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medicina
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7/17/2019 Sesión 15 fisiopatplogia
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Asignatura: ANÁLISIS INSTRUMENTALEscuela: Farmacia y Bioquímica
CURSO: ANÁLISIS INSTRUMENTALPROFESOR: MS QF DAVID RUIDÍAS ROMERO
QUINCEAVA
SEMANA
Fundamentos Instrumentación Optimización de la separación cromatográfica Aplicación de la HPLC
7/17/2019 Sesión 15 fisiopatplogia
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Técnica L columna, cm Diámetro de partícula, µm
LC 50 – 500 150 – 200
HPLC 3 – 30 3 – 10
UPLC Hasta 5 < 2
1. Fundamentos
LC: Liquid Chromatography
HPLC: High Performance Liquid Chromatography orHigh Pressure Liquid Chromatography
UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography
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Asignatura: ANÁLISIS INSTRUMENTALEscuela: Farmacia y Bioquímica
7/17/2019 Sesión 15 fisiopatplogia
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CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio
LC Reparto Líquido adsorbido sobre unsólido
Distribución entrelíquidos inmiscibles
Reparto con fasesenlazadas
Especies orgánicas enlazadasa una superficie sólida
Distribución entrelíquido y superficieenlazada
Adsorción Sólido Adsorción
Intercambio iónico Resina de Int. Iónico Intercambio iónico
Exclusión por tamaño Líquido en intersticios de unsólido polimérico
Distribución/Exclusión
1. Fundamentos
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1. Fundamentos
LC DE INTERCAMBIO IÓNICO
++
+
++
+
+
F l u j o d e f a s e m ó v i l -
--
---
-
---
+
+ +
+
+
+
+
+
+ Intercambiador iónico (aniónico) - +y : Especies a separar
Las especies con carga negativa se unen a la resina que estácargada positivamente, quedando retenidas.
Las especies con carga positiva son repelidas por la resinasiendo eluídas de la columna.
Intercambiador catiónico:xRSO3
-H+ + Mx+ ↔ (RSO3-)xMx+ + xH+
sólido disolución sólido disolución
Intercambiador aniónico:xRN(CH3)3
+OH- + Ax- ↔ [RN(CH3)3+]xAx- + xOH-
sólido disolución sólido disolución
EQUILIBRIOS DE INTERCAMBIO
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1. Fundamentos
F l u j o d e f a s e m ó v
i l
Bolas de gel: fase estacionaria
y : especies a separarLas moléculas más pequeñas penetranen los intersticios o canales del gel,viajando a menor velocidad
Las moléculas más grandes no pueden penetraren los canales del gel y por tanto viajan a mayorvelocidad.
LC DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS
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2. Instrumentación
COMPONENTES DE LA INSTRUMENTACIÓN
Depósitos de fase móvil
Bomba cromatográfica
Sistema de inyección
Compartimento para la columnacromatográfica: Columna
Detector
Depósito
de residuos
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2. Instrumentación
Fase móvil
Columnacromatográfica
Válvula deinyección
Bomba
cromatográfica
Detectorfluorimétrico
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2. Instrumentación
SISTEMA DE BOMBEO
• Proporciona presiones superiores
a 6000 psi.• Salida de disolventes libres de
impulsos.• Velocidades de flujo habituales de
0,1 – 5 mL/min.
• Reproducibilidades de flujo de, almenos, 0,5% (Ej. 2 mL min-1: 1,99 –2,01 mL/min)
• Resistencia a la corrosión .
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2. InstrumentaciónSISTEMA DE INYECCIÓN: - Muestreadores automáticos
- Válvulas de bucle de muestreo
Lazo o bucle deinyección (5 – 500 µL)
Orificio para inyección
mediante microjeringa
Palanca paracambio de posición
Entrada de fase móvildesde la bomba
Salida haciala columna
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Microjeringa
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2. Instrumentación
Microjeringa Microjeringa
POSICIÓN DECARGA
Hacia lacolumna
Hacia lacolumna
Entrada defase móvil
Entrada defase móvil
Aresiduos
Lazo demuestra
POSICIÓN DEINYECCIÓN
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2. Instrumentación
Bandeja
Brazo deinyección
Lavado
Viales demuestras
MUESTREADOR AUTOMÁTICO
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2. Instrumentación COLUMNA CROMATOGRÁFICA
• Columnas: L=10-30 cm. D.I.= 4-10 mm.
Rellenos de tamaño de partícula: 5-10 µm.
N/m= 40000-60000
• Microcolumnas: L=3-7cm. D.I.=1-4 mm.
Rellenos de tamaño de partícula: 3-5 µm.
N/m= 100000
Entrada
Guarda-columna
Carcasa de
alumnioanodizado
Fritas detitanio poroso
Frita de titanioporoso
Salida
Columna principal(plástico)
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Fig.1
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2. InstrumentaciónCOLUMNAS DE LC
PRECOLUMNACOLUMNA
Flujo de fase móvil
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2. InstrumentaciónTERMOSTATIZACIÓN DE LA COLUMNA
Columna
Compartimentode
termostatización
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2. InstrumentaciónSISTEMAS DE DETECCIÓN
Algunos de los detectores comerciales más usados
Detector Límite de detecciónaproximado, ng Intervalo de linealidad endecenas
Absorbancia 0,1 – 1 3-4
Fluorescencia 0,001 – 0,01 5
Electroquímico 0,01 - 1 4 - 5
Conductividad 0,5 - 1 5
Índice de refracción 100 - 1000 3
Espectrometría de masas 0,1 - 1 5
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Entradade flujo
2. Instrumentación
Entradade flujo
Salida de flujo
Fuentede luz Detector
ESQUEMAS BÁSICOS DE DETECTORES
ESPECTRÓMETRO DE ABSORCIÓNVISIBLE-ULTRAVIOLETA
Fuente deiones
Analizadorde masas
Detectorde iones
Adquisiciónde datos
ESPECTRÓMETRO DE MASAS
Identificación:Espectros de masas
A b u n d
a n c i a
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Fig.1
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3. Optimización de la separación cromatográficaA. SELECCIÓN DEL TIPO DE LC
Parámetros a considerar:- Peso molecular- Solubilidad
- Polaridad- Estructura química
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102
103
104
105
106
P
e s o m o l e c u l a r
Polar no iónicoNo polar Iónico
Insoluble en agua Soluble en agua
Aumento de la polaridad
Exclusión
(En gel permeable) (Filtración en gel)
Adsorción
Reparto
Intercambioiónico
(Repartoen fasereversa)
(Repartoen fasenormal)
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3. Optimización de la separación cromatográfica
B. SELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL
Descartar los disolventes incompatibles por sus propiedades físicas
Ajuste de la fuerza de los disolventes
Selectividad de los disolventes
Fase móvil óptima
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3. Optimización de la separación cromatográfica
Separación de 8 compuestosFase móvil:Mezclas agua (A)/acetonitrilo (B)
ELUCIÓN ISOCRÁTICA
AJUSTE DE LA FUERZA DE LOS DISOLVENTES
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3. Optimización de la separación cromatográficaAJUSTE DE LA FUERZA DE LOS DISOLVENTES
ELUCIÓN EN GRADIENTE
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3. Optimización de la separación cromatográficaLC DE REPARTO
Técnica Faseestacionaria
Fasemóvil
Fase normal polar apolarFase reversa apolar polar
R e s p u e s t a d e l d e t e c t o r
Tiempo
Inyección
12
3 4
Polaridad de los compuestos
1 > 2 > 3 > 44 > 3 > 2 > 1
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4. Aplicaciones al análisis de fármacos
LC DE REPARTO
PAHs, pesticidas, sulfonamidas, vitaminas, drogas y sus metabolitos, antibióticos,esteroides, analgésicos, colorantes, ácidos grasos, nucleótidos ….
Fase reversa.Elución en gradiente con mezclaACN:agua.
Sulfonamidas
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4. Aplicaciones al análisis de compuestos orgánicos
LC DE ADSORCIÓN : Fase estacionaria alúmina y sílice
OlefinasHidrocarburos aromáticosHaluros, sulfurosÉteresNitrocompuestos
Ésteres, aldehídos, cetonasAlcoholes, aminasSulfonasSulfóxidosAmidas
Ácidos carboxílicos
ORDEN EN TIEMPO DE RETENCIÓN DE MAYOR A MENOR
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Obsérvese que los compuestos menos polares presentan mayor afinidad por la fase estacionaria
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4. Aplicaciones al análisis de aguas
LC DE INTERCAMBIO IÓNICO
Análisis y control de
calidad de aguas
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A
B
C
D
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4. Aplicaciones al análisis de proteínas
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LC DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
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