Seminario de Histología1UA de Histología, Embriología, Biología Celular y Genética

Microscopía

¿Qué es la histología?

• Objeto de estudio

• Instrumento

• Metodología

Unidades de medida que se utilizarán en el curso:

1 mm = 1000 µm ( µm : micrómetro)1 µm = 1000 nm ( nm : nanómetro)1nm = 10 Å ( Å : Angstrom )

Luz blanca

➢Ondas electromagnéticas

➢Distintas longitudes de onda

➢Se desvía en su trayecto al pasar por medios de distinto índice de refracción

➢ Al pasar por compuestos coloreados son absorbidos determinados rayos

El microscopio óptico se basa en la utilización de la luz visible

NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LA MATERIA

Microfotografía electrónica de un soma neuronal, 15.000X

NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LA MATERIAAnatómico

Tisular

Subcelular

Tisular Celular

Microscopios

Mucosa olfatoria humana

H y E x 540

Ganglio linfático,

corteza profunda, H y E

x 400.

Microscopía óptica y electrónica

PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

Microscopio trinocular, con cámara de video/fotográfica

Indice de refracción (IR) de un medio:

Relación entre la velocidad de la luz en un determinado medio EJ : vidrio) y la velocidad de la luz en el vacío.

AIRE

VIDRIO

REFRACCIÓN A TRAVÉS DE UNA LÁMINA DE VIDRIO DE CARAS PARALELAS

VIDRIO

AIRE

REFRACCIÓN A TRAVÉS DE UNA LENTE BICONVEXA

Marcha de rayos

Punto focalobjeto

Lente biconvexa

Punto focal

Imagen

Distancia Focal

objeto

Centro de la lente

Lado de la lente donde se ubica el objeto

Lado de la lente donde se forma la imagen

Eje óptico

Formación de la imagen en el microscopio

Imagen resultante: mayor, virtual e invertida

Hepatocitos observados con el MO. Técnica de H&E.

Epitelio intestinal observado con el MO. Técnica de coloración H&E.

LÍmite de resolución

Poder de resolución

Aumento

CONCEPTOS IMPORTANTES

Límite de Resolución

Mínima Distancia que debe existir entre 2 puntos para servistos como separados

Poder Resolutivo

Capacidad de un Sistema Óptico para ver Detalles

LR OJO 0.25 mm

LR MO 0.25 um

LR ME 0.2 nm

LR < PR

LÍMITE DE RESOLUCIÓN

λ . 0.61

LR = -----------------------------

AN

( n . Sen α )

LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ

APERTURA NUMÉRICA

Indice de Refracciòn del Medio

Semiangulo de Incidencia de la luz

0.61 X λn x senαLR =

¿Cómo se puede mejorar el Poder Resolutivo del MO?Se logra un mayor PR si se obtiene un menor LR. Para ello:

1) λ : Utilizando filtro azul

se aproxima λ

a los 400 nm

Este rayo no contribuyea formar la imagen

Objetivo

Objetivo

α

2) n

Utilizando aceite de inmersión n =1.52

El rayo entra dentro de la lente objetivo y contribuye en la formación de la imagen

Aire n=1

α

α

Objetivo

Preparado

α

SEMIÁNGULO DE INCIDENCIA

λ . 0.61

LR = -----------------------------

AN

( n . Sen α )

BLANCA 500 nm

AZUL 400 nm

UV 200 nm

AIRE n=1

H2O n= 1.33

ACEITE n=1.52

Este rayo no contribuye

a formar la imagen

Objetivo

Objetivo

α

Aceite de inmersión n =1.52

El rayo entra dentro de la lente

objetivo y contribuye en la formación

de la imagen

Aire n=1

α

α

Cálculo del aumento

• El aumento o magnificación se obtiene multiplicando la magnificación del objetivo por la del ocular.

• Ejemplos:

• Ocular y objetivo seco débil.: 10X multiplico por 10X= 100X.

• Ocular y objetivo seco fuerte: 10X multiplico por 40X= 400X.

• Ocular y objetivo de inmersión: 10X multiplico por 100X= 1000X.

TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Tipos de microscopios ópticos según iluminación: Fundamentos y utilidades

• Campo claro Campo oscuro

• Luz polarizada

• Contraste de fase

• Contraste diferencial de interferencia

• Epifluorescencia

• Confocal

• Por excitación de dos fotones

Microscopio de campo oscuro• Se ilumina el objeto de forma oblicua usando un condensador especial. Sólo la

luz que impacta oblicuamente al objeto entra al objetivo.

• Empleo de objetivos de baja AN (<1.1)

Borrelia

Cultivo celular

-El objeto se ve brillante sobre fondo oscuro.

-Se ven contornos o bordes, no la estructura interna.

-Se ven objetos que con campo claro no se ven por falta de contraste.

-Pueden distinguirse, aunque no resolverse, estructuras que no se distinguen con el MO de campo claro.

-Pueden visualizarse células vivas.

Microscopio de contraste de fase

Convierte la diferencia de fase en diferencia de intensidad

Diafragma anular y placa de fase en el objetivo (anillo transparente).

Imagen intermedia formada por interferencia de todos los rayos

Ventaja: estudio de células vivas. Permite estudios dinámicos.

Microscopio de contraste de fase

Fibroblasto en cultivo

Campo claro Contraste de fase

Interferencia diferencial Campo oscuro

Microscopio de luz polarizada

Luz polarizada

Polarizador y analizador

Prismas de espato de Islandia o Nicol, Discos polaroid- Cuerpos isotrópicos o monorrefringentes- Cuerpos anisótropos o birrefringentes

rayo ordinariorayo extraordinario (polarizado)

Cristales de imidazolato observados con microspio de luz polarizada

Microscopio de interferencia diferencial (DIC)

- Se hacen visibles las diferencias de velocidad que sufren los rayos luminosos al atravesar un objetotransparente (diferencias de fase) : como diferencias de intensidad o de coloración.

- Aspecto de relieve.

- Utiliza luz blanca polarizada.

- Ventajas: las del microscopio de contraste de fase y se puedecuantificar el espesor del corte y cambios en el índice de refracción

Propiedades de la fluorescencia

Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga.

Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro.

La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.

Microscopio de epifluorescencia

Microscopio de epifluorescencia

Inmunofluorescencia con fluorocromos de distintos colores

Mitosis: marcación de microtúbulos, cromosomas y filamentos de actinaCélulas marcadas con distintos anticuerpos

Microscopio confocal (invertido)

Permite observar una célula o tejido vivo en diferentes planos focales.

Se observa el plano que está situado en el punto de foco del sistema óptico eliminando, de forma óptica a través de un diafragma o "pinhole", la luz proveniente de los planos que están fuera de foco.

Visión tridimensional del elemento estudiado

Microscopio de epifluorescencia Microscopio confocal

Microscopio por excitación de dos fotones

Microscopia Electrónica

Microscopio electrónico de transmisión del Instituto de Biología Celular y Neurociencias Prof E. De Robertis. 1UA de Histología, Embriología, Biología Celular y Genética.

Microscopio electrónico de transmisión vs. microscopio óptico

Lente objetivo

Lente ocular

Diafragma

Fuente

Microfotografía electrónica de un hepatocitonúcleonucleoloREGmitocondiasUltraestructura: Microscopía electrónica

Microscopio electrónico de barrido

Macrófago activadoEspermatozoides sobre membrana pelúcida

(coloración agregada)

Glomérulo RenalMicroscopio de campo claro

Microscopio confocal

Microscopio electrónico de Transmisión Microscopio electrónico de Barrido