SISTEMAS ACARREADORES DE FRMACOS

Dra. Ma. Josefa Bernad Bernad

INTRODUCCIN

Grandes avances en la biologa molecular y celular

Interacciones a nivel celular y tisular

Macromolculas: Hormonas, proteinas, DNA, etcMacromolculas: Hormonas, proteinas, DNA, etc

Especificidad de la accin, evitando efectos secundarios(Frmacos antineoplsicos)

Niveles de frmacos ms o menos constantes

Especificidad de la accin

Tres diferentes niveles de targeting:1.- Tejidos (hgado)2.- Poblacin especifica de clulas en un tejido

(hepatocitos)3.- Compartimientos intracelulares (lisosomas)

(Antimicrobianos)3-2-1: Mayor a menor complejidad3-2-1: Mayor a menor complejidad

Los vehculos deben ser capaces de interactuar selectivamente en el lugar indicado

Liberacin adecuada del frmaco (Velocidad de liberacin)

Protenas y pptidos como agentes teraputicos

No va oral: Fcilmente degradados y desactivados por enzimas proteolticasPeso molecular muy grande para absorberse

Otras rutas (nasal, bucal): Baja y variable biodisponibilidadOtras rutas (nasal, bucal): Baja y variable biodisponibilidad

Ruta parenteral: Vida media muy corta. Inyeccin frecuente

Importancia del medio biolgico.- Interacciones con componentes celulares o clulas en si

Incompatibilidad del vehculo con el frmacoDesviacin del lugar de accin

TIPOS DE VEHCULOS

1.- Ciclodextrinas

2.- Sistemas coloidales

2.1.- Emulsiones2.2.- Liposomas2.3.- Niosomas2.3.- Niosomas2.4.- Nanopartculas2.5.- Micropartculas

3.- Anticuerpos

4.- Eritrocitos resellados

CICLODEXTRINAS

FORMACIN DE COMPLEJOS DE INCLUSIN

EQUILIBRIO EN DISOLUCIN

PASOS DE LA COMPLEJACION

Salida de las molculas de agua de la cavidad de las ciclodextrinas

Prdida de la capa de hidratacin del husped Prdida de la capa de hidratacin del husped

Entrada del husped a la cavidad vacia

Liberacin de la energa de tensin del anillo

Restauracin de la estructura del disolvente

METODOS DE PREPARACION

Preparacin de complejos en disolucin

- mezcla de disolventes - adicin del husped sobre unadisolucin de anfitrin

Preparacin en suspensin

Amasado

Fusin del husped

INTERACCIONES CICLODEXTRINAS-HUSPED

Desplazamiento de las molculas de agua desde el interior de las CD

Liberacin de la tensin del anillo

Int. van der Waals

Int. electrostticas

Puentes de hidrgeno

Efecto solvofbico

CARACTERIZACIN DE COMPLEJOS DE INCLUSIN

.- Difraccin de Rayos X de polvos

.- Espectroscopa de Infrarrojo

.- Resonancia Magntica Nuclear de slidos

.- Anlisis calorimtrico.- Anlisis calorimtrico

.- Espectroscopa de masas

.- Microscopa electrnica

APLICACIONES

- Modelos enzimticos - Catalizadores- Modelos enzimticos - Catalizadores

- Tecnologa farmacutica - Alimentos y cosmtica

- Pesticidas - Biotecnologa

- Qumica analtica - Diagnstico

Tecnologa Farmacutica

Formulacin de frmacos

- compuestos lquidos se pueden formular como slidos

- Forma de dosificacin slida

- compuestos lquidos se pueden formular como slidos- malos olores y sabores pueden ser evitados- compuestos incompatibles pueden ser mezclados- desintegracin fcil de los comprimidos

Forma de dosificacin lquida

- no es necesario usar disolventes orgnicos- irritacin local, hemlisis... son evitadas

Proteccin de los ingredientes activos

- Oxidacin, luz- Destruccin, descomposicin por calor- Volatilidad y sublimacin

Tecnologa Farmacutica

Aumento de la estabilidad fsica y qumica

- Volatilidad y sublimacin

Eliminacin o reduccin de:- Olores y sabores- Contaminacin microbiolgica- Higroscopicidad

Ventajas tecnolgicas- Manejo de polvos- Reduce costos de almacenaje

Optimizacin de la biodisponibilidad- aumento de la solubilidad y vel. de disolucin- disminuye la hidrofobicidad del frmaco

Tecnologa Farmacutica

disolucinrpida

F-CD

disociacin(muy rpida)

F-CD

F. absorbido

(muy rpida)

F+CD

Absorcin

F. absorbido

F

CDCD

Disolucin controlada en el tracto gastrointestinal

Absorcin insignificante en forma intacta en el intestino

FARMACOCINTICA Y TOXICIDAD DE LAS CICLODEXTRINAS

Prcticamente el total de la CD es metabolizada por la microflora del colon

Los metabolitos primarios (maltosa, glucosa) siguen la misma ruta que el almidn

por la microflora del colon

Toxicidad

Crnica:

Aguda : LD50 = X

Nefrotoxicidad

Hemlisis

100

125

150

175

200

-CD

-CDSolubilidad en agua g/100mlHidroxilos secundarios

Cavidad apolar

20 30 40 50 60 70 80 90

0

25

50

75

100

-CD

Temperatura C

Hidroxilos primarios

AUMENTO DE LA SOLUBILIDAD DEL HUSPED

Violeta de genciana con hp--CD

Violeta de genciana con -CD

Violeta de genciana con hp--CD

.- David C. Bibby et al.; Mechanisms by which cyclodextrins modify drug release from polymeric drug delivery systems; International Journal of Pharmaceutics 197 (2000) 111

.- Beatriz Pose-Vilarnovo et al.; Improvement of water solubility of sulfamethizole through its complexation with - and hydroxypropyl--cyclodextrin; Characterization of the interaction in solution and in solid state European Journal of Pharmaceutical Sciences 13 (2001) 325331.- Dominique Duchene , Denis Wouessidjewe, Gilles Ponchel; Cyclodextrins and carrier systems; Journal of Controlled Release 62 Cyclodextrins and carrier systems; Journal of Controlled Release 62 (1999) 263268.- Renata Kobetic et al. Study of the lorazepam: cyclodextrin inclusion complexes using electrospray ionization mass spectrometry. Tetrahedron Letters 42 (2001) 60776082

.- R. Ficarra et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 23 (2000) 3340 Study of b-blockers:b-cyclodextrins inclusion complex by NMR, DSC, X-ray and SEM investigation

.- G.N. Kalinkova . International Journal of Pharmaceutics 187 (1999) 115 Studies of beneficial interactions between active medicaments and excipients in pharmaceutical formulations

SISTEMAS COLOIDALES

- Sistemas que presentan un tamao menor a 5 m

- Pueden clasificarse en:

- Emulsiones

- Partculas:- Partculas:- Nanopartculas

- Micropartculas

- Liposomas

- Niosomas

Su xito en teraputica depende de:

su capacidad para mantenerse en la circulacin

Su capacidad de alcanzar las clulas o tejidos meta

Propiedades de superficie

Caracterizacin fsico-qumica : relacin con toma delfrmaco in Vitro por las clulas o las distribucin enlos tejidos

Distribucin en el organismo

Obstculo: Rpido aclaramiento de las partculas coloidales por los macrfagos del sistema reticuloendotelial, principalmente en el hgado y en el bazo

Solucin

Modificacin del tamao de partculaModificacin del tamao de partcula

Modificacin de la carga de la superficie

Modificacin de la hidrofobicidad de la superficie

ADMINISTRACIN DE SISTEMAS COLOIDALES

- Se reconocen como partculas extraas y soneliminadas de la circulacin por los macrfagos delSRE (hgado y bazo principalmente)

1.- A ms hidrfila sea la superficie menor es lainteraccin con muchos de los componentes delorganismo y por ello menor respuesta inmune.

Se puede evitar o disminuir

organismo y por ello menor respuesta inmune.

Tipo de superficieMaterial

Unin a Fibringeno (g/cm2)

ngulo de contacto

PolietilenoCarbon

9560

0.730.77

Hidrofbica

Hidroflica0.230.4

2215

PoliHEMACelofano

Brynda et al., J. Biomed. Mater. Res., 18, 685-593, 1984

2.- No tener expresin de antgenos en la superficiey as no habr reconocimiento por anticuerpos

3.- No poseer lugares de unin para el C3b (sistema del complemento)

4.- Poseer caractersticas de superficie adecuadas 4.- Poseer caractersticas de superficie adecuadas para la unin con el componente H (sistema del complemento) -- ej: Alto contenido de grupos carboximetilo disminuye la activacin del sistema del complemento

MATERIALES BIODEGRADABLES PARA LIBERACIN DE FRMACOS

.- Ni los materiales usados, ni sus metabolitos deben ser txicos.- Su degradacin debe ser suficientemente rpidaEjemplos:

Albmina srica bovinaGelatinaEtilcelulosaEtilcelulosaDerivados de dextranoPolmeros sintticos

.- Menos inmunognicos

.- Baratos y disponibles en grandes cantidades

.- Bien caracterizados

.- Relativamente txicos (Productos de degradacin: isobutanol,

formaldehido)

Ejemplos:.- Poliesteres de cido lctico (PLA) y su

copolmero con cido gliclico (PLA/GA) (Una o dos semanas para degradarse)

.- Polmeros sintticos: Poliesteres (poli(cido hidroxibutrico)=PHB, su copolmero con hidroxi(cido valerinico)=PHB/HV), poliortoesteres, hidroxi(cido valerinico)=PHB/HV), poliortoesteres, polianhidridos y poliamidas)

CMO CONSEGUIR ESPECIFICIDAD DEL LUGAR DE ACCIN?

1.- Campos magnticosMicroesferas de albumina cargadas con Fe3O4Problemas de toxicidad por acumulacin en hgadoWider et al, 1979, J. Pharm. Sci., 68, 79-82Wider et al, 1980, Cancer research, 40, 3512-3517

2.- Anticuerpos de origen humano para evitar efectos de rechazo

Problemas: se afecte la actividad del anticuerpo

3.- Residuos de azcar que pueden unirse a ciertos receptores de la superficie celular (lectinas)

Coloides

VENTAJAS DE LOS SISTEMAS COLOIDALES

.- Protegen al frmaco del anfitrin (degradacinenzimtica).

.- Protegen al anfitrin del frmaco (disminucin de efectossecundarios).

.- La velocidad de liberacin del frmaco puede seroptimizada en funcin de los requerimientosfarmacolgicos y farmacocinticos.

LIMITACIONES DE LOS SISTEMAS COLOIDALES

.- Mtodos de preparacin

.- Susceptibilidad al SRE

.- Acceso limitado a clulas no fagocitarias

.- Inmunogeneicidad

MODIFICACIN DE LOS VEHCULOS

.- Modificacin de la superficie por adsorcin de polmeros

.- Recubrimiento con poloxamero y poloxamina

.- Recubrimiento con fenoles alquil polioxylados

.- Recubrimiento con fosfolpidos.- Recubrimiento con fosfolpidos

.- Recubrimiento con compuestos etoxilados

.- Irradiacin gama

Modificacin de la superficie por adsorcin de polmeros

Hidrofbica Hidroflica

1.- Modificacin qumica1.1.- Introduccin de grupos funcionales (OH, COOH)1.2.- Unin de PEG

Problemas de toxicidadAbuchowski et al, 1977, J.Bio.Bhem., 252, 3578-3581

Problemas de toxicidad

2.- Adsorcin de polmeros.- El polmero no debe desorberseej: Poloxamina 908,

Ts no inicos: nonilfenol etoxilado ( EO Afinidad)Poloxameros (Polioxietileno-Polipropileno)

Eficacia de adsocin fuerzas conductorasKromberg et el, 1984, J.Coloid. Interf. Sci.,102, 418-423

Recubrimiento con poloxmero y poloxamina

Poloxmeros (EO)n- (PO)m- (EO)n

Poloxaminas(EO)n- (PO)m

(EO)n- (PO)mN-CH2-CH2-N

(PO)m- (EO)n

(PO)m- (EO)n

Afinidad

Peso Molecular

Grupos EO

Grupos PO

Tiempo de incubacin

Recubrimiento con fenoles alquil polioxylados

R

O(CH2-CH2-O)n-1 CH2CH2OH

Mayor hidrofobicidad que poloxmeros y poloxaminas

Mayor capacidad de adsorcin

Recubrimiento con fosfolpidos

Bajo aclaramiento por el SRE

Alta lipofobicidad

Tipo de fosfolpido Espesor de la capa ()

Infusol (60-80% PC) 33.7Infusol (60-80% PC)

NC 95 (90-96% PC)

DPPC

PG-huevo (96-98% PCH)

PE-soya (92.2% PEH)

33.7

43.4

36.2

23.7

36.4

Recubrimiento con compuestos etoxilados

Monoglicridos etoxilados (serie Targat)Aceites de castor (serie Targat R)Esteres de cidos grasos sorbitan etoxilados (Tween)

.- A mayor proporcin de parte hidrofbica mayor unin.- A mayor proporcin de parte hidrofbica mayor unin

.- A ms puntos de unin menor problema de desorcin

.- A mayor nmero de grupos EO mayor hidrofilicidad de la superficie

.- A ms insaturaciones mayor adsorcin

Irradiacin gama

Degradacin de las cadenas y entrecruzamiento

Disminucin de la hidrofobicidad

Susceptibilidad a adsorcin de polmeros hidroflicos

CARACTERIZACIN DE LOS VEHCULOS

.- Determinacin del tamao de partcula

.- Determinacin de la carga

.- Determinacin del potencial zeta

.-Determinacin de la hidrofobicidad de la superficie

.- Anlisis qumico de la superficie

.- Determinacin de la temperatura de floculacin crtica

Determinacin del tamao de partcula

Influye en la distribucin en el organismoMayor a 6m mayor que el dimetro de los capilares(LD50 ratas=154000/g para 13.5m y 705/G para 90.7m)

A mayor tamao de partcula mayor aclaramiento por el SRE

Mtodos: Espectroscopa de correlacin fotnicaDifraccin de lserMicroscopa electrnica

Espectroscopa de correlacin fotnica

.- Determinacin del tamao medio de partcula

Basada en dispersin de luz lser

Aplicable para partculas entre 5nm y 3 m

.- Distribucin del tamao de partcula

.- Espesor de la capa de recubrimiento de partculaspequeas

.- Dar seguimiento al proceso de agregacin-deagregacin en suspensiones

Difractometra laser

Rango de medida: 0.1 m a 100 m

LASER

Detector

Rayo laser 12

1.- ngulo de difraccin grande para pequeas partculas2.- ngulo de difraccin pequeo para partculas grandes

Patrones de difraccin de luz nicos para cada tamao de partcula

Ventajas: Puede medir cualquier dispersin transparenteOtros necesitan electrolitos (agregacin departculas o coalescencia de gotas pordisminucin del potencial zeta)

Microscopa electrnica

Solo puede usarse para muestras slidas

Solucin: Congelar rpidamente y evaporar para aislar las partculas que hay en la dispersin

Diferencias en funcin del mtodo:

Distribucin del tamao de partcula

Tamao de partcula

Microscopa electrnica

200 000X

Determinacin de la carga (Potencial Zeta)

Unin de partculas a macrfagos:

1.- Mediada por receptores a inmunoglobulinas(Berken et al., 1966, J. Exp. Med., 123, 119-144)

2.- Mediada por receptores a sistema del complemento(Mantovani et al., 1972, J. Exp. Med., 135, 780-792)(Mantovani et al., 1972, J. Exp. Med., 135, 780-792)

3.- Mediada por interacciones hidrofbicasEj: Globulos rojos

(+neurominidasa o polilisina)

GR sin carga, > Interaccin con macrfagos (in vitro)(Capo et al., 1981, Immunol. Comm., 10, 35-43)

CargaProceso de dispersin de las partculas en aguaGrupos cargados en la superficieAdsorcin de iones del medio de dispersin

Qu es el potencial zeta?

Una partcula (o lquido disperso) suspendido en un fluidoUna partcula (o lquido disperso) suspendido en un fluidoEs rodeado por una capa de iones con una carga especfica. Esta capa es rodeada por otra capa, ms difusa que la primera, y que tambin tiene su carga elctrica. La diferencia de carga entre la primera capa y el bulto de la disolucin es el potencial zeta.

Cmo medir el potencial Zeta?Velocidad de las partculas en un campo elctrico

Para que sirve el potencial zeta?

Cuando iones o polmeros se adsorben en una partcula, su carga de la superficie vara y por lo tanto su estabilidad. As la medida del potencial zeta nos va a dar una medida de la aglomeracin.

Prcticamente todos los coloides acuosos son negativos, -14 a 30 mV. A ms negativo la estabilidad negativos, -14 a 30 mV. A ms negativo la estabilidad aumenta, esto se consigue por la adicin de electrolitos anionicos. Si el potencial es 30 mVo menos, la repulsin es suficiente para conferir una gran estabilidad y entre 45 y 70, la estabilidad est asegurada.

Para conseguir aglomeracin es necesario que el potencial zeta sea cercano a cero, lo cual se consigue adicionando electrolitos catinicos.

Rayo laser Luz dispersada

Partculas Luz dispersada

Partculas no recubiertas-Partculas cubiertas

Espesor de la capa de recubrimiento-plano de corte

Caractersticas de esta capa

Cambios en el potencial zeta

Concentracin de iones

Tipo de sales

Extensin de la disociacin inica

Interaccin de las partculas con los iones

Determinacin de la hidrofobicidad de la superficie

Determinacin de la adsorcin de polmeros en la superficie

> hidrofobicidad de la superficie> unin de polmeros

Interaccin de vehculos con clulas

Partculas hidrofbicas>unin a los fagocitos

>fagocitosis

Distribucin de las partculas en el organismo

Partculas hidrofbicasAdsorcin de IgG

Unin a los receptores Fc de los fagocitos

Mtodos

Unin de rosa de Bengala

Se incuban las partculas con rosa de bengala durante 3 hSe centrifugan por 1 2 h a 20,000 r.p.m.Se determina espectrofotometricamente el sobrenadante

60(

g/m

g)

50PS-0.06

(

0 10 20 30 40 50

0

10

20

30

40

50

PS-0.9

PS-0.14

PS-0.06

Co

nce

ntr

aci

n d

e R

B a

dso

rbid

a

Concentracin de RB ( g/ml)

Cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC)

Columna cromatogrfica

Interacciones hidrofbicas(Matriz neutra hidrofbica)

Separacin de sustancias

.- Hidrofobicidad del soluto

.- Hidrofobicidad de la columna

.- Interacciones soluto-disolvente

.- Interacciones entre el disolvente (Efecto salting-out Cl-, PO43-y salting-in Ca2+, Ba2+)

Ejem: PS-COOH y PS-OH SefarosaSin necesidad de un detergente

Otra columna

Poloxamina 908, Poloxmero 338 y 407< hidrofobicidad

Reducen fagocitosis

Particin entre dos fases acuosas

HeptanoBencenoEter

Disoluciones de polmeros

Polipropilen glicolPolietilen glicolAlcohol ppolivinlicoMetilcelulosa

Sistema Octanol-agua

EterFenolAcetonaAguaSales-agua

MetilcelulosaHidroxipropil dextranoDextranoCarboximetil dextranoSulfato de dextrano

Sistema 16% de dextrano 20 ---- 12% PEG 2000

Anlisis qumico de la superficie

Deteccin de contaminantes en la superficie de la partcula

Explicacin de fenmenos observados en la modificacin superficial del vehculo

Distribucin in vivoDistribucin in vivo

Espectroscopa fotoelectrnica de Rayos X (XPS o ESCA)Espectroscopa de masas Ion esttico secundario (SSIMS)

Determinacin de la temperatura crtica de floculacin (TCF)

Recubrimiento con polmeros sobre una partcula

Estabilizacin de la partcula

Cantidad de polmero adsorbido por unidad de superficieCantidad de polmero adsorbido por unidad de superficieEspesor de la capa de polmero

Peso molecular del polmeroAfinidad por la superficie

TemperaturaConcentracin de electrolitos en el medio de dispersin

Solvencia del grupo estabilizante en el disolvente

TCF: Temperatura a la cual las partculas comienzan aflocular y precipitan

Medida de estabilidad y de hidrofilicidad de la superficie

TCF-Temperatura de punto de nube(Grupos OE expuestos al medio)

ptica Detector

Computadora

Bao termostatado

Control de temperatura

Celda con muestra

VEHCULOS MODELO NO-BIODEGRADABLES

Evitar solapamiento de efectos

Qu deben cumplir estos modelos?

.- Disponibles en diferentes tamaos de partcula.- Disponibles en diferentes tamaos de partcula

.- Partculas con diferentes propiedades de superficie

.- Posibilidad de modificar la superficie

.- No interferir con la distribucin en el organismo

.- Poblacin monodispersa

.- Sin contaminacin por tensoactivos

.- No variabilidad entre lotes

VEHCULOS POLIMRICOS BIODEGRADABLES

Polmero degradado ms rpidamente in vivo que in vitro

Naturales:

.- Albmina (Burger et al., 1985, Int. J. Pharm., 23, 333-344)

.- Polisacridos (Artursson et al., 1987, J. Pharm. Sci., 76, 127-133)

.- Gelatina (Yoshioka et al., 1981, Int. J. Pharm., 81, 131)

Mal caracterizados

Reacciones adversas

Disponibilidad limitada y caros

Sintticos

.- Polialquilcianoacrilatos (Verdun et al., 1986, J. Controlled Re., 3, 205-210)

.- Poli (cido lctico) = PLA

.- Copolmero Poli (cido lctico) cido gliclico = PLA/GA

.- Copolmero Poli (cido lctico) poli (cido hidroxibutrico)

.- Poliesteres (Poli cido -mlico)(Braud et al., 1985, Polym. Bull., 13, 293-299)(Braud et al., 1985, Polym. Bull., 13, 293-299)

.- Poliortoesteres(Heller et al., 1985, Methods in enzimology., vol. 112, Academic Press, 422-435)

.- Polianhidridos(Mathiowitz et al., 1987, J. Controlled Rel., 5, 13-22)

.- Qumicamente bien definidos

.- No reacciones inmunolgicas

.- Relativamente ms baratos

Polialquilcianoacrilatos

.- Liberan productos de degradacin txicos

.- Pueden usarse para liberar frmacos citotxicos

PLA y PLA/GA HO-CH-COOH

CH3

cido lctico (D o L)

HO-CH2-COOHcido gliclico

HO-(CH2-CO-O-CH-CO-O)n-H

.- No txicosProductos de degradacin de los carbohidratos.- Usados en la formulacin de pptidos (Sanders et al., 1985, J. Controlled Rel., 2, 187-195), antibiticos (Ikada et al., 1985, J. Controlled Rel., 2, 179-186), corticoides (Spilizewski et al., 1985, J. Controlled Rel., 2, 197-203), etc.

cido lctico (D o L)

CH3

.- Degradacin hidroltica no enzimtica

.- Tiempo de degradacin:PLA = 1 aoPLA/GA al 50% = 3-6 semanasPHB

HO-(CH-CH2-CO-O)n-H

CH3

Puede ser:.- Aislado de ciertas bacterias mediante disolventes.- Aislado de ciertas bacterias mediante disolventes.- Sintetizado qumicamente

Desventajas:.- Muy cristalino (tamao y forma de partcula).- No absorbe agua, degradacin hidroltica en

superficie

Solucin:Copolimerizacin con -hidroxivalerato

Produccin de vehculos

Emulsificacin - Evaporacin

Beck et al., 1980, Contracept. Deliv. Syst., 1, 79-86

1.- Se disuelve el polmero en un disolvente orgnico2.- Se dispersa en un medio acuoso con untensoactivo para estabilizar la emulsin o/w3.- Se sonica para disminuir el tamao de partcula3.- Se sonica para disminuir el tamao de partcula4.- Se evapora el disolvente

De qu depende el tamao y la distribucin del tamao de

partcula?

.- Mtodo de emulsificacin

.- Tipo y concentracin de tensoactivo

.- Viscosidad de la fase acuosa

.- Relacin fase orgnica/fase oleosa

.- Tipo d disolvente orgnico

.- Concentracin de polmero en la fase orgnica

.- Tipo de polmero

.- Peso molecular del polmero

.- Velocidad de agitacin en la pre-emulsificacin

.- Tiempo e intensidad de sonicacin

.- Velocidad de evaporacin del disolvente (presin y temperatura )

Koosa, 1989, PhD thesis, Nottinghan University

10 12 14 16 18 20

170

180

190

200

210

220

230

240

250

Tam

ao d

e p

art

cula

(nm

)

2 2Contenido de CH Cl (%v/v )

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Tam

ao d

e p

art

cula

(m

)Temperatura de evaporacin (C)

Purificacin: dilisis o centrifugacin

Carga de frmaco en sistemas coloidales

Tipo de partcula

Tamao de

partcula (m)

% de frmaco

incorporado

PHB-prednisolona

0.45 29.8

11.14 37.6

25.20 46.8

PHB-tetracaina

0.25 14.5

5.45 19.140

50

60

70

80

90

100

110

1:1 Frmaco:Polmero

1:21:41:6

1:8

Liberacin de prednisolona desde partculas de PHB

% li

bera

do

tetracaina 5.45 19.1

PLA-prednisolona

4.35 27.4

26.00 37.2

PLA-tetracaina

0.36 55.6

11.72 47.5

0 400 800 1200 1600 2000-10

0

10

20

30

% li

bera

do

Tiempo (min)

Koosha et al., 1988, Acta Pharm. Tecnol., 34, 24S

CULTIVOS CELULARES COMO PRUEBA DE EFICACIA

1.- Afinidad de los vehculos por diferentes poblacionesde clulas.

2.- Toxicidad de los sistemas coloidales(liposomas,Juliano et al., 1985, Biochim. Biophys. Acta, 812, 42-48; microesferas, Edman et al., 1984, J. Pharm. Sci., 73, 153-48; microesferas, Edman et al., 1984, J. Pharm. Sci., 73, 153-156; en funcin de sus propiedades fisicoqumicas, Mulleret al, 1988, Archiv der pharmazie, 321, 681)

3.- Fagocitosis en funcin de las propiedades desuperficie (Davis et al., 1985, Int. J. Pharm., 23, 69-77)

Fagocitosis

Cultivo celular

Adicin de partculas e incubacin por 90 minutos

Tincin con Giemsa

Observacin microscpica

Agente de recubrimiento

Espesor de la capa

Actividad fagoctica

Ninguno 0 100

Poloxmero 108 58 100.4

Poloxmero 188 76 95.4

Poloxmero 217 58 87.6

Poloxmero 235 35 86.5

Poloxmero 237 80 83.5Poloxmero 237 80 83.5

Poloxmero 335 53 66.7

Poloxmero 288 130 56.5

Poloxmero 238 132 47.0

Poloxmero 338 158 36.7

Poloxmero 407 154 21.6

Poloxamina 908 134 69.5

Toxicidad

Medida de la enzima intracelular Lactato deshidrogenasa (LDH)

Se libera al daarse la membrana celular

80

100

% de LDH liberado

LDH liberado despus de 1 hrLDH liberado despus de 24 hr

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.100

20

40

60

% de LDH liberado

Concentracin de Poloxmero 184 %

DISTRIBUCIN IN VIVO DE LOS VEHCULOS

Se determina por centelleo gama

Se marca la forma de dosificacin a seguir con un istopo radioactivo

La unin debe ser muy fuerte para no La unin debe ser muy fuerte para no hacer un seguimiento del istopo

Capaz de estudiar in vivo procesos dinmicos

Experimental

Se etiquetan las partculas con 131I

Se adiciona NaI-131 a las partculasSe irradia la suspensin por 1-2 das

Se dializan las partculas (Quitar I libre)

30-40% de eficacia en partculas pequeas (60-140 nm)

10% de eficacia para 910 nm

Partculas sin modificar Partculas coloidales especficas

Partculas coloidales Partculas coloidales (emulsiones)

Partculas de 142 nm no recubiertas

Partculas de 142 nm recubiertas con poloxamina 908

DISTRIBUCININ VIVO

CARACTERSTICAS DE SUPERFICIE DEL VEHCULO

Poloxamina 908 Circulacin sangunea

Consideraciones:Tamao de partculaEspesor del recubrimientoHidrofobicidad de la superficie

Poloxamina 908 Circulacin sanguneaPoloxmero 407 Mdula sea

Mayor hidrofobicidad del poloxmero

Adsorcin de opsoninas especficas de los fagocitos de la mdula sea

DISEO RACIONAL DE VEHCULOS DE FRMACOS

Es necesario conocer:

.- Mtodos para producir vehculos biodegradables

.- Poder modificarlos para no ser txicos

.- Poder caracterizarlos en funcin de su distribucin .- Poder caracterizarlos en funcin de su distribucin in vivo

Para evitar el reconocimiento por el SER:

.- Vehculos no cargados

.- Superficie hidroflica

Cmo conseguirlo?

.- Modificacin qumica

.- Adsorcin de polmeros:.- Polioxietileno-polipropileno (Poloxmero y poloxamina).- Nonilfenol polioxietilado (Antarox, Gafat).- Alcohol de cidos grasos polioxietilados.- Alcohol de cidos grasos polioxietilados

(Tween).- Fosfolpidos

Caracterizacin de partculas:

.- Tamao .- Hidrofobicidad superficial

.- Carga .- Composicin qumica de la superficie

.- Reduccin de carga .- Efecto estabilizante del polmero

.- Interacciones con componentes del plasma .-

Tamao:PCSDifractometra laserMicroscopa electrnica

Carga:Anemometra doppler laser

Interaccin con componentes del suero (opsonizacin):Interaccin con componentes del suero (opsonizacin):Medida de la carga en suero

Hidrofobicidad de la superficieMedidas de adsorcin (Rosa de Bengala)Cromatografa de interaccin hidrofbicaParticin entre dos fases acuosas

Anlisis qumico:Espectrometra de masas de iones secundarios

CONCLUSIONES

1.- Los vehculos no deben estar cargados

2.- La superficie debe ser hidroflica

3.- La superficie debe de ser no activante

4.- Las cadenas de oxido de etileno dan estas caractersticas

5.- La adsorcin de componentes del suero debe ser baja

6.- El espesor del recubrimiento debe ser mnimo (no da estabilizacin)

7.- El tamao de la partcula no importa si la superficie es la adecuada

8.- Todos los requerimientos deben de cumplirse simultneamente

EMULSIONES

Se preparan fcilmente

Son reproducibles

Se pueden preparar a gran escala

Diferentes caractersticas segn:Fase oleosaTensoactivos

Pueden ser estables por varios aos

Precaucin: Evitar gotas mayores de 5 m

Influencia del tipo de tensoactivo

220

240

260

280Tamao de gota (nm)

Polaxmero 188Polaxmero 388Polaxamina 908Polaxmero 407

0 1 2 3 4 5 6 7140

160

180

200

220

Tamao de gota (nm)

Concentracin de surfactante (%peso/V)

Caracterizacin

.- Tamao y carga de las gotas

Resultados

.- A mayor cantidad de tensoactivo, menor tamao de las gotasgotas

.- Al disminuir las gotas se observa polidispersabilidadSe ampla la distribucin de tamao de partcula

.- La concentracin ptima de tensoactivo es del 2-3 %(Partculas de 180 nm, distribucin estrecha del tamao

de partcula)

Estabilidad

.- pH, viscosidad, conductividad

.- Estudios de estabilidad acelerada.- Agitacin a temperatura ambiente a una frecuencia determinada.- Agitacin o almacenamiento a altas temperaturas (40 60 C)temperaturas (40 60 C).- Ciclos de congelacin.- Adicin de electrolitos

Precaucin: Tipo de frmacoAdicin de electrolitos en el medioPresinNmero de ciclosViscosidad

.- AgitacinGran energa cintica a las partculas

Sobrepasan la repulsin electrostticaCoalescencia

.- TemperaturaDisminucin de la viscosidad

Menor rigidez de la capa de tensoactivo

.- Ciclos de congelacinElimina la repulsin electrosttica

CoalescenciaImportante: velocidad de congelacin

temperatura de congelacintiempo de almacenamientonmero de ciclos

Influencia del nmero de ciclos

80

100

120Tamao mximo ( m)

Lecitina de huevo 1Lecitina de huevo 2

0 2 4 6 8 100

20

40

60

Tamao mximo (

Nmero de ciclo

.- Adicin de electrolitosSe disminuye el potencial Zeta

Coalescencia

Ejem.: -50 mV 0 mV +10 mV 0 mV3-5 mM/l

Ca2+

Ca2+ 100 mM/l

Ca2+

16

18

20

0 10 20 30 40 500

2

4

6

8

10

12

14

16

Tam

ao m

xi

mo (

m)

Tiempo (horas)

PoloxaminaLecitina de huevo 1Lecitina de huevo 2

Conclusiones

La emulsificacin debe llevarse a cabo por microfluidificacin

A bajas [tensoactivo] (0.5%) 250-290 nm y a altas (7%) 150nm

ptimas: 2-3% Distribucin estrecha de tamao de partcula y ptimas: 2-3% Distribucin estrecha de tamao de partcula y poca poblacin mayor de 5m

Los mejores tensoactivos: Poloxmero 188, 338 y 407

.- Lundberg, BB. Mortimer, BC. Redgrave, TG. Submicron lipid emulsions containing amphipathic polyethylene glycol for use as drug-carriers with prolonged circulation time. International Journal of Pharmaceutics. 134(May 28): p 119-127. 1996..- Nomura, T. Koreeda, N. Yamashita, F. Takakura, Y. Hashida, M. Effect of particle size and charge on the disposition of lipid carriers after intratumoral injection into tissue isolated tumors. Pharmaceutical Research. 15(Jan): p 128-132. 1998..- Lundberg, BB. Griffiths, G. Hansen, HJ. Conjugation of an anti B cell lymphoma monoclonal antibody, LL2, to long circulating drug carrier lipid emulsions. Journal of Pharmacy & Pharmacology. 51(Oct): p 1099-1105. emulsions. Journal of Pharmacy & Pharmacology. 51(Oct): p 1099-1105. 1999..- Okochi, H. Nakano, M. Basic studies on formulation, method of preparation and characterization of water-in-oil-in-water type multiple emulsions containing vancomycin. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 44(Jan): p 180-186. 1996..- Kurihara, A. Shibayama, Y. Mizota, A. Yasuno, A. Hisaoka, M. et al. Enhanced tumor delivery and antitumor activity of palmitoyl rhizoxin using stable lipid emulsions in mice. Pharmaceutical Research. 13(Feb): p 305-310. 1996.

LIPOSOMAS

Introduccin

Se descubrieron en 1960

Hasta 1992 se han publicado 15000 artculos y se hanregistrado 1000 patentes

Se han usado como modelos de membranas celulares ycomo sistemas de liberacin de frmacos

Se definen como vesculas de diferentes tamaos,formadas por una o ms capas concntricas defosfolpidos y que presentan en su interior una cavidadhidroflica

Clasificacin

Segn sus propiedades estructurales:

MLV Vesculas grandes multicapas, > 0.5 m

OLV Vesculas oligocapas, 0.1-1 m

UV Vesculas unicapa, cualquier tamao

SUV Vesculas unicapa pequeas, 20-100 nm (*)

MUV Vesculas unicapa de tamao medio

LUV Vesculas unicapa grandes, > 100 nm (**)

GUV Vesculas unicapa gigantes, > 1 m

MVV Vesculas multivesiculares, > 1 m

Segn el mtodo de preparacin:

REV: Vesculas uni u oligocapa hechas por evaporacin en fase reversa

MLV-REV: Vesculas multicapa hechas por evaporacin en fase reversa

SPLV: Vesculas estables pluricapa

FATMLV: MLV congeladas-descongeladas

VET. Vesculas preparadas por extrusin

FPV: Vesculas preparadas por French press

FUV: Vesculas preparadas por fusin

DRV: Vesculas de deshidratacin-rehidratacin

BSV: Bubblesomas (Talsma et al., J. Pharm. Sci., 1994)

Los liposomas son diferentes segn:

.- Tipo de lpidos usados

.- Tcnica de preparacin

.- Condiciones de preparacin

Influencia sobre:

.- Proceso de opsonizacin

.- Perfil de perdida

.- Disposicin en el cuerpo

.- Vida media del liposoma

SUV LUV MLV MVV

OLV MLV: MLV-REV, SPLV

Mecanismo de formacin

Diferentes tipos de molculas pueden formar liposomasFosfolpidosEsteroles (colesterol)etc.

Caracterstica general: MOLCULAS AMPIFLICAS

Parte hidroflica: Interacciona con el medio acuoso

Parte hidrofbica: Se esconde del medio acuoso

Empaquetamiento

Israelachvili et al, Q. Rev. Biophys., 13, 121-200, 1980

Israelachvili, Intermolecular and surface forces,New surface forces,New York: Academic Press

Parmetro crtico de empaquetamiento

p = v / a0lc

v = Volumen molecular de la parte hidrofbica

a0 = rea superficial ptima por molcula enla interfase hidrocarbono-agua

lc = Espesor crtico medio para la reginhidrocarbonada. Debe ser menor que lahidrocarbonada. Debe ser menor que lalongitud mxima de la cadena lipdicaextendida

Excepciones:.- Cambios en el pH o temperatura cambian estado de agregacin.- Los agregados pueden interactuar entre ellos.- Puede haber mezclas de lpidos No prediccin

Ejemplos:.- Lisofosfatidilcolina

Bicapas (Unin con cidos grasos)Micelas

.- Fosfatidiletanolamina

Micelas invertidas Bicapas (Mezcla con colesterol)

Estabilidad:Estabilidad:Teora elstica de curvatura

La energa de una bicapa en vescula es mayor que la de bicapas apiladas

Metastables

La formacin de vesculas es conducida por:1.- Unin desfavorable de la parte hidrofbica con el disolvente2.- Unin favorable de la parte polar con el disolvente3.- Energa de curvatura elstica

Importante:

Cristal lquidoTcGel (Ms rgida, menos permeable) Cristal lquido

Tc: Temperatura de transicin

Depende de:Longitud de la cadena aclicaGrado de saturacinGrupo polar

-15 C lecitina de huevo 50 C diestearoilfosfatidilcolina

Gel (Ms rgida, menos permeable)

Materias primas

O CH2

CH2

CH2

N

Me

Me

Me

+

Grupo fosfatidil Cabeza Nombre

O

O

O

O

O

PO O

O CH2

CH2

NH3+

NH +

Colina

Etanolamina

OH

OH

O

OH

OH

OH

O CH

NH3+

COO-

O CH2

CH2 CH2

OHOH

O H

Glicerol

cido

Inositol

Serina

Fosfolpidos ms usualmente utilizados:

1.- F. NaturalesYema de huevo

Soya

2.- F. Naturales modificadosPC insaturados PC saturados

3.- F. Semisintticos

Cis

3.- F. SemisintticosCambios de las cadenas aclicas

4.- F. SintticosCitas 35 y 36

5.- F. Con grupos no naturalesPEG: Aumentan el tiempo de circulacinCitas 37 a 40

5.- F. Con grupos no naturalesProtenas: especificidad en el lugar de accin

Tcnicas de preparacin

Mechanical methodsa. Vortexing or hand shaking of phospholipid dispersions (MLV)b. "Microfluidizer" technique (mainly SUV)c. Bubbling inert gas through aqueous phospholipid dispersions(MLV, LUV)d. . High shear homogenization (mainly SUV)

Methods based on replacement of organic solvent(s) byaqueous mediaaqueous mediaa. Removal of organic solvent(s) before hydration (MLV, OLV,SUV)b. Reverse-phase evaporation (LUV, OLV, MLV)c. Use of water immiscible solvents: ether and petroleumetherinfusion (solvent vaporization) (MLV, OLV, LUV)d. Use of water miscible solvents such as ethanol injection (MLV,OLV,SUV)

Methods based on detergent removal by

a. Gel exclusion chromatography (SUV)

b. "Slow" dialysis (LUV, OLV, MLV)

c. Fast dilution (LUV, OLV)

d. Miscellaneous related techniques (MLV, OLV, LUV, SUV)

Methods based on size transformation and fusion Methods based on size transformation and fusion

a. Spontaneous fusion of SUV in the gel phase (LUV)

b. Freeze-thawing (MLV)

c. Freeze-drying (MLV)

d. Dehydration of SUV followed by rehydration with or without sizing

e. Ca2+ ion induced fusion (LUV, OLV, MLV)

f. Detergent-induced growth (LUV, OLV)

Generalidades:Los lpidos deben de ser hidratadosHomogeneicidad de tamaoMolculas no encapsuladas deben de ser eliminadas

1.- Hidratacin

a. Mtodos mecnicosSe hidratan por agitacin los lpidos, sobre una superficie de vidrio y organizados en capa fina, depositados desde una disolucin orgnica.

Extrusin a baja presin, homogeneizacin a alta velocidad o ultrasonicacin se usa para disminuir el tamaotamao

b. M. Basados en el reemplazamiento de disolventes orgnicos por medios acuososSe inyecta el disolvente orgnico con los lpidos en una fase acuosa y el primero se va evaporando continuamente (alta eficiencia de encapsulacin, 50%)

Se hace una emulsin w/o y esta se incorpora en unaw/o/w (baja eficacia)

c. M. Basados en la eliminacin del detergente

Se disuelven los lpidos en presencia de tensoactivosy luego se eliminan stos por diferente tcnicas (bajay luego se eliminan stos por diferente tcnicas (bajaeficacia de encapsulacin, gran posibilidad deincorporar protenas en la membrana, formacin deinmunoliposomas)

d. M. Basados en la transformacin de tamao y fusinAl sonicar fosfolpidos hay defectos en la membrana,al trabajar por encima de su Tc se evitan y causanfusin, dando LUV con una distribucin amplia

Citas 91-99

e. M. Basados en ajuste de pHDispersin de cido fosfatdico/fosfatidilcolina concambio de pH (baja eficacia, heterogeneidad y altoscambio de pH (baja eficacia, heterogeneidad y altoscostos)

2. Distribucin de tamao

a. Sin homogeneizacin de tamao

El tamao va a depender de los parmetroscontrolables del mtodo empleado (Dispersin 0.2 m)

b. Con homogeneizacin de tamao

.- Ultracentrifugacin

.- Cromatografa de permeacin en gel (tamao deporo)

.- Sonicacin

.- Homogeneizacin a alta velocidad

.- Extrusin a baja presin (Membranas depolicarbonato y presiones de 1 MPa)

< 0.2 m

3.- Eliminacin de material no encapsulado

Puede causar efectos no deseados

Para eliminarlo:

Dilisis y ultrafiltracin: Paso a travs de membranas

Ultracentrifugacin: Centrifugacin a altas velocidadesUltracentrifugacin: Centrifugacin a altas velocidades

Cromatografa de permeacin en gel: Tienen que pasar los liposomas grandes,la encapsulacin se da en ciertas condiciones

Reacciones de intercambio inico: Resinas que interaccionen con el material a eliminar

Interacciones liposomas-soluto

1.- Interaccin soluto-bicapa y permeabilidad de la bicapa

Rigidez y carga de la bicapa Props. FQ del soluto

Fzas: Electrostticas, VW, efecto hidrofbico

Tipos de frmacos:Tipos de frmacos:

Muy solubles en agua: Agua atrapada en el interior del liposoma

Solubles en agua: Agua atrapada y solubilidad en la bicapa

Insolubles en agua: Solubilidad en la bicapa

2.- Liberacin dirigida

Evitar los lisosomas de la clula

2.1.- Controlada por la composicin de la bicapa

Colesterol o gel: Liberacin lenta

Cristal lquido o sin colesterol: Biodegradacin rpida

2.2.- Dependiente del pH

cido olico + dioleoilfosfatidiletanolamina: a pH < 6.5 cido olico + dioleoilfosfatidiletanolamina: a pH < 6.5 se protona el cido y se desestabiliza la membrana

2.3.- Desestabilizacin por eliminacin de componentes de la bicapa

Colesterol puede ser sustituido por componentes del suero; Otros pueden ser eliminados de la mb al adicionar al medio una sustancia con afinidad hacia ellos

2.4.- Activacin del sistema del complemento

Inmunoliposomas

Interaccin Ac-Ag

Se activa la cascada del S.Complemento

2.5.- Desestabilizacin de liposomas por la temperatura

T Cristal lquido GelTc Cristal lquido Gel

Gran permeabilidad de la membrana

Cmo mejorar la eficacia de carga?

1.- Carga Pasiva

Se atrapa el frmaco en la formacin de liposomas

Volumen capturado (l/mol lpido): Agua encapsulada por mol de lpido.

Eficiencia de encapsulacin: Fraccin de soluto encapsulada por el liposomas

2.- Carga Activa

Permiten cargar los liposomas despus de la formacin del mismo, manteniendo su integridad.

Se atrapa el frmaco en la formacin de liposomas o en una etapa de debilitacin de la membrana.

2.1.- Gradiente de pHSe puede encapsular frmacos inicos

manteniendo un gradiente de pH en la bicapa

2.2.- Carga de cationes metlicos

Se hacen lipoflicos los cationes al acomplejarse con un vehculo lipoflico (quinolato).

En el interior del liposoma hay un agente quelante con gran afinidad por el catin metlico y eso direcciona el compuesto hacia el interior del liposoma

Estabilidad de liposomas

1.- Estabilidad qumica

1.1. Hidrlisis de las uniones ster

Factores que le afectan: Temperatura, pH, rigidez de la bicapa, fuerza inica

1.2.- Peroxidacin lipdica de fosfolpidos

Cadenas aclicas poliinsaturadas

Oxidacin

Perxidos cclicos, hidroperoxidos, malondialdehido, alcanos

Cambios en la permeabilidad de la membranaCambios en la permeabilidad de la membrana

Solucin: Ausencia de metales pesados, adicin de antioxidantes (-tocoferol), agentes complejantes (EDTA)

Precaucin: Irradiacin gama

2. Estabilidad fsica

2.1.- Perdida de carga.- Depende de la composicin de la bicapa y de las propiedades FQ del frmaco.- Colesterol: estabiliza la bicapa.- Estado de gel es ms estable que Cristal lquido

2.2.- Agregacin: Formacin de grandes unidades de material liposmico, formadas por liposomas

2.3.- Fusin: Formacin de nuevas estructuras coloidales

3. Aumento de la vida de los liposomas

Finalidad: Distribucin adecuada en el organismo

3.1.- Seleccin de los componentes de la bicapa

.- Bajas temperaturas y pH = 6-7

.- Cadenas lipdicas saturadas.- Cadenas lipdicas saturadas

.- Adicin de antioxidantes y eliminacin de oxigeno.- Colesterol.- Elegir bicapas en estado gel (DSPC).- Evitar agregacin y fusin mediante cargas en la superficie

3.2.- Liofilizacin

.- Crioprotectores: Sacaridos, proteinas, aa y polialcoholes.

Forman estructuras vtreas amorfas en las cuales se incluye el liposoma y se protege del crecimiento cristalino

Forman una capa de hidratacin que evita la desestabilizacin por perdida del agua de hidratacindesestabilizacin por perdida del agua de hidratacin

.- Naturaleza de la bicapa

La temperatura de la transicin de fase puede variar

.- Parmetros tecnolgicos: Tiempo, velocidad y temperatura de congelacin

Caracterizacin

1.- QumicaCromatografa (TLC, GLC, HPLC) Separar componentesDeteccin y cuantificacin: ndice de refraccin, dispersinde luz, ionizacin por flama

2.- Fsica.- Determinacin del tamao

Microscopa electrnica: tincin negativa y criofijacinMicroscopa electrnica: tincin negativa y criofijacinUltracentrifugacin

.- Nmero de capas y morfologa internaMicroscopa electrnica31P-NMR: reacciones con metales o productos coloreados

.- Carga = Potencial Zeta

.- Fluidez de la bicapaTcnicas de polarizacin por fluorescencia (Pegan

molculas en la interfase lpido-agua)

Preparaciones estriles y libres de pirgenos

1.- Esterilizacin por calorPerdida de retencin y degradacin qumica

2.- Esterilizacin por Rayos gamaRptura qumica de los fosfolpidos

3.- Esterilizacin por filtracinConsiderar liposomas mayores de 0.2 m

4.- Procedimientos de produccin aspticosSistemas caros y especificaciones difciles de encontrar

Aplicaciones teraputicas

1.- Nuevos sistemas de liberacin va parenteralIV: Aclaramiento por el SER (liposomas estabilizados)IP, IM y Subcutanea: sistemas depot de lenta liberacin

.- Estabilizacin de liposomas: Incorporacin de componentes naturales hidroflicos (gangliosidos, componentes naturales hidroflicos (gangliosidos, fosfatidilinositol, PEG = Stealth) Circulacin prolongada extravasacin efecto terapetico

.- Liberacin de proteinas y pptidos: Nz lbil y eliminacin sistmica

Discontinuidades en la membrana por interacciones de la bicapa con las proteinas

.- Liposomas funcionalizados: superficie modificada para interaccionar con ciertos tipos de clulas o tejidos (Ac, glicoproteinas, etc.). Estimulacin del Sistema inmunitario

2.- Liberacin tpica de liposomas: Ocular y drmica

.- Liberacin controlada de frmacos

.- Especificidad de accin

.- Matriz solubilizante

.- Mejorar la penetracin

Ejem: Liposoma-gangliosido-carbacol: adhesin a cornea

Esteroides en piel

3.- Liberacin pulmonar

Alternativa a la administracin sitmica de antiasmticos y antialrgicos.

.- Aumentan solubilizacin de frmcos en el aerosol

.- Son biodegradables. Se evitan efectos secundarios

Precaucin: Tamao de las gotas

4.- Sistemas de liberacin oral

Tracto gastrointestinal: pH extremo, altas concentraciones de Ts (sales biliares), altas concentraciones de enzimas

Uso: estabilidad en el tracto GI e interaccin con la pared intestinal

Pruebas clnicas

.- 1976. Liposomas-bleomicina 111In Cncer

.- 1976. Liposomas-amiloglicosida glicognesis

.- Terapa antifngica: Anfotericina B

.- Anticancerigenos: .- Anticancerigenos: Doxorubicina. Tripptido muramilOtros compuestos

.- Vacunas: malaria

.- Artritis intraarticular

Conclusiones

.- Los liposomas se pueden incorporar en formas farmacuticas.- Se han estandarizado mtodos analticops para caracterizarlos.- Se ha conseguido carga adecuada y retencin prolongada.- Se ha desarrollado adecuado equipo de manufactura.- Ha habido gran avance en el desarrollo de liposomas de larga circulacin.- Se han producido vacunas.- Se han empleado en terapia gnica.- Se est estudiando su uso para liberacin de proteinas

.- Campo multidisciplinario Mayores logros

De Oliveira, MC. Dubernet, C. Paternostre, M. Fattal, E. Ollivon, M. et al. pH-sensitive liposomes as a carrier for oligonucleotides (ODN): development of a new methodology to follow physicochemical changes along with pH of native and ODN loaded liposomes. S.T.P. Pharma Sciences. 11(1): p 103-107. 2001.

Monem, AS. Ali, FM. Ismail, MW. Prolonged effect of liposomes encapsulating pilocarpine HCl in normal and glaucomatous rabbits. International Journal of Pharmaceutics. 198(Mar 30): p 29-38. 2000

Hattori, Y. Kawakami, S. Yamashita, F. Hashida, M. Controlled biodistribution of galactosylated liposomes and incorporated probucol in biodistribution of galactosylated liposomes and incorporated probucol in hepatocyte selective drug targeting. Journal of Controlled Release. 69(Dec 3): p 369-377. 2000.

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Lambros, MP. Schaffer, F. Blackstock, R. Murphy, JW. Liposomes, a potential immunoadjuvant and carrier for a cryptococcal vaccine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 87(Sep): p 1144-1148. 1998.

NIOSOMAS

Vesculas formadas principalmente por Ts no inicos

Presentan mayor estabilidad que los liposomas

Ts usados: poliglicerol alquil-teres, glucosil alquil-teres, teres alquil-teres, teres corona y polioxietilen alquil-teres y steres

Se introducen ts cargados para aumentar la estabilidad

% colesterol

Tensoactivos y Consideraciones geomtricas

steres: .- Se degradan en presencia de esterasas en trigliceridos y cidos grasos..- Son menos txicos que los teres

.- Gran importancia del rea interfacial (A) por molcula de tensoactivo

A > 3Vc / lc

Vc = volumen del hidrocarbonolc = Mxima longitud alcanzable del hidrocarbono

Micelas esfricas

A > 2Vc / lc Micelas en barraA > 2Vc / lc Micelas en barra

A > Vc / lc Vesculas

Al aumentar la concentracin de tensoactivos:.- Vesculas Capas.- Micelas en barra Fase hexagonal.- Micelas esfricas Fase hexagonal o

cbica

Formacin de vesculas

Tensoactivo EO3 EO5 EO7

C10 + - -

C12 + - -

C14 + + -

C16 + sep. fase + lig.viscosa + viscosa

C16EO3 , C18EO3, C16EO5 y C18EO5 : Gel a temperatura ambiente, desestabilizan la suspensin

C10EO5 y C12EO5: cabezas hidroflicas voluminosas

Solucin: colesterol

C16 + sep. fase + lig.viscosa + viscosa

C18 + sep fase + sep. fase - lig. viscosa

Transiciones gel-lquido

FluorometraFluidez depende de: Grupo hidroflico

Longitud de la cadena alqulicaContenido de colesterol

Parmetros:Dw: refleja la mobilidad de las cadenas alqulicasc: grado de orientacin de las cadenas

Preparacin de vesculas

Mtodos

1.- M. De inyeccin de ter: se disuelven los ts en dietil-eter y se inyectan lentamente a 60C en la fase acuosa.

LUV Presencia de ter

2.- M. De agitacin manual: se disuelven los ts en dietil-eter, se evapora con rotavapor y se hidrata a 50-60C con agua.se evapora con rotavapor y se hidrata a 50-60C con agua.

LUV

3.- Sonicacin: Se adiciona ts en agua y se sonica. SUV. > 100nm

4.- M. De Handjami-Vila: Se mezclan ts y activo en agua, se homogeniza por homogeneizacin o ultracentrifugacin

5.- Evaporacin en fase reversa: Se disuelve el ts en una mezcla de cloroformo-buffer fosfatos, se sonica y se evapora con rotavapor. Se forma un gel, se hidrata y se contina la evaporacin.

T > 60 C: SUV LMV > 1m

Agitacin: LMV SUV

Eficacia de atrapamiento

.- Depende del mtodo de preparacin

.- Inyeccin de ter > agitacin manual

.- > [colesterol] > atrapamiento

.- > longitud de cadena > atrapamiento

.- > carga > atrapamiento

Toxicidad

Disminucin de la frecuencia del ritmo cliliar de la traquea:

Niosomas en estado gel < txicos que cristal lquido

Proliferacin de queratinocitos

steres < txicos que teres steres < txicos que teres (Degradacin enzimtica)

Aplicaciones teraputicas

Administracin intravenosa

Doxorubicina: Niosomas de C16G3 con y sin colesterol, 800-1000 nm, mtodo de agitacin manual.

Disolucin de frmaco

Niosomas

Estiboglucinato de sodio: (leishmaniasis).

Distribucin del frmaco segn la composicin del vehculo y comparado con su administracin sin vehculo

Administracin oral

Metotrexato

47.5:47.5:5

60:30:5C16G3 + colesterol + dicetilfosfato

Mtodo de agitacin manual + sonicacin, 100nm

> Concentracin en hgado, cerebro y sangre que el metotrexato solo.

No diferencias entre los dos tipos de niosomas

Administracin transdrmica

Se evita efecto de primer paso

Lenta velocidad de penetracin. Estrato corneo es la barrera

Comparacin C18EO3 (gel) con C12EO3 (cristal lquido)Comparacin C18EO3 (gel) con C12EO3 (cristal lquido)

> Flujo de estradiol en cristal lquido

Penetracin individual de los componentes o de las vesculas

1 2

3

Niosomas de estradiol a diferentes tiempos, despus de su administracin en piel(estrato corneo)

Hu, C. Rhodes, DG. Proniosomes: novel drug carrier preparation. International Journal of Pharmaceutics. 185(Aug 5): p 23-35. 1999.

Carter, KC. Dolan, TF. Alexander, J. Baillie, AJ. McColgan, C. Visceral leishmaniasis: drug carrier system characteristics and the ability to clear parasites from the liver, spleen and bone marrow in Leishmania parasites from the liver, spleen and bone marrow in Leishmania donovani infected BALB/c mice. Journal of Pharmacy & Pharmacology. 41(Feb): p 87-91. 1989

NANOPARTCULAS

Partculas coloidales slidas en el rango de tamaos 10 - 1000 nm

Estn hechas de material macromolecular en el cual el frmaco est disuelto, atrapado o encapsdulado y al cual puede ser adsorbido o unido.

Polmeros biodegradables

Tamao de partcula < de 4 m (dimetro de los capilares)

Eleccin de polmero, tamao y mtodo de preparacin

Bioaceptabilidad del polmeroPropiedades fisicoqumicasMeta teraputica

Mtodos de preparacin

Polimerizacin en emulsin

.- Se disuelve el monmero en un disolvente por medio de un ts.

.- Se polimeriza Th de polimerizacin en gotasTh de polimerizacin en micelasTh de polimerizacin en micelasTh de polimerizacin en disolvente

.- Precipitacin

PM: 1000 Da polialquilcianoacrilato4 x 105 Da Polimetilmetacrilato

Tamao: 100 nm Densidad: 1 g/cm3

1 particula: 1000 5 x 105 macromolculas

Polimerizacin en una fase acuosa continua

Polimetilmetacrilato

.- Se biodegradan muy lentamente (respuesta inmune deseada, vacunas)

.- Metilmetacrilato (monmero) S = 1.5%

.- Radiacin de alta energa (R-) (El PM dp de la [monmero])

.- Iniciacin qumica (peroxodisulfato de amonio o de potasio) + calor.- Iniciacin qumica (peroxodisulfato de amonio o de potasio) + calor(PM aumenta con la [monmero]) y disminuye con el aumento de temperatura y la [iniciador]

Tamao de partcula (nm)

Concentracin de metil metacrilato (mM)

10 33.7 80 156.25

65 85 65 85 65 85 65 85

Peroxodisulfato de potasio (mM)

65 85 65 85 65 85 65 85

0.3 85 72 129 128 181 170 256 2621.65 98 88 151 169 212 193 248 2483.0 92 72 135 149 223 177 250 258

Polialquilcianoacrilato

.- Son degradadas rpidamente (se eliminan del cuerpo en pocos das)

.- Solubilidad = 0.05-7%

(Agitacin constante para mantener disperso el monmero en agua)

.- Polimerizacin inicia con bases (-OH- del agua o frmacos)

y finaliza con H+. Nanopartculas pequeas

Aglomeracin(estabilizantes)

Difcil predecir tamao de partcula

HO- + CH2=CCN

CO2RHO-CH2-C-

CN

CO2RPolimerizacin

HO CH2-C CH2-C-H+

HO-CH2-C H

CN CN CN

n+1

HO CH2-C CH2-C

CO2R nCO2R CO2R

Fin de la polimerizacin

Copolmeros acrlicos

.- Se usaron los siguientes monmeros: metilmetacrilato, 2 hidroxietil metacrilato, cido metacrlico, etilenglicol dimetil acrilato, acrilamida, N,N dimetilenacrilamida.

.- Irradiacin gama o iniciacin qumica

Poliestireno

.- No biodegradable

60-360 nm

.- Poco soluble Uso de tensoactivos

Polivinilpiridina

.- Polimerizacin en mezclas agua/metanol o agua/acetona

.- Disoluciones con agentes de entrecruzamiento (Poli-oxido de etileno o NN bis-metilenacrilamida)

.- El tamao de partcula dp de [monmero] y cantidad de disolvente orgnico. (160-250 nm)

Poliacroleina

.- Activacin por R- o por condiciones bsicas (NaOH)

.- El tamao se controla con el tipo y concentracin de tensoactivo (40-8000nm)

Poliglutaraldehido

.- Policondensacin aldlica o monmero de glutaraldehido a pH alcalino.

.- El tamao de partcula se controla con la concentracin de monmero (a <

Polimerizacin en emulsin en una fase orgnica continua

.- Se uso para polialquilacrilatos y polialquilcianoacrilatos

.- Se disuelven los monmeros en fase orgnica o en fase acuosa y con tensoactivos se incorporan en fase orgnica.

.- Se obtienen nanocpsulas (a veces): el frmaco se disuelve en la fase acuosa y se adicionan ts para hacer una emulsin a la cual se le adiciona el monmero que migra a la gota y polimeriza rpidamente en medio bsico, dejando en el interior polimeriza rpidamente en medio bsico, dejando en el interior una disolucin acuosa separada del medio por una capa polimrica

Polimerizacin interfacial

.- Se consiguen nanocpsulas

Poli (Na,Ne-l-lisinadiiltereftaloil)

.- Se aplica una diferencia de potencial entre ambas fases y cuando este reduce la ts interfacial a cero hay emulsificacin

Polialquilcianoacrilato

.- Se adiciona monmero y frmaco en la fase oleosa y se aaden lentamente a una fase acuosa con tensoactivos.

.- El contacto con los OH-, inician la polimerizacin y se forman las nanocpsulas

Deposicin de disolvente

.- Se disuelve el polmero y un ts en acetona

.- Se le adiciona el frmaco y se pone la mezcla en agua con ts.

.- Evaporacin de la acetona y parcial eliminacin del agua

.- Formacin de nanocpsulas

Evaporacin de disolvente

.- Se disuelve el polmero y el frmaco en un medio orgnico.

.- Se emulsifica en agua

.- Se evapora por calor o bajas presiones

.- El tamao de partcula depende del tamao de la gota

Velocidad de agitacin, tipo y cantidad de ts, la viscosidad de los medios y la temperatura

Ejemplos: cido polilctico, poli (-hidroxibutirato), chitosan

Desolvatacin desde una disolucin orgnica de polmeros

(Nanopartculas poliacrlicas)

.- Se adicionan los polmeros, copolmeros y frmaco en un disolvente orgnico miscible con el agua.

.- Se adicionan al agua

.- Se observa formacin de nanopartculas (90-205 nm) y gran eficacia de atrapamiento.

Emulsin oleosa (Nanoparticulas de albumina)

.- Se disuelve el frmaco y el polmero en agua y se emulsiona en una fase oleosa.

.- Las gotas pueden ser endurecidas por entrecruzamiento con aldehidos o por desnaturalizacin a altas temperaturas.

.- Si gelatina, la desnaturalizacin se da a bajas temperaturas

Unin de frmacos a nanopartculas

.- Las nanopartculas se pueden producir en presencia del frmaco o adsorberlo despus a las nanopartculas vacias.

.- Si est presente:Acoplamiento covalente al polmeroFormacin de una dispersin o disolucin slida

.- Si se adiciona despus:Unin covalenteAdsorcin: en superficie o formacin de dispersin slida

Tipo de unin:Diferente mecanismo y velocidad de liberacin

Caracterizacin de nanopartculas

1.- Fisicoqumica

Parmetro Mtodo

Tamao de partcula Espectrometra de correlacin fotnicaMicroscopa electrnica de transmisinMicroscopa electrnica de barrido (SEM)SEM combinada con espectrometra de energa dispersiva de Rayos-X

Peso Molecular Cromatografa en gel

Densidad Picnometra de compresin de helio

Cristalinidad Difraccin de Rayos-XCristalinidad Difraccin de Rayos-XCalorimetra de barrido diferencial

Carga superficial ElectroforesisAnemometra laser Dopler

Hidrofobicidad Cromatografa de interaccin hidrofbicaMedidas de ngulo de contacto

Propiedades de superficie Espectrometra de masas de iones secundarios estticos

Anlisis de elementos en la superficie ESCA (Espectroscopia fotoelectrnica de Rayos-X para anlisis qumico

2.- Anlisis de carga de frmaco

.- Separacin de las partculas por ultracentrifugacin o ultrafiltracin.

.- Disolucin de las nanopartculas

.- Cuantificacin

(Puede resultar una cuantificacin erronea)

.- Filtracin por gel.- Filtracin por gel

(Puede haber liberacin del frmaco)

3.- Degradacin de las nanopartculas

.- Erosin del polmero

.- Ruptura del ster formando un cido polimrico soluble

Degradacin de nanopartculas de albmina

4.- Liberacin de frmacos

.- Puede ocurrir por:

1.-Desorcin de la superficie

2.-Difusin a travs de la matriz

3.-Difusin a travs de la

.- Se mide:

1.- Celdas de difusin

2.- Tcnicas de dilisis

3.- Ultracentrifugacin3.-Difusin a travs de la pared

4.-Erosin de la matriz

5.- Proceso combinado de erosin-difusin

4.- Ultrafiltracin

Aplicaciones de las nanopartculas

Citostticos

Antiinfecciosos

Pptidos

Administracin peroralAdministracin peroral

Administracin oftlmica

Antiinflamatorios

Nanotubos de carbn

Nanopartculas de 5 nm, ejem: anticuerpos

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MICROPARTCULAS

Partculas pequeas, del orden de micras, que sirven paraTransportar frmacos.

.- Microesferas: micropartculas que contienen el frmaco disperso o disuelto en la matriz polimrica

.- Microcpsulas: micropartculas que mantienen el frmaco en su interior y estn rodeadas por una capapolimrica

Pueden ser preparadas a partir de diferentes materiales y sus caractersticas fsicas dependern del uso que se pretende. La eleccin del material depende de:

.- Frmaco

.- Destino

.- Enfermedad

.- Duracin de accin

.- Toxicidad de la materia prima

Preparacin

La tcnica utilizada va a depender de:.- Naturaleza del material

.- Naturaleza del frmaco

.- Tamao deseado

.- Especificaciones de carga y liberacin.- Especificaciones de carga y liberacin

Generalidades:.- Polimerizacin de monmeros

.- Precipitacin por reemplazamiento del disolvente

.- Dispersin del material por homogeneizacin-emulsificacin

Aceite de oliva

muy puroDisolucin acuosa de

albmina ms el frmaco

Agitar en frascos

ajustados con aspas

Emulsin

aceite-agua

Entrecruzado con

glutaraldehido 1-5%

Microesferas qumicamente

estabilizadas

Calor

100-160 C

Microesferas

estabilizadas por calor

Disolucin acuosa de

estabilizante en 0.01 N de

HCl ms el frmaco

Monmero de alquilcianoacrilato

adicionado gota a gota Formacin del polmero al

agitar 2 h a temperatura

ambiente

Nanopartculas de

polialquilcianoacrilato en suspensin

Ajuste de pH,

filtrado y

liofilizacin

polialquilcianoacrilato en suspensin

Nanopartculas de

polialquilcianoacrilato en polvo

Polihidroxibutirato en

disolvente orgnico

Surfactante en disolucin

acuosa

Sonicacin

Evaporacin del

Emulsin agua en aceite

Evaporacin del

disolvente

Microesferas de PHB en suspensin

filtrado y liofilizacin

Microesferas de PHB en polvo

Micropartculas de polibutil-2-cianoacrilato por SEM

Carga y liberacin de frmacos

Para que las micropartculas sean efectivas deben de:

.- Llevar suficiente carga de frmaco

.- Liberarlo segn un perfil de tiempo determinado

Incorporacin:

.- Durante el proceso de manufacturaAlta eficacia de carga y liberacin lenta

.- Posterior a la manufacturaBaja eficacia de carga y liberacin rpida

Problemtica: Efecto burst = liberacin de la carga en los estadios iniciales de la administracin

Soluciones:.- Entrecruzamiento de la matriz polimrica.- Recubrimiento con polmeros.- Unin covalente entre el polmero y el frmaco

Posibles mecanismos de liberacin:.- Difusin.- Desorcin.- Erosin.- Biodegradacin.- Combinacin de todos ellos

Importancia en ladistribucin delfrmaco en el organismo

Usos en teraputica

.- Evitar la accin del organismo sobre el frmaco(degradacin) o evitar la accin del frmaco sobre elorganismo (toxicidad).

.- Liberacin controlada: aplicacin nasal y ocular, etc.

.- Especificidad de accin.- Especificidad de accinAntineoplsicos

Artritis reumatoide (Liberacin compartimental)

Liberacin en el pulmn

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ANTICUERPOS

.- El uso de anticuerpos especficos como vehculos hace que el frmaco se encuentre en > proporcin en el lugar de accin y en menor concentracin a nivel sistmico.

.- Tcnicas para obtencin de anticuerpos: hibridoma

.- Unin frmaco-Anticuerpo

CovalenteNo covalente

Prdida de actividad o disminucin de la misma, as como problemas de paso de membranas

ELECCIN DE ANTICUERPOS

.- Debe ser altamente especfico

.- Poseer gran afinidad para unirse con las clulas correspondientes

.- Fciles de preparar

.- Ac monoclonales: si hay modificacin de su actividad, su .- Ac monoclonales: si hay modificacin de su actividad, su eficiencia va a bajar

.- Ac policlonales: mayor actividad hacia diferentes antgenos

ELECCIN DE FRMACOS

.-El frmaco debe de tener un grupo funcional al cual se pueda unir el anticuerpo, sin prdida de actividad farmacolgica.

CONJUGACIN CON FRMACOS

.- Normalmente se usa una molcula de unin para conseguir la interaccin del frmaco con el anticuerpo.

Dextrano: .- Es barato, no degradable, muy soluble, no txico.- Se le adicionan grupos funcionales para poder servir

como puentecomo puenteDextrano + NaIO4Dextrano + hidrazida

cido poli-glutmico.- No es txico

Oxidacin (-CHO)

D-hidrazida

PG-hidrazidaPG + hidrazida

(-COOH)

Ejemplos:

.- Conjugados de daunomicina y adriamicina

Unin va dextrano oxidado a Ac monoclonales y policlonales contra AFP de rata (-fetoproteina segregada por clulas hepticas cancerosas)

Tanto frmaco como Ac mantienen su actividadTanto frmaco como Ac mantienen su actividad

.- Conjugados de cis-platino

Buscar en la red, poner alguna otra cita sobre anticuerpos como vehculos

.- Tsunoda, S. Tsutsumi, Y. Nakagawa, S. Mayumi, T. Targeting therapy using a monoclonal antibody against tumor vascular endothelium. Yakugaku Zasshi - Journal of the Pharmaceutical Society of Japan. 120(Mar): p 256-264. 2000. AN: 38-05408.- Panpitpat, C. Thisyakorn, U. Chotpitayasunondh, T. Furer, E. Cryz, SJ. et al. Elevated levels of maternal antitetanus toxin antibodies do not suppress the immune response to a Haemophilus influenzae type b polyribosylphosphate-tetanus toxoid conjugate vaccine. Bulletin of the World Health Organization. 78(3): p 364-371. 2000.World Health Organization. 78(3): p 364-371. 2000..- Lundberg, BB. Griffiths, G. Hansen, HJ. Conjugation of an anti B cell lymphoma monoclonal antibody, LL2, to long circulating drug carrier lipid emulsions. Journal of Pharmacy & Pharmacology. 51(Oct): p 1099-1105. 1999..- Rehlaender, BN. Cho, MJ. Antibodies as carrier proteins. Pharmaceutical Research. 15(Nov): p 1652-1656. 1998..- Normand-Sdiqui, N. Akhtar, S. Oligonucleotide delivery: uptake of rat transferrin receptor antibody (OX-26) conjugates into an in vitro immortalized cell line model of the blood-brain barrier. International Journal of Pharmaceutics. 163(Mar 18): p 63-71. 1998.

CLULAS ROJAS

Pueden ser abiertas y reselladas para introducir molculas y no sufren variaciones en su estructura.

Son especficas para clulas eritrofagocitarias ejem: enfermedad de Gaucher (glucocerebsidos)

Su comportamiento en circulacin es idntico que el de GR sin modificar.GR sin modificar.

La liberacin del frmaco se dar por:Solubilidad lipdicaTransporte por difusin facilidad o t. Activo

Sistemas de liberacin controlada: depende de la concentracin alcanzada en plasma segn su velocidad de liberacin

PROCEDIMIENTOS DE CARGADO

1.- Ruptura reversible de la membrana por fuerzas osmticas

.- Dilucin del medio externo = hipotonicidad[NaCl] = 0.55% - 0.33% (100% lisis)Clulas jovenes + resistentesClulas venosas lisan antes que arterialesGhost: lavado antes de resellar

.- DilisisSe colocan las clulas en una bolsa de dilisis frente a un medio hipotnico

.- Dilucin pre-hinchamientoSe suspenden en un medio hipotnico (no se rompen, solo se hinchan) y luego se rompen con lamnima cantidad de medio hipotnico (GR cas integro en su contenido intracelular)

2.- Aumento de la permeabilidad de la membrana mediantevoltaje (pulso elctrico)

Se puede controlar nmero y tamao de poros en el GR.Se pueden producir clulas anormales que son eliminadas por el SER (pulsos excesivos).

.- Procedimiento iso-inicoAdicin de penetrantes (glicol)

3.- Fusin con otras clulasSi el frmaco est en el interior, pasar al citoplasmadel GR.Si el frmaco est en la membrana, quedar en la membrana del GR.

4.- EndocitosisVacuolas en el citoplasma. Si es hipertnico hay shock osmtico y el frmaco queda libre.

RESELLADO

Medio hipotnico: claro

Medio isotnico: turbio

Eritrocitos abiertos

Eritrocitos resellados

Medio hipotnico

+ sales+ sales

Medio isotnico

Incubacin a 37 C por 30-60 min

PROPIEDADES DE ERITROCITOS RESELLADOS

1.-Prdida de la [componentes citoplasticos] normal

2.- Unin de Ac a los GR

3.- Dao qumico de la membrana

4. Alteraciones en los lpidos de membrana4. Alteraciones en los lpidos de membrana

Ejem: Si 1mM de Ca2+ es presente durante la lisis, se pierde la asimetra normal de los fosfolpidos.

USOS TERAPUTICOS

.- Liberacin de frmacos a clulas fagocitariasEjem: leishmaniasis Formicina A

.- Vehculo para enzimas y proteinas

.- Liberacin prologada de frmacosEjem: Artritis CorticosteroidesEjem: Artritis Corticosteroides

TERAPIA GNICA

Es la introduccin de material exgeno (natural orecombinante) en sujetos humanos para corregirdeficiencias celulares expresadas en el nivel fenotpico."

Es una estrategia teraputica basada en la modificacindel repertorio gentico de clulas somticas mediante ladel repertorio gentico de clulas somticas mediante laadministracin de cidos nucleicos y destinada a curartanto enfermedades de origen hereditario como adquirido.

Es la transferencia de material gentico nuevo a clulasde un individuo dando lugar a un beneficio terapeticopara el mismo.

Aos 70s:

.- Se desarrolla la tecnologa de clonacin de genes

.- Surge el concepto de la transferencia de informacingentica como un utensilio para la prctica clnica

(Sin la capacidad de aislar y replicar secuenciasgenticas definidas, sera imposible producir materialpurificado para uso clnico)

La terapia gnica se presenta como una promesa terapetica de utilidad en todo tipo de patologas.

Terapia gnica:.- Avances del conocimiento en Biologa Molecular,

Gentica , Virologa, Bioqumica, y Biofsica entre otras.

purificado para uso clnico)

Primera meta para este tipo de terapia:

.- los desordenes genticos.

Fin de la manipulacin gentica:

.- En pacientes con defectos genticos simples, tales como la hemofilia, lo nico que se requiere es una fbrica de protenas para producir suficiente factor de fbrica de protenas para producir suficiente factor de coagulacin circulante para ser efectivo fisiolgicamente.

.- En enfermedades como el cncer es necesario, inicialmente, conseguir especificidad hacia las clulas malignas, ya que deberan usarse sistemas teraputicos que no requieran el tratamiento posterior de defectos somticos resultantes como reacciones adversas.

Problemas:

Dificultad de liberar los genes en el lugar adecuado y controlar su expresin

Solucin:

Se consideran diferentes tipos de vehculos que sean capaces de acarrear el material gentico a su lugar de accin. A esos vehculos se les conoce como vectores.de accin. A esos vehculos se les conoce como vectores.

Puede llevar a una serie de riesgos potenciales ( insercin de mutagnesis que puede degenerar en cncer y viremia)

Paso limitante:

Eficiencia de la transferencia gnica y duracin de la expresin del gen teraputico.

Los factores a considerar en un vector:.- Eficacia de la transferencia del gen.- Duracin de la expresin del gen.- Capacidad para repartir la dosificacin.- Capacidad para dirigirse a las clulas apropiadas

y evitar las inapropiadas.

Los factores desconcertantes que puedan aparecer:.- Incluyen la incapacidad del vector para entrar o

integrarse en los cromosomas celularesintegrarse en los cromosomas celulares.- El cierre de los promotores transcripcionales, .- La prdida del ADN introducido.- La destruccin de las clulas tratadas .- La neutralizacin del vector insertado o del

producto gnico.

Eleccin del vector

MTODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES

1.- Retrovirus

2.- Adenovirus

3.- Virus adeno-asociados

4.- Otros virus4.- Otros virus

5.- Sistemas no virales5.1. Transferencia gnica mediada por receptores5.2. DNA desnudo5.3. Partculas de DNA condensadas5.4. Inyeccin libre de agujas5.5. Electroporacin5.6. Bombardeo de partculas5.7. Liposomas

DISEO DE VECTORES

Los vectores vricos estn hechos al menos de dos componentes: el genoma vrico modificado y la estructura del virin que lo rodea.

Se debe discapacitar el crecimiento del virus en las clulas diana mientras se mantiene su capacidad para desarrollarse en forma de vector.en forma de vector.

De esta forma, podemos considerar que los cidos nucleicos del vector comprenden dos elementos: esas secuencias vricas esenciales que permanecen y la unidad de transcripcin para el gen exgeno.

Pelcula de funcionamiento de los vectores

Funcionamiento de los vectoresFuncionamiento de los vectores

1.- Retrovirus

Son los vectores ms ampliamente usados

Son derivados del virus de la leucemia murina Moloney

Ventajas:.- Integra el DNA en el anfitrin, sin aparente patogeneidad..- Pueden alcanzarse de moderados a altos tters.- Pueden alcanzarse de moderados a altos tters.- Pueden ser infectadas un amplio rango de clulas.- Se pueden insertar en el vector genes grandes

Inconvenientes:.-Se requiere divisin celular para integrarse.-Sus titers son bajos comparados con virus DNA (adenovirus y herpex virus)

.- Se inserta en el genoma aleatoriamente, pudiendo causar mutaciones.

Los retrovirus:

.- contienen ARN de cadena sencilla como genoma viral

.- el ARN vrico se transcribe a la inversa para producir ADN de cadena doble (gracias a la accin del enzima reversotranscriptasa)

.- el ADN que se integra en el genoma de la clula .- el ADN que se integra en el genoma de la clula hospedadora se expresa en perodos prolongados. Resultado, las clulas infectadas vierten virus de forma constante sin dao aparente en la clula hospedadora. El genoma viral es pequeo (aproximadamente 10 kilobases) y comprende tres genes que codifican:

La mayora de los retrovirus se pueden integrar slo en clulas que se replican (uso resringido)

Ciclo vitalEntrada del retrovirus en la clula: .- El virus encuentra una clula con una molcula de superficie llamada CD4. .- Una o mas de las molculas GP120 del virus, se unen fuertemente a las molculas de CD4 en la superficie celular. .- Las membranas del virus y de la clula se unen.- Tras la fusin, el RNA del virus, las protenas y enzimas son liberadas al interior de la clula.

Transcripcin inversa: La transcriptasa inversa del VIH convierte el RNA Transcripcin inversa: La transcriptasa inversa del VIH convierte el RNA viral en DNA, forma en que estn los genes de la clula husped.

Integracin: El DNA recin hecho del virus, entra en el ncleo de la clula, donde ser insertado en el DNA husped con la ayuda de la integrasa del virus (provirus).

Transcripcin: Fabricacin de nuevas partculas virales.

Traduccin: Sintesis de las protenas estructurales

Ensamblaje y salida: Las protenas nucleares recin sintetizadas, los enzimas y el RNA se agrupan en el interior de la membrana celular, mientras las protenas de la envuelta viral se van agregando. Se forma una partcula viral inmadura y sale de la clula, adquiriendo una cubierta que incluye tanto protenas celulares como vricas. Durante esta parte de del ciclo, el virus todava no es infeccioso. Las largas cadenas de protenas y enzimas son digeridas en pequeos segmentos por una enzima llamada proteasa. Tras este paso ya tenemos partculas infectivas.

2.- Adenovirus

Los adenovirus comprenden una gran clase de virus no desarrollados que contienen ADN lineal de cadena doble.El genoma del adenovirus es ms grande ( sobre 35 kilobases ), y su organizacin es ms compleja que la de retrovirus.

Las principales ventajas:.- son capaces de transferir el gen episomal de forma .- son capaces de transferir el gen episomal de forma eficiente en una amplia cantidad de clulas y tejidos.- son fciles de producir en grandes cantidades

La principal desventaja:es que la respuesta del hospedador al virus parece limitar la duracin de la expresin y la capacidad de repetir la dosis, al menos con altas dosis de vectores de primera generacin.

3.- Virus adeno-asociados

El AAV es un virus muy pequeo, muy simple, no autnomo, que contiene ADN lineal de cadena sencilla. El virus requiere la coinfeccin con adenovirus u otros para replicarse.

La organizacin del genoma es extremadamente simple, comprendiendo slo dos genes:comprendiendo slo dos genes:

La ventaja potencial:

capaz de una expresin a largo plazo en clulas que no se dividen,

Su principal limitacin:son difciles de desarrollar en grandes cantidades

4.- Otros virus

HERPESVIRUS

El virus presenta un material gentico compuesto por ADN bicatenario lineal de 100 a 250 Kb.

El potencial de estos virus como vectores gnicos:

.- la habilidad de llevar grandes secuencias de ADN extrao insertadas

.- su habilidad para establecer infecciones latentes de larga duracin en las cuales el genoma del virus existe como un episoma con efectos no aparentes en la clula hospedadora .

5.- Sistemas no virales

Ventajas:

.- Flexibles con respecto al tamao de DNA a transportar.

.- Bajos costos.- Bajos costos

.- Gran seguridad

.- Facilidad para ensamblar el material de transferencia (reacciones qumicas)

5.1. Transferencia gnica mediada por receptores

.- Se transplanta al transportador de los ligantes, unas molculas que sern reconocidas por los receptores presentes en el tipo celular elegido (azcares, pptidos, hormonas, etc.)

.- Son capaces de sustituir por una interaccin transportador/clula muy especfica, la no especfica debida a las cargas inicas.

.- Endocitosis : El interior del endosoma se acidifica progresivamente y luego se fusiona con otra clase de vescula llamada lisosoma (lo luego se fusiona con otra clase de vescula llamada lisosoma (lo evaden por unas molculas llamadas fusiogenas) .

.-El ADN penetra en el ncleo durante la divisin celular, cuando se rompe la envoltura nuclear.

.- En las clulas en reposo solo pasan, por difusin (< 9 nm). 9- 25 nm. pueden penetrar en el ncleo valindose de los poros de la membrana nuclear.

5.2. DNA desnudo

Por este mtodo el ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente es directamente inyectado dentro del tejido deseado.

As el mtodo de inyeccin de ADN directamente es simple, econmico, y un procedimiento que no es txico comparado con la entrega mediante virus. con la entrega mediante virus.

El potencial para llevar largas construcciones de ADN es tambin ventajoso.

Los niveles y persistencia de la expresin de genes es probablemente demasiado corta (das) .

5.3. Partculas de DNA condensadas

Se condensa DNA con polmeros catinicos por medio de Interacciones electrostticas.

Se protege el DNA de la degradacin

Polmeros usados: Polilisina, polietilen imina y oligopptidos

Uso principalmente in vitro

5.4. Electroporacin

.- Aplicacin de un campo elctrico sobre la membrana dela clula meta.

.- Ruptura de la membrana y entrada del DNA al citoplasma

.- Usos in vitro

.- rea novedosa in vivo

5.5. Bombardeo de partculas

.- Dos equipos:

.- Basado en He a alta presin

.- Basado en lquidos a alta presin

.- Mtodo efectivo de transferir genes tanto in vitro como in

vivo .

.- El plsmido de ADN es primero revestido sobre su superficie de gotas de 1 a 3 micras de dimetro de oro o tungsteno. Estas partculas son aceleradas por una descarga elctrica de un aparato o por un pulso de gas y son " disparadas" hacia el tejido.

.- Un acercamiento menos invasivo es por el bombardeo directo de partculas en la piel.

.- Se supera la barrera de la membrana celular. Sin embargo, caractersticas de rigidez de los diferentes tejidos, la procedencia del ADN extrao, y la capacidad de transcripcin intrnseca conducen a grandes variaciones en transcripcin intrnseca conducen a grandes variaciones en la eficiencia de la expresin de los genes en conjunto.

5.7. Liposomas

MOLECULAR MEDICINE TODAY,

JULY 1999 (VOL. 5); Gene therapy

using HVJ-liposomes: the best of both

worlds?; Yasufumi Kaneda, Yoshinaga Saeki and Ryuichi MorishitaMorishita

Liposomas catinicos

.- ADN (carga negativa) + lpidos catinicos (+)

.- Lpidos catinicos (+) + la superficie celular (una red de cargas negativas debido a los residuos del cido silico).

.- Vector catinico/ ADN tienden a agregarse: 50 a 150 nm

.- Condensacin controlada del ADN

.- Formacin de partculas que encerrarn una sola molcula de ADN. (20 nm)

.- Paso a los compartimentos vasculares, as como la penetracin en las clulas y su ncleo..

Lpidos monocatinicos:

.- DOTMA (N(1-(2,3-dioleyloxy)-propyl)-NNN-trimethylammonium chloride).

.-Pptidos policatinicos de segunda generacin como DOPSA (2,3-dioleyloxy-N-(2(sperminecarboxamido) ethyl)-NN-dymethyl-1-propanaminium trifluoroacetate)

Resultado:

Captura del 100% de los complejos estables de polinucletidos, y por atraccin de cargas y por propiedades de fusin, los lpidos pueden absorberse a la membrana celular y entregar el cido nucleico directamente dentro del citoplasma, evitando la ruta de degradacin lisosomal.

ESTRATEGIAS TERAPUTICAS

Estrategias in vitro

.- obtencin previa de clulas del paciente procedentes de un tejido u rgano de inters.

.- disgregacin de las mismas y su mantenimiento en condiciones de cultivo de tejidos in vitro

.- transfeccin por el " gen teraputico" utilizando para ello un vector adecuado.

.- Las clulas son amplificadas y recolectadas con el fin de ser reimplantadas al paciente..

Estrategias in vivo

.- administracin sistemtica de la construccin gnica de inters.

.-Vector que facilite el proceso de transferencia del gen y permita la entrada y localizacin intracelular del mismo, de tal forma que ste resulte en un gen funcionante.

.- Es importante recurrir a vectores con destinos especficos dentro del organismo lo cual permite la entrega celular selectiva del gen en un determinado rgano o tejido, sin requerir para ello procedimientos traumticos o quirrgicos.

TERAPIA GNICA IN VIVO O IN VITRO ?

La decisin depende de:

.- los rasgos fisiolgicos del tejido diana daado

.- la naturaleza del tejido con respecto a los genes que deben ser transferidos

.- la facilidad para transferir los genes dentro de las clulas

.- la habilidad para llegar hasta ese tejido diana

.- su respuesta frente al mtodo de transfeccin, etc.

Errores in vitro-in vivo