Síntesis y Separación por HPLC de tetrahidropirazolo[1,5-a]

quinazolinas y tetrahidropirazolo[5,1-b]quinazolinas

Renesteban Forero Franco

Trabajo de grado presentado como requisitoparcial para optar al título de químico

Asesor: Dr. Jaime Antonio Portilla Salinas

Palabras Clave:

5-aminopirazoles, Quinazolinas, ciclocondensación bicomponente, Cromatografíade Placa Delgada, HPLC analítico, HPLC semipreparativo.

Universidad de los AndesFacultad de Ciencias

Departamento de QuímicaBogotá – Colombia, Junio de 2012

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN 1

2. OBJETIVOS

2.1.Objetivo General 1

2.2.Objetivos Específicos 1

3. ANTECEDENTES

3.1.Pirazoles y sus derivados 2

3.2.Aminopirazoles 2

3.3.Pirazoloquinazolinas 3

3.4.Síntesis Inducida por microondas 3

3.5.Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) 3

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 5

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1.Síntesis de las Pirazoloquinazolinas 6

5.2.Separación de la mezcla regioisomérica 11(a-f)/12(a-f) 7

5.2.1. Separación fase Analítica 7

5.2.2. Separación fase Semipreparativa 9

5.2.2.1. Optimización de las condiciones de separación 11

5.2.2.2. Caracterización de los regioisómeros 11

6. CONCLUSIONES 14

7. SECCION EXPERIMENTAL 14

7.1. Instrumentos y Condiciones 14

7.2.Disolventes 15

7.3.Reactivos y Precursores

7.3.1. Reactivos y Precursores Comerciales 15

7.3.2. Precursores Sintetizados 15

7.3.2.1. Síntesis de los Acrilonitrilos (Procedimiento General) 15

7.3.2.2. Síntesis de los 5-aminopirazoles (Procedimiento General) 15

7.4.Síntesis de tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas y

tetrahidropirazolo[5,1-b]quinazolinas 15

8. BIBLIOGRAFÍA 16

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Radicales empleados en los 5-aminopirazoles 5

Tabla 2. Resultados de puntos de fusión y rendimiento para la mezcla 11(a-f)/12(a-f). 6

Tabla 3. Resultados de Rf’s para la mezcla 11(a-f)/12(a-f). 7

Tabla 4. Relaciones de área de separación respecto de la total. 11

Tablas 5 y 6. Determinación del volumen y concentración de inyectado óptimos. 12

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. Síntesis general de pirazoles 2

Esquema 2. Síntesis de 5-aminopirazoles 2

Esquema 3. Síntesis general de pirazoloquinazolinas 3

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Tautomería de NH-aminopirazol 3

Figura 2. Polaridades de la fase móvil y estacionaria 4

Figura 3. Triángulo de velocidad, carga y eficiencia para la escogencia de un método en HPLC 5

Figura 4. Región de importancia del espectro RMN 1H para la mezcla 11f/12f 6

Figura 5. Cromatogramas de la mezcla 11c/12c. 8

Figura 6. Comportamiento del separado respecto al flujo de disolvente de la mezcla 11c/12c 9

Figura 7. Resultados de la mezcla THF/ACN/H2O 1:2:3 con la columna semipreparativa 10

Figura 7.1. Identificación de los regioisómeros por espectroscopía UV en la fase analítica. 11

Figura 8. Espectro RMN 1H de la primera cola (regioisómero supuesto como el lineal) 12

Figura 9. Espectro RMN 1H de la segunda cola (regioisómero supuesto como el angular). 12

Figura 10. Diagrama de cruce entre cromatogramas de los dos. 13

LISTA DE ABREVIATURAS

HPLC (High performance liquid Chromatography) Cromatografía liquida de alta eficacia.

CCD Cromatografía de capa delgada.

CC Cromatografía de columna.

MW Microondas.

EtOH Etanol.

AcONa Acetato de Sodio.

ACN Acetonitrilo

THF Tetrahidrofurano

MetOH Metanol

DCM Diclorometano

H2O Agua

RMN Resonancia Magnética Nuclear (Espectroscopía).

RMN 1H Resonancia Magnética Nuclear Protónica (Espectroscopía).

AGRADECIMIENTOS

A Dios primeramente quien me dotó de inteligencia y sabiduría, nosolo en la realización de este proyecto sino de toda mi carrera. A mipapá quien me apoyó de una forma incondicional en todos losaspectos. A mis hermanos y a mis amigos…

RESUMEN

En los últimos años, la síntesis de pirazoloquinazolinas ha venido tomando un papel importante en

diversas áreas del conocimiento. Sus aplicaciones más importantes se encuentran en el campo de

la química medicinal como inhibidores de enzimas vitales en el proceso de multiplicación celular.

En este trabajo se pretende realizar la síntesis y separación de una serie química de la mezcla

regioisomérica de tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas y tetrahidropirazolo[5,1-b]quinazolinas. El

proceso de síntesis se llevó a cabo por inducción con microondas y el estudio de la separación, de

los regioisómeros formados, por HPLC analítico y semipreparativo. Los productos de la

cromatografía semipreparativa fueron analizados por RMN 1H y determinado el grado de

separación obtenido sobre la mezcla regioisomérica.

ABSTRACT

In the last years, the synthesis of pyrazolequinazolynes has being taking an important role in many

areas of knowledge. Their most important applications are in the field of medicinal chemistry

acting like inhibitors of vital enzymes in the cellular multiplication process. The primary objective

of this work is to performance the synthesis and separation of a regioisomeric mixture of

tetrahydropyrazole[1,5-a]quinazolynes y tetrahydropyrazole[5,1-b]quinazolynes. The synthesis

step was carry out by microwave induction using 5-aminopyrazoles and β-cyclic diketones, and the

study of separation of the mixture formed, by analytical and semipreparative HPLC. The products

of the semipreparative chromatography were analyzed by 1H RMN and determined the separation

grade obtained of the regioisomeric mixture.

1

1. INTRODUCCION

En años recientes, el interés por el estudio de compuestos heteronucleares nitrogenados hacrecido enormemente. Las aplicaciones que presentan este tipo de moléculas trascienden lamayoría de las líneas de investigación en química orgánica e inorgánica. Dentro de las máscomunes se encuentran el de servir como pesticidas, agentes antibacteriales, antimicrobiales,antipiréticos, anticancerígenos, etc. Dado el amplio espectro de posibilidades que ofrecen estetipo de compuestos, cada vez son más los grupos de investigación que dedican sus esfuerzos enencontrar nuevas formas de síntesis y aplicaciones.

Dentro de esta generalidad de compuestos se destacan los pirazoles, que dada su capacidadanfótera son empleados en síntesis de heterociclos fusionados de forma rápida y sencilla. Algunospirazoles fusionados tales como las pirazoloquinazolinas han presentado gran atención en elcampo médico y especialmente en el área del cáncer, ya que se comportan como inhibidores deenzimas, como la aurora kinasa, responsable del correcto funcionamiento de los centrosomas enel proceso de multiplicación celular.2

En este trabajo se presenta la síntesis y estudio de la separación del par regioisoméricopirazoloquinazolínico (reportado en la literatura), que se obtiene a partir de 5-aminopirazoles y 2-acetilciclohexanona. El desarrollo del proyecto se llevará acabo utilizando radiación microondaspara inducir las reacciones y técnicas cromatográficas tales como HPLC y CCD. La caracterizaciónde los productos purificados por HPLC se llevó a cabo por RMN 1H, gracias a una señal particularque presenta este tipo de estructura.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo General

Sintetizar la mezcla regioisomérica tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas y tetrahidropirazolo[5,1-

b]quinazolinas. Y empleando cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) bajo condicionessemipreparativas, intentar llevar a cabo la separación de la mezcla correspondiente.

2.2. Objetivos Específicos

• Realizar la ciclocondensación bicomponente entre 5-amino-1H-pirazoles y 2-acetilciclohexanona, con el fin de formar la mezcla regioisomérica de pirazoloquinazolinas.

• Hacer el seguimiento de las reacciones para comprobar la obtención de las moléculaspretendidas empleando CCD y RMN.

• Estudiar la interacción entre las pirazoloquinazolinas con los diferentes tipos de disolventepara determinar la mezcla de separación ideal por HPLC analítico.

• Ajustar las condiciones de la separación por HPLC analítico a condiciones semipreparativase intentar optimizar estas condiciones para una serie completa.

2

3. ANTECEDENTES

3.1. Pirazoles y Sus derivados

Los pirazoles son moléculas que pertenecen a la serie diazólica. Se caracterizan por poseer unaestructura anular de 5 miembros compuesta por 3 átomos de carbono y 2 átomos de nitrógeno enposiciones adyacentes.1 Dentro de sus aplicaciones más frecuentes están el de servir como gruposfuncionales en los pesticidas.2 En la medicina, los pirazoles se han destacado por presentarpropiedades analgésicas, antinflamatorias3, antibacteriales4, y anticancerígenas5 entre otros.

Existen varios métodos de síntesis de derivados de pirazoles, pero principalmente son preparadosa partir de una reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre diazometano con un dipolarófiloacetilénico;6 o mediante compuestos 1,3-dicarbonílicos con derivados de hidracina (Esquema 1).7

CH2 N+

N-

CNH NNH

CN

+

R1

R

O

O + NH2 NH2 NNH

R1

R

1 23

45

6Esquema 1. Síntesis general de pirazoles

3.2. Aminopirazoles

Los 5-aminopirazoles representan un importante conjunto de moléculas que ha atraído unespecial interés debido a su largo historial de aplicaciones en la industria farmacéutica yagroquímica8. Su principal método de síntesis es por la interacción de hidracina con acrilonitrilos

β-sustituidos por un grupo de fácil desplazamiento X (Esquema 2).

R

CN

X

NH2 NH2+Reflujo, EtOH

N NH

NH2R

X= Cl, NH2, OH

78 9

R= CH3, C6H5, 4-CH3C6H4, 4-OCH3C6H4, 4-ClC6H4,4-BrC6H4, 4-O2NC6H4

Esquema 2. Síntesis de 5-aminopirazoles

Los aminopirazoles 9 se comportan como sistemas 1,3 binucleófilos de gran reactividad enreacciones de ciclocondensación con variedad de bielectrófilos (Figura 1). Estas aminas son muyutilizadas en la síntesis de otros heterociclos fusionados, tales como las pirazoloquinazolinas queson pirazolopirimidinas fusionadas a un anillo bencénico.

3

N NH

NH2R

NH

N

NH2R

9Figura 1. Tautomería de NH-aminopirazol

3.3. Pirazoloquinazolinas

El estudio de las pirazoloquinazolinas es bastante útil en química medicinal, ya que este tipo deestructura tiene potencial aplicación en tratamientos contra el cáncer.2 El método predilecto de

síntesis de pirazoloquinazolinas se basa en el empleo de 5-aminopirazoles con β-dicetonas cíclicasde 6 eslabones, como el trabajo reportado por Portilla y colaboradores (Esquema 3).10

NN N

R

CH3

Hr

NN N

R

CH3

Hr

1211

CH3

OO

NNH

NH2

R

NHN NH2

R

9

10

MW

+

Esquema 3. Síntesis general de pirazoloquinazolinas

Según el esquema anterior, por la propiedad tautomérica de los 5-aminopirazoles existe laposibilidad de formar la mezcla de pirazolo[1,5-a]quinazolinas 11 y pirazolo[5,1-b]quinazolinas 12.Según los reportes en la literatura,10 la mezcla de regioisómeros 11 y 12 fue imposible de separarpor métodos cromatográficos ordinarios, tales como CCD y CC, por lo que el uso de la técnica depurificación por HPLC sería útil si se logra estandarizar un método adecuado para ello.

3.4. Síntesis Inducida por Microondas

La síntesis química inducida por microondas es una poderosa herramienta que, aplicada a unamplio rango de reacciones químicas, ha permitido llevar a cabo importantes contribuciones talescomo: disminuir tiempos de reacción, obtener altos rendimientos, evitar la obtención deproductos colaterales y reducir procesos de purificación. Así mismo, la aplicación de esta forma deenergía dentro de los procesos químicos constituye una interesante oportunidad para desarrollartransformaciones novedosas y concretar reacciones que no tienen lugar bajo condicionesconvencionales.11

3.5. Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentesde una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografíalíquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la faseestacionaria. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente devidrio, la cual está rellena con la fase estacionaria. Luego de poner la muestra en la parte superior,se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de gravedad. Con el objeto de

4

aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de la fase estacionaria sefue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo trajo la necesidad de utilizar altas presionespara lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida dealta eficacia (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altaspresiones requeridas.12

La elución depende de varios aspectos como son la polaridad de la fase estacionaria, el tamaño deexclusión, etc. Cuando existe una fase estacionaria apolar y el disolvente es polar, quedaránretenidas las moléculas apolares que se encuentren en la muestra a separar, mientras que laspolares eluirán de la columna y viceversa. De esta forma, la separación se da dependiendo delgrado de polaridad de las moléculas de la disolución en cuestión. A continuación se presenta undiagrama de polaridades de los disolventes y de la fase estacionaria13

Figura 2. Polaridades de la fase móvil y estacionaria

Existen dos formas generales de separación por HPLC, preparativa y analítica. La primera se basa

en emplear cantidades muy pequeñas del analito (del orden de µg) con el objetivo de realizaranálisis espectroscópicos únicamente; se logra una muy buena separación pero prácticamente nose recupera nada del producto. Contrario a esta, la forma preparativa emplea grandes cantidadesde analito (orden 1g) con la ventaja de que se pueden recuperar los productos, aunque suseparación no sea tan buena como la analítica.

Dado que la cromatografía preparativa consume una gran cantidad tanto de muestra como deeluente, no es muy usual seguir esta vía como primera opción en una metodología experimental.Para realizar una optimización del método usualmente se hacía una separación analítica y luego seescalaba a una preparativa. Para solucionar estos inconvenientes, se desarrolló la técnica de HPLCsemipreparativo que sirve de puente entre estas dos formas de separación. Esta técnica presentaventajas respecto de sus predecesoras en el sentido que busca tener un alto rendimiento en laseparación y al mismo tiempo un buen grado de pureza en los compuestos separados. De estaforma, el HPLC semipreparativo emplea valores intermedios tanto de la cantidad de analito que seusa (del orden de los mg) como del tamaño de la columna para la separación. A continuación seexpone un gráfico que muestra la relación entre las tres técnicas de HPLC.9

5

Figura 3. Triangulo de velocidad, carga y eficiencia para la escogencia de un método en HPLC

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

De acuerdo a la literatura citada, se plantea la problemática a solucionar. La primera parte

consiste en la síntesis de la mezcla regioisomérica tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas 11 y tetra-hidropirazolo[5,1-b]quinazolinas 12 empleando 5-aminopirazoles 9 y 2-acetilciclohexanona 10 pormedio de una reacción inducida por radicación microondas (ver Esquema 3). La segunda parteconsistió en la separación de la mezcla regioisomérica por HPLC analítico y semipreparativo.

Se obtuvo por este método la mezcla regioisomérica 11 y 12 siguiendo el procedimiento descritoen la literatura,14 y la formación de los productos corroborada por CCD y RMN 1H. La variación delos sustituyentes R en la serie de regioisómeros formados es (ver además Esquema 3):

11 o 12(a-f) Ra CH3

b 4-BrC6H4

c 4-CH3C6H4

d 4-OCH3C6H4

e C6H5

f 4-ClC6H4

Tabla 1. Radicales empleados en los 5-aminopirazoles

Dada la inevitabilidad de la formación de la mezcla regioisomérica en el producto final, seevaluaron diferentes métodos de cromatografía y por último se estudió la separación por HPLCanalítico y semipreparativo. Esto con el objetivo de aislar las pirazoloquinazolinas obtenidas yrealizar así un análisis espectroscópico de las moléculas separadas (con RMN 1H), y con ellodeterminar si la mezcla se logró separar con los métodos estudiados.

6

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Síntesis de las pirazoloquinazolinas

A continuación se presenta la tabla de propiedades físicas encontradas para cada una de laspirazoloquinazolinas sintetizadas:

11 + 12(a-g) P.f. (°C) Rend.(%)11,12 a 195-205 9711,12 b 166-179 7511,12 c 185-189 9711,12 d 160-195 9111,12 e 141-147 8311,12 f 199-202 89

Tabla 2. Resultados de puntos de fusión y rendimiento para la mezcla 11(a-f)/12(a-f).

Todas las reacciones se llevaron acabo en cantidades equimolares de 10 y 9(a-f) e inducidas pormicroondas durante 7-10 minutos y fueron seguidas por CCD (los puntos de fusión fueroncomprobados en la literatura14). La mezcla regioisomérica 11c/12c se tomó como referencia parael desarrollo del análisis espectroscópico por RMN 1H (todos los demás compuestos dieron señalesmuy similares):

8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5ppm

1.042.192.00

6.77

6.80

7.207

.22

7.26

7.28

7.30

7.84

7.877

.94

7.96

Figura 4. Región de importancia del espectro RMN 1H para la mezcla 11f/12f

Como es posible observar, el área de todas las señales esta duplicada debido a la presencia de lamezcla de las dos pirazoloquinazolinas. Lo característico de este espectro de RMN 1H es el Hpirazólico (Hr ver Esquema 3), que no solo sirve para demostrar la formación de los isómeros 11 y12, sino que por medio del valor de la intensidad de la señal en el espectro es posible tener unacuantización a simple vista de la mezcla regioisomérica. La posición de la señal para los dosisómeros se encuentra, para todos los productos, en aproximadamente 6-7 ppm y según losresultados, fue imposible determinar a qué tipo de isómero (11 o 12) corresponden las señalesque se desdoblan, ya que se requiere tener mayor cantidad de muestra para llevar a cabo lacaracterización completa de los dos isómeros que en principio se lograron separar por HPLCsemipreparativo.

7

5.2. Separación de la mezcla regioisomérica 11(a-f)/12(a-f)

5.2.1. Separación fase Analítica

Dada la condición de mezcla regioisomérica del producto obtenido, corroborado esto porespectroscopía RMN, se procedió a estudiar la posibilidad de separación primeramente pormétodos convencionales. Así, se comenzó observando el comportamiento empleando la técnicade cromatografía en placa delgada resultando la siguiente tabla de Rf’s (Tabla 3).

DCM/CiclohexanoProducto 1:1 3:1 6:1 DCM11,12 a 0,00 0,00 0,00 21,3511,12 b 12,74 15,14 14,60 100,0011,12 c 9,15 11,35 11,41 97,7311,12 d 5,08 4,32 4,76 93,8911,12 e 7,27 10,81 14,38 96,5911,12 f 12,66 14,59 14,49 95,89

Tabla 3. Resultados de Rf’s para la mezcla 11(a-f)/12(a-f).

Como es posible observar, a pesar de que se emplearon varias mezclas de disolventes condiferentes polaridades, y una placa considerablemente larga (20 cm), no se registró unaseparación virtual del producto; aun así, para que los resultados fueran definitivos en cuanto a suconclusión, se permitió que la placa corriera varias veces (para las ultimas mezclas de disolventes)dejándola incluso 12 – 15 horas para determinar si lograba haber separación (Los disolventes en laplaca normal se demoraban de 1 – 2 horas en recorrer la longitud total). Finalmente, después detodos los ensayos realizados, se pudo inferir que por este método es imposible la separación delos regioisómeros en cuestión.

Dado que la técnica CCD es un indicio a pequeña escala de lo que sucede al emplear cromatografíade columna, y a que en la bibliografía ya había un reporte de que era imposible la separación delos regioisómeros por este método14, no se desarrolló como tal este montaje.

Una vez probadas las técnicas convencionales que se tenían a disposición en el laboratorio, seprocedió sin más dilaciones con la separación por HPLC. Para tal fin, se empleó primeramente una

columna C18, tamaño de partícula 5µ, de 150mm de largo y 4.6mm de diámetro interno, marcaEconosphere, característica para efectuar la separación analítica del compuesto que, permite enúltimas, determinar la viabilidad del procedimiento por esta técnica.

A continuación se presentan los cromatogramas para las diferentes mezclas de disolventesrealizadas en la fase analítica (todos los compuestos fueron disueltos en ACN con una

concentración de 0.33 mg/mL y el volumen de inyección fue de: 20µl) (Figura 5).

8

Figura 5. Cromatogramas de la mezcla 11c/12c.

En general, los comportamientos frente a cada mezcla de disolventes fue mas o menos parecida,sin embargo, para algunos productos, la separación era mucho mejor con determinadascombinaciones (como la ACN/H2O 2:1, en tiempo total de retención y tiempo de separación entrepicos) aunque en otras no se registraba nada (caso de la THF/H2O 2:1 y ACN/MetOH 1:1).

Se observó también el comportamiento de la separación respecto al flujo de disolvente, dando deforma general un ensanchamiento en las curvas y una mejor separación (cuando la hubo), paratodos los productos (figura 6).

a. b. c.

d. e. f.

g.

9

Figura 6. Comportamiento de la cromatografía respecto al flujo de disolvente de la mezcla 11c/12c

En la fase analítica se pudo observar de forma particular que los cromatogramas de todos losproductos, en los que se apreciaba separación, presentaban una gaussiana de área mayor y una demenor en proporción de ~1:0.83 respectivamente. Para todo tipo de fase estacionaria se deduceque la molécula más soluble eluirá primero mientras que la otra será retenida en la superficie de lafase estacionara. De esta forma, es posible establecer a priori la correspondencia en elcromatograma con los regioisómeros 11/12 (Esquema 3). Uno de los regioisómeros es angular, loque impediría una menor solvatación respecto de la lineal por parte de las moléculas dedisolvente que es relativamente polar, en términos prácticos esto hace que el lineal sea mássoluble y eluya primero que el angular, dado que la fase estacionaria es apolar. Esta deducción fueestablecida de acuerdo a resultados de estructuras análogas ya reportadas,15 donde en las señalesde los espectros se observa algo muy similar a lo que sucede en los cromatogramas.

5.2.2. Separación fase semipreparativa

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la fase analítica, las mezclas que mejor separaronpara todos los productos fueron las binarias ACN/H2O (2:1), ACN/H2O (1:1), y la ternariaTHF/ACN/H2O (1:2:3) (ver figura 5). Para la fase semipreparativa se empleó una columna C18, de

tamaño de partícula 10µ, de 100mm de largo y 10mm de diámetro interno, marca Econosphere.Se comenzó evaluando el comportamiento de las mezclas binarias sin observarse separaciónalguna. Se procedió entonces a probar con la mezcla ternaria THF/ACN/H2O (1:2:3) resultando unaseparación apenas perceptible en la mezcla regioisomérica. Las pruebas se realizaron con lamezcla 11c/12c por presentar gran similitud en comportamiento con las demás mezclas según losresultados de la fase analítica (Figura 7).

10

Figura 7. Resultados de la mezcla THF/ACN/H2O 1:2:3 con la columna semipreparativa.

Como se observa la separación no se efectúa de manera marcada como en el caso analítico. Estose atribuye a dos razones principales: la primera es al hecho de que la columna empleada para lafase semipreparativa es marcadamente diferente de la analítica, tanto en dimensiones (diámetrointerno y altura) como en tamaño de partícula; lo que para efectos prácticos se traduce como unadisminución del área de contacto total entre el sustrato y la fase estacionaria. Y la segunda, radicaen el hecho de que es muy probable que, dada las características propias de la columna, una de lasmoléculas (probablemente la lineal que como fue teorizado eluiría más rápido) se retenga en todala fase estacionaria, modifique su superficie, y haga que la segunda no se adhiera del todo a estafase sino que se mantenga en forma de mezcla con el primer regioisómero, hasta que la primeraeluya completamente. Esto último es muy común en columnas semipreparativas con tamaño departícula elevado, y una de las razones principales de que la separación se vea como un efecto de“overwhelming” en el cromatograma (sobrecarga evidenciada por una expansión horizontal delpico gaussiano).

La forma de determinar el grado de separación se hizo por espectroscopía UV-Vis (detectorShimadzu SPD M20A), observando el valor de los máximos y mínimos representativos para las dosgaussianas que fueron registrados al realizar la fase analítica (puesto que allí se obtuvo unaseparación cuasi completa). Estos valores se tomaron como referencia para conocer las regionesde las colas hasta donde se encontraba una molécula individual. (Figura 7.1 ver siguiente página)

Se evaluaron otras mezclas ternarias variando la proporción de los disolventes para determinar lade mejor separación. Se probaron las mezclas: THF/ACN/H2O 1:2:3, 1:2:4, 1:2:5, 1:3:2 yTHF/Met/H2O 1:2:3 y 1:4:3 con resultados diversos, aunque las que mejor separaron fueron lasque contenían ACN y H2O, con una mayor proporción de esta última (probablemente porque lamuestra es mas soluble en ACN que en MetOH, y el H2O, al ser muy polar, permite una mejorretención en la fase estacionaria que es apolar).

11

Figura 7.1. Identificación de los regioisómeros por espectroscopía UV en la fase analítica.

5.2.2.1. Optimización de las condiciones de separación

Con el objetivo de optimizar la separación de los regioisómeros, con las tres mezclas deTHF/ACN/H2O que presentaron mejor separación, se evaluó la mejor analizando la relación deárea separada sobre la total (la primera se refiere al área bajo la curva durante el intervalo detiempo en el que se encontraba una molécula individual según el UV), obteniéndose los siguientesresultados:

THF/ACN/H2O %area1:2;3 9,31:2;4 9,71:2:5 3,4

Tabla 4. Relaciones de área de separación respecto de la total.

De acuerdo a los resultados anteriores se escogió la mezcla THF/ACN/H2O 1:2:4 por ser la demayor relación de área, y porque además, genera una comparativa disminución de disolventeorgánico aminorando los costos de la separación. La segunda parte de la optimización tuvo quever con el volumen de inyección y con la concentración de inyectado. Para ello se tuvieron encuenta primero diferentes volúmenes de inyección, y una vez determinado el mejor (a partir de lamayor relación de área), se compararon diferentes concentraciones para conocer la más óptima.Los resultados obtenidos se presentan en las siguientes tablas:

12

[] (mg/mL) 1,43 Vinj (mL) 1

Vinj (mL) %area mg/corrida [] (mg/mL) mg/corrida5 0,4 0,028 1,43 0,1442 3,6 0,103 1,71 0,160

1,5 4,2 0,089 2,14 0,170

1 10,1 0,144 3,1 0,139

0,3 10,7 0,046Tablas 5 y 6. Determinación del volumen y concentración de inyectado óptimos.

5.2.2.2. Caracterización de los regioisómeros

Una vez obtenidos el volumen y la concentración apropiada de inyección, se procedió a recolectarlas fracciones para aislar los regioisómeros que, según el espectro Uv-Vis, se encontraban en lasdos colas de la gaussiana (se tomaron 105 fracciones para recolectar aproximadamente 17 mg demuestra que coincide con la sensibilidad del equipo RMN que se usó para la caracterización). Altener suficiente cantidad de muestra, se realizó un espectro de RMN 1H para caracterizar losproductos obtenidos en la separación, y se analizó el grado de separación de los mismos de lamezcla regioisomérica (figura 8 y 9).

8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2ppm

0.992.382.00

CH-Pirazol

Chloroform-d

H-ArH-Ar

7.95

7.85

7.30

7.26

7.21

6.80

Figura 8. Espectro RMN 1H de la primera cola (regioisómero supuesto como el lineal)

8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3ppm

1.112.742.00

Chloroform-d

6.80

7.18

7.26

7.81

7.90

Figura 9. Espectro RMN 1H de la segunda cola (regioisómero supuesto como el angular).

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Como es posible observar, existe un aumento en la relación de intensidades de señal quecorresponde al hidrógeno del pirazol del que se supone como el regioisómero lineal (figura 8), y alsupuesto como angular (figura 9) (ver último párrafo parte 5.2.1). Esto permite inferir que si huboseparación de la mezcla aunque no fue del todo completa, o al menos para la extracción de laprimera cola, porque según lo que ilustra el espectro de la figura 9 aunque existe una señalpredominante, aún se observa una pequeña al lado de esta que corresponderá al hidrógenopirazólico de la otra molécula.

La razón de esto último se encuentra en el hecho de que se recogían fracciones en el límite entremolécula individual y mezcla, según lo que el UV-Vis registraba. El problema en este punto radicaen que, a pesar que el espectrómetro no detecta la señal de la otra molécula en el límite (por serde absorción muy parecida y porque lo que toma es un promedio de las longitudes de onda deabsorción), ya existe una pequeña fracción del otro regioisómero, pero esta cantidad no alcanza aser lo suficiente para que el promedio ponderado de las absorbancias produzca un cambio en elregistro del detector (que solo mostraba el resultado en números enteros). Este principio quedabien ejemplificado en la siguiente figura:

Figura 10. Diagrama de cruce entre cromatogramas de los dos.

Por último, se puede concluir que sí hubo separación de la mezcla regioisomérica por HPLC yaunque los resultados fueron mejores para el caso analítico, se pudieron aislar en parte laspirazoloquinazolinas por HPLC semipreparativo, algo que no se pudo hacer con los métodosconvencionales de separación; aunque se recomienda, para mejorar la separación, emplear unacolumna con mejor resolución y con menor tamaño de partícula.

Solo queda por decir que, como una forma de continuación a este proyecto, se podría llegar adeterminar algún tipo de actividad biológica sobre las pirazoloquinazolinas separadas en uneventual trabajo de investigación futuro, dada su amplia aplicación en el campo de lostratamientos anticancerígenos como inhibidores de la aurora kinasa.2

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6. CONCLUSIONES

• La serie de pirazoloquinazolinas objetivo fue sintetizada y se observó la formación de la mezclaregioisomérica (corroborada por RMN 1H). Se compararon sus puntos de fusión con los de laliteratura.

• La mezcla regioisomérica para toda la serie química sintetizada demostró ser imposible separarpor los métodos de cromatografía convencional (CCD y columna) debido a la gran similitud queexistía en las características físicas de las dos moléculas regioisoméricas.

• Al emplear la técnica de HPLC analítico se logró una cuasi separación de los regioisómeros,evidenciado esto por la formación de dos gaussianas muy bien definidas en proporción 1:0.83,lo que permitió que se lograran distinguir los isómeros por espectroscopía UV-VIs. No obstante,la alta definición en la separación no sucedió al emplear el método semipreparativo, debido aque existían diferencias significativas en cuanto a las características propias de las columnasempleadas para cada método.

• A pesar de los resultados poco eficientes de la columna semipreparativa, se logró optimizar almáximo la separación con la discriminación de mezcla de disolventes, volumen de inyección yconcentración del inyectado. Esto permitió que se pudieran aislar fracciones de cada moléculaidentificadas por su espectro UV y que se lograran caracterizar parcialmente por RMN 1H.

• Al analizar el espectro RMN 1H de las moléculas separadas, se logró evidenciar la separación delas moléculas por el cambio en la intensidad de las señales del espectro. Sin embargo laseparación no fue del todo completa para una de ellas, debido a la sensibilidad en el detectorde UV-Vis que no permitía distinguir con claridad la ponderación de los isómeros en el límiteentre molécula individual y mezcla.

• De acuerdo a los resultados obtenidos en general, se pudo establecer que emplear HPLC es elmétodo idóneo para separar estos regioisómeros, sin embargo se recomienda emplear unacolumna semipreparativa con mejores especificaciones en cuanto a dimensiones (≥ 150 mm) y

tamaño de partícula (≤ 5 µm) para obtener mejores resultados.

7. SECCION EXPERIMENTAL

7.1. Instrumentos y Condiciones

Todas las reacciones inducidas por microondas se llevaron a cabo en un horno microondas parasíntesis marca: CEMDiscover Modelo 908005. Los puntos de fusión fueron tomados en unfusiómetro Fischer Scientific. La separación cromatográfica por HPLC se realizó en un equipoShimadzu modelo LC-6AD con arreglo de diodos Modelo SPD-M20A. Los espectros de RMN 1Hfueron tomados en un RMN Eft spectrometer de Anasazi Instruments, Inc. de 90MHz empleandoTMS como estándar interno y DMSO-d6 o CDCl3 como disolventes.

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7.2. Disolventes

En todos los casos de síntesis los disolventes fueron utilizados grado analítico y HPLC cuando fue elcaso de los experimentos por HPLC: Etanol, Hexano, Dioxano, Acetato de Etilo, Agua, THF, Metanoly Acetonitrilo. Los cuatro últimos disolventes se utilizaron grado HPLC

7.3. Reactivos y Precursores.

7.3.1. Reactivos y precursores comerciales.

HCl, ácido acético glaciar, Bromo, Cianuro de Potasio, acetofenona, p-bromoacetofenona, p-metilacetofenona, p-metoxiacetofenona, p-cloroacetofenona, 2 acetilciclohexanona.

7.3.2. Precursores Sintetizados

7.3.2.1. Síntesis de los Acrilonitrilos (procedimiento general)

Para la síntesis de la serie de acrilonitrilos como precursores de los 5-aminopirazoles, es necesario

realizar una sustitución nucleofílica sobre el carbono α de la respectiva acetofenona. Para ello esnecesario que la misma tenga en esa posición un buen grupo saliente para que se realice lasustitución, Ej. El bromo. Para generar el respectico bromuro de aroilo se realizó el siguienteprocedimiento:

En un balón de fondo plano se añadió la acetofenona con ácido acético glaciar en proporción 1:2m/v. Luego, bajo agitación constante, se añadieron cantidades equimolares de Br2 por espacio de30 minutos. Al terminar la adición, se enfrió la mezcla en baño de hielo manteniendo la agitacióndurante 1 hora, se filtró el producto y se lavó con ETOH hasta quedar incoloro.

Para la síntesis de los acrilonitrilos 7(a-f) se tomaron cantidades equimolares del respectivobromuro de aroilo con KCN y se disolvieron en etanol, en un balón conectado a sistema de reflujo.La solución se calentó a reflujo durante 2 horas y luego se colocó en un baño de hielo durante 15minutos. El precipitado se filtró y los cristales precipitados se colectaron por filtración.

7.3.2.2. Síntesis de los 5-aminopirazoles 9(a-f) (procedimiento general)

En un balón fueron añadidos hidrato de hidracina y el respectivo acrilonitrilo 7(a-f) en proporciónmolar de 3:1, con etanol en sistema de reflujo con agitación constante. La mezcla fue calentada enreflujo con agitación constante durante 4h y luego se le adiciono agua en proporción 2.5:1 v/vrespecto del etanol añadido. El precipitado se filtró, y se recristalizó en etanol.

7.4. Síntesis de tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas y tetrahidropirazolo[5,1-b]quinazolinas

En un tubo de microondas fueron añadidas cantidades equimolares del 5-amino pirazol 9(a-f)(1mmol) con 2 acetil ciclohexanona 10. La reacción fue llevada a cabo por inducción en MW, y elproducto fue triturado y lavado con abundante etanol, el sólido recuperado se filtró y serecristalizó de etanol.

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8. BIBLIOGRAFÍA

1 Eicher, T.; Hauptmann, S. The Chemistry of Heterocycles: Structure, Reactions, Syntheses, andApplications. 2nd ed. 2003, Wiley-VCH.

2 Talele, T. T.; McLaughlin, M. L. J Mol Graph Model. 2008, 26, 1213-1222.

3 Pathak, R.; Bahel, S. J. Indian Chem Soc. 1980, 57, 1108-1109.

4 Daidone, G.; Raffa, D.; Musiu, C.; Milia, C. Eur. J. Mrd. Chem. 1998, 33, 375-378.

5 a) Mortlock, A. A.; Foote, K.M.; Heron, N. M.; Jung, F. H.; Pasquet, G.; Lohmann, J. J.; Warin, N.;Renaud, F.; De Savi, C; Roberts, N. J.; Johnson, T. J Med Chem. 2007, 50(9), 2213-24. b) Foote, K.M.; Mortlock, A. A.; Heron, N. M.; Jung, F. H.; Hill, G. B.; Pasquet, G.; Brady, M. C.; Green, S.;Heaton, S. P.; Kearney, S.; Keen, N. J.; Odedra, R.; Wedge, S. R.; Wilkinson, R. W. Bioorg MedChem Lett. 2008 18(6), 1904-9.

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7 Wiley, R. H.; Hexner, P.E. Org Synth. 1963, 4, 351-353.

8 a) Elguero, J. In Comprehensive Heterocyclic Chemistry; Katritzky, A. R.; Rees, C. W., Eds.;Pergamon Press: Oxford, 1984; Vol. 5, pp 167-03. b) Elguero, J. In Comprehensive HeterocyclicChemistry II; Katritzky, A. R.; Rees, C. W.; Scriven, E. F. V., Eds.; Pergamon Press: Oxford, 1996;Vol. 3, pp 1-75.

9 Marvin C. McMaster. HPLC A Practical User´s Guide Second Edition. Wiley 2007, p. 137-139

10 Portilla, J. A. Sintesis y Caracterización de Nuevos 5-Aminopirazoles y su reacción en condicioneslibre de disolvente con cicloalcanonas 1,3 bielectrofilicas y analogos. Santiago de Cali. (2007) p.33.

11 Hayes B. L. Microwave Synthesis. Chemistry at the Speed of Light. CEM Publishing:Matthews, NC, 2002.

12 Hung, L. B.; Parcher, J. F.; Shores, J. C.; Ward, E. H. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110(11), 1090.

13 Tinoco, Sauer.; Wang & Puglisi. Physical Chemistry, Prentice Hall 2002 p. 134.

14 Portilla, J. A., Sintesis y Caracterización de Nuevos 5-Aminopirazoles y su reacción encondiciones libre de disolvente con cicloalcanonas 1,3 bielectrofilicas y analogos. Santiago deCali. (2007) p. 107-108.

15 Portilla, J.; Quiroga, J.; Cobo, J.; Glidewell, C. Acta Cryst. 2005, C61, 398-403.