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Márcio Elias Ferreira, Ph.D. [email protected] Laboratório de Genética EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia BIOTECNOLOGIA: BIOTECNOLOGIA: avan avan ç ç os e aplica os e aplica ç ç ões no ões no melhoramento gen melhoramento gen é é tico tico vegetal vegetal

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Márcio Elias Ferreira, [email protected]ório de GenéticaEMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia

BIOTECNOLOGIA: BIOTECNOLOGIA: avanavançços e aplicaos e aplicaçções no ões no melhoramento genmelhoramento genéético tico

vegetalvegetal

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VigorHíbrido

Conclusões e

perspectivas

conjunto de técnicas que utilizam os seres vivos no desenvolvimento de processos e produtos

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Conclusões e

perspectivas

As variedades de plantas de diferentes espécies cultivadas foram desenvolvidas, em sua grande maioria, com base na seleção fenotípica de características de interesse econômico.

Fenótipo representa o efeito coletivo dos genes expressos em interação com o ambiente.

Sucesso: métodos de melhoramento, genética quantitativa (herdabilidade, variância genética, correlação genética), estatística, fitotecnia

Desconhecimento da arquitetura genética por traz do fenótipo: não se sabe quais são os genes e o papel destes genes no fenótipo.

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Conclusões e

perspectivas

Decckers & Hospital, 2002

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Conclusões e

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•Cruzamento de melhores materiais•Seleção de recombinantes baseada em fenótipo•Fixação do genótipo desejado em linhagens ou híbridos•Modelo infinitesimal de Fisher

EFICIENTE: não precisa de informação sobre número de locos, efeito, localização, sequência gênica, função gênica

Melhoramento Convencional

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Nature 2002 4(16):701-702

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Nature 2002 4(16):701-702

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Conclusões e

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IR8 e a RevoluIR8 e a Revoluçção Verdeão Verde

Comparação de alelo sd-1 de IR8 e Dee-geo-woo-gen com alelo de planta normal:mutante tem deleção de 383 pb que cria um stop códon

• outros três alelos sd-1 (semi-anão) apresentam substituição de aminoácido (linhagens derivadas de Jikkoku, Calrose 76 e Reimei.

•GA20 oxidase do loco sd-1 expressa nas folhas, caule e flores fechadas. Deleção leva ao porte semi-anão.

•Característica monogênica com grande efeito em característica quantitativa: arquitetura.

Nature 2002 4(16):701-702

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Conclusões e

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Novamente,

Não foi necessário conhecimento de localização, efeito, ordem, sequência ou função para desenvolver as variedades de arroz altamente produtivas da Revolução Verde.

O uso de ferramentas moleculares proporciona o aumento da eficiência dos programas de melhoramento genético para características quantitativas?

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As duas principais linhas de melhoramento molecular, isto é, do melhoramento genético que incorpora estratégias, métodos e conhecimentos de genética molecular na manipulação de seqüências de DNA que afetam o fenótipo de interesse, incluem:

(1) a inserção direta de genes por diferentes estratégias de engenharia genética nas espécies de interesse e

(2) a seleção baseada na detecção de variação genotípica associada àvariação fenotípica nos programas de melhoramento genético.

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Conclusões e

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Aumento da eficiência com uso de ferramentas moleculares?

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Tipicamente busca genes que representam novidade na espécie.

Os genes, em geral, são oriundos de espécies completamente diferentes da espécie-alvo.

A nova característica agrega valor à espécie alvo.

Principais genes comerciais:

Resistência a insetos (Bt)Resistência a herbicida (glifosato)

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Sucesso no desenvolvimento de variedades com características controladas por um único gene;

Genes em geral representam novidade à espécie;

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Tempo de desenvolvimento varietal: similar ao melhoramento convencional (aproximadamente 10 anos, Gepts, 2002); conversão idem.

• identificação do gene de interesse em espécie de taxa distante

• clonagem do gene• construção de vetores• transformação• seleção de transgênicos com expressão

adequada da característica de interesse

Outros fatores (política, regulamentação e propriedade intelectual) podem estender ainda mais os prazos de desenvolvimento varietal.

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Limitação:

Banco de genes de interesse econômico está restrito a poucos exemplos (ex. Bt, resistência a herbicida, resistência a patógenos);

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Limitação: Engenharia Genética de características quantitativas

Banco não inclui, na prática, genes ou reguladores de expressão para melhoramento de características quantitativas. Previsão: longo prazo.

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narciso

narciso

Erwinia

NarcisoErwiniaNarciso

MilhoErwiniaNarciso

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• Engenharia genética, a curto prazo, não substitui melhoramento clássico.

• Seu principal atributo e contribuição é a incorporação de novidade à espécie de grande interesse econômico.

• Engenharia genética de metabolismo para aumentar eficiência enzimática está em sua infância.

• Engenharia genética não parece ser possível, a curto prazo, no melhoramento de características quantitativas.

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SELESELEÇÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES ÃO ASSISTIDA POR MARCADORES -- poderáeventualmente substituir à análise fenotípica utilizada nos programas de melhoramento?

MotivaMotivaçção para uso ão para uso éé antiga no melhoramento: antiga no melhoramento: seleseleçção indiretaão indireta de uma caracterde uma caracteríística de fstica de fáácil cil

fenotipagem como critfenotipagem como critéério de selerio de seleçção para uma ão para uma caractercaracteríística complexa; stica complexa;

seleseleçção diretaão direta do gendo genóótipo desejado.tipo desejado.Ex. Ex. Sax, K. 1923 The association between size differences with seedSax, K. 1923 The association between size differences with seed--coat pattern and coat pattern and

pigmentation in pigmentation in Phaseolus vulgarisPhaseolus vulgaris. Genetics 8:552. Genetics 8:552--560560

Thoday, J.M. 1961 Location of polygenes. Nature 191:368Thoday, J.M. 1961 Location of polygenes. Nature 191:368--370370MolecularMolecularBotstein, D.; White, R.L.; Skolnick, M. and Davis, R.W. 1980 ConBotstein, D.; White, R.L.; Skolnick, M. and Davis, R.W. 1980 Construction of a genetic struction of a genetic

linkage map n man using restriction fragment length polymorphismlinkage map n man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. s. Am. J. Hum. Genet. 32:314Genet. 32:314--331331

Edwards, M.D.; Stuber, C.S.; Wendel, J.F. 1987 MolecularEdwards, M.D.; Stuber, C.S.; Wendel, J.F. 1987 Molecular--markermarker--facilitated investigations facilitated investigations of quantitativeof quantitative--trait loci in maize. Itrait loci in maize. I-- Numbers, genomic distribution and types of Numbers, genomic distribution and types of gene action. Genetics 116:113gene action. Genetics 116:113--125125

Paterson, A.H.; Lander, E.S.; Hewitt, J.D.; Paterson, S.; LincolPaterson, A.H.; Lander, E.S.; Hewitt, J.D.; Paterson, S.; Lincoln, S.E. and Tanksley, S.D. n, S.E. and Tanksley, S.D. 1988 Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by1988 Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphisms. Naturelinkage map of restriction fragment length polymorphisms. Nature 335:721335:721--726726

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DEFINIÇÃO: é toda sequência de DNA (expresso ou não) capaz de detectar POLIMORFISMO de sequência e que possui um comportamento MENDELIANO.

•Hibridização•PCR•PCR seguido de fragmentação•Fragmentação seguida de PCR

•Marcação por fluorescência•Marcação por nitrato de prata•Marcação por brometo de etídio•Marcação por 32P ou 33P

APLICAÇÃO:FilogeniaDiversidade genéticaAnálise de vínculoEstrutura de populaçõesEvoluçãoConstrução de mapas genéticosMapeamento qualitativoMapeamento de QTLsClonagem posicionalSeleção assistida

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Uso amplo (rotina):• Exemplos: RFLP, RAPD, SSR, SNP, DArT

• Incorporar genes de resistência a doenças de difícil avaliação fenotípica ou que requerem avaliação múltipla;

• Piramidizar genes que conferem resistência a isolados do mesmo patógeno (o que éimpossível de ser conduzido por inoculação simultânea em programa convencional de melhoramento).

• Conversão de linhagens (retrocruzamento assistido)

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Conversão de linhagens (retrocruzamento assistido, background selection)

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Conversão de linhagens (retrocruzamento assistido,seleção de background)

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Duas gerações de retrocruzamento com seleção de backgroung atinge ~93% de conversão (sem seleção é ~87,5%). Grande ganho no tempo de lançamento varietal.

Justificável - seleção baseada no fenótipo émenos eficiente e mais onerosa do que baseada em polimorfismo de DNA

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Potencial uso de seleção indireta para característica de interesse (seleção assistida) para desenvolvimento varietal

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• Grande desenvolvimento da teoria de seleção assistida (Dekkers and Hospital, 2002; Dreher et al., 2003).

• Emprego em espécies modelo começa a se desenvolver (incipiente);

• Emprego em espécies “órfãs”: nulo

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Características quantitativas: uso nulo ou limitado de seleção assistida

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MAS - interessante em situações em que a herdabilidade é intermediária e hágrande dificuldade ou custo na fenotipagem (Moreau et al., 1998)

Fenotipagem da característica de interesse é difícil (ex. resistência a nematóide do cisto em soja –Heterodera glycines), a seleção assistida por marcador fortemente ligado a gene de interesse tem grande atrativo para ser adotada em rotina pelos programas de melhoramento genético por facilitar o processo de fenotipagem (Young, 1999).

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Se todos os genes que controlam uma característica pudessem ser mapeados e os seus efeitos mensurados, a processo de seleção indireta poderia ser mais eficiente

Contudo,

Os QTLs mapeados em geral são de grande efeito, relativamente àqueles que também contribuem para o fenótipo, em contraposição ao modelo infinitesimal.

O polimorfismo de DNA nestas regiões nem sempre é observado entre as linhagens parentais e do grau de isolamento genético entre elas.

Depende do próprio processo de fenotipagem, que para características quantitativas não guarda uma correlação alta com o genótipo da característica de interesse.

Ao longo das gerações e por efeito da recombinação, o desequilíbrio de ligação édiminuído e a eficiência de seleção indireta diminui.

QTLs não são geralmente convservados entre diferentes populações

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Espécie Característica QTL Gene Funçãoarabidopsistempo florescimento ED1 CRY2 criptocromoarroz abscisão de grãos Sh4 Sh4 regulatóriaarroz abscisão de grãos qSH1 qSH1 regulatóriaarroz capacidade regeneração PSR1 PSR1 redutase ferrodoxina-nitrato arroz número de grãos Gn1a OxCKX2 oxidase/desidrog citocininaarroz perfilhamento moc1 Moc fator transcriçãoarroz submergência Sub1A Sub1A fator de transcriçãoarroz tamanho de grão GS3 GS3 proteína transmembranaarroz tempo florescimento Hd1 Se1 fator transcrição (Constans)arroz tempo florescimento Hd6 CK2 quinasearroz tempo florescimento Hd3a Hd3a niarroz tempo florescimento Edh1 Edh1 regulatóriaarroz tolerância a salinidade SKC1 SKC1 bomba de sódiomilho dominância apical Tb1 Tb1 fator transcriçãomilho tempo florescimento dwf1 dwf1 regulatóriatomate conteúdo açúcar Brix9-2-5 Lin5 invertase apoplásticatomate forma do fruto ovate ovate desconhecidotomate tamanho de fruto fw2.2 OFRX regulatória

Poucos exemplos: Seleção assistida baseada diretamente na genotipagem do gene no QTL de interesse

Clonagem posicional

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O uso de seleção assistida depende, fundamentalmente, da vantagem econômica em utilizar a tecnologia em relação a um programa convencional de seleção.

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Conclusões e

perspectivas

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Piramidização de genes de resistência à Magnaportheem arroz e desenvolvimento de multilinhas;

Fenotipagem RC1Seleção assistida

Piramidizaçãomultilinhas

Fenotipagem RC2Seleção assistida

Impacto: Experimento em RC3. Piramidização de genes de resistência a diferentes raças do mesmo patógeno com screening simultâneo é complexo;

Piramidização indireta: efeito tampão

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Conclusões e

perspectivas

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• Qualidade de grãos• STRs flanqueando genes de interesse

• Sintase de amido (SSII-3; SSII-2; waxy• ADP-glucose pirofosforilase (AGPase LS;

AGPase SS)• Ramificação de amido (SBE I; SBE IIa; SBE IIs)• Desramificação amido (DBE-isoamilase)

Alta qualidade grãosMédia produtividade

Média qualidade grãosAlta produtividade

Alta qualidade grãosAlta produtividade

Outros QTLs

Impacto: Experimento em RC1. Avaliação para qualidade de grãos é feita somente em estágios avançados do programa. Neste caso, a avaliação é precoce.

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perspectivas

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AB-QTL (Advanced Backcross QTL Analysis) (Tanksley & Nelson, 1996).

PASSOS:-mapeamento de QTLs em cruzamentos amplos

-seleção de QTLs cujos alelos positivos são provenientes do doador.

-Análise de fenótipo em geração avançada de retrocruzamento

-Seleção de linhagens quase-isogênicas com base em informação de QTLs

PRODUTOS:

-linhagens quase-isogênicas contendo alelos desejáveis para características quantitativas introgredidos de doador silvestre

-Aumento de diversidade genética dos programas

-Diminuição do efeito de linkage drag

-Uso de acessos do banco de germoplasma

O. sativa BG 90-2 O. glumaepatula RS 16X

F1BG 90-2

RC1 Construção do mapa genéticoBG 90-2

X

X

RC2

RC2F2 Fenotipagem

MAPEAMENTO DE QTLs

X

RC2F3

X

RC2F7

X(...)

Linhagens quase-isogênicas

seleção

seleção

seleção

(...)

O. sativa BG 90-2 O. glumaepatula RS 16X

F1BG 90-2

RC1 Construção do mapa genéticoBG 90-2

X

X

RC2

RC2F2 Fenotipagem

MAPEAMENTO DE QTLs

XX

RC2F3

XX

RC2F7

XX(...)

Linhagens quase-isogênicas

seleção

seleção

seleção

(...)

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Conclusões e

perspectivas

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Por que em certos cruzamentos o híbrido F1 é superior à performance das linhagens parentais homozigotas, ou da mais vigorosa das linhagens parentais?

Hipóteses – efeitos não aditivos no fenótipo.

DOMINÂNCIA - onde conjuntos independentes de alelos com pequeno efeito deletério, acumulados no genoma pela autofecundação de linhagens parentais, atuam de forma complementar quando presentes no híbrido (F1) das linhagens parentais. As linhagens parentais, pelo contínuo aumento de homozigose a cada geração de autofecundação, apresentam um efeito de depressão por endogamia, fenômeno geralmente associado ao vigor híbrido.

SOBREDOMINÂNCIA - interações alélicas em um loco heterozigoto atuam de forma sinergística entre os alelos para aumentar o vigor da planta.

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Conclusões e

perspectivas

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(a)

(b)

Fu and Dooner, 2002

Vigor Híbrido

Depressão por endogamia

Corrobora hipótese de dominância.Explica também porque distância genética, por si só, não é um bom estimador de vigor híbrido

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Conclusões e

perspectivas

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com um único ensaio (“corrida”) de seqüenciamento por síntese baseado em polimerase é possível re-sequenciar em 4 dias cerca de 1300 milhões de pb, com fragmentos de aproximadamente 32-40 pb na plataforma Illumina (http://www.illumina.com).

Na plataforma Roche-454 (http://www.454.com ), baseada na técnica de pirosequenciamento, é possível em apenas 7 hs e em uma única corrida obter cerca de 100 Mpb, com comprimento de fragmentos seqüenciados em torno de 250 pb.

Outra possibilidade é o emprego da plataforma SOLiD – Applied Biosystems, que o seqüenciamento baseado em ligação, capaz de gerar 3.000 Mpb em uma corrida no período de cinco dias, com tamanho de fragmento na ordem de 35 pb(http://marketing.appliedbiosystems.com/images/Product/Solid_Knowledge/flash/102207/solid.html ).

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Conclusões e

perspectivas

É´possível afirmar que a genotipagem vai se tornar mais econômica (e fácil) do que a fenotipagem.

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As contribuições de áreas de biologia molecular, genética molecular e genômica para o conhecimento básico da constituição biológica dos organismos é inquestionável.

Já o emprego de tecnologias derivadas deste conhecimento em soluções práticas no melhoramento de plantas, notadamente nas rotinas de um programa de desenvolvimento varietal, éainda limitado.

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perspectivas

Conclusões e Perspectivas

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A engenharia genética tem tido impacto reconhecido na introgressão de genes de herança qualitativa, oriundos de espécies filogeneticamente distantes da espécie agrícola de interesse, mas que conferem um alto valor agregado à variedade transgênica.

Porém, o repertório gênico com impacto comercial é ainda limitado a poucos exemplos, como resistência a herbicida e resistência a insetos.

A engenharia genética para características quantitativas ainda espera por um exemplo prático, de grande impacto comercial.

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Conclusões e

perspectivas

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A genética molecular, através do emprego de marcadores moleculares, tem contribuído em várias áreas da biologia e do agronegócio.

No melhoramento genético a seleção indireta com marcadores moleculares tem sido empregada com sucesso em programas de retrocruzamento e conversão de linhagens, tanto para genes de herança simples (incluindo transgenes) quanto para QTLs de forte efeito na variação fenotípica.

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perspectivas

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Marcadores moleculares utilizados no mapeamento e clonagem posicional vêm apresentando grande avanço no conhecimento, possibilitando a clonagem de QTLs e a compreensão do seu papel no fenótipo de uma característica quantitativa.

Contudo, o impacto da seleção assistida por marcadores moleculares no melhoramento de características quantitativas éainda incipiente.

Este impacto tem se revelado mais promissor quando em combinação com avaliação fenotípica.

Biotecnologia e Melhoramento

Engenharia GenéticaCaraterísticas monogênicas

Seleção Assistida MarcadoresCaraterísticas monogênicas

Engenharia GenéticaCaracterísticas poligênicas

Seleção Assistida MarcadoresCaraterísticas poligênicas

VigorHíbrido

Conclusões e

perspectivas

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O re-seqüenciamento em escala do genoma estrutural aponta para o conhecimento da base molecular de fenômenos de grande interesse para o melhoramento genético, como heterose.

O seu desvendamento por certo levará ao desenvolvimento de estratégias combinadas de genética molecular e melhoramento para a seleção de genótipos superiores e com maior vigor híbrido e menor depressão por endogamia.

Biotecnologia e Melhoramento

Engenharia GenéticaCaraterísticas monogênicas

Seleção Assistida MarcadoresCaraterísticas monogênicas

Engenharia GenéticaCaracterísticas poligênicas

Seleção Assistida MarcadoresCaraterísticas poligênicas

VigorHíbrido

Conclusões e

perspectivas

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O melhoramento clássico, sem dúvida, continuará a desenvolver as variedades melhoradas para a agricultura, como sempre o fez, independentemente do conhecimento dos genes e do controle que exercem sobre a fisiologia da característica de interesse.

A redução dos custos de análise molecular promoverá uma integração cada vez maior do melhoramento clássico com os avanços da biotecnologia nos próximos anos.

Biotecnologia e Melhoramento

Engenharia GenéticaCaraterísticas monogênicas

Seleção Assistida MarcadoresCaraterísticas monogênicas

Engenharia GenéticaCaracterísticas poligênicas

Seleção Assistida MarcadoresCaraterísticas poligênicas

VigorHíbrido

Conclusões e

perspectivas

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Em um futuro próximo, portanto, não parece factível a substituição da seleção fenotípica, que caracteriza os programas de melhoramento, pela seleção genotípica, baseada na análise de variação alélica nos locos gênicos, ou locos de marcadores moleculares em desequilíbrio de ligação como os locos que controlam a característica de interesse.

Não parece factível, ainda, a substituição do melhoramento clássico pela engenharia genética.

Parece adequado supor que, ao invés de substituição haverá, na verdade, uma integração cada vez mais intensiva de técnicas de engenharia genética, marcadores moleculares e genômica no melhoramento genético.

Biotecnologia e Melhoramento

Engenharia GenéticaCaraterísticas monogênicas

Seleção Assistida MarcadoresCaraterísticas monogênicas

Engenharia GenéticaCaracterísticas poligênicas

Seleção Assistida MarcadoresCaraterísticas poligênicas

VigorHíbrido

Conclusões e

perspectivas

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