 A = 11017 A = 11017 B = 25 B = 2 B = 34 B = 2 B = 23 C = 6 C = 3 C = 5 C = 3 C = 4681114 D = 46781112
13141516 D = 59 D = 613141516
17 D = 46121416 D = 5
E = 9 E = 6111516 E = 891011 E = 5 E = 9 F = 7814 F = 12 F = 7 F = 12 G = 12 G = 811 G = 13
H = 9 H = 1516 I = 13
Cuadro 8.5. Grupos obtenidos a partir de la incubación con endonucleasas de 17 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní.
Grupo Cepas Descr ipción 1 11017 ECUML102 ECUML51 ECUML105 2 2 ECUMP5 3 3 ECUMP23 4 4 ECUMP201 5 5 ECUML27 6 78 ECUMP134 ECUMP12 7 9 ECUML23 8 12 ECUML91 9 13 UMR 6011 10 611141516 ECUML124 ECUML83CIAT 3550 CIAT 5013
CIAT 14
Los resultados del análisis genético de los aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní, y colectados en las Provincias de Manabí y Loja, muestran que la población del
microsimbionte es muy heterogénea dentro de 2 grupos de bacterias de crecimiento lento y
crecimiento rápido. La heterogeneidad se encuentra a nivel de sitio de aislamiento, observando que
las situaciones de similitud se encuentran entre aislamientos provenientes de sitios geográficamente
distanciados entre sí.
Actividad 1b. Almacenamiento de las cepas.
El banco germoplásmico del microsimbionte perteneciente a los cultivos de fréjol, arveja, alfalfa,
soya y maní, se encuentra almacenado en la sección de Microbiología del DNPV, Estación Santa
38
Catalina. Las cepas están almacenadas bajo liofilización y tubos de vidrios con medio de cultivo, y
a una temperatura de 4º C. Las cepas liofilizadas podrán ser mantenidas en ese estado por dos años,
y las cepas en tubos de vidrio con medio de cultivo podrán ser mantenidas por cuatro meses.
Actividad 2 a. Estudio de la compatibilidad genética entre Rhizobium y fréjol.
La estimación de la diversidad genética fue mayor cuando se usaron los cultivares locales de fréjol.
Las figuras 8.5 y 8.6 muestran los perfiles Box A1RPCR de aislamientos de los suelos de
Cañicapac y Mater. El agrupamiento es evidente de acuerdo al hospedero usado, lo cual demuestra
la compatibilidad genética (especificidad) entre el Rhizobium colectado en suelos ecuatorianos y sus respectivos hospederos locales.
39
Fig 8.5. Dendograma Box A1RPCR mostrando los aislamientos de fréjol (variedad local Bolon B1) y la variedad introducida (I) sembrados en suelo de Cañicapac C. Se incluyen las cepas referencias: UMR 6917, UMR1632, UMR1899, y UMR6815.
40
Fig. 8.6 Dendograma Box A1RPCR mostrando los aislamientos de fréjol (variedad local Machete MA), y la variedad introducida Imbabello (I), sembradas en suelo de Mater (M). Se incluyen las cepas referencia: UMR 6917, UMR 1632, UMR 1899, y UMR 6815.
41
Actividad 2 b. Estimación del potencial fijador de nitrógeno de las cepas de Rhizobium en invernadero.
La estimación de la capacidad de fijación de nitrógeno en invernadero, de las cepas
correspondientes a los cultivos de fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní, se determina una vez realizado
los análisis estadísticos de cada una de las variables analizadas (ver apéndices).
Cuadro 8.6. Cepas seleccionadas por cada leguminosa con relación a la capacidad de fijación de
nitrógeno bajo condiciones de invernadero. Las variables consideradas para la selección fueron:
color de la planta, número y peso seco de nódulos (mg/100 nódulos), peso fresco (g/planta) y peso
seco (g/planta) de la parte aérea de la planta.
ARVEJA
No. CEPA ORIGEN OBSEVACIONES 1. ECUAM19 Zhoray Las cepas fueron recolectadas en las 2. ECUAP1 Pindiling Provincias de Cañar y Azuay. 3. ECUAS5 Cojitambo 4. ECUAI1 Ingapirca 5. ECUAM39 Pindiling 6. ECUAM52 Vaqueria 7. ECUAM35 Pindiling 8. ECUAZ1 Zhoray 9. ECUAM53 Vaqueria 10. ECUAV1 Verde Loma 11. ECUAM38 Cojitambo 12. ECUAM51 Vaqueria 13. ECUAM11C Zhoray 14. ECUAP3 Pindiling 15. ECUAJC1 Cojitambo 16. ECUAM48 Verde Loma 17. ECUAS3 Zhoray 18. ECUAZ2 Zhoray
42
MANI
No. CEPA ORIGEN OBSEVACIONES 1. ECUMP5 Portoviejo Las cepas fueron recolectadas en 2. ECUMP161 Portoviejo localidades de las Provincias de 3. ECUML126 Loja Manabí y Loja 4. ECUML15 Loja 5. ECUMP1 Portoviejo 6. UMR 3081 Universidad de Minnesota 7. ECUMP103 Portoviejo 8. ECUML105 Loja 9. ECUMP17 Portoviejo 10. ECUMP61 Portoviejo 11. ECUMP131 Portoviejo 12. ECUMP23 Portoviejo 13. ECUMP101 Portoviejo 14. ECUMP134 Portoviejo 15. ECUMP91 Portoviejo 16. ECUML94 Loja 17. ECUMP163 Portoviejo 18. ECUMP93 Portoviejo 19. ECUMP71 Portoviejo 20. ECUML76 Loja 21. ECUML104 Loja 22. ECUML115 Loja 23. ECUMP72 Portoviejo 24. ECUMP21 Portoviejo 25. ECUMP11 Portoviejo 26. UMR 6011 Universidad de Minnesota 27. ECUMP3 Portoviejo 28. ECUML74 Loja 29. ECUMP222 Portoviejo 30. ECUMP21 Portoviejo 31. ECUML81 Loja 32. ECUML52 Loja 33. ECUML112 Loja 34. ECUMP133 Portoviejo 35. ECUMP86 Portoviejo 36. ECUML63 Loja 37. ECUML45 Loja 38. UMR 3080 Universidad de Minnesota 39. ECUML36 Loja 40. ECUMP151 Portoviejo 41. ECUML102 Loja 42. UMR 3079 Universidad de Minnesota
43
SOYA
No. CEPA 0RIGEN OBSERVACIONES 1. CIAT 51 Colombia 2. 6001 Universidad de Minnesota 3. ECUS005 Quevedo Provincia de Los Ríos 4. ECUS10S3 Quevedo 5. TAL 571 Niftal 6. ECUS1SJ Quevedo 7. ECUSP1 Quevedo 8. ECUS001 Quevedo
FREJOL
Las cepas para fréjol fueron probadas directamente en campo ya que los estudios de invernadero se
realizaron en la investigación de Bernal y Graham (2001).
ALFALFA
Las cepas fueron probadas directamente en campo. El estudio de selección en invernadero se realizó
en 1984 como parte de un estudio colaborativo entre el INIAP y la Facultad de Ciencias Agrícolas.
Los ensayos de campo se realizaron con la colaboración del Cuerpo de Paz.
Actividad 2 c. Estimación del potencial fijador de nitrógeno bajo condiciones de campo
Cuadro 8.7. Cepas seleccionadas por cada leguminosa con relación a la capacidad de fijación de
nitrógeno, bajo condiciones de campo. Las variables consideradas para la evaluación fueron:
número y peso seco de nódulos (mg/100 nódulos), peso fresco (g/planta) y peso seco (g/planta) de
la parte aérea de la planta, y porcentaje de nitrógeno.
ARVEJA
No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES 1. ECUA I1 Ingapirca Aislamientos del banco base del Dr. Venancio Arana
(Universidad Central del EcuadorFacultad de Ciencias Agrícolas).
2. ECUAZ2 Zhoray 3. ECUA P3 Pindiling 4. ECUAM53 Vaqueria 5. ECUAM35 Pindiling 6. ECUAZ1 Zhoray 7. *CL 05 U. Central Utilizada como control. 8. *CL 14 U. Central Control 9. *CL 09 U. Central Control 10. *CA 34L U. Central Control
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MANI
No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES 1. ECUML45 Loja 2. ECUML81 Loja 3. ECUMP86 Portoviejo 4. ECUML102 Loja
SOYA
No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES 1. CIAT 51 Colombia 2. 6001 U. de Minnesota 3. ECUS001 Quevedo 4. ECUS1SJ Quevedo
FREJOL
No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES
1. UMR 1478 U. de Minnesota 2. UMR 1481 U. de Minnesota 3. UMR 1899 U. de Minnesota
ALFALFA
No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES 1. 6008 U. de Minnesota Las pruebas se realizaron en la provincia de
Chimborazo con la colaboración del Cuerpo de Paz. 2. TAL 380 Niftal
Actividad 2 d. Estudio de la competitividad de cepas asociadas al cultivo de fréjol.
Análisis antigénico de las cepas de Rhizobium etli (UMR 1478 y 1481) y de la cepa de Rhizobium
tropici (1899) mediante inmunodifusión.
Determinación del título de aglutinación.
La determinación del título de aglutinación se muestra en el cuadro 8.8. Se observa que todos los
sueros de las cepas muestran valores elevados en cuanto al título de aglutinación. Estos resultados
indican que los sueros obtenidos pueden ser utilizados para realizar las reacciones de
inmunodifusión.
45
Cuadro 8.8. Titulación
CEPA DILUCION
1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 25600
UMR1899(a) +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + + + +
UMR1899(b) +++ +++ +++ +++ +++ ++ + + + + +
UMR1481(a) +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ + + +
UMR1481(b) +++ +++ +++ +++ ++ ++ + + + +
UMR1478(a) +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + + + +
UMR1478(b) +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ + +
Prueba de reacción cruzada.
Esta prueba fue utilizada para verificar la existencia de reacción cruzada entre cepas. Se utilizó la
misma técnica utilizada en la titulación. Los sueros pertenecientes a cada una de las cepas fueron
probados contra antígenos de las otras cepas. Se observó que la cepa de Rhizobium tropici (UMR
1899) reaccionó con todos los sueros utilizados, mientras que las cepas de Rhizobium etli (UMR
1478 y 1481) reaccionaron únicamente con sus correspondientes sueros.
Cuadro 8.9. Número Más Probable (NMP) de Rhizobium en el suelo.
Suelo de Pifo
Dilución R1 R2 R3 R4
10 2 + + + + 4
10 3 + + + 3
10 4 + 1
10 5 + 1
10 6 + 1
10 7 0
10 8 0
Testigo 0
Total 10
Según la tabla de número más probable (NMP), y considerando 6 diluciones (S=6), los números de
rizobios/ml de la dilución 10 2 son de 5.8 x 10 1 . De acuerdo con la fórmula: NMP= m x d / v x n
46
Donde: m= número más probable (por ml) en la primera dilución
d= dilución de la primera dilución considerada
v= volumen inoculado (1ml);
n= volumen o peso del suelo
Por lo tanto, para el suelo de esta parcela en Pifo, el promedio y desviación estándar son iguales a
5.8 x 10 2 células de Rhizobium por gramo de suelo. El bajo contenido de células de Rhizobium en la parcela utilizada indica que el suelo es apropiado para realizar estudios de competitividad.
Evaluación de las relaciones de competitividad entre cepas.
Esta etapa de la investigación se encuentra en proceso de evaluación. Los nódulos colectados de
cada tratamiento fueron sembrados y purificados en levadura manitol agar (LMA) y posteriormente
serán sometidos al análisis de inmunodifusión. Este proceso utiliza las cepas UMR 1478
(Rhizobium etli), UMR 1481 (R. etli), y la UMR 1899 (R. tropici).
Actividad 3 a. Recolección de los soportes
Siete soportes recolectados y procesados se encuentran almacenados en la bodega del Departamento
de Protección Vegetal, Estación Santa Catalina del INIAP.
Actividad 3 b. Análisis físico y químico de los soportes.
La mayoría de soportes utilizados contuvieron un alto porcentaje de materia orgánica, con
excepción de la zeolita que es netamente mineral. El pH de cada material varió de ligeramente ácido
a alcalino, lo que determinó la cantidad y el neutralizante a utilizar (Cuadro 8.10).
47
Cuadro 8.10. Análisis de los materiales utilizados en la preparación de soportes para inoculantes.
Cutuglagua Pichincha 2003.
Análisis C. Rosa Ceniza Zeolita T. Chimb T. LLoa Compost T. Alaska
pH 4.2 Ac 8.8Al 5.1Ac 5.5LAc 6.3LAc 7.7 LAl 6.5LAc
NH4(ppm) 69.00 A 44.00M 72.00A 166.00A 172.00A 90.00A 42.00M
P (ppm) 63.00 A 183.00A 10.00M 36.00A 14.00M 160.00A 5.00B
K(meq/100ml) 0.14B 0.88A 0.20M 0.41ª 0.62A 3.60A 0.77A
M.O. % 16.80 A 19.80A 0.60 11.20ª 9.40A 9.90A 44.10A
Bases(meq/100ml) 22.89 24.50 15.11 18.94 18.22 27.90 14.47
C/N ** 29.93 3.53 19.75 11.84 11.30 **
Interpretación
pH Elementos
Ac = Ácido N= Neutro
Lac = Liger. Ácido LAl = Lige. Alcalino
PN = Prácticamente neutro Al = Alcalino
B = Bajo
M = Medio
A = Alto ** No se realizó el análisis.
Análisis biológico de las turbas.
El análisis biológico de las turbas no mostró diferencias significativas con relación a poblaciones
microbianas. Como promedio las turbas presentaron poblaciones de 1 x 10 4 bacterias /g, 1 x 10 5
actinomicetes/g, y 2 x10 3 hongos/g de turba. Es necesario indicar la presencia de mayor número de
actinomicetes y la presencia de hongos benéficos como es el caso de Trichoderma. Esto permite sugerir el uso de las turbas como inoculante microbiano en la preparación de compost. Dentro del
grupo de los actinomicetes, bacterias y hongos del suelo se encuentran especies solobilizadores de
fósforo y también especies antagónicas a patógenos del suelo, que podrían mejorar la calidad y
eficiencia de un compost.
Actividad 3 c. Interacción rizobioportador.
Número de r izobios en cada soporte.
Los inoculantes preparados con la turba proveniente de la Provincia del Chimborazo dieron un
promedio de 7.50x10 8 ufc/g de inoculante a los 120 días (cuadro 8.11). La turba de Alaska 3.41x10 8
ufc/g de inoculante. El soporte a base de ceniza 1.77x10 8 ufc/g de inoculante fueron los que
48
presentaron mayor supervivencia después de 120 días de almacenamiento a 4ºC. El compost
presentó una concentración de 1.10x10 8 ufc/g. Los sustratos que no cumplieron con la
concentración estándar exigida (1x10 8 ) fueron: la capa rosa, zeolita, la turba de Lloa, y el soporte a
base de vaina de fréjol con materia orgánica.
Evaluación de mater iales alternativos como soporte de la bacter ia, hasta los 120 días.
Cuadro 8.11. Datos reales para unidades formadoras de colonias por gramo de inoculante en la
evaluación de sustratos como alternativas para portadores.
SUSTRATOS (S) 8 días
ufc/g ino
15 días
ufc/g ino
30 días
Ufc/g ino
60 días
Ufc/g ino
90 días
ufc/g ino
120 días
ufc/g ino
1. Capa rosa
2. Ceniza
3. Zeolita
4. T Chimborazo
5. T. Lloa
6. Compost
7. Turba alaska
8. Vaina de fréjol
1.43x10 8 bc
6.06x10 8 ab
3.41x10 8 ab
1.63x10 9 a
4.01x10 6 d
4.79x10 8 ab
1.41x10 8 bc
6.35x10 7 c
1.05x10 8 abc
2.60x10 8 abc
2.02x10 8 abc
1.16x10 9 a
3.39x10 7 c
1.14x10 9 a
4.44x10 8 ab
3.98x10 7 bc
1.97x10 8 bc
6.92x10 8 ab
1.03x10 8 c
1.94x10 9 a
6.84x10 7 c
5.58x10 8 ab
2.44x10 8 bc
3.72x10 6 d
1.21x10 8 abc
3.63x10 8 ab
7.03x10 7 bc
1.09x10 9 a
2.57x10 7 c
2.38x10 8 abc
8.28x10 8 ab
1.33x10 6 d
1.20x10 8 bc
2.70x10 8 ab
8.97x10 7 bc
1.10x10 9 a
2.34x10 7 c
2.24x10 8 ab
6.34x10 8 ab
0.00 d
5.43x10 7 cd
1.77x10 8 abc
4.01x10 7 cd
7.50x10 8 a
1.06x10 7 d
1.00x10 8 bc
3.41x10 8 ab
0.00 e
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 50 100 150
Días
Log (x+1) u
fc/g ino
s1 Capa rosa s2 Ceniza s3 Zeolita s4 T. Chimborazo s5 T. Lloa Compost s7 Turba alaska s8 Vaina de fréjol
Figura 8.7. Log ufc/ g de inoculante para 8, 15, 30, 60, 90, 120 en el experimento evaluación de
sustratos como alternativa de portadores.
49
Actividad 4 a. Evaluación de la esterilización de los portadores.
Este estudio no se realizó dentro del plazo establecido del proyecto, por falta de tiempo, pero podría
llevarse a cabo en un período de ampliación del proyecto. Para esto se ha buscado la colaboración
de la Comisión Ecuatoriana de Energía Atómica, quines disponen de una fuente radioactiva la
misma que servirá como herramienta en la metodología de esterilización de los portadores. El otro
método constituye la esterilización al vapor utilizando un autoclave del laboratorio del
Departamento de Protección Vegetal.
Se compararán los dos métodos de esterilización conociéndose cual de ellos es el mejor en el
mantenimiento de la viabilidad de la bacteria Rhizobium, el mismo que será utilizado para la preparación de los inoculantes en la leguminosas en estudio.
Actividad 5.1 Difusión de los resultados y el uso de los productos generados por el proyecto.
En el caso de arveja y alfalfa, las actividades han sido constantemente transmitidas a los
agricultores de la comunidad, a través de la radio “AS la radio” en ChaupilomaTabacundo
(Pichincha), y a través de la radio Ingapirca en la comunidad de Virgen de la Nube (Cañar). Estas
actividades están siendo conducidas con la colaboración directa de la Fundación GAIA, la cual
participa también como colaboradora del Proyecto Comminandes (anexo 2).
Las actividades de difusión incluyen a) información general del proyecto, b) información acerca de
la importancia de los inoculantes de Rhizobium y del compost como biofertilizantes y mejoradores del suelo, y c) entrevistas con expertos en agricultura.
Se ha iniciado un programa de radio denominado “Pakarina de Los Andes” perteneciente a la
emisora “AS la Radio” de Tabacundo, el mismo que es producido y dirigido por gente de la
localidad. El programa enfatiza en temas relacionados con la importancia de las leguminosas, los
inoculantes, y el uso del compost, manejo del suelo, y agricultura orgánica. Complementariamente
se incluyen aspectos relacionados con la revalorización de las prácticas de agricultura ancestral
como el uso de leguminosas, la elaboración del compost y aplicaciones. Como evidencia de estos
eventos radiales, se guardan las grabaciones de los temas presentados semanalmente, especialmente
en la radio “AS la radio” de Tabacundo. Además las actividades de ambos proyectos han sido
50
cubiertas por los diarios “Heraldo” y “El Tiempo” en Cañar, y “El Chasqui” de Chaupiloma
(Tabacundo).
Actividad 6.1. Institucionalización de un sistema de control de calidad del inoculante.
El Departamento de Protección Vegetal de la Estación Santa Catalina (INIAP), cuenta con una
sección de Microbiología de Suelos, para la producción de inoculantes de fréjol, arveja, alfalfa,
soya, y maní. Se tiene un sistema de control de calidad basado en la elaboración de antisueros
(fréjol), crecimiento de la bacteria en apropiados medios de cultivo, viabilidad del producto
(número de células/gramo de inoculante), y empaquetamiento del producto debidamente
identificado con fecha de expiración, recomendaciones, tipo de Rhizobium, y su correspondiente leguminosa.
9. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
Con relación a la caracterización de las cepas, esta se realizó solo con los aislamientos asociados al
fréjol y al maní tal como se explica en los métodos. Los resultados obtenidos en fréjol muestran
que los aislamientos de bacterias aisladas en el Ecuador, presentan una gran diversidad genética. La
investigación ha mostrado que (i) las cepas de R. etli del Ecuador asociadas al cultivo de fréjol, muestran separación fenotípica y genotípica del Rhizobium asociado con el fréjol de Mesoamérica,
con algunas subdivisiones.
En el caso de los aislamientos asociados al cultivo de maní, se observó a través de la
caracterización fenotípica tres grupos de aislamientos, algunos de los cuales presentan
características fenotípicas similares a cepas del género Rhizobium. Los resultados de las pruebas genéticas muestran gran heterogeneidad en base a los estudios de ERICPCR, REPPCR, y RFLP
de la región intergénica 16S23S rRNA. Se recomienda realizar estudios moleculares
complementarios (ej. Gene 16S rRNA, hibridación del ADN), para poder confirmar la posición
taxonómica de estos aislamientos asociados al cultivo de maní. Al respecto Taurian et. al (2002),
indican que el cultivo de maní es asociado con cepas pertenecientes tanto al género Rhizobium como al género Bradyrhizobium. Los resultados obtenidos con los aislamientos asociados al fréjol, muestran que el uso de cultivares
locales o introducidos en el caso del fréjol, puede influenciar la diversidad genética de las cepas
aisladas, esto también podría darse en el caso del maní.
51
La coevo lución del hospedero y su microsimbionte podría ser un factor de las diferencias reportado
en este estudio entre el Rhizobium del Ecuador y de Mesoamérica. La separación de P. vulgaris en estos dos centros de origen data a 5000 años (Kaplan 1965), con una incompatibilidad genética
ahora evidente entre representativos de ambos acervos genéticos (Singh y Gutiérrez, 1984 y Gepts
and Bliss, 1985). Por lo tanto, es muy probable que un aislamiento a largo plazo de hospederos
específicos y su Rhizobium en cada centro de origen debiera conducir a cierto nivel de especificidad
en sus asociaciones. Esto podría darse también en el caso de maní, por lo que se sugiere mayor
estudio en la asociación del maní con su microsimbionte. Bernal (1993) reportó ya diferencias en la
velocidad de la nodulación de cultivares, por parte del Rhizobium perteneciente a los dos diferentes acervos genéticos en el caso de fréjol. El mismo autor en 1993 evaluó la velocidad de nodulación de
cepas de Ecuador en variedades representativas, encontrando que los cultivares Mesoamericanos
Durango y Puebla 152 eran significativamente más lentos para nodular con las cepas Ecuatorianas.
Entre los factores que pueden contribuir a la heterogeneidad y a las diferencias en la respuesta
simbiótica entre las cepas de fréjol del Ecuador, está la dependencia local sobre los “landraces”,
incluyendo cultivares volubles en lugar de variedades mejoradas, la práctica en el sur del Ecuador
de sembrar y mantener mezclas varietales, y la topografía irregular y aislamiento de los valles
Interandinos donde el fréjol es un cultivo de subsistencia. Estudios adicionales se requieren tanto en
la bacteria asociada a fréjol como a la de maní, para definir de mejor manera la extensión e
importancia de la especificidad y la coevolución en esta simbiosis.
Las diferencias en el Rhizobium asociado a cultivares representativos de los diferentes centros de origen de un cultivo, podría tener implicaciones en el campo. Tanto Chaverra y Graham (1992), y
Bernal (1993) reportaron especificidad entre cultivares de fréjol y su microsimbionte, lo cual podría
también existir en maní. Esto permite afirmar de la necesidad de elaborar inoculantes de Rhizobium
con cepas nativas de la región donde la leguminosa requiere de inoculación.
Con relación a las cepas seleccionadas (ver productos), el proyecto contribuye a la producción de
las leguminosas, con la presencia de cepas de buena respuesta a la inoculación en fréjol, arveja,
alfalfa, soya y maní, en base a los parámetros analizados como peso seco de la parte aérea, peso
seco de nódulos, porcentaje de nitrógeno, y rendimiento. Así por ejemplo en fréjol, las cepas de Rhizobium etli, especialmente la cepa UMR 1478 se destacó en el rendimiento de grano fresco, peso
seco y peso seco de nódulos. En este caso de fréjol, los resultados obtenidos se corroboran con los
estudios realizados por (Bernal y Graham, 2001, Graham P.H. 1999) quienes usaron la prueba de la
velocidad de nodulación, la misma que mostró que las cepas ecuatorianas UMR 1478, 1481, 1468
52
son eficientes en nodular al hospedero, y a nivel de invernadero mostraron ser buenos fijadores de
nitrógeno.
Con respecto a las variables analizadas, la que tuvo mayor influencia en la determinación de la
eficiencia de fijación de nitrógeno fue el peso seco. Al respecto Castellanos y PeñaCabrales (1989)
afirman, que el peso seco explica de buena manera la eficiencia de fijación biológica, en donde, la
producción de materia seca es de primordial importancia y la producción de semilla es secundaria.
Sin embargo, en fréjol por ejemplo, en donde el producto utilizado es el grano o la vaina verde, el
efecto de la nodulación debe ser observado preferiblemente llevando a las plantas hasta la
fructificación completa, siendo el rendimiento, la variable más razonable para predecir el
comportamiento simbiótico. La ventaja de haber usado la variable rendimiento es, que esta es una
variable de rutina en todos los ensayos de las leguminosas. Con relación al porcentaje de nitrógeno,
la extracción de nitrógeno puede ser secundaria en la determinación de la eficiencia de fijación de
nitrógeno.
Al momento el Departamento de Protección Vegetal dispone de cepas altamente fijadoras de
nitrógeno, probadas a nivel de campo, y de un sistema de control de calidad del inoculante. Para
esto se han seguido las metodologías sugeridas por Controux (1991). Para el proceso de
inoculacion, al momento se cuenta con medios de divulgación como trípticos, los cuales explican el
proceso de inoculación y siembra de leguminosas que debe seguir el agricultor (Bernal et al. 2002).
En el estudio de sustratos, se comprobó que la turba proveniente de la Provincia del Chimborazo
mantiene una sobrevivencia adecuada de la bacteria, como por ejemplo las cepas de fréjol
pertenecientes a la especie Rhizobium etli: UMR 1478 la misma que tuvo una sobrevivencia por 120
días. Si bien el valor de pH de algunos portadores utilizados en el proyecto no es el más indicado
para la supervivencia del Rhizobium, el agregado de CaCO3 (515%) permitió obtener un pH
adecuado (6.57.0 ) para la viabilidad de las bacterias. De los tres materiales mencionados, la turba
de la Provincia de Chimborazo (Fig. 7.7) presentó las mejores características para mantener viable a
la bacteria UMR 1478. Esto se corrobora con los trabajos realizados por Cevallos y Rodríguez
(2003), quienes experimentaron con bacterias gram – y gram + excepto Rhizobium, determinando que para las primeras el material de la Provincia de Chimborazo presentó las mejores condiciones.
Estos resultados permiten señalar a la turba de Chimborazo como potencial portador en la
producción de inoculantes.
53
El sustrato a base de ceniza aparece también como un sustrato con mayor concentración de
unidades formadoras por gramo de inoculante. Respecto al uso de ceniza como portador Sparrow
y Ham (1981), en sus trabajos con Rhizobium phaseoli, determinaron que éste material, fue exitosamente usado como soporte.
La zeolita (mineral aluminosilicato hidratado), pese a su naturaleza, ofreció una buena sobrevivencia
en los tres primeros registros debido a su capacidad de retención de agua, y a la disponibilidad de
ciertos nutrientes. Al respecto, los estudios realizados por GrahamWeiss et al. (1987) con
vermiculita (silicatos de hierro aluminio y magnesio hidratados), determinaron, que sustratos con
estas características deben ser suplementados con materia orgánica para mantener sus cualidades
por un período más largo.
El sustrato preparado especialmente con restos de vainas de fréjol no fue funcional, se debió en gran
medida a los tiempos de esterilización, puesto que, los ensayos realizados con respecto a este
parámetro, han utilizado primordialmente turbas. Los tiempos obtenidos en estos experimentos han
sido aproximados a otros materiales alternativos, no siendo siempre los más adecuados.
10. SITUACION INICIAL Y ACTUAL DEL GRUPO META.
El conocimiento del grupo meta sobre el uso de los inoculantes de Rhizobium en leguminosa era
limitado. Podría mencionarse que pocos agricultores de la Sierra y Costa conocían la presencia y
uso de los inoculantes. No existía información de las prácticas de inoculación. El grupo meta tiene
actualmente conocimiento de la presencia de inoculantes elaborados a base de Rhizobium. Algunos agricultores de la Sierra dedicados a producir fréjol, alfalfa, arveja en la Provincia del Cañar y
Chimborazo, y los agricultores que cultivan soya en la Provincia de Los Ríos y maní en las
Provincias de Loja y Manabí, conocen los principales pasos a seguir para la inoculación de las
cepas de Rhizobium en la semilla. Conocen de ciertas cepas competitivas y fijadoras de nitrógeno que fácilmente pueden ser conseguidas en el INIAP y usadas en los respectivos cultivos y
difundidas a otros agricultores de cada región.
11. ESTIMACION DE EFECTOS E IMPACTOS.
Efectos tecnológicos
Sin duda la tecnología generada por el proyecto viene a constituir un componente importante dentro
54
del nuevo enfoque de la agricultura limpia u orgánica. Esta alternativa de fertilización biológica es
clave dentro de los sistemas de manejo de suelos para su recuperación y aumento de la fertilidad.
Esta tecnología conjuntamente con el uso del compost combinado con otros microorganismos del
suelo (micorrizas, y bacterias promotoras de crecimiento vegetal) vendrían a complementarse
dentro de las prácticas de fertilización de las leguminosas, las mismas que son muy importantes
como cultivos de rotación en los diferentes sistemas agrícolas.
Además la tecnología generada contribuye considerablemente con la protección del medio ambiente
al reducir el uso de los agroquímicos, y por lo tanto contribuye con el equilibrio del ecosistema.
Efectos Económicos
En la mayoría de suelos en los que realiza agricultura en el Ecuador se puede apreciar una creciente
disminución de su fertilidad. Esta situación pone de manifiesto un deterioro permanente del suelo,
con consecuencias nefastas si no se incorporan inmediatamente alternativas que controlen este
problema. Esto se agravaría con la reducción de los ingresos de los productores, y escasas
superficies apropiadas para la agricultura originando un problema económico. Esto trae como
consecuencia un aumento progresivo en el uso de fertilizantes, lo cual incrementa los costos por
unidad producida. La utilización de inoculantes en las leguminosas dentro de los sistemas de
producción agrícola, logra una mayor disponibilidad de nutrientes que permiten un rendimiento
sostenibles de los cultivos, y una mayor tasa de retorno, ya que disminuye el costo de ciertos rubros
principalmente fertilizantes, mano de obra y transporte.
La utilización de inoculantes es una alternativa de bajo costo y de fácil manejo que permite dar
respuesta a uno de los graves problemas de la agricultura ecuatoriana, como es el déficit nutricional
de nitrógeno en los suelos. Si se compara el precio (US $ 60) de cuatro sacos de fertilizante químico
18460 más dos sacos de urea (US $ 22) usados en fréjol, versus el precio de US $ 5 de un paquete
de 200 g del inoculante generado por el proyecto ( dosis: 5g/0.5 kg de semilla) más el costo de
fertilizante químico (20 kg N/ha, dosis baja recomendada a la siembra), la reducción del fertilizante
nitrogenado sería significativa, y más rentable si la incorporación del inoculante se la realiza en
semilla de calidad (Mendoza, 2003).
Otro ejemplo del beneficio económico de la fijación biológica de nitrógeno, es el caso de la alfalfa
55
en la región del medio oeste de los Estados Unidos, donde también predominan las fincas
familiares. El uso de la alfalfa en rotación con el maíz reduce sustancialmente el empleo de
fertilizantes químicos, sin causar bajas en la producción. El beneficio neto estimado oscilaba entre
US $ 5090 millones en toda la región (Peterson y Russelle, 1991).
Efectos Ambientales.
La fijación biológica de nitrógeno (FBN) contribuye globalmente con cerca de la mitad del
nitrógeno utilizado en el cultivo de las plantas. La otra mitad procede casi en su totalidad del
amonio sintetizado vía Haber Bosch con un gasto, para conseguir el H2 y la alta temperatura y
presión requeridas, del 1 % de la energía consumida en el ámbito mundial. Hoy día la FBN cobra
más valor, ya que puede evitar el uso abusivo de fertilizantes nitrogenados con el consiguiente
ahorro en el consumo de energía y la disminución de la degradación del medio ambiente.
Los resultados y productos generados por el proyecto van dirigidos a la sostenibilidad de la
producción agrícola, ya que con el racional y adecuado manejo del nitrógeno, se contribuye al uso
de una agricultura de bajos insumos, caracterizada por la reducción de la dependencia de los
fertilizantes químicos, los cuales a más de ser costosos representan un peligro ambiental como
fuentes de contaminación y degradación principalmente de los recursos suelo y agua.
12. PRODUCTOS DEL PROYECTO.
11.1 Cepas (inoculantes) de la bacter ia Rhizobium para leguminosas.
Tres cepas para fréjol: UMR 1478, UMR 1481, y UMR1468.
Dos cepas para maní: ECUML 102, ECUMP86
Tres cepas para arveja: ECUaI1, ECUAZ2, ECUAP3.
Dos cepas para alfalfa: UMR 6008, TAL 380
Cuatro cepas para soya: CIAT 51, UMR 6001, ECUS001, ECUS1SJ
11.2 Trípticos:
1. Inoculación de la semilla de leguminosas con la bacteria Rhizobium.
56
2. Inoculación con Rhizobium de la semilla del cultivo de soya. 3. Estudio en campo de la fijación simbiótica de nitrógeno en dos variedades de fréjol, con
tres cepas de Rhizobium etli. 4. Identificación de cepas eficientes en fijación biológica de nitrógeno para producción de
inoculante en maní.
5. Evaluación de sustratos como alternativa de portadores de Rhizobium.
11.3 Publicaciones:
1. Diversidad del Rhizobium asociado con Phaseolus vulgaris L. en Ecuador y evaluación de la capacidad fijadora de nitrógeno de tres cepas en dos variedades. Revista Rumipamba.
Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Central del Ecuador.
2. Selección de biotipos prominentes de Bradyrhizobium sp. en el cultivo de maní (Arachis hipogeae) en las provincias de Manabí y Loja. Revista Rumipamba. Facultad de Ciencias
Agrícolas. Universidad Central del Ecuador.
11.4 Días de campo
1. En Chuquipata, Provincia del Cañar (arveja). Participaron . Se realizó el 19 de
Noviembre del 2002.
2. En la Provincia de Loja (maní). Participaron agricultores de la Granja el Almendral y
técnicos. Se realizó el 20 de Marzo del 2003.
3. En Chambo, Chimborazo (alfalfa). Participaron agricultores de la zona de Chambo y
técnicos del Cuerpo de Paz. Se realizó el 17 de Noviembre del 2002.
4. En Tumbaco, Pichincha (fréjol). Participaron estudiantes y docentes de la Facultad de
Ingeniería Agronómica de la Universidad Central. Se realizó el 11 de Junio del 2002.
5. En Pifo, Pichincha (fréjol). Participaron agricultores de la zona de Pifo y estudiantes de la
Facultad de Ingeniería Agronómica de la Universidad Central. Se realizó el 13 de
Diciembre del 2003.
6. En la Granja Chaltura, Imbabura (fréjol). Participaron estudiantes de la Facultad de
Agronomía de la Universidad Técnica del Norte. Se realizó en Febrero del 2002.
57
11.5 Laborator io de Microbiología de Suelos en el Depar tamento de Protección Vegetal.
Estación Santa Catalina, INIAP.
13. LOGROS ADICIONALES.
Colaboración con los proyectos: a) “Fijación biológica de nitrógeno en leguminosas forrajeras de la
Costa” de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo, concretamente con el Ing. Gorky Díaz. b)
Proyecto COMMINANDES. Así por ejemplo el uso de los inoculantes de Rhizobium (proyecto PROMSA) conjuntamente con el uso del compost generado por el proyecto COMMINANDES ha
permitido que los agricultores de la comunidad Virgen de la Nube en el Cañar, y la comunidad de
Chaupiloma de la Provincia de Pichincha, hagan uso de ambas tecnologías logrando resultados
satisfactorios. También comunidades de la Provincia de Chimborazo conjuntamente con miembros
del Cuerpo de Paz llevan a cabo experimentos usando estas tecnologías (anexo 3).
Los resultados y productos del proyecto permiten usarlos como parte de un paquete tecnológico
orientados hacia una agricultura ecológica, limpia u orgánica. Los resultados conjuntamente con los
del Proyecto COMMINANDES han sido difundidos tanto en la comunidad científica Ecuatoriana e
Internacional, concretamente en los siguientes eventos: 1) Taller: Formulación del Plan Nacional de
Innovación en Agricultura Orgánica” realizado en la Estación Experimental Tropical Pichilingue
del INIAP (Octubre 2003), 2) Taller: Marco conceptual y Normativa de la Agricultura Orgánica,
realizado en la Estación Experimental Pichilingue del INIAP (Octubre 2003), 3) Primer Encuentro
58
Mesoamericano y del Caribe y Tercer Encuentro Nacional de Investigadores, Experimentadores y
Técnicos en Agricultura Orgánica, realizado en la Escuela Centroamericana de Ganadería, Atenas,
Costa Rica (Agosto 2003).
La interacción directa con Centros de Investigación Internacional, así como por ejemplo con la
Universidad de Minnesota (Estados Unidos) y con la Universidad de la Plata (Argentina). En este
ultimo caso, gracias a la colaboración del Dr. Mario Aguilar del Laboratorio de Biotecnología de la
U. de la Plata, este laboratorio permitió la capacitación del Egresado Mauricio Jerez en técnicas
moleculares y concretamente con la caracterización genética de cepas de Bradyrhizobium asociadas al cultivo de maní.
La capacitación de los Ings. Diego Campaña y Aracely Jaramillo (colaboradora del proyecto
Comminandes), y del Egdo. Mauricio Jerez en los cursos: 1) Curso teórico práctico de
Microbiología Ambiental, organizado por la Universidad Católica del Ecuador (PUCE), durante los
meses de Agosto y Septiembre del 2003. 2) Curso teórico práctico de Microbiología Agrícola,
organizado por la PUCE (Septiembre 2003).
La visita de la Dra. Marcela Franco de la Universidad Javeriana de Colombia, y del Dr. Rene Novo
de la Universidad de Cuba, permitió el inicio y continuación de una estrecha interacción
principalmente relacionada con el intercambio de información científica.
Los resultados del proyecto también han sido fundamentales como antecedentes de propuestas de
proyectos aprobados. Así por ejemplo, el perfil del proyecto PFNR03008 “Establecimiento y
mantenimiento de un cepario de micorrizas nativas de soya y cacao que incrementen sus
rendimientos y contribuyan con la conservación de los recursos suelo y agua” ha sido seleccionado
por el Comité de Proyectos de Investigación del FUNDACYT, para la presentación de la propuesta
en extenso (anexo 4).
14. LIMITACIONES EN EL DESARROLLO DEL PROYECTO.
1. Retraso del inicio del proyecto. El investigador principal (IP) estuvo fuera del país en la
fecha en que debía iniciarse el proyecto (Enero 2001), ya que estuvo terminando sus
estudios de Doctorado (Ph.D.) en la Universidad de Minnesota. El proyecto sé inicio siete
meses después (Agosto 2001).
59
2. El proyecto tuvo que suspender temporalmente la ejecución de diferentes actividades
planificadas debido al problema de la “devolución del IVA”. Experimentos de laboratorio,
invernadero y campo fueron suspendidos por casi tres meses, así como la conservación del
valioso germoplasma de la bacteria Rhizobium y de otros microorganismos colectados durante algunos años por el Instituto, debido precisamente a la falta de reactivos y material
de laboratorio necesarios para su conservación.
Se realizaron todas las consultas pertinentes en la Estación Santa Catalina para solucionar el
“problema de la devolución del IVA” de parte del SRI, pero lamentable fue difícil encontrar
alternativas viables y rápidas, que permitan la continuidad inmediata del proyecto. En este
punto es necesario enfatizar que el manejo administrativofinanciero fue responsabilidad
exclusiva de las áreas Financiera y de Contabilidad de la EESC. El proyecto contribuyó con
los demás proyectos PROMSA de la Estación Santa Catalina, para contratar dos
profesionales contadoras específicamente para las actividades de manejo de los fondos de
cada proyecto. Por tal razón, los investigadores de ninguna manera fueron responsables de
solucionar un problema estrictamente administrativo. Con estos antecedentes, el
investigador principal del proyecto se permitió solicitar por escrito al Director General del
INIAP se digne convocar a varias reuniones con carácter urgente y con la presencia de las
autoridades de la Estación Santa Catalina, Director Financiero, Director de Planificación, y
técnicos involucrados, con el fin de encontrar una solución definitiva y en conjunto al
problema en mención.
3. La salida del Ing. Alfonso Suárez del proyecto, quien desempeñaba las funciones de
investigador principalmente en las actividades de campo.
4. El exceso de trámites burocráticos del Instituto y la lentitud en el flujo de recursos
económicos definitivamente fueron también grandes obstáculos para la ejecución rápida y a
tiempo de las actividades.
15. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.
El proyecto ha permitido la formación de un banco germoplásmico de la bacteria Rhizobium, con cepas para los cultivos de fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní. Las cepas se encuentran almacenadas
60
bajo el proceso de liofilización, el mismo que permite una viabilidad de por lo menos cinco años.
Con relación al estudio de la compatibilidad genética entre la bacteria y el cultivo de fréjol, el
proyecto concluye que la diversidad genética de la bacteria es mayor cuando se usan cultivares
locales. Esto indica que existe cierta especificidad y por lo tanto se recomienda usar inoculantes con
cepas aisladas de suelos pertenecientes a regiones donde la leguminosa es nativa. Este
comportamiento podría darse en la asociación maníBradyrhizobium, pero se requiere de estudios
complementarios.
El proyecto ha seleccionado cepas eficientes en fijación biológica de nitrógeno, para los cultivos de
fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní. En fréjol las cepas UMR 1478 y UMR 1481, en maní: ECUML
102, ECUMP86, en arveja ECUA –I1, ECUAZ2, en alfalfa UMR 6008, TAL 380, y en soya
(invernadero): CIAT 151, UMR 6001, ECUS001, ECUS1SJ.
Todas las cepas en mención fueron estadísticamente similares al tratamiento nitrogenado, y
superiores (estadísticamente diferentes) al testigo sin inocular, tanto en los parámetros de
rendimiento y porcentaje de nitrógeno. En fréjol, la cepa UMR 1478 tuvo una respuesta en
rendimiento de 8554.53 kg/ha en peso fresco, siendo estadísticamente igual al rendimiento del
tratamiento nitrogenado, el cual fue superior con un promedio de 10121.88 kg/ha. En maní, las
cepas ECUMP86 y ECUML102 fueron las que mostraron valores superiores tanto en rendimiento
(kg/ha), como en porcentaje de nitrógeno. Así, las cepas ECUMP86 y ECUML102 rindieron
1248.27 kg/ha y 1234.36 kg/ha respectivamente versus 1247.92 kg/ha del tratamiento con nitrógeno
y 1038.43 kg/ha del tratamiento testigo. En nitrógeno, las cepas mostraron valores de 3.91 % y
4.00% respectivamente, versus 4.00% y 3.91% de los testigos. En cuanto a variedades, el
rendimiento de la variedad INIAP380 fue superior al de la variedad Caramelo.
El estudio de competitividad de cepas asociadas al fréjol, permitió conseguir la elaboración de
antisueros de calidad y en suficiente cantidad para las cepas en estudio. Esto permite tener un stock
de antisueros para futuros estudios serológicos de Rhizobium.
El INIAP dispone de un stock de materiales que después de un análisis físico, químico y biológico,
muestran ser de calidad, para ser utilizada como buen portador de la bacteria Rhizobium. Se identificó en base a los sustratos disponibles localmente, el mejor sustrato (Turba de Chimborazo)
como buen portador de la bacteria Rhizobium.
61
La difusión de los resultados ha permitido que el número de agricultores que usan inoculantes,
incremente, comprobado mediante un diagnóstico en las Provincias del Cañar (comunidad Virgen
de la Nube) y de Pichincha (ChaupilomaTabacundo). Esta actividad se ha visto reforzada por los
programas de radio en ambos sitios.
Se ha institucionalizado un sistema de control de calidad de los inoculantes producidos
para los cultivos de fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní.
Recomendaciones
Nuevamente es necesario enfatizar que el proyecto se inicio con siete meses de retraso. El inicio
estuvo programado para Enero del 2001 pero recién en Agosto de ese año, pudo iniciarse las
actividades cuando el investigador principal del proyecto retorno al país después de culminar sus
estudios de doctorado (Ph.D.) en la Universidad de Minnesota. Por lo tanto se recomienda y se
solicita a la vez continuar con algunas actividades inconclusas del proyecto, concretamente: 1) el
método de esterilización de la turba, 2) pruebas de inmunodifusión en el estudio de competitividad
entre cepas de Rhizobium, 3) culminación del estudio de efectividad de cepas bajo condiciones de campo en soya. Estas actividades podrían ser culminadas en un período de extensión del proyecto.
Sobre la base de los resultados de la caracterización de las cepas asociadas al cultivo de maní, se
recomienda complementar con otros estudios tanto de laboratorio como de campo. Se recomienda
una evaluación de campo de las cepas representativas de cada uno de los grupos obtenidos en el
análisis genético del RFLP, para ver su comportamiento como fijadoras de nitrógeno.
Se recomienda realizar experimentos demostrativos en la provincia de Manabí (zonas maniceras),
donde se evalúen las cepas de la colección (cepas nativas y cepas importadas), por existir cierto
grado de especificidad con el cultivo según los resultados obtenidos en Loja.
Si bien es cierto que los estudios de campo se ejecutaron en suelos pobres, se recomienda realizar
investigación sobre la respuesta de la inoculación al fósforo, sus niveles, y formas de aplicación. El
fósforo es un elemento esencial en el proceso de la fijación del nitrógeno, y en los suelos andinos
(Andisoles) el fósforo, es adsorbido por las partículas del suelo, dificultando la absorción por el
cultivo.
62
Mayor difusión de la tecnología en otras regiones donde el proyecto no tuvo mayor presencia,
especialmente en la Costa Ecuatoriana. Se recomienda la implementación de un laboratorio para la
elaboración de inoculantes en la Costa. Los agricultores necesitan proveerse fácil y constantemente
de los inoculantes al momento preciso de la siembra.
Continuar con el sistema de producción de inoculantes, incluyendo el control de calidad del
producto garantizando la eficiencia y uso por parte del agricultor.
16. LECCIONES APRENDIDAS.
En cada experimento el trabajo conjunto con el agricultor permitió que este pueda observar de una
manera directa las fortalezas y limitaciones que puede ofrecer el proceso de la inoculación de las
semillas de leguminosas.
El agricultor ha aprendido el procedimiento de inoculación de la semilla. En cada visita realizada se
puede observar el interés que el agricultor pone en el proceso. Cada vez es mayor el número de
agricultores interesados en el inoculante.
Las conversaciones con técnicos y agricultores, permitieron establecer una mayor difusión de los
conocimientos generados por el proyecto, sobre inoculantes. Estos cada vez son mas conocidos por
el agricultor.
El proyecto ha permitido adquirir una destreza de los investigadores responsables en la solución de
problemas administrativos y financieros relacionados con el manejo del proyecto. A pesar de que no
fue responsabilidad de los técnicos el manejo administrativo del mismo (ver “limitaciones en el
desarrollo del proyecto”), sin embargo los investigadores involucrados pusieron toda la energía
necesaria para motivar al personal de Contabilidad de la Estación Santa Catalina (INIAP), y así
acelerar el flujo de los fondos para responder y cumplir eficientemente con los objetivos del
proyecto.
63
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18. ANEXOS.
Anexo 1. Análisis estadistico de los experimentos de invernadero y campo. Estudio de la capacidad
de fijación biológica de nitrógeno.
Cuadro 1. ADEVA para el variable peso fresco en el ensayo evaluación de cepas de soya. Invernadero. Pichilingüe – Los Ríos 2004.
Fuente de var iación Grados de liber tad Suma de Cuadrados Cuadrados Medios Tratamientos Repeticiones Error
9 3 27
31.15 11.90 59.83
3.462 3.965 2.216
68
Cuadro 2. Promedios y Rangos de significación para la variable peso fresco en la evaluación de cepas de soya Pichilingüe – Los Ríos 2004
Descr ipción Promedios g/planta Rango (Tuquey 5% ) TESTIGO NITROGENADO ECUS1SJ TAL571 CIAT 51 ECUS001 ECUS005 6001 ECUS1053 TESTIGO ABSOLUTO ECUSP1
9.975 8.773 8.573 8.515 8.392 8.345 7.858 7.850 7.710 6.318
A abababababababab b
Cuadro 3. ADEVA para la variable peso seco en el ensayo evaluación de cepas de soya. Invernadero. Pichilingüe – Los Ríos 2004.
Fuente de var iación Grados de liber tad Suma de Cuadrados Cuadrados Medios Tratamientos Repeticiones Error
9 3 27
25.71 11.57 36.98
2.857 ns 3.858 ns 1.370
Cuadro 4. Promedios de peso seco obtenidos en la evaluación de cepas de soya. Invernadero. Pichilingue – Los Ríos 2004.
Descripción Promedios g/planta TESTIGO NITROGENADO TAL 571 ECUS1SJ ECUS001 CIAT 51 6001 ECUS005 ECUS1053 ECUSP1 TESTIGO ABSOLUTO
6.222 4.770 3.878 3.865 3.74 3.733 3.722 3.593 3.557 3.443
69
Cuadro 5. Análisis de varianza para las variables evaluadas en el estudio de variedades de fréjol y cepas de Rhizobium etli bajo condiciones de campo. Tumbaco Pichincha 2003.
FUENTES DE VARIACIÓN
GRADOS DE LIBERTAD
CUADRADOS MEDIOS Peso seco follaje
Peso seco nódulos
Rendimiento. % de N
Total Tratamientos Var iedades (V) Cepas (C) c5 vs
c1,c2,c3,c4 c4 vs c1,c2,c3 c1 vs c2,c3 c2 vs c3
V x C Repeticiones Er ror Exp.
39 9 1 4 1 1 1 14
3 27
16.11** 37.08** 15.63* 28.72* 21.66* 0.55 ns 11.59 ns 11.35 ns 12.54 ns 4.41
0.30* 0.06 ns 0.63** 0.90* 1.44** 0.18 ns 0.02 ns 0.02 ns 0.25 ns 0.13
14780279.86** 32105113.69** 25168044.23** 54523767.76** 33968195.44** 469616.77 ns 11710597.31* 61307.04 ns 3908466.42 ns 2019735.46
0.35* 0.42 ns 0.52* 1.64** 0.35 ns 0.02 ns 0.07 ns 0.16 ns 0.23 ns 0.14
Promedio g/mata CV %
16.09 g/planta 13.05
2.31 g/mata 15.39%
7786.84 kg/ha 18.25%
3.68 %N 10.28%
Cuadro 6. Promedios y Pruebas de significación para los factores variedades y cepas en las variables en estudio en la evaluación de variedades de fréjol y cepas de Rhizobium etli bajo condiciones de campo. Tumbaco Pichincha 2003.
Descripción
Factor variedades
Promedios Peso seco g/planta
Peso seco nódulos g/mata
Rendimiento kg/ha
% de N
v2 INIAP Canario SCC2 v1 INIAP 412 Toa
Factor Cepas
17.05 a 15.13 b
2.34 2.27
6890.95 b 8682.74 a
3.79 3.58
c5 Fertilizado y sin cepa c3 UMR 1478 c1 UMR 1481 c2 UMR 1468 c4 Testigo
17.78 a 17.10 a b 15.93 a b 15.40 a b 14.24 b
2.01 c 2.53 a b 2.38 a b c 2.60 a 2.02 b c
10121.88 a 8554.53 a b 7995.75 b 6843.49 b c 5418.56 c
4.09 a 3.56 a b 3.68 a b 3.69 a b 3.40 b
70
Cuadro 7. Promedios para la interacción variedades por cepas en las variables en estudio en la evaluación de variedades de fréjol y cepas de Rhizobium etli bajo condiciones de campo. Tumbaco Pichincha 2003.
Descripción
Interacción VxC v2c3 v1c5 v2c1 v2c5 v2c2 v2c4 v1c1 v1c3 v1c2 v1c4
Promedios Peso seco g/planta
19.59 18.56 17.04 17.01 16.78 14.85 14.81 14.61 14.02 13.63
Peso seco nódulos g/mata
2.60 1.94 2.43 2.08 2.56 2.06 2.33 2.46 2.64 1.97
Rendimiento kg/ha
7659.94 10874.13 7035.88 9369.63 5870.74 4518.56 8955.63 9449.13 7816.25 6318.56
% de N
3.86 3.96 3.58 4.22 3.80 3.49 3.79 3.26 3.59 3.31
Cuadro 8. Análisis de los materiales utilizados en la preparación de soportes para inoculantes. Cutuglagua Pichincha 2003.
ANÁLISIS C. ROSA CENIZA ZEOLITA M. CHIMB
M. LLOA
COMPOST TUR. ALASK
pH 4.2 Ac 8.8Al 5.1Ac 5.5LAc 6.3LAc 7.7 LAl 6.5Lac NH4(ppm) 69.00 A 44.00M 72.00A 166.00A 172.00
A 90.00A 42.00M
P (ppm) 63.00 A 183.00A 10.00M 36.00A 14.00 M
160.00A 5.00B
K(meq/100 ml)
0.14B 0.88A 0.20M 0.41A 0.62A 3.60A 0.77ª
M.O. % 16.80 A 19.80A 0.60 11.20A 9.40A 9.90A 44.10ª Bases(meq/ 100ml)
22.89 24.50 15.11 18.94 18.22 27.90 14.47
C/N 29.93 3.53 19.75 11.84 11.30 Interpretación pH Elemento
s Ac = Ácido N= Neutro Lac = Liger. Ácido LAl = Lige. Alcalino PN = Prácticamente neutro Al = Alcalino
B = Bajo M = Medio A = Alto
71
Cuadro 9. Análisis de varianza para unidades formadoras de colonia por gramo de inoculante, en el estudio evaluación de sustratos como alternativas para portadores. Cutuglagua Pichincha 2003.
Cuadro 10. Datos reales para unidades formadoras de colonias por gramo de inoculante en la evaluación de sustratos como alternativas para portadores Cutuglagua Pichincha 2003.
SUSTRATOS (S)
8 días ufc/g ino
15 días ufc/g ino
30 días ufc/g ino
60 días ufc/g ino
90 días ufc/g ino
120 días ufc/g ino
S1 Capa rosa s2 Ceniza s3 Zeolita s4 T. chimborazo s5 T. Lloa s6 Compost s7 Turba alaska S8 Vaina de fréjol
1.43x10 8 bc 6.06x10 8 ab 3.41x10 8 ab 1.63x10 9 a 4.01x10 6 d 4.79x10 8 ab 1.41x10 8 bc 6.35x10 7 c
1.05x10 8 abc 2.60x10 8 abc 2.02x10 8 abc 1.16x10 9 a 3.39x10 7 c 1.14x10 9 a 4.44x10 8 ab 3.98x10 7 bc
1.97x10 8 bc 6.92x10 8 ab 1.03x10 8 c 1.94x10 9 a 6.84x10 7 c 5.58x10 8 ab 2.44x10 8 bc 3.72x10 6 d
1.21x10 8 abc 3.63x10 8 ab 7.03x10 7 bc 1.09x10 9 a 2.57x10 7 c 2.38x10 8 abc 8.28x10 8 ab 1.33x10 6 d
1.20x10 8 bc 2.70x10 8 ab 8.97x10 7 bc 1.10x10 9 a 2.34x10 7 c 2.24x10 8 ab 6.34x10 8 ab 0.00 d
5.43x10 7 cd 1.77x10 8 abc 4.01x10 7 cd 7.50x10 8 a 1.06x10 7 d 1.00x10 8 bc 3.41x10 8 ab 0.00 e
Anexo 2. Breve información del proyecto COMMINANDES:
Título del Proyecto: Producción ecológica de papa en áreas periurbanas de los Andes,
combinando compostaje e inoculantes microbianos.
Definición del problema:
En el Ecuador la papa es un cultivo de importancia económica en la Región Interandina, y
últimamente es común en áreas periurbanas. Lamentablemente la producción del cultivo es
baja (58 T/ha) como resultado de varios factores abióticos (propiedades físicas y químicas
del suelo) y bióticos (ej. enfermedades de la raíz). Además, por un lado los costos de
fertilizantes y pesticidas para contrarrestar estos problemas son altos e inaccesibles para el
pequeño y mediano productor, y por otro lado el mal manejo de estos insumos perjudica al
medio ambiente especialmente a los recursos suelo y agua.
FUENTE DE VARIACIÓN
GRADOS DE LIBERTAD CUADRADOS MEDIOS
8 días 15 días 30 días 60 días 90 días 120 días Total Sustratos Error
317 24
2.52** 0.09
1.39** 0.22
2.71** 0.09
3.57** 0.24
35.43** 0.17
33.33** 0.10
Promedio log (x+1) ufc/g inocu. Promedio de ufc/g de inoculante CV%
8.24 1.74x10 8 3.71
8.33 2.14x10 8 5.60
8.25 1.78x10 8 3.63
8.05 1.12x10 8 6.02
7.25 1.78x10 7 5.63
7.00 1.00x10 7 4.52
72
Justificación del problema:
El reciclaje de restos orgánicos originados en agroindustrias de la papa, utilizando el
poder enzimático de los microorganismos del suelo, a un producto útil y seguro (compost)
es postulado como una opción practica dirigida a mejorar la producción de papa y de otros
cultivos de áreas periurbanas (y urbanas). Además del reciclaje de los restos vegetales
(leguminosas, gramíneas, hortalizas, etc) y animales (estiércol), el manejo de los
microorganismos benéficos del suelo (micorrizas, Rhizobium, bacterias promotoras de crecimiento), ha sido propuesto como una importante practica agrícola para reducir los
insumos químicos (fertilizantes y pesticidas), y para mejorar el potencial ecológico y
sustentable de los suelos en sistemas periurbanos y también urbanos. Estos bioprotectores
de plantas y biofertilizantes pueden ser manejados cambiando la calidad, cantidad y
tiempo de aplicación del compost. Estas dos tecnologías (bioprotectores/biofertilizantes y
compost) han mostrado ser eficientes independientemente, pero ninguna o muy poca
información existen sobre el efecto cinegético de ambas tecnologías.
El objetivo de esta investigación es investigar la combinación del compost con inoculantes
(biofertilizantes / bioprotectores) basándose en microorganismos nativos a fin de 1)
Adicionar un valor a los restos orgánicos producidos por las agroindustrias y agricultores
de áreas periurbanas, 2) Reducir el uso de los fertilizantes químicos y de pesticidas, y 3)
Estimular la capacidad colectiva local (asociaciones de agricultores y ONG’s) para
desarrollar sistemas de compostaje a microescala y de manejo de inoculantes a partir de
microorganismos del suelo.
Ámbito y cobertura
Este proyecto está dirigido a los agricultores de sistemas agrícolas donde la papa juega un
rol importante, y localizados en áreas periurbanas de la Región Interandina. Los
productores dispondrán de compost, el mismo que vendrá a constituir en un insumo de
fertilización orgánica mejorando las condiciones del suelo, y de inoculantes basado en
microorganismos del suelo los que vendrán a constituir en promotores de crecimiento
73
vegetal y de biofertilizantes. El proyecto es parte de un consorcio formado por Ecuador,
Bolivia, Cuba, Francia, Irlanda y Bélgica.
Fecha Inicio Proyecto: 01012003
Fecha Finalización: 01012005
Instituciones coejecutoras:
INIAP: Departamento Nacional de Protección Vegetal (DNPV)
Departamento de Suelos
Programa de Papa (Proyecto Fortipapa)
CIP (Sede Quito).
FAO
Fundación GAIA.
Agricultores/ productores de Chaupiloma (TabacundoPichincha), y Virgen de la Nube
(Cañar).
Gobiernos locales (Municipios).
Objetivo principal: Contribuir con la producción ecológica de papa en la Región Interandina.
Objetivos del proyecto.
1. Obtener compost de calidad.
2. Obtener biofertilizantes a base de hongos micorrízicos y bacterias promotoras de
crecimiento vegetal en papa y otros cultivos de la Región Interandina.
Anexo 3. Informe del Dr. Jonathan Haskett* sobre el uso de la tecnología de
inoculantes de Rhizobium, en la Provincia del Chimborazo.
De: "Jonathan Haskett" <[email protected]>
Para: <[email protected]>
Asunto: Re:_Felíz_Nuevo Año.
Fecha: Lunes, 12 de Enero de 2004 15:25
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1) How farmers feel about the use of inoculants?. Are they happy?
Most farmers are happy with this technology. One farmer reported that his peas matured
more rapidly and all matured at the same time, making harvest more easy. Another farmer
reported that his innoculated alfalfa grew as well as alfalfa recieving chicken manure, but
for half the cost at first harvest (note: he added phosphorus fertilizer and micronutrients).
Other farmers are very pleased by the results and have been passing on the information to
their neighbors.
One farmer did not like the results he got with innoculum in beans. He maintained that the
innocualted beans grew more poorly than those not innoculated. This was difficult to verify
and to determine because he subsequently changed his story saying that the beans actually
grew just as well. This is the only instance of someone not being happy with the innoculum
that I have encountered. (note: that the original complaint was made when the gentleman
was apparently intoxicated).
2) What more do farmers need in relation with this technology?
Access, is THE main problem. Farmers need a ready, consistent supply of innoculum,
WHEN the need it. Planting decisions are often driven by weather and can be quite
variable. The lag time between requesting the inoculums and getting it is a problem.
Inoculums should also be supplied in smaller bags so farmers can inoculate smaller
quantities of seeds. This is because there is no refrigeration and it is difficult to reseal bags
and keep them at the correct humidity. So bags should be considered single use and sized
for smaller amounts of seeds.
3) How many "field days" have you had there in the community?
I have done one formal field day. I have done numerous charlas with farmers in small
groups or individually. I find this to be much more effective, especially if we go ahead and
plant the farmer's field that day. The multiplier effect them comes in when and if the farmer
talks to his/her neighbors. I have seen this multiplier effect in action.
4) What kind of methods are you using to difuse the Rhizobium technology there?
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I have done numerous charlas with farmers in small groups or individually. I find this to be
much more effective than field days, especially if we go ahead and plant the farmer's crop
that day. The multiplier effect them comes in when and if the farmer talks to his/her
neighbors. I have seen this multiplier effect in action.
5) Please explain that inoculants supply are going to be through Peace Corp members.
Myself and three other Peace Corps volunteers have actively promoted and distributed
inoculums at our sites. These sites are widely dispered and isolated. Three of the sites are
entirely indigenous and in each of the three inoculums was an entirely new technology that
nobody had ever heard of before. We have been providing the inoculums on a trial basis at
no cost. Eventually I would like inoculums to be commercially available but at a cost that
poor people can afford.
6) What other research do you think is necessary to carry out under field conditions.
Side by side inoculums trials with different strains would be invaluable, to determine which
strains are superior and whether they are better than native strains. Another critical aspect
to determine would be response to phosphorus fertilizer and micronutrients. That is what
level of P is optimal, what form (super phosphate, rock phosphate) is optimal, and how this
can be related to locally available soil tests or other (cost free indicators).
Of some interest would also be the potential use of inoculated legumes as green
manure/mulches in fruit crops such as strawberries and tomato de arbol.
However the strain experiments and the P fertilization experiments are much more critical.
Hope this is useful, if you need more information or more detailed descriptions let me
know. cheers, Jonathan.
* El Dr. Jonathan Haskett es Ph.D. graduado en la Universidad de Minnesota. Es
especialista en Fertilidad de Suelos y actualmente se encuentra trabajando como voluntario
del Cuerpo de Paz en comunidades de la Provincia del Chimborazo.
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Anexo 4: Aprobación de propuesta (FUNDACYT).
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Anexo 5: Trípticos.
5.1 Inoculación de la semilla de leguminosas con la bacteria Rhizobium. Gustavo Bernal, Alfonso Suárez, Mauricio Jeréz, Diego Campaña
Plegable No. 195 (INIAPPROMSA)
Departamento Nacional de Protección Vegetal
Estación Santa Catalina, INIAP.
Agosto 2002
(Plegable realizado)
Propósito.
La bacteria del genero Rhizobium tiene la capacidad de fijar el nitrógeno del aire y convertirlo en una forma que las leguminosas puedan aprovecharlo para su desarrollo y buen rendimiento. Este
proceso tiene lugar después de la germinación de la semilla, en los nódulos (bolitas) formados en la
raíz de la planta.
La inoculación de las semillas con Rhizobium es una práctica de fertilización biológica nitrogenada que remplaza a la fertilización química. Con esta practica, se reducen los costos de fertilización, así
como también la contaminación del suelo y del agua.
Recomendaciones generales.
El inoculante preparado a base de turba (tierra negra) debe ser tratado con ciertas precauciones, por
cuanto este reúne a millones de bacterias, las mismas que necesitan condiciones adecuadas para
sobrevivir. La concentración del producto es de 10 9 células viables de Rhizobium por gramo del inoculante.
Ver ifique la fecha de vencimiento del inoculante.
Verifique que el inoculante sea apropiado para la leguminosa a ser sembrada. Por ejemplo el
inoculante de semilla de fréjol solo funciona en este cultivo.
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Solicite el inoculante por lo menos 15 días antes de la siembra.
De preferencia use el inoculante inmediatamente después de comprarlo.
Si la siembra de la semilla no es inmediata, conserve el inoculante antes de usarlo a una temperatura
de 4 º C (parte baja de la refrigeradora), o en un lugar fresco por un máximo de cuatro meses. Evite
almacenarlo junto con pesticidas o sustancias toxicas.
¿Cuánto del inoculante debo usar por peso de semilla?
La cantidad de inoculante a utilizarse depende del tamaño de la semilla.
Para una leguminosa de 1 a 10 semillas por gramo (ej. Soya, Fréjol, Maní, Arveja, etc.), utilice:
10 gramos (2 cucharadas pequeñas llenas) de inoculante por kilogramo de semilla.
Para una leguminosa de 1120 semillas por gramo (ej.Leucaena), utilice: 20 gramos de inoculante
por kilogramo de semilla.
Para una leguminosa de 20 semillas o más por gramo (ej. Trébol, Alfalfa, Pueraria, Centrosema),
utilice: 50 gramos de inoculante por kilogramo de semilla.
¿Cómo debo inocular la semilla?
Prepare una solución azucarada al 15%. Para esto, coloque 15 gramos (3 cucharadas pequeñas) de
azúcar negra en 85 mL (poco menos que media taza) de agua. Agite vigorosamente hasta que el
azúcar se diluya por completo. La cantidad a preparar depende de la cantidad de semilla a
sembrarse. Prepare solo lo necesario.
Coloque una cantidad apropiada de la solución azucarada sobre la semilla (ej. contenida en un
balde), hasta que todas las semillas obtengan un aspecto brilloso. No adicione más solución.
Coloque el inoculante y mezcle con la semilla usando un palo o estaca. La distribución del
inoculante debe ser homogénea, sin que se formen grumos. Seguir mezclando hasta que las
semillas empiecen a despegarse una de la otra. Cada semilla debe estar cubierta de inoculante
mostrando un color oscuro homogéneo.
Seque la semilla bajo sombra evitando que el inoculante se despegue de la semilla.
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¿Cuándo debo sembrar la semilla?
De preferencia siembre la semilla inmediatamente después de la inoculación y cúbrala con el
suelo. El suelo debe estar suficientemente húmedo. Lo ideal es sembrar en horas de la mañana (7
10 A.M). Evite temperaturas altas y días muy soleados.
Evite almacenar la semilla inoculada, pues la bacteria Rhizobium puede perder la efectividad debido a toxinas producidas por la semilla, y desecamiento de las células. Además la semilla
podría ser atacada por insectos o enfermedades.
¿Qué debo hacer si el suelo es muy ácido o muy básico?
Si el suelo es ácido (pH 45) es recomendable cubrir las semillas recién inoculadas con carbonato
de calcio hasta que todas las semillas tengan una coloración blanca (pellet). Siembre
inmediatamente.
Si el suelo es básico (pH 8 8.5) es recomendable recubrir la semilla con roca fosfórica después de
la inoculación. Siembre inmediatamente.
5.2 Estudio de la fijación simbiótica de nitrógeno de 3 cepas de Rhizobium etli en dos variedades de
fréjol, bajo condiciones de campo (se adjunta).
5.3 Evaluación de sustratos como alternativas de portadores de la bacteria Rhizobium (se adjunta). 5.4 Selección de cepas eficientes en fijación biológica de nitrógeno, para producción de inoculante
en maní (se adjunta).
5.5 Inoculación de semilla de maní con bacteria Rhizobium ( se adjunta) 5.6 Tríptico en arveja (en revisión)
5.7 Tríptico en soya (en revisión)
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20. FIRMA DE RESPONSABILIDAD
ENTREGARECEPCIÓN DEL INFORME FINAL DEL PROYECTO IQCV081
Número total de páginas:
Nombre y firma del Investigador Principal del Proyecto
Gustavo Bernal, Microbiólogo de Suelos Ph.D. Responsable del Departamento Nacional de Protección Vegetal
Estación Experimental Santa Catalina, INIAP.
Fecha
13012004
NOTAS IMPORTANTES
El Informe Final del proyecto ha sido remitido el día martes 13 de enero del 2004. La razón
del envío en esta fecha se debe a que la toma de datos de experimentos que todavía se
encuentran en campo (caso soya) fue realizada los últimos días del mes de diciembre/2003,
de acuerdo al cronograma de actividades.
Mayores detalles en relación con los estudios de la selección de cepas de Rhizobium
asociadas a los cultivos de fréjol y de maní se encuentran en las Tesis de Grado de los Ings.
Diego Campaña y Mauricio Jerez. El presente informe presenta solo un resumen de las
tesis.
Los informes trimestrales fueron realizados y entregados a tiempo.
Los inventarios de los bienes adquiridos con recursos del proyecto están siendo remitidos
en el informe financiero final del proyecto, el mismo que esta a cargo del Departamento de
Contabilidad de la Estación Santa Catalina, INIAP.