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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Alumno: Daniel Sánchez Puerto
Julio, 2020
Sistema CRISPR/Cas9 y su aplicación a la edición
dirigida de genomas
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UNIVERSIDAD DE
JAÉN
Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Facultad d
e C
iencia
s E
xperim
enta
les
Sistema CRISPR/Cas9 y su aplicación a la edición
dirigida de genomas
Alumno: Daniel Sánchez Puerto
Julio, 2020
3
RESUMEN
CRISPR/Cas9 es un sistema que forma parte de la defensa
inmunitaria de bacterias y arqueas frente a las infecciones víricas. Está
compuesto por una proteína específica denominada Cas9 y un ARN
guía que, al ser combinados, son capaces de identificar, cortar y
destruir una secuencia de ADN vírico. Debido a esta capacidad y a su
sencillez es actualmente uno de los más importantes avances en la
edición genómica, teniendo sus aplicaciones gran utilidad en el ámbito
de la terapia génica.
En esta revisión, además de lo descrito anteriormente,
hablaremos del funcionamiento de este sistema, de su estructura y
composición, así como de los inconvenientes que presenta y de las
implicaciones éticas existentes alrededor de sus posibles aplicaciones.
Palabras clave: CRISPR/Cas, secuencias CRISPR, Cas9, ARN guía,
edición genómica, terapia génica.
ABSTRACT
CRISPR / Cas9 is a system that forms part of the immune
defense of bacteria and archaea against viral infections. It is made up
of a specific protein called Cas9 and a guide RNA that, when combined,
are capable of identifying, cutting and destroying a viral DNA sequence.
Due to this capacity and its simplicity, it is currently one of the most
important advances in genomic editing, having its applications great
utility in the area of gene therapy.
In this review, in addition to what is described above, we will talk
about the operation of this system, its structure and composition, as well
as the drawbacks it presents and the ethical implications existing
around its possible applications.
Key words: CRISPR/Cas, CRISPR sequences, Cas9, guide ARN,
genomic edition, gene therapy.
4
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 5
2. OBJETIVO ................................................................................................. 6
3. ANTECEDENTES ...................................................................................... 7
3.1 Recombinación homóloga (Homology directed repair, HDR) .............. 7
3.2 Nucleasas con dedos de Zinc (Zinc Fingers Nuclease, ZFN) .............. 9
3.3 TALEN (Transcription activator-like effector nucleases) .................... 10
4. El sistema CRISPR/Cas ......................................................................... 12
4.1 Origen y descubrimiento del sistema ................................................. 12
4.2 Funcionamiento ................................................................................. 13
4.3 Tipologías .......................................................................................... 15
4.4 Composición y estructura .................................................................. 17
5. EL SISTEMA CRISPR/CAS9 EN LA EDICIÓN DIRIGIDA DE GENOMAS............................................................................................... 19
5.1 Funcionamiento de la técnica ............................................................ 19
5.2 Aplicaciones ...................................................................................... 20
5.2.1 Inserciones, deleciones e inversiones ............................................ 20
5.2.2 Terapia génica ............................................................................... 22
5.2.3 Imaging .......................................................................................... 24
5.2.4 Edición múltiple .............................................................................. 25
5.2.5 Cáncer ............................................................................................ 25
5.2.6 Activación y suscripción transcripcional ......................................... 26
5.2.7 Coronavirus .................................................................................... 27
5.3 Posibles problemas ........................................................................... 30
5.3.1 Cortes Off-Target ........................................................................... 30
5.3.2 Autoinmunidad ............................................................................... 30
6. IMPLICACIONES ÉTICAS DEL SISTEMA CRISPR/Cas........................ 31
7. DISCUSIONES ........................................................................................ 32
8. CONCLUSIONES .................................................................................... 32
9. REFERENCIAS ....................................................................................... 33
5
1. INTRODUCCIÓN
La comunidad científica ha experimentado un aumento
exponencial en su interés por la edición genómica en las últimas
décadas. Sin duda, el descubrimiento de la estructura del ADN en 1953
por James Watson y Francis Crikc marca el inicio del cambio
experimentado en ciertas áreas de la ciencia, especialmente la
genética (Watson, J.D., & Crick, 1953).
Este creciente interés, acaba derivando en la aparición de
nuevas disciplinas, como puede ser la ingeniería genómica. Esta
disciplina debe ser entendida como un tipo de ingeniería genética
en la que el ADN es insertado, eliminado o reemplazado en el
genoma de un organismo utilizando enzimas del tipo nucleasas, que
son denominadas “tijeras moleculares” (Lacadena, J.R, 2017).
La ingeniería genómica nos ha proporcionado numerosa
información sobre los genes, cuya identificación, añadida al
conocimiento de sus estructuras y funciones, han posibilitado la
identificación de muchas enfermedades ligadas a ellos y, por lo tanto,
la aparición de tratamientos efectivos que revirtieran sus efectos.
Uno de los momentos más importantes en la búsqueda de
información sobre la secuencia de genes y genomas llegaría con el
Proyecto Genoma Humano (PGH), que buscaba la obtención de un
mapa físico y funcional de nuestro genoma, siendo la primera gran
incursión de las comunidades de investigación biológica y médica en
la "gran ciencia" (Collins, Morgan & Patrinos, 2003).
Esta información, unido al uso de las enzimas tipo nucleasas
(tijeras moleculares) comentado con anterioridad, ha derivado en la
aparición de diversos métodos de edición genómica basados en el
corte del genoma mediado por estas enzimas, como pueden ser las
nucleasas de dedos de zinc (ZFN) o las nucleasas efectoras de tipo
activador de la transcripción (TALEN), o mediado por ARN, como
ocurre en el sistema CRISPR/Cas9, del cual tratará este trabajo.
6
CRISPR/Cas9 ha sido la técnica de ingeniería genética que ha
tenido un desarrollo más rápido en los últimos años. Se basa en la
Cas9, una endonucleasa guiada por ARN que, a su vez, tiene su
fundamento en el sistema inmune bacteriano CRISPR, acrónimo del
inglés “Clustered regularly interspaced short palindromic repeats”, es
decir, repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente
interespaciadas.
El uso de esta técnica ha redefinido, de manera radical, el
panorama de la edición genómica. Ello se debe, principalmente, a
cuatro características fundamentales que posee el sistema
CRISPR/Cas9: especificidad, eficiencia, accesibilidad y versatilidad
(Santaló-Pedro J., 2017). Además, debemos destacar que, a diferencia
de ZFN y TALEN, las nucleasas guiadas por ARN están basadas en
un apareamiento entre un ARN artificial y su diana específica en el ADN
(Sander & Joung, 2014).
Por lo expuesto anteriormente, podemos afirmar sin miedo a
equivocarnos que una tecnología como CRISPR/Cas9 está llamada a
revolucionar diversos campos de la ciencia y la tecnología, gracias
principalmente a sus aplicaciones en terapia génica, en la activación y
suspensión transcripcional o en la edición múltiple. En definitiva, y
gracias a este sistema, las secuencias de ADN dentro del genoma
endógeno y sus salidas funcionales ahora se editan o modulan
fácilmente en prácticamente cualquier organismo de elección (Hsu,
Lander & Zhang, 2014).
2. OBJETIVOS
El principal objetivo de esta revisión bibliográfica es analizar el
estado en el que se encuentra actualmente el sistema CRISPR/Cas9
y, por ende, sus aplicaciones en la ingeniería genética, desde las más
conocidas, como la terapia génica, a las más recientes, como su uso
en la detección del Sars-CoV-2. De igual manera, trataremos su
funcionamiento y los inconvenientes que presenta. Además, no
7
pasaremos por alto el debate ético que existe sobre el uso de esta
técnica.
3. ANTECEDENTES
La primera técnica de manipulación genética, nacida en los años
70, fue la recombinación homóloga directa (HDR por sus siglas en
inglés). Una técnica cuyo principal problema fue su baja eficacia en
organismos eucariotas, por lo que no es una buena opción si queremos
modificar de forma rápida el genoma de alguna especie animal o
vegetal, necesitando además unos procedimientos especialmente
largos y no precisamente sencillos (Kim, 2016). Es por ello, que
surgieron nuevas técnicas que vinieron a paliar las carencias que
presentaba la recombinación homóloga directa, fueron principalmente
las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y las TALEN, nucleasas
efectoras de tipo activador de las transcripción.
Figura 1. Técnicas de edición genómica a lo largo del tiempo (Kim, 2016).
3.1 RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA (Homology directed repair,
HDR).
Fue una de las primeras técnicas utilizadas en la edición
genómica. Podríamos definir la recombinación homóloga como un
proceso metabólico del ADN, encontrado en todas las formas de vida,
que proporciona reparación o tolerancia en los daños complejos del
ADN (huecos de ADN, roturas de doble cadena de ADN (DSB) o
8
enlaces cruzados entre cadenas (ICL), entre otros). Además de su
papel en la preservación del genoma, la recombinación homóloga
desempeña un papel destacado en la duplicación fiel del genoma,
proporcionando un soporte crítico para la replicación del ADN y el
mantenimiento de los telómeros (Li & Heyer, 2008).
Figura 2. Modelo de recombinación homóloga (Santoyo, 2008).
La manipulación genética mediante el mecanismo de
recombinación homóloga directa es una técnica que podemos dividir
en tres fases.
En la primera de ellas, una recombinasa específica del sitio se
expresa a través de un transgén. Posteriormente, es una
endonucleasa, también específica del sitio, la que se expresa. Y
finalmente, nos encontramos un constructo donante transgénico
(portador de sitios de reconocimiento para la endonucleasa) homólogo
al ADN del lugar al que se va a dirigir. Mediante esta técnica podemos
seleccionar, y mutar, genes identificados solo por secuencia, cuyas
funciones serán estudiadas con posterioridad (Rong et al.,2002).
9
3.2 NUCLEASAS DE DEDOS DE ZINC (Zinc Fingers Nucleases,
ZFN).
La existencia de los dedos de zinc fue descubierta en
numerosas proteínas de organismos eucariotas a principios de los
años 80 (J. Miller, Mclachlan & Klug, 1985). Un dedo de zinc tiene una
longitud aproximada de 30 aminoácidos, encontrándose los átomos de
zinc en unos 12 de ellos. Existen muchas variantes y también son los
responsables de diversas funciones, como puede ser dar estabilidad a
la estructura de las proteínas o interaccionar, de manera específica,
con ADN y ARN.
Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) están formadas debido a
la fusión que se produce entre varios dedos de zinc y el dominio de
rotura del ADN no específico de la endonucleasa de restricción Fokl.
Su estructura modular las ha convertido en un atractivo para el
diseño de proteínas personalizadas de unión a ADN. La clave para la
aplicación de proteínas de dedos de zinc en el reconocimiento
específico de ADN viene dada por el desarrollo de matrices no
naturales en las que podemos encontrar más de tres dominios de
dedos de zinc. Gracias a ello, secuencias específicas pudieron dirigirse
al genoma humano por primera vez (Gaj, Gersbach & Barbas, 2013).
Figura 3. Estructura de los efectores tipo dedo de zinc.
10
3.3 TALEN (Transcription activator-like effector nucleases).
Se trata de una técnica de ingeniería genética basada en las
enzimas nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción, TALEN
por sus siglas en inglés. Estas enzimas pueden ser diseñadas para
cortar, en el genoma, secuencias específicas de ADN.
Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción
(TALEN), consisten en un dominio de unión de ADN específico
diseñado (efectores TALE) y un dominio de escisión FokI. Debido a la
simplicidad del código de reconocimiento de ADN y su ensamblaje
modular, los TALEN pueden actuar como tijeras de ADN molecular
personalizables que inducen roturas de doble cadena (DSB) en una
ubicación genómica dada. Por lo tanto, proporcionan un enfoque
valioso para modificaciones específicas del genoma (Chen & Gao,
2013).
Figura 4. Representación del mecanismo de acción de TALEN (Angaji & Beikzadeh,
2019).
11
Los efectores TAL son proteínas que se secretan, al infectar
plantas, por parte del género de bacterias Xanthomonas,
especializadas en el uso de esta estrategia (Li et al., 2012). Se
introducen en el citoplasma celular y, desde ahí, transportadas al
núcleo de la célula vegetal.
El dominio mediante el cual se unen al ADN está formado por
una secuencia repetida que contiene de 33 a 34 aminoácidos,
presentando variaciones en los aminoácidos 12 y 13. Serán estos
aminoácidos los que determinen que en la secuencia de ADN se
reconozcan los nucleótidos específicos. Son conocidos como
diresiduos de repetición variable, o RVD por sus siglas en inglés (Lau
et al., 2014).
Para efectuar la técnica, y una vez que los dominios de corte y
de unión han sido ensamblados a una secuencia específica de ADN,
se insertan en plásmidos que, habiendo seleccionado previamente las
células de interés, son transfectados a ellas. TALEN su puede utilizar
también en la edición de genes a través de inducción de cortes de
doble hebra, respondiendo las células a ellos mediante mecanismos
de reparación.
El mecanismo de reparación de la unión de extremos no
homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés) actúa uniendo
directamente el ADN sin necesidad de que haya superposición de
secuencias para el reconocimiento. Este mecanismo de reparación
provoca cambios aleatorios en el sitio de corte mediante inserciones
y/o deleciones, o reordenamiento cromosómico. Estos cambios
producidos por el NEHJ conducen, a menudo, a mutaciones de
desplazamiento de cuadros que pueden dar lugar a codones de parada
prematuros, lo que hace que los genes no funcionen (Malzahn, Lowder,
& Qi, 2017).
12
4. EL SISTEMA CRISPR/Cas
4.1 ORIGEN Y DESCUBRIMIENTO DEL SISTEMA
CRISPR es el acrónimo de Clustered Regurarly Interspaced
Short Palindromic Repeats, lo que en español podríamos traducir como
repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente
interespaciadas. La otra parte del nombre de este sistema, Cas, hace
referencia a un grupo de proteínas nucleasas, es decir, que forman
parte del núcleo celular. Fueron nombradas así debido a su asociación
a CRISPR (CRISPR associated system).
Podemos situar el origen de este sistema en la defensa
inmunitaria ante los virus que presentan las bacterias y las arqueas,
quienes incorporan ADN de patógenos, como bacteriófagos, entre
secuencias palindrómicas repetidas y, posteriormente, generan un
ARN llamado «ARNcr» al transcribirse (Lammoglia-Cobo et al., 2016).
Para ello, las bacterias poseen una proteína específica denominada
Cas9 que, junto con un ARN guía, identifica, corta y destruye la
secuencia de AND vírico (Vetcher, 2017).
En cuanto a su descubrimiento, debemos señalar que ya en el
año 1.987 se publica un artículo que habla por primera vez de unas
secuencias repetidas que se encontraban en el genoma de Escherchia
coli, si bien se consideró que no poseían ninguna función (Ishino et al.,
1987).
Años más tarde, en 1993, sería el científico español Francisco
Martínez Mojica, quien describiría la misma secuencia en otro tipo de
bacterias que habitaban en las salinas de Santa Pola (Alicante),
Haloferax mediterranei (Martinez Mojica, Juez & Rodriguez-Valera,
1993). Y, posteriormente, en el año 2000, tras descubrir la misma
secuencia en otro grupo de bacterias, las denominó como “short
regurarly spaced” (Martinez Mojica, Diez-Villaseñor, Soria & Juez,
2000).
13
Tan solo dos años después, y contando con el beneplácito de
Francisco Martínez Mojica, el científico Ruud Jansen descubre unos
genes asociados a las secuencias repetidas descritas por Martínez
Mojica y le da un nuevo nombre, pasando a denominarse “clustered
regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) (Jansen, van
Embden, Gaastra & Schouls, 2002).
De nuevo sería Martínez Mojica, en el año 2005, quien identifica
una similitud entre los espaciadores asociados a CRISPR, que
describió en el año 2002 Ruud Jansen, y el material genético que
poseían ciertos virus patógenos de bacterias (Gómez-Tatay & Mejías
Rodríguez, 2017). En ese momento se define a CRISPR como un
sistema que presentan las bacterias como defensa ante los virus,
siendo, además, heredable a las siguientes generaciones de bacterias
(Martinez Mojica, Diez-Villaseñor, Garcia-Martinez & Soria, 2005).
Finalmente, en el año 2012, con la realización, en un tubo de
ensayo, del primer “corte” gracias al sistema CRISPR/Cas9, nación la
posibilidad de poder realizar esto mismo en otro tipo de células, por
ejemplo eucariotas. Posteriormente, ese mismo año, Feng Zhang logró
realizar el primer corte utilizando CRISPR/Cas9 sobre el genoma de
una célula viva de mamífero (Cong et al., 2013).
4.2 FUNCIONAMIENTO
El funcionamiento del sistema CRISPR/Cas comenzó a
conocerse a finales de los años 2000, dividiéndose en 3 fases distintas:
Fase de adaptación.
Fase de expresión.
Fase de interferencia.
En la primera fase, o fase de adaptación, existe una parte del
ácido nucleico extraño que es incorporado al locus, concretamente a
la zona de espaciadores. De esta manera, el proceso es memorizado
14
para responder de manera eficaz ante futuras infecciones. En la
incorporación intervienen, degradando el ADN extraño, las propias
proteínas Cas, que reconocen la secuencia diana en el ácido nucleico
invasivo mediante el emparejamiento de bases con la cadena
complementaria de ADN bicatenario o ARN monocatenario, e induce
la secuencia escisión específica, evitando así la proliferación y
propagación de elementos genéticos extraños (Gasiunas et al., 2013).
En la segunda fase, o fase de expresión, tiene lugar las
transcripción de CRISPR/Cas. Este proceso da lugar a un precursor,
denominado CRISPR-ARN o pre-crARN, desembocando finalmente en
crARNs de reducido tamaño que complementan la secuencia de ADN
extraño.
En último lugar, la tercera fase o fase de interferencia, en la que
las proteínas Cas, usando como guía los crARNs obtenidos en la fase
de expresión, detectan las secuencias intrusas y las degradan
(Chylinski et al., 2013), realizando un corte específico que evita un
nuevo ataque del agente externo (Gasiunas, Barrangou, Horvath, &
Siksnys, 2012).
Figura 5. Ilustración dónde se reflejan las tres fases del mecanismo de defensa
de microorganismos llevado a cabo por CRISPR-Cas (Bhaya et al. 2011).
15
4.3 TIPOLOGÍAS
Basándonos en características como la organización de locus y
su contenido, la filogenia o la conservación de los genes, los sistemas
CRISPR/Cas pueden clasificarse en tres tipos diferentes (I, II y III),
conteniendo todos ellos los genes Cas1 y Cas2 (Makarova, Brouns, et
al. 2011)
Inicialmente se pensaba que los genes Cas 1 y Cas2 se
encontraban distribuidos universalmente. Sin embargo, fue Francisco
Martínez Mojica el encargado de señalar que el gen Cas2 no se
encuentra presente en algunos microorganismos. En estos casos, su
función la asume otra biomolécula. Cuando en el sistema CRISPR/Cas
encontramos presencia de ambos genes, Cas1 codifica para una
ADNasa mientras que Cas2 hace lo propio con una endorribonucleasa
(Yosef et al. 2012).
Además, cada tipo de sistema CRISPR/Cas, presenta una
secuencia específica de Cas (Barrangou & van der Oost, 2013). El
sistema CRISPR/Cas tipo I tendría una secuencia específica de Cas3,
el tipo II de Cas9 y el tipo III de Cas10. De igual modo, es posible
identificar subclases dentro de cada tipo de sistema CRISPR/Cas,
siendo la diferencia principal ciertos aspectos relacionados con el gen
que codifica para Cas1 (Makarova, Brouns, et al. 2011).
Para hablar de cada uno de los tipos de sistema CRISPR/Cas,
podríamos situar por un lado los tipo I y III, dadas sus similitudes tanto
de carácter bioquímico como estructural, generando una respuesta con
una presencia de proteínas Cas similar, a través de la cual se
desencadena un mecanismo de acción que incluye actividad ARNasa.
En otro lado, tendríamos el tipo II. Este sistema ha desarrollado una
respuesta frente a los elementos que llevan el material genético que
sigue la estructura descrita anteriormente (fase de adquisición,
expresión e interferencia), pero lo hace de manera muy diferente a la
presente en los tipo I y III.
16
En el sistema CRISPR/Cas de tipo II nos encontramos una
molécula de ARN transactivador, la cual mediante su unión al pre-
ARNcr, y posterior corte, deriva a ARN dúplex. Será este ARN dúplex
el que, mediante unión a Cas9, produzca un doble corte (DSB por sus
siglas en inglés) en las dos hebras del ADN intruso y produzca la
destrucción del patógeno (Barrangou & Marraffini, 2014).
Finalmente, debemos destacar que el sistema CRISPR/Cas de
tipo II tiene presencia exclusiva en bacterias, mientras que el sistema
tipo III se encuentra de manera más común en arqueas. Es el sistema
tipo I el que tiene presencia tanto en bacterias como en arqueas (Liu &
Fan, 2014).
Figura 6. Fases de los tipos I-III de CRISPR y sus diferencias (Rath, Amlinger,
Rath, & Lundgren, 2015b)
17
4.4 COMPOSICIÓN Y ESTRUCTURA
El sistema CRISPR/Cas se divide en dos obvios componentes,
la secuencia CRISPR y las proteínas Cas.
En cuanto a las secuencias CRISPR, ya hemos señalado en
apartados anteriores que son secuencias de ADN presentes en el
genoma bacteriano. Las bacterias, una vez infectadas, incorporan el
ADN de la secuencia CRISPR a su propio genoma para generar una
respuesta inmunológica que le permita defenderse ante una nueva
infección (Lander, 2016).
Si hablamos de las proteínas Cas, debemos señalar que son
enzimas producidas tras la expresión de los genes que llevan el mismo
nombre. Normalmente su principal función es la de cortar el ADN,
guiadas por el ARN guía, de manera eficaz.
Figura 7. Estructura y función del sistema CRISPR/Cas (Sorek et al., 2008).
18
Existen varios tipos de proteínas Cas que participan en el
sistema junto a CRISPR. Podríamos hablar de cuatro grupos
principales, proteínas Cas adaptativas, de expresión, de interferencia
y, finalmente, existe un grupo que presenta también funciones ligadas
al sistema CRISPR, son las proteínas Cas de función auxiliar.
Dentro de las proteínas Cas adaptativas encontramos Cas1 y
Cas2, si bien Cas4 también puede estar involucrada en algunas
ocasiones. E incluso en los sistemas CRISPR de tipo II también
podríamos encontrarnos con la proteína Cas9 (Makarova et al., 2015).
En las proteínas Cas de expresión y de interferencia, podremos
encontrar Cas6 para los sistemas tipo I y II (siendo la encargada de
que madure el ARNcr) y Cas9 para los sistemas tipo II. Finalmente, las
proteínas de función auxiliar suelen resultar una combinación de
proteínas y dominios menos comunes que las proteínas Cas
encontradas en los casos anteriores. Son un caso tan particular que
sus funciones aún no han sido definidas con claridad (Makarova et al.,
2017).
Figura 7. Clasificación de las proteínas Cas (Makarova et al., 2015).
19
5. EL SISTEMA CRISPR/Cas EN LA EDICIÓN DIRIGIDA DE
GENOMAS
5.1 FUNCIONAMIENTO DE LA TÉCNICA
Como se ha comentado con anterioridad, para activar la
proteína Cas9 es necesaria la presencia del ARNcr. También es
necesaria la presencia de ARNtracr. Ambos tipos de ARN pueden dar
lugar a un ARN guía sintético, ARNsg según sus siglas en inglés. Este
ARNsg puede dirigir a Cas9 contra una secuencia genómica de
cualquier organismo y, por lo tanto, Cas9 puede convertirse en una
nucleasa programable (Valor, 2018). Será esta utilidad de Cas9 la que
convierta al sistema CRISPR/Cas en una gran herramienta para la
edición dirigida de genomas.
Una vez que el complejo formado por Cas9 y el ARNsg produce
un corte en el ADN del organismo diana, la reparación del mismo puede
tener lugar mediante dos mecanismos:
NHEJ (Non-Homologous End Joining)
Estamos ante una vía rápida pero, a su vez, con gran tendencia
al error. Su mayor problema radica en la generación de inserciones y
deleciones en la región de genoma que sufre el corte. La consecuencia
inmediata es el desorden de la secuencia y, por ende, la posible
aparición de mutaciones que haga al gen perder su función (Lin,
Staahl, Alla, & Doudna, 2014).
HDR (Homology directed repair)
Se trata de una vía menos eficaz e incluso inactiva en la gran
mayoría del tiempo pero, a su vez, también es una vía conservadora
en comparación a la unión de extremos no homólogos. Como requisito,
precisa de un ADN molde (Luo, 2016) que acabará siendo incorporado
al genoma gracias a la recombinación homóloga.
20
Figura 8. Reparación por NHEJ o HDR de un corte de doble cadena (Adhikari &
Poudel, 2020).
5.2 APLICACIONES
5.2.1 INSERCIONES, DELECIONES E INVERSIONES
Inserciones y deleciones
Como hemos comentado en el anterior apartado, existen dos
mecanismos, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la
reparación directa por homología (HDR), para reparar un corte de
doble cadena (Adhikari & Poudel, 2020). También señalábamos que la
diferencia entre ambos radicaba en la mayor actividad pero también
mayor número de errores cometidos por NHEJ, frente a la técnica más
conservadora y eficaz de HDR, aunque esta última presentaba menor
actividad.
Debido a los errores que comete NHEJ, en el corte de doble
cadena se generan tanto inserciones como deleciones de nucleótidos,
lo que puede generar la aparición de mutaciones al cambiarse la
lectura en la secuencia de nucleótidos.
21
Es en este momento en el que aparece la primera de las
aplicaciones del sistema CRISPR/Cas que comentaremos en esta
revisión. Las mutaciones generadas debido a los errores de NHEJ
pueden usarse en nuestro beneficio si conseguimos su eliminación en
el gen diana. El problema radica en la aleatoriedad y poca predicción
que nos ofrece NHEJ, lo que la hace poco adecuada en la generación
de ediciones de una sola base o en la inserción de secuencias
específicas (Chandrasegaran & Carroll, 2016). Por lo tanto, debemos
reafirmarnos en el uso de HDR para asegurarnos el éxito en la
aplicación de este sistema, si bien, debido a la prevalencia natural de
NHEJ, debemos asegurar el correcto aislamiento de la secuencia diana
para que la eficacia de HDR sea mejorada (Li et al., 2014).
Figura 9. A) Generación de knockout por reparación de corte de doble cadena por
NHEJ. B) Inserciones con CRISPR/Cas y mecanismo de reparación HDR. (Dow,
2015).
22
Inversiones
También existen otra serie de modificaciones que generan
mutaciones de mayor entidad en los cromosomas, como podrían ser
las inversiones. Fueron observadas sobre modificaciones off-target y
brindaban la posibilidad de dejar atrás la edición en genes individuales
y hacerlo en cromosomas completos.
Este puede ser el caso de enfermedades como la hemofilia A,
siendo la mayoría de los casos producidos por dos grandes inversiones
en cromosomas que producen la alteración del gen F8. Por ello, se
intervino con el sistema CRISPR/Cas9 para anular la inversión
cromosómica y, de esta manera, eliminar la enfermedad (Graw et al.,
2005). También es posible realizar correcciones, ejecutando una
modificación cromosómica dirigida, en las mutaciones genéticas.
Figura 10. Proceso de inversión cromosómica (Kim & Kim, 2014).
5.2.2 TERAPIA GÉNICA
La terapia génica es, sin duda, de las aplicaciones de
CRISPR/Cas en las que más esperanzas hay depositadas. A día de
hoy, CRISPR/Cas ya ha sido aplicada como terapia génica, con
interesantes resultados, en varias enfermedades en modelos animales
(Cruz & Freedman, 2018).
23
Otra de las utilidades del sistema CRISPR/Cas9, en el ámbito
de la edición genómica, es la introducción de mutaciones que actúen
como protectoras y combatan las enfermedades no genéticas o
complejas desde los tejidos somáticos.
También podría ser utilizado fuera del tejido somático. Un
ejemplo de ello es la ingeniería de células terapéuticas, las cuales
pueden modificarse ex vivo para realizar una posterior reinfusión en el
paciente (Hsu, Lander & Zhang, 2014).
Figura 11. Aplicaciones de Cas9 en la ingeniería genómica (Hsu, Lander & Zhang,
2014).
24
5.2.3 IMAGING
Las imágenes basadas en Cas9 constituyen otra de las
aplicaciones del sistema CRISPR. En los estudios preliminares
puestos en marcha para evaluar esta aplicación se usó la GFP, una
proteína fluorescente que fue fusionada con Sp dCas9 para observar
la dinámica, durante el ciclo celular, de los loci repetitivos del genoma.
Una vez analizados los primeros estudios en los que se
implementó esta técnica, se han introducido mejoras que potenciaran
esta aplicación del sistema CRISPR. Algunas de ellas han sido la unión
de las imágenes que proporcionaba Cas9 del genoma con la matriz de
péptidos SunTag (Tanenbaum, Gilbert, Qi, Weissman & Vale, 2014) o
el uso de dCas9 ortogonales previamente marcados con proteínas que
emitieran fluorescencia para desarrollar imágenes multicolor (Ma et al.,
2015).
Figura 12. Representación gráfica general de las imágenes CRISPR (Chen et al.,
2013).
25
5.2.4 EDICIÓN MÚLTIPLE
Otra de las aplicaciones del sistema CRISPR/Cas radica en la
introducción simultánea de varios ARNsg. Con ello podríamos
modificar varios genes al mismo tiempo. Para ello, y con la intención
de reducir al mínimo las limitaciones que puede presentar este
mecanismo a la hora de su aplicación, se han diseñado varios sistemas
basados en la generación, partiendo de un único plásmido, de múltiples
ARNsg (Cao, Xiao & Yan, 2018).
Centrándonos en las utilidades de esta técnica podríamos
señalar el estrés metabólico, generando la edición múltiple una mejora
de la tolerancia celular a este mecanismo. Para ello, se actúa de
manera directa sobre los reguladores que confieren la tolerancia y se
les manipula genéticamente para que la mejoren de manera
significativa (Chen, Stabryla & Wei, 2016). De igual modo, gracias a
esta aplicación del sistema CRISPR podríamos conseguir un mayor
control del genoma, con las posibilidades en el ámbito de la medicina
que ello generaría. Por supuesto, esta capacidad de control del
genoma genera también muchos debates, de carácter ético, sobre los
límites de actuación que se deben establecer.
5.2.5 CÁNCER
Sin duda el uso del sistema CRISPR en el tratamiento del cáncer
es la aplicación que más impacto mediático genera, debido a que una
gran parte de la población se encuentra sensibilizada ante esta
enfermedad.
Recientemente, en el mes de febrero de este año 2020,
investigadores de la Universidad de Pensilvania han demostrado que
células editadas genéticamente con el sistema CRISPR/Cas9
prosperan tras ser reintroducidas en pacientes de cáncer (Stadtmauer
et al., 2020).
26
Figura 13. Ingeniería CRISPR/Cas9 de células T en pacientes con cáncer (Stadtmauer
et al., 2020).
5.2.6 ACTIVACIÓN Y SUPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL
CRISPR/Cas9 no solo es capaz de realizar cambios a nivel
genómico, también es un sistema capaz de activar o inhibir la
transcripción.
En este caso, Cas9 no necesita realizar un corte en el ADN.
Cas9 actuará como una proteína programable que se una al ADN.
(Barrangou & Doudna, 2016). A una versión de Cas9 inactiva, que
presenta una serie de mutaciones (principalmente en los sitios activos
RuvC y NHN), se le unen activadores o inhibidores de la actividad
transcripcional y modificadores epigenéticos. Esta unión se produce
mediante fusiones génicas o aptámeros ligados al ARNsg.
27
5.2.7 CORONAVIRUS
Aunque el sistema CRIPSR/Cas se relacione principalmente
con aplicaciones relacionadas con la edición genómica, no es su única
utilidad. Es por ello que, debido a la pandemia provocada por la Covid-
19, muchos investigadores comenzaron a centrar sus esfuerzos en
combatir al SARS-CoV-2, también mediante la adaptación de
herramientas CRIPSR que pudieran ofrecer alternativas a nivel de
diagnóstico pero también como estrategia terapéutica.
Podemos, por lo tanto, dividir las aportaciones del sistema
CRISPR a la lucha frente a la Covid-19 en dos grupos diferentes:
detección del virus y desarrollo de terapias frente a Sars-CoV-2.
DETECCIÓN DEL VIRUS
Existen dos vías, basadas en la detección específica de
moléculas de ARN y ADN, para aprovechar la tecnología CRISPR en
el diagnóstico de Sars-CoV-2. Fueron desarrolladas con anterioridad,
pero han sido adaptadas recientemente una vez que el genoma de este
coronavirus fue descrito.
La primera vía, descubierta en el Instituto Broad, es conocida
como SHERLOCK (Kellner et al., 2019). La técnica utiliza la proteína
Cas13a como elemento funcional, y su mecánica es simple. El ARN
guía activa a Cas13a tras unirse a su secuencia diana y, gracias a ello,
se consigue degradar el ARN de la reacción. Esta función de Cas13a
es aprovechada por los investigadores para introducir fragmentos de
ARN, marcados previamente, que al degradarse pueden ser
detectados con fluorescencia o colorimetría. Con ello podremos
detectar si el ARN del virus está o no presente.
El inconveniente de esta técnica radica en que su uso está
limitado a la investigación, ya que aún no se ha validado en pacientes,
por lo que no puede usarse en un contexto clínico.
28
A pesar de ello, se han realizado avances en el uso de
SHERLOCK. Gracias a su combinación con una plataforma de análisis
basada en chips ha nacido CARMEN (Combinatorial Arrayed
Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids), una tecnología
que es capaz de analizar más de 1.000 muestras de manera
simultánea (Ackerman et al., 2020).
La segunda vía, desarrollada en la Universidad de California, se
denomina DETECTR (Chen et al., 2018). Se trata de un sistema
diseñado para detectar ADN a través del uso de la enzima Cas12a. El
mecanismo funciona de la misma manera que en la técnica
SHERLOCK, cambiando el ARN por ADN.
La técnica ha sido adaptada en los últimos meses para colaborar
en la detección de Sars-CoV-2. Para ello, al tratarse de una técnica
que detecta ADN, tras la extracción de ARN de la muestra se debe
copiar a ADN y, posteriormente, amplificarlo. Con este proceso
podemos detectar dos genes, N y E, de este coronavirus.
A diferencia del anterior, el método DETECTR sí ha sido testado
con éxito en pacientes positivos por COVID-19. A pesar de ello, aún no
puede usarse en el diagnóstico clínico de la enfermedad.
DESARROLLO DE TERAPIAS
El sistema CRISPR fue descubierto como un sistema que
defiende a las bacterias frente a las infecciones víricas. Partiendo de
esa base, podríamos deducir que CRISPR puede ser útil en la
detección y destrucción del coronavirus SARS-CoV-2.
Precisamente en el año 2019, y nuevamente investigadores del
Instituto Broad, se desarrolló una estrategia que usa el sistema
CRISPR para atacar virus de ARN mediante el uso de la enzima
Cas13. Posteriormente, se combinó esta estrategia con la mencionada
anteriormente SHERLOCK, dando como resultado CARVER (Cas13-
Assisted Restriction of Viral Expression and Readout), una herramienta
especializada en detectar y eliminar virus (Freije et al., 2019).
29
Aunque CARVER fue la primera herramienta que demostró el
éxito del sistema CRISPR en la detección de los virus de ARN, no ha
sido el primer método testado para utilizar esa aplicación frente al
coronavirus causante de la pandemia de la Covid-19. En este caso, los
honores corresponden a un grupo de investigadores de la Universidad
de Stanford, que han diseñado PAC-MAN (Prophylactic Antiviral
CRISPR in huMAN cells) (Abbott et al., 2020).
El trabajo, que ha sido publicado como preprint, se basa en el
uso de la enzima Cas13d, pequeña, específica y con elevada actividad
de catálisis. Para realizar la investigación, se simuló la infección por
SARS-CoV-2 con partículas de lentivirus que contenían el genoma de
este coronavirus, obteniendo resultados que avalaban el éxito de PAC-
MAN frente al virus. Aunque los propios investigadores saben que aún
es necesario realizar nuevos experimentos en los que se use de
manera directa SARS-CoV-2, se muestran ilusionados con las
posibilidades reales de lucha frente a la Covid-19 que presenta esta
técnica.
Figura 14. Nuevas aplicaciones para las herramientas CRISPR en diagnóstico (Chen
et al., 2018; Gootenberg et al., 2018).
30
5.3 POSIBLES PROBLEMAS
5.3.1 CORTES OFF-TARGET
Los cortes off-target son la principal limitación que tiene en la
actualidad el sistema CRISPR/Cas (Tian et al., 2017). Este
inconveniente se basa en la producción de cortes no específicos en el
ADN debido a la unión de Cas9 con sitios no diana del genoma. De
hecho, hay estudios que señalan que solo un 1,6% de las moléculas
de ARN guía de Cas9, dirigidas a las regiones exónicas de los genes
o al promotor, presentan una coincidencia perfecta (Bolukbasi, Gupta,
& Wolfe, 2016).
Como posible solución a este problema, se están creando
modelos modificados, presentando mayor especificidad, de la enzima
Cas9. Con ello se pretende reducir los errores que se producen al
editar el genoma. Mientras tanto podemos afirmar que, a día de hoy,
no es posible evitar que los cortes off-target hagan presencia. La
inespecificidad de CRISPR/Cas9 continúa siendo su principal factor
limitante.
5.3.2 AUTOINMUNIDAD
La autoinmunidad es otro de los inconvenientes que lastra la
aplicación del sistema CRISPR/Cas9 en el ámbito sanitario. Se
produce concretamente cuando se usa el sistema “in vivo” en
organismos eucariotas. Esto es debido a que la enzima Cas9 es
atacada por anticuerpos de determinadas bacterias que están
presentes en el suero de adultos, pero también de recién nacidos. Los
estudios llevados a cabo sobre este aspecto destacan que es la
exposición habitual a géneros bacterianos como Staphylococcus o
Stretptococcus la que ha hecho que desarrollemos anticuerpos frente
al sistema CRISPR/Cas9 (Charlesworth et al., 2018).
31
6. IMPLICACIONES ÉTICAS DEL SISTEMA CRISPR/CAS
Desde que, en 1993, el científico español Francisco Martínez
Mojica describiera CRISPR/Cas, una técnica sencilla, rápida y barata
para la modificación del genoma de los seres vivos, ha experimentado
un desarrollo acelerado, siendo considerada una de las herramientas
más revolucionarias de nuestros días. A pesar de ello, aún queda
mucho por hacer y saber de ella. La mayoría de los retos pendientes
con el sistema CRISPR/Cas son de corte científico, si bien últimamente
los retos en el ámbito ético y jurídico han tomado protagonismo, y son
tan importantes o más que los primeros.
Podríamos dividir los retos éticos de CRISPR/Cas en dos
vertientes: la necesidad de tener control absoluto de la técnica antes
de usarla en humanos y la opinión existente que sostiene que el
desarrollo de CRISPR/Cas nos hará una especie de dioses, que su uso
atenta contra la dignidad o que su extensión nos conduce a un mundo
basado en el perfeccionamiento (De Miguel, 2018).
Estas cuestiones no son ajenas a la comunidad científica, que
ya en el año 2015 afrontó las implicaciones éticas del sistema
CRISPR/Cas en una reunión en la que se debatió el uso de esta técnica
en humanos (Baltimore et al., 2015).
En el año 2018, en el marco de la segunda cumbre internacional
sobre la edición del genoma, el debate ético de la aplicación de
CRISPR/Cas alcanzó su punto álgido. El investigador chino He JianKui
anunció que había usado la técnica para tratar los embriones de dos
gemelas para hacerlas inmunes frente al virus del SIDA del que era
portador su padre. Esta noticia horrorizó a la comunidad científica,
surgiendo voces que pedían detener este tipo de pruebas tras
comprobar que CRISPR/Cas podría convertirse en un juguete en
manos de cualquier investigador (Villanueva-Cañadas, 2019).
32
A día de hoy, aún no está claro donde situar los límites en la
edición genómica y en las posibles aplicaciones que nos ofrece
CRISPR/Cas.
7. DISCUSIONES
CRISPR/Cas, si bien tiene su origen en la defensa bacteriana
frente a infecciones víricas, se ha situado como una de las técnicas
más importantes en el ámbito de la ingeniería genética debido a su
sencillez y bajo coste. De igual manera, ha conseguido desbancar a
otros métodos como las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) o las
enzimas nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción
(TALEN) gracias a su eficacia.
Además, el sistema CRISPR/Cas cuenta con la ventaja de que
la propia proteína Cas9 es susceptible de ser modificada, lo que
posibilita la generación de nuevas aplicaciones creando nuevas
proteínas alternativas. Esto ha hecho que, en la actualidad, la mayoría
de investigadores que trabajaban en la edición dirigida del genoma
hayan ligado sus últimos avances al uso de este sistema, lo que ha
generado a su vez la aparición de inconvenientes (cortes off-target,
autoinmunidad…) que limitan a CRISPR/Cas. A pesar de ello, mucha
de la esperanza de la comunidad científica está depositada en los
avances y descubrimientos que el uso de esta técnica pueda generar.
8. CONCLUSIONES
CRISPR/Cas ha conseguido, en un breve espacio de tiempo,
situarse en la vanguardia de la ingeniería genética. Este sistema
representa una herramienta sencilla, eficaz y barata que, además,
puede ser manipulada con facilidad. Todo ello, unido al amplio espectro
de posibles aplicaciones que presenta, la han convertido en la
esperanza para revertir enfermedades de las que hace unos años
veíamos lejano encontrar un posible tratamiento.
33
No debemos olvidar que, a pesar de todas sus ventajas,
CRISPR/Cas también presenta una serie de inconvenientes que aún
la hacen tener limitaciones importantes. Además, el debate en el
contexto ético y jurídico es demasiado denso para pasarlo por alto.
A pesar de todo ello, podemos señalar sin miedo a equivocarnos
que estamos ante el sistema en el que, tras superar sus barreras
limitantes, más podemos confiar para ser convertido en la mejor
herramienta para la edición dirigida del genoma.
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