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Sistemas Microfluídicos Basados en Gotas:
Aplicaciones en el análisis genómico y celular
Juan Sebastian Ortiz Colmenares
Centro de Investigaciones Microbiológicas (CIMIC)
Departamento de Ciencias Biológicas
Facultad de Ciencias
Centro de Microelectrónica (CMUA)
Departamento de Ingeniería eléctrica y electrónica
Facultad de Ingeniería
Universidad de Los Andes
Bogotá D.C.
Julio de 2020
2
Sistemas Microfluídicos Basados en Gotas:
Aplicaciones en el análisis genómico y celular
Trabajo de Grado presentado como requisito para optar al título de microbiólogo de la Universidad
de Los Andes
Juan Sebastián Ortiz Colmenares
Directores:
Martha Josefina Vives Flores, PhD
Johann Faccelo Osma Cruz, PhD
Centro de Investigaciones Microbiológicas (CIMIC)
Departamento de Ciencias Biológicas
Facultad de Ciencias
Centro de Microelectrónica (CMUA)
Departamento de Ingeniería eléctrica y electrónica
Facultad de Ingeniería
Universidad de Los Andes
Julio de 2020
3
CONTENIDOS
Figuras ................................................................................................................................................. 4
Abreviaturas ........................................................................................................................................ 5
1 Introducción ................................................................................................................................ 6
2 Objetivos..................................................................................................................................... 7
2.1 Generales ............................................................................................................................. 7
2.2 Específicos .......................................................................................................................... 7
3 Sistemas Microfluídicos ............................................................................................................. 8
4 Sistemas Microfluídicos Basados en Gotas ................................................................................ 9
4.1 Generación de gotas .......................................................................................................... 10
4.2 Manipulación de las gotas ................................................................................................. 11
4.2.1 Encapsulado .............................................................................................................. 11
4.2.2 Coalescencia .............................................................................................................. 12
4.2.3 Picoinyección ............................................................................................................ 13
4.2.4 Mezcla ....................................................................................................................... 13
4.2.5 Incubación ................................................................................................................. 14
4.2.6 Clasificación .............................................................................................................. 15
5 Análisis y detección de ácidos nucleicos .................................................................................. 17
5.1 Amplificación .................................................................................................................... 18
5.1.1 Polymerase Chain Reaction (PCR) ........................................................................... 18
5.1.2 Amplificacion isotérmica .......................................................................................... 19
5.2 Detección ........................................................................................................................... 20
5.2.1 SiC-seq ...................................................................................................................... 20
5.2.2 Förster resonance energy transefer (FRET) ligation assay ...................................... 21
5.2.3 DNA Beads ............................................................................................................... 21
6 Heterogeneidad Celular ............................................................................................................ 22
6.1 Plantas ............................................................................................................................... 22
6.2 Resistencia Bacteriana ....................................................................................................... 23
6.2.1 Heteroresistencia ....................................................................................................... 24
6.2.2 Persistencia ................................................................................................................ 25
6.2.3 Fagoterapia ................................................................................................................ 25
6.3 células humanas................................................................................................................. 26
7 Conclusiones y perspectivas ..................................................................................................... 29
8 Referencias ............................................................................................................................... 30
4
FIGURAS
Figura 1. Primer sistema microfluídico ............................................................................................... 8 Figura 2. Proceso típico de fotolitografía ............................................................................................ 9 Figura 3. Representación esquemática de los 3 tipos principales de formación pasiva de gotas en
SMBG. .............................................................................................................................................. 10 Figura 4. Principales operaciones unitarias (módulos) utilizadas en la microfluídica de gotas. ....... 11 Figura 5. Representación esquemática de los diferentes niveles de encapsulación y
compartimentalización que se pueden obtener a través de los SMBG21. .......................................... 12 Figura 6. Módulos de coalescencia, .................................................................................................. 13 Figura 7. Efecto de rozamiento en microcanales .............................................................................. 14 Figura 8. Trampas para la retención de gotas .................................................................................... 15 Figura 9. Clasificación pasiva de gotas basada en el perfil del flujo. ............................................... 15 Figura 10. Separación en función de la presión de Laplace generada por un riel en el canal ........... 16 Figura 11. Esquema del principio de FRET ...................................................................................... 21 Figura 12. Representación de los fenómenos asociados al fallo de tratamientos antimicrobianos ... 24
5
ABREVIATURAS
AAE antibióticos de amplio espectro
ADN ácido desoxirribonucleico
ARN ácido ribonucleico
ASB albumina de suero bovino
CMI concentración mínima inhibitoria
ELISA Enzyme linked immuno-sorbent assay
FRET Förster resonance energy transfer
HDA Helicase dependent amplification
kHz kilohertz
LAMP loop mediated isothermal amplification
ddLAMP droplet digital LAMP
MDA multiple displacement amplification
NK natural killer
nm nanómetro
O/W aceite disperso en agua
pb pares de bases
PCR polymerase chain reaction
dPCR digital PCR
ddPCR droplet digital PCR
qPCR quantitative PCR
PDMS Poli(dimetilsiloxano)
PMMA poli(metil-metacrilato)
QS quorum sensing
RCA rolling circle amplification
RPA recombinase polymerase amplification
RT-PCR retro-transcriptase polymerase chain reaction
SI sistema inmune
SiC-seq single-cell sequencing
SMBG Sistema Microfluídico Basado en Gotas
TSA test de susceptibilidad antimicrobiana
TSNG técnicas de secuenciación de nueva generación
W/O agua dispersa en aceite
6
1 INTRODUCCIÓN
En el primer semestre del 2020 se vivió una situación inesperada que impidió la culminación normal
del semestre académico. La pandemia, originada por el SARS-CoV-2, demandó la imposición de
medidas de cuarentena en la mayoría de los países del mundo, incluyendo a Colombia. Esto hizo
imposible el uso de laboratorios y otros espacios de las universidades, indispensables para la
investigación y para la realización de los proyectos de grado. Por este motivo, muchos de los
proyectos de grado, que incluían trabajo experimental, tuvieron que ser reemplazados por alternativas
que pudiesen ser realizadas desde las casas de sus respectivos autores.
El proyecto de grado inicial pretendía utilizar un sistema microfluídico basado en gotas para
encapsular espermatozoides y generar un modelo que permitiera correlacionar el caudal utilizado con
la cantidad de células encapsuladas en cada gota. Posteriormente, este modelo sería evaluado en el
proceso de encapsulamiento de bacteriófagos específicos para Cutibacterium acnes. Debido a las
medidas mencionadas anteriormente fue imposible obtener información experimental suficiente para
llevar a cabo este proyecto. De manera que, teniendo en cuenta las múltiples ventajas que ofrecen los
sistemas microfluídicos, se decidió presentar una revisión de las aplicaciones relevantes de estas
tecnologías en el área de la microbiología.
Este documento se encuentra dividido en dos partes, las cuales a su vez cuentan con varias secciones.
La primera parte contiene una sección en la que se describen las generalidades de los sistemas
microfluídicos y los métodos de manufactura más comunes. En donde se hace énfasis en los sistemas
microfluídicos basados en gotas, se explican sus diferencias con respecto a otros sistemas
microfluídicos y se describen algunas de las operaciones unitarias más comunes encontradas en estos
dispositivos.
En la segunda parte se describen aplicaciones de los sistemas microfluídicos basados en gotas
(SMBG) en la microbiología, enfocándose en las aplicaciones de estos sistemas en la genómica y el
estudio de la heterogeneidad celular, a nivel de células individuales. Finalmente, se presentan algunas
conclusiones y perspectivas con respecto al papel de estas tecnologías en el área de la microbiología.
Este trabajo fue desarrollado bajo la dirección de la Dra. Martha J. Vives, del Centro de
Investigaciones Microbiológicas (CIMIC), y el Dr. Johann F. Osma, del Centro de Microelectrónica
de la Universidad de Los Andes (CMUA).
7
2 OBJETIVOS
2.1 GENERALES Realizar una revisión del estado del arte de las aplicaciones en microbiología de los sistemas
microfluídicos basados en gotas (SMBG)
2.2 ESPECÍFICOS • Describir técnicas básicas propias de los SMBG
• Reconocer ventajas y retos de los SMBG en el área de la genómica
• Identificar aplicaciones en el estudio de la heterogeneidad celular
8
3 SISTEMAS MICROFLUÍDICOS
Hacia finales de la década de 1940 se reportó por primera vez la fotolitografía como un método para
grabar finos sistemas electrónicos en pequeñas tarjetas de silicio1. Este hito dio inicio a la
microelectrónica, que se vería enormemente impulsada con el desarrollo de los primeros circuitos
integrados unos años después. La fotolitografía típicamente consiste de el recubrimiento de una
superficie son una capa delgada de material fotosensible, el cual es posteriormente irradiado con luz
en puntos específicos. Las zonas que han sido sensibilizadas con luz pueden posteriormente ser
eliminadas (para un material fotosensible negativo) o ser las únicas conservadas (para uno positivo)
durante el proceso de revelado1 (Figura 2). En 1979, Terry y colaboradores publicaron un documento
en el cual se describe un cromatógrafo de gases en un disco de silicio de 5 cm de diámetro, fabricado
a través de la técnica de fotolitografía2. El dispositivo constaba de una bomba capaz de inyectar
volúmenes de hasta 1nl, un capilar de cromatografía de 1,5m de longitud y un sensor de conductividad
térmica que actuaba como detector. Este dispositivo se considera como el primer lab on a chip,
presentado en la Figura 1, de la historia y daría paso a una nueva disciplina que hoy en día es conocida
como microfluídica.
Figura 1. Primer sistema microfluídico integrado A) Cromatógrafo de gases descrito por Terry et al. Consta de
una columna capilar de 1,5m de longitud enrollada, una entrada para el gas de arrastre y una para la muestra.
El flujo está regulado por una válvula situada en la intersección de estos dos (parte superior izquierda). Se puede
identificar el detector en la parte derecha de la imagen como un pequeño cuadro negro. B) Vista esquemática
del cromatógrafo de gases. Adaptado1.
En la actualidad, existe una gran variedad de materiales y técnicas disponibles para la fabricación de
dispositivos microfluídicos3. Sin embargo, la mayoría aprovechan la facilidad y versatilidad de la
fotolitografía para fabricar plantillas, las cuales se pueden utilizar como molde para crear piezas de
poli(dimetilsiloxano) (PDMS) acanaladas que posteriormente pueden ser ancladas a un soporte de
vidrio para crear el dispositivo. Esta forma de manufactura permite crear estructuras complejas como
válvulas, mezcladores y sensores, entre otras, lo que la hace muy versátil, además de precisa y
relativamente simple. Otras técnicas de manufactura, como el grabado químico de vidrio, pueden
resultar más costosas y complejas al requerir la manipulación de sustancias altamente corrosivas.
Recientemente se ha incursionado en el uso de materiales mucho más económicos en conjunto con
técnicas de grabado laser, lo cual representa microsistemas más económicos3,4. Estos últimos han
demostrado ser capaces de competir en eficiencia con microsistemas manufacturados de forma
tradicional, sin embargo, existe una limitación en términos del área transversal de los canales que se
puede obtener con esta técnica, debido a las limitaciones de las máquinas de corte laser disponibles
en la actualidad.
9
Figura 2. Proceso típico de fotolitografía. Se cubre la superficie con una película fotosensible por rotación para
asegurar homogeneidad y se cura con calor para eliminar el solvente y fijar la película. Posteriormente se
expone a luz UV a través de una máscara para sensibilizar secciones específicas que luego se remueven durante
el proceso de revelado.
Los sistemas microfluídicos han tenido una gran acogida en el mundo científico y han encontrado
lugar en áreas como la química sintética5, química analítica6, biología molecular7, medicina8,9,
tratamiento de aguas10,11 e incluso robótica12, entre muchas otras. Sin embargo, un tipo específico de
sistemas microfluídicos ha ganado particular atención en la microbiología, los (SMBG). Este
documento pretende revisar los principales tipos de SMBG y algunas de sus aplicaciones más
relevantes en el área de la microbiología.
4 SISTEMAS MICROFLUÍDICOS BASADOS EN GOTAS
La microfluídica basada en gotas, también llamada microfluídica digital, se concentra en la creación
y manipulación de pequeñas gotas a partir de la mezcla controlada de 2 o más fases inmiscibles. Este
tipo de sistemas fue reportado por primera vez en 1997, cuando se publicaron los diseños de un
dispositivo que permitía la producción de emulsiones monodispersas de agua en aceite (W/O) y de
aceite en agua (O/W) al incorporar la fase dispersa en la fase continua con ayuda de microcanales
tallados en una tarjeta de silicio13. Desde entonces ha surgido una gran variedad de diseños enfocados
a la generación y la manipulación de gotas, lo que ha permitido que estos microsistemas encuentren
aplicaciones en múltiples áreas de la medicina, la microbiología y la química.
Por lo general, los SMBG son fabricados en PDMS sobre láminas de vidrio, no obstante, también
existen algunos ejemplos fabricados en poli(metil-metacrilato) (PMMA), poliestireno o polímeros
fluorados. Aun así, la combinación clásica de vidrio y PDMS ofrecen múltiples ventajas sobre otros
materiales, como transparencia e índices de refracción que permiten el paso efectivo de luz,
facilitando así la visualización y análisis de lo que sucede al interior, además de la estabilidad térmica
y la baja reactividad de este material. Por otra parte, se han desarrollado métodos para incorporar y
fabricar electrodos in situ en PDMS, lo cual resulta ser una gran ventaja, ya que algunas técnicas de
manipulación de las gotas requieren campos eléctricos muy cercanos a los microcanales12.
Adicionalmente, el PDMS es altamente poroso, lo que permite que haya un intercambio gaseoso
parcial entre los líquidos al interior de los microcanales y el exterior14,15. Esto hace posible utilizar
los SMBG para trabajar con células vivas, lo cual ha permitido la aparición de dispositivos que
permiten organizar células dependiendo de diferentes factores, incubarlas, modificarlas y estudiarlas
en múltiples dimensiones. Aun así, cada uno de los métodos y materiales para la fabricación de SMBG
tienes sus propias ventajas y desventajas, como se ha reportado en la literatura16–18.
10
Una de las ventajas más relevantes de utilizar SMBG es que cada una de las gotas sirve como un
compartimento independiente, lo que permite manipular volúmenes muy pequeños (hasta picolitros)
de manera controlada y precisa. Adicionalmente, se han desarrollado diferentes métodos que permiten
manipular las gotas generadas aprovechando diversos fenómenos físicos. Estas distintas técnicas
pueden verse como bloques de construcción, que al combinarse pueden dar origen a circuitos
complejos que permiten realizar ensayos o funciones específicas. Sin embargo, acoplar estos bloques
no siempre es tarea fácil, razón por la cual es necesario en ocasiones diseñar muchos componentes de
los circuitos desde cero para que se adapten a las necesidades específicas o realizar procesos por lotes.
Aun así, existe cierto grado de consenso para una gran variedad de operaciones unitarias, como la
generación de gotas, inyecciones de material, incubación, retención y clasificación de las gotas.
4.1 GENERACIÓN DE GOTAS Los diferentes métodos de producción de gotas pueden ser clasificados como pasivos o activos, siendo
los pasivos aquellos que se basan en una diferencia de flujos para crear una desestabilización de la
tensión superficial de la fase dispersa y generar así las pequeñas gotas. Por otra parte, los métodos
activos requieren de una fuerza de energía externa para generar las gotas. Entre estos últimos se
encuentran metodologías que involucran el uso de fuerzas eléctricas, magnéticas, térmicas y
mecánicas para lograr la emulsificación19,20. Así mismo, la naturaleza de las fases inmiscibles
utilizadas puede variar dependiendo de la aplicación. Dado que se pretende hacer énfasis en las
aplicaciones de los SMBG en el campo de la microbiología, se expondrán ejemplos de sistemas cuya
fase dispersa es acuosa y su fase continua es oleosa (aceites fluorados y no fluorados), cuyos sistemas
de generación de gotas se basan en las metodologías pasivas (Coflow, T-junction o Flow-focusing),
pues son las más útiles para trabajar con células y en general con material de origen biológico.
Coflow Este tipo de sistemas se basa en el uso de canales concéntricos. La fase dispersa se introduce
a través del canal interno, mientras que la fase continua fluye, usualmente con una velocidad mayor,
por el canal externo, en la misma dirección que la fase dispersa. Esta metodología es particularmente
útil para formar gotas dentro de gotas o gotas de varias capas21.
T-junction En estos microsistemas la fase continua fluye por un canal recto y la fase dispersa es
inyectada de manera perpendicular, lo cual termina rompiéndola en pequeñas gotas. La relación entre
las velocidades de ambas fases genera patrones de goteo diversos, lo que permite controlar de forma
muy precisa el tamaño y morfología de las gotas generadas22. Esta geometría es particularmente útil
si se desea una alta monodispersidad.
Flow focusing Esta metodología se caracteriza por una fase dispersa que fluye a través de un orificio
y es flanqueada por 2 salidas de fase continua (ver Figura 3). En este caso, la dirección de los flujos
de fase continua suele cambiar en el punto en el que se incorpora la fase dispersa, mientras que la
última conserva la dirección de flujo. Esta geometría permite obtener una gran variedad de tamaños
de gota en función del tamaño del orificio y la relación entre los flujos de ambas fases23.
Figura 3. Representación esquemática de los 3 tipos principales de formación pasiva de gotas en SMBG.
11
A pesar de que estas geometrías presentan múltiples variaciones, el principio es el mismo y la mayoría
de los aspectos de las mismas se conservan. Con diferentes optimizaciones se han llegado a obtener
frecuencias de producción de gotas del orden de los kHz24,25. Esto implica una gran capacidad de
trabajo y promete ahorrar costos y tiempo en la reproducción de metodologías relativamente sencillas
al producir una gran cantidad de microreactores (gotas) con cantidades mínimas de reactivos (nano-
y picolitros por gota).
4.2 MANIPULACIÓN DE LAS GOTAS Cada una de las gotas generadas puede actuar como un microreactor independiente26, sin embargo,
para que estas sean realmente útiles se requiere de la habilidad para manipularlas, de manera que se
puedan ejecutar adecuadamente protocolos de síntesis, diagnostico o ensayos biológicos en su interior.
Por esta razón, a lo largo del tiempo se han venido desarrollando diferentes mecanismos que permiten
la manipulación precisa de las gotas formadas a través de diferentes métodos pasivos (basados en
efectos hidrodinámicos) o activos (basados en estímulos externos como ultrasonido, laser,
dispositivos mecánicos neumáticos, térmicos, entre otros)14. Esto facilita el diseño de circuitos
específicos para cada proceso que se requiera.
Figura 4. Principales operaciones unitarias (módulos) utilizadas en la microfluídica de gotas.
4.2.1 Encapsulado
En este caso nos referiremos a encapsulado como el proceso de creación de una gota con una partícula
o sustancia especifico en su interior, los cuáles pueden ser muestras de material genético, células,
partículas virales, entre muchas otras. En este caso, la estrategia principal consiste en la suspensión
de dichas partículas/sustancias en la fase dispersa de manera previa a la formación de las gotas y,
posteriormente, se utiliza una de las estrategias previamente mencionadas para la formación de las
gotas. Un aspecto interesante de los sistemas microfluídicos es que pueden ser utilizados para
organizar partículas en suspensión de forma relativamente simple y eficiente27, de manera que, al
ajustar parámetros como la concentración y la relación entre los flujos de ambas fases, se puede
controlar la cantidad de partículas o sustancia en el interior de la gota. Este proceso ha sido
particularmente importante en el desarrollo de técnicas single-cell o de célula individual, en las que,
a diferencia de las técnicas tradicionales, se analizan o tratan células de manera individual. Al
12
encapsular células individuales en gotas se puede asegurar que las células se mantengan separadas y
se facilita la manipulación de las mismas. Por otra parte, también es posible encapsular gotas
preexistentes para formar estructuras en capas, similares a cebollas, o algunas más complejas y
compartimentalizadas21,28.
Figura 5. Representación esquemática de los diferentes niveles de encapsulación y compartimentalización que
se pueden obtener a través de los SMBG21.
4.2.2 Coalescencia
La fusión (coalescencia) de gotas puede tener una gran variedad de aplicaciones, desde la formación
de partículas poliméricas, hasta la incorporación de muestras a librerías. Cuando las gotas no se
encuentran estabilizadas con algún surfactante la fusión se da de forma espontánea cuando dos o más
gotas entran en contacto, sin embargo, aquellos sistemas en los que se hace uso de surfactantes
requieren tratamientos especiales. La mayoría de las técnicas utilizadas para este fin hacen uso de
frenos hidráulicos que se logran a través de geometrías específicas en los canales. Uno de los primeros
diseños reportados para la fusión de dos gotas en un microsistema consiste en un canal angosto por
donde viajan las gotas, el cual cuenta con un ensanchamiento en algún punto con un volumen
suficiente para contener 2 gotas a la vez14. El canal angosto hace que las gotas se mantengan alargadas
y comprimidas, al llegar al ensanchamiento la gota reduce la velocidad con la que fluye y esto da
tiempo a que llegue una segunda gota al espacio ensanchado del canal. Cuando esto sucede las dos
gotas entran en contacto, sin embargo, esto no es suficiente para que las gotas se unan. Cuando las
gotas siguen avanzando se empiezan a elongar para poder continuar por el canal que se vuelve a
estrechar, es en este momento cuando la tensión interfacial que existe entre las mismas se
desestabiliza y se combinan las dos gotas en una sola29. Otra de las geometrías utilizadas para este
propósito consta de una “cámara de fusión” en la cual se posicionan varios pilares que permiten
“atrapar” la gota temporalmente y acercarla lo suficiente a una segunda gota para que puedan
combinarse Figura 6. Si bien el principio es similar, en este segundo caso el fenómeno no depende de
la distancia que separa las gotas, sino del tamaño de la gota que se encuentra en la recamara. La gota
se quedará atrapada hasta que se haya unido a suficientes gotas para alcanzar un tamaño que le permita
escapar y continuar su recorrido por el circuito30. Adicionalmente, se han reportado metodologías que
logran la coalescencia a través de curvaturas en el diseño de los canales31. Por otra parte, también se
han reportado estrategias que hacen uso de campos eléctricos para promover la coalescencia de las
gotas. Una gran ventaja de usar campos eléctricos es que se pueden encender y apagar, lo que permite
que solo algunas gotas se combinen y se puede acoplar a detectores que seleccionen automáticamente
estas gotas basados características como la fluorescencia32. La electrocoalescencia es una estrategia
que permite un control muy preciso de la combinación de las gotas, sin embargo, representa también
una complicación adicional en el diseño de los circuitos microfluídicos puesto que requiere del uso
de micro electrodos y la implementación de un sistema electrónico que controle el campo requerido33.
13
Figura 6. Módulos de coalescencia. Izquierda, sistema de coalescencia basado en freno hidraulico simple29.
Derecha, sistema de coalescencia asistida por pilares que actúan como retenedores para la gota30.
4.2.3 Picoinyección
Las picoinyecciones se pueden ver como una modificación de los módulos de coalescencia en
términos de lo que le sucede a la gota. En este caso, en lugar de combinar nuestra gota con otra
existente lo que se hace es adicionar una pequeña cantidad de líquido. Estas cantidades suelen estar
en la escala de los picolitros. A nivel de diseño, el mecanismo es relativamente sencillo; el líquido a
inyectar se mantiene en un canal incidente, de manera que se forme un menisco capaz de entrar en
contacto con la gota y mezclarse32. Sin embargo, la estabilización con tensoactivos vuelve a ser un
inconveniente, pues la gota puede pasar sin unirse al menisco. Para resolver este problema se ha
reportado el uso de electrodos en la zona opuesta al menisco, capaces de producir un campo eléctrico
que genere la electrocoalescencia34,35. En 2012 se reportó una estrategia que aprovecha los electrolitos
presentes en los líquidos a inyectar para usarlos como electrodos y permitir así la picoinyección
asistida por electrocoalescencia, sin la necesidad de integrar electrodos metálicos al sistema36. Si bien
la electrocoalescencia representa una forma efectiva de resolver el problema, algunos compuestos
biológicos podrían verse afectados por el uso del campo eléctrico. Por esta razón, Yuan y
colaboradores desarrollaron una estrategia que les permite realizar inyecciones controladas sin la
necesidad de un campo eléctrico, a partir del manejo preciso de la presión al interior del canal en el
que se encuentra el fluido a inyectar37. Adicionalmente, al modificar la presión externa o la relación
de flujos de las fases continua y dispersa se puede controlar la cantidad de fluido inyectado entre
rangos de unidades a centenas de picolitros.
4.2.4 Mezcla
Tras combinar o inyectar fluido en una gota es necesario mezclar los contenidos para asegurar una
distribución homogénea. Esta operación unitaria se hace importante a la hora de asegurar la
reproducibilidad de los ensayos realizados, así como la correcta culminación de los mismos. Cuando
las gotas fluyen a través de un canal recto y angosto se generan patrones circulares al interior de las
gotas, como producto de la fricción de la gota con las paredes del canal. Sin embargo, este patrón es
simétrico, de manera que cada mitad de la gota se puede mezclar por sí misma, pero difícilmente se
mezclaran las dos mitades. De la misma manera que para las operaciones unitarias anteriores, se han
diseñado estrategias activas y pasivas para llevar a cabo el proceso de mezcla de los componentes al
interior de las gotas en un SMBG. Los sistemas pasivos tienden a utilizar curvaturas y diseños en
forma de zigzag para hacer que las gotas cambien su orientación y así aprovechar el fenómeno de
rozamiento para asegurar la homogeneidad al interior38–40 (Figura 7). Si bien estas geometrías suelen
ser bastante efectivas, algunas sustancias biológicas, como la albumina de suero bovino (ASB),
pueden presentar problemas debido a su viscosidad y tendencia a adsorción en las paredes del canal41.
Liau y compañía demostraron que agregar pequeñas protuberancias a los canales en serpentín
14
permitía la mezcla efectiva de sustancias complejas y que no se mezclarían con diseños tradicionales,
como la ASB. Por otra parte, se han descrito métodos activos, los cuales se han aprovechado de
fenómenos como el calentamiento42, ultrasonido43 y microondas44. Cada una de estas metodologías
tiene sus propias ventajas y desventajas. Por una parte, la mezcla activa permite la mezcla selectiva
de gotas y suele ser muy rápida e independiente de la longitud del canal, sin embargo, puede
complejizar al diseño del microsistema al requerir sistemas electrónicos para controlar los estímulos,
además de diseños complejos para retener las gotas mientras se someten a dicho estímulo. Por otra
parte, los mezcladores pasivos permiten la mezcla de múltiples gotas en paralelo, por lo que pueden
tener una mayor tasa de mezcla de gotas (en gotas por segundo) y la mezcla no requiere de actuadores
externos ni sistemas electrónicos, aun así, la eficiencia de la mezcla depende de la longitud de la zona
de mezclado y los diseños pueden requerir consideraciones especiales cuando contienen ciertas
sustancias (como ASB) o tienen altas viscosidades.
Figura 7. Efecto de rozamiento en microcanales. Los canales en zigzag facilitan la mezcla de los contenidos al
interior de las gotas39.
4.2.5 Incubación
Normalmente una gota puede durar entre unos cuantos segundos hasta minutos en un microsistema
tras ser creada. No obstante, muchas pruebas biológicas requieren periodos de incubación que pueden
ir de unas horas hasta días. Una solución intuitiva para este problema es incrementar la longitud de
los canales del sistema y agregar curvaturas para optimizar el espacio. Sin embargo, una mayor
longitud y tortuosidad en el diseño de los canales genera incrementos en la resistencia hidráulica y
por lo tanto en la presión del fluido, lo cual podría generar deformaciones del microsistema,
taponamientos o la ruptura del dispositivo26,32. Una manera de solucionar este problema es utilizando
zonas en los canales más profundas y anchas que la zona en la que se generan las gotas45.
Adicionalmente, se han agregado secuencias de pequeñas constricciones a estos anchos canales, las
cuales permiten mezclar aleatoriamente las gotas que allí se encuentran. Esto permite que todas las
gotas tengan tiempos de residencia similares al evitar el problema de que las gotas en el centro del
canal se mueven con mayor velocidad que aquellas en los bordes46,47. Una de las desventajas que
presentan estos sistemas es que las gotas posteriormente no se pueden analizar en el mismo orden que
fueron generadas, lo cual puede ser problemático para algunas aplicaciones. Es aquí cuando la
tecnología de Dropspots juega un papel importante. Estos sistemas consisten pequeñas cámaras
circulares organizadas en línea y conectadas por un canal muy angosto, diseñadas de manera tal que,
en ausencia de presión, puede almacenar una única gota en cada una de las cámaras. Esto permite
capturar las gotas e incubarlas por más de 12 horas48. Por otra parte, se han diseñado otros métodos
que permiten atrapar y estudiar los contenidos de gotas, los cuales permiten la recuperación selectiva
o total de las gotas desordenadas u ordenadas. Estos métodos utilizan “trampas” para gotas en los
canales, las cuales aprovechan propiedades hidrodinámicas para capturar las gotas en un orden
15
específico y pueden retenerlas allí hasta que se revierta el flujo o se usen estímulos externos para
liberarlas49,50.
Figura 8. Trampas para la retención de gotas. Arriba, sistema DropSpot. Abajo, dos diseños que permiten
atrapar gotas con un flujo activo y liberarlas de manera ordenada a revertir el flujo49,50.
4.2.6 Clasificación
La clasificación de gotas es sumamente útil para separar e identificar aspectos importantes de los
contenidos. Las técnicas de clasificación se han utilizado con múltiples fines, desde comprobar la
presencia de células al interior, la producción de una enzima o la presencia de una molécula en
particular, hasta comprobar polimerización de un sustrato o separar gotas en función de su tamaño.
De igual manera que con otras operaciones unitarias mencionadas anteriormente, la clasificación se
puede llevar a cabo por métodos activos o pasivos, sin embargo, en este caso el método se define por
la característica que se quiere discriminar en la población de gotas.
Figura 9. Clasificación pasiva de gotas basada en el perfil del flujo.
Métodos pasivos
En primer lugar, los métodos pasivos pueden ser utilizados para clasificar gotas en función de
características físicas, tales como tamaño, viscosidad y la tensión superficial. En 2008, Maenaka y
colaboradores reportaron un sistema que permitía separar gotas en función de su tamaño al incluir un
flujo de fase continua poco antes de un ensanchamiento súbito del canal51. Esto genera una
diferenciación en la trayectoria de las gotas dependiente del tamaño, donde las gotas más pequeñas
son arrastradas hacia el lateral del canal, mientras que las gotas más grades se ven afectadas en menor
medida. Al colocar bifurcaciones después del ensanchamiento del canal es posible separar los flujos
de partículas grande y pequeñas, logrando así una clasificación pasiva en función del tamaño51.
Adicionalmente, controlando la geometría del canal se pueden colocar hasta 6 caminos diferentes tras
16
la zona de ensanchamiento, lo que permite separar simultáneamente múltiples tamaños. Otra manera
de separar por tamaños hace uso de hendiduras talladas en los canales a manera de rieles, este diseño
cuenta una hendidura principal en el centro de un canal un poco más ancho que la gota, pero poco
profundo. Una segunda hendidura, ligeramente más ancha que la principal, es tallada entre la
hendidura principal y uno de los bordes y corriente abajo. La geometría del canal mantiene
ligeramente comprimidas a las gotas y la hendidura libera un poco esa presión, de manera que las
gotas siguen la hendidura como si fuera un riel. Cuando una gota suficientemente ancha se acerca al
punto donde comienza la segunda hendidura, esta tiene la posibilidad de expandirse y es desplazada
hacia la nueva hendidura por efectos de la presión de Laplace. Esto significa que, esta geometría no
solo separa en función del tamaño, sino también de propiedades como viscosidad y tensión superficial,
pues son determinantes para que una gota migre de un riel a otro52,53.
Figura 10. Separación en función de la presión de Laplace generada por un riel en el canal. A) Una gota
suficientemente grande para entrar en contacto con el nuevo riel. (B) Una gota demasiado pequeña para
interactuar con el nuevo riel53.
Métodos activos
Por otra parte, las aproximaciones activas se caracterizan por que requieren de un sistema electrónico
que permita controlar el estímulo que separará las gotas. Los métodos utilizados se pueden clasificar
en 5 grupos: eléctricos, acústicos, térmicos, magnéticos y neumáticos. Todos ellos requieren del
diseño de sistemas electrónicos que permitan controlar la separación, por lo que el diseño y uso de
los dispositivos se hace más complicado. Sin embargo, estos métodos ofrecen grandes ventajas, como
la capacidad de separar gotas fluorescentes. Los métodos eléctricos, por lo general, se basan en el uso
de microelectrodos para generar un campo eléctrico, el cual podrá interactuar con partículas sin carga
(dielectroforesis) o con carga. Sciambi et al. Publicaron un método de separación que utiliza un láser
para detectar fluorescencia en las gotas, si se detecta fluorescencia se activa un campo eléctrico que
permite desviar la trayectoria recta que tienen estas gotas para así separarlas de las demás54–56. Por
otra parte, el control acústico utiliza ondas de ultrasonido para dirigir las gotas. Sin embargo, para
ello suele requerirse el uso de materiales piezoeléctricos, como óxidos mixtos de litio y niobio, lo
cual incrementa la complejidad de la manufactura del sistema57,58. A pesar de que este tipo de sistemas
pueden llegar a ser muy eficientes, el error puede incrementar con el aumento del tamaño o la masa
de las gotas59. Los métodos térmicos se basan en cambios de temperatura localizados, los cuales a su
vez generan diferencias en las propiedades físicas del fluido en esa zona, como el perfil de velocidades
del fluido. A pesar de que se han reportado múltiples ejemplos de calentamiento a través de resistores,
estos deben tener en cuenta complejas combinaciones de los múltiples efectos producidos por el
calentamiento localizado60,61 y pueden ser difíciles de implementar, sin embargo, pueden combinar
operaciones unitarias como ruptura controlada de las gotas y separación en un solo módulo62. Por su
parte, las estrategias que utilizan campos magnéticos pueden generarlos a partir de electroimanes o
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imanes permanentes, aun así, éstas están limitadas a la separación de partículas con componentes
magnéticos en su interior. Finalmente, las estrategias neumáticas son particularmente complejas pues
requieren de la acción de una bomba neumática sobre una cavidad deformable en el microsistema,
sin embargo, estas cavidades son fáciles de incorporar en el diseño y permiten una gran variedad de
aplicaciones que simplifican los procesos. Yoon et al. reportaron la fabricación de un dispositivo que
permite separar las gotas en 5 canales63. Para ello diseñaron un canal ancho, el cual se divide
posteriormente en 5 canales paralelos, separados por 4 paredes de PDMS flexible. En la zona en la
que el canal ancho se divide y justo tras las paredes exteriores del canal fueron colocadas dos cámaras
deformables. Cada cámara se encuentra conectada a una bomba neumática, de manera que,
dependiendo de la presión al interior de cada cámara se pueden sellar diferentes divisiones del canal
y así seleccionar en cuál de las divisiones ingresará cada gota64,65. Xi et al. pudieron determinar, a
partir de un análisis multifactorial, que las metodologías eléctricas son las más robustas y versátiles,
sin embargo, pueden llegar a ser muy costosas. Por otra parte, los métodos acústicos obtuvieron el
menor puntaje global en el análisis realizado, debido a la complejidad de los fenómenos que se deben
tener en cuenta, sin embargo, estas metodologías son durables y permiten buena selectividad si se
calibran adecuadamente.
El uso de SMBG en ensayos moleculares ofrece múltiples ventajas frente a los métodos tradicionales.
Por una parte, las reacciones se llevan a cabo en gotas rodeadas por una fase inmiscible, lo que permite
un control preciso sobre el proceso y reduce las posibilidades de contaminación. Por otro lado, el
reducido tamaño de las gotas implica una menor cantidad de reactivos y rápida acumulación de
productos, lo que permite analizar cantidades muy pequeñas, incluyendo moléculas o células
individuales66. Su tamaño también facilita la transferencia de masa y energía, lo que reduce los
tiempos requeridos por algunas reacciones67. Adicionalmente, la monodispersidad de las gotas
incrementa la replicabilidad de los experimentos y facilita su automatización. Finalmente, la gran
cantidad de gotas que se pueden crear, manipular y analizar en un corto tiempo hacen que estas
tecnologías puedan ser utilizadas a nivel industrial, clínico, o de laboratorio.
5 ANÁLISIS Y DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
El análisis de ADN es uno de los aspectos más importantes de la biología moderna. Al analizar el
material genético de los organismos hemos sido capaces de establecer filogenias y organizar el árbol
de la vida, obtener información sobre la manera en la que los caracteres son heredados, identificar
genes asociados con enfermedades, comprender mejor a miles de organismos y desarrollar nuevas
formas de luchar contra patógenos. Este tipo de análisis se ha convertido en un factor vital a la hora
de realizar casi cualquier tipo de investigación biológica o microbiológica y actualmente es
ampliamente utilizado para diagnóstico médico. El hecho de que la prueba más utilizada para
confirmar la infección con SARS-CoV 2 sea una RT-PCR es un claro ejemplo de la importancia que
representa la amplificación e identificación rápida de material genético.
La secuenciación de ADN fue materializada por primera vez hace más de 40 años, alrededor de 1976,
cuando fueron reportados dos métodos que permitirían identificar la secuencia de fragmentos de ADN
en menos de un día68. Desde entonces se han logrado grandes avances en el campo que han permitido
obtener información cada vez más confiable, de mejor calidad y de maneras mucho más eficientes en
términos de tiempo, tamaño muestra requerida e incluso dinero. Hoy en día existen muchas formas
diferentes de análisis de ADN; desde microarreglos, hasta secuenciación de novo con técnicas de
secuenciación de nueva generación (TSNG). Estas técnicas se caracterizan por que las moléculas se
encuentran ancladas en lugares específicos por lo que no se mueven durante el proceso de
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secuenciación. Esto permite realizar una lectura continua de las bases que se adicionan y el orden en
que lo hacen para una cadena de ADN determinada al analizar las señales generadas por una posición
particular.
En la actualidad, múltiples técnicas de secuenciación han sido acopladas a SMBG, lo cual ha
demostrado generar ventajas en los sistemas en términos de rendimiento, cantidad de muestra y
tiempo. Adicionalmente, el uso de SMBG facilita enormemente el análisis de células individuales e
incluso ofrece la posibilidad de automatizar este proceso. Esto permite llevar a cabo estudios
complejos de las poblaciones celulares en los que se identifican diferencias particulares entre cada
una de las células que hacen parte de dicha población, lo cual ha demostrado ser sumamente
importante en el estudio de enfermedades como el cáncer69. En las TSNG las reacciones suceden
siempre en el mismo lugar, de manera que es suficiente con discriminar el tipo de señal que proviene
de un solo lugar y organizar las diferentes señales en orden cronológico para identificar la secuencia
de bases nitrogenadas correcta. Sin embargo, en los SMBG las reacciones tienen lugar al interior de
gotas que se mueven a lo largo de un sistema de canales. Esto hace imposible la detección de las
señales emitidas en la manera en que se suele hacer con otras tecnologías, lo cual no significa que sea
imposible realizar la secuenciación de ácidos nucleicos como se conoce hasta ahora. Si bien es cierto
que aún no es posible secuenciar un genoma completo al interior de una gota, si hay muchos ensayos,
como la PCR, que se pueden realizar de forma efectiva al interior de las gotas de un SMBG.
5.1 AMPLIFICACIÓN
5.1.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)
La PCR es una de las técnicas más importantes en la biología molecular, dado que permite la rápida
amplificación de material genético para así poder obtener concentraciones detectables y sobre las
cuales se pueden realizar análisis posteriores70. La mayoría de técnicas de PCR dependen de ciclos
de cambios de temperatura y una polimerasa capaz de soportarlos, como la Taq Polimerasa. Dadas
las ventajas que ofrecen los sistemas de microfluídica, múltiples aproximaciones para adaptación de
esta tecnica en sistemas microfluídicos han sido reportadas. Kumar et al. reportaron un sistema
completamente integrado capaz de realizar lisis celular, amplificación por PCR y cuantificación de
amplicones de ADN en un solo circuito de PDMS, con ayuda de micro calentadores de óxido de indio
y estaño71. Adicionalmente, teniendo en cuenta las ventajas que ofrece la compartimentalización en
microgotas, se han diseñado diversas aproximaciones que permiten llevar a cabo la amplificación de
material genético en SMBG.
Digital droplet PCR La PCR digital (dPCR) es una técnica de PCR cuantitativa que, a diferencia de
la PCR en tiempo real o qPCR, permite la cuantificación absoluta del material genético presente en
una muestra72. Es decir, no requiere de material de referencia. Esta técnica, sin embargo, requiere de
diluciones seriadas y distribuciones sistemáticas del material en múltiples pozos, las cuales se realizan
manualmente con micropipetas, aumentando así la posibilidad de introducir error en las mediciones73.
Al incorporar esta tecnología a los SMBG surgió la droplet digital PCR (ddPCR), la cual aprovecha
la mecanización de los procesos de dilución y separación que ofrecen los SMBG para crear gotas con
una única molécula de ADN en su interior74. Posteriormente estas son mezcladas con reactivos
estándar para ensayos basados en TaqMan y termocicladas por lotes. Finalmente, la suspensión de
las microgotas es reintroducida en un microsistema equipado con un detector de fluorescencia para
identificar la cantidad de gotas en cuyo interior tuvo lugar la reacción de amplificación de ADN y
con base a esto se puede calcular la concentración inicial del material genético objetivo en la muestra.
De esta manera, la ddPCR es capaz de cuantifica de forma precisa las secuencias objetivo presentes
en una muestra al contar las moléculas de ADN contenidas en gotas discretas de agua en aceite75.
19
Actualmente esta técnica es la metodología principal para la detección de ADN tumoral circundante,
el cual es utilizado para realizar seguimiento no invasivo y periódico a diferentes tipos de cáncer
como el colorectal76.
Continuous Flow PCR Los procesos de termociclado también pueden ser llevados a cabo al interior
del SMBG. Para ello se han reportado múltiples estrategias que utilizan diversas fuentes de
calentamiento para lograr los cambios de temperatura cíclicos que se requieren para llevar a cabo la
amplificación efectiva del material genético. Li y sus colegas diseñaron y reportaron un microsistema
con canales en forma de serpentín77. En la zona donde se encuentran los valles del serpentín colocaron
una placa de calentamiento a 65°C y en los picos del mismo una placa a 90°C. Si bien este
microsistema no es un SMBG, esta aproximación les permitió amplificar ADN correspondiente a
Treponema denticola en menos de 8 minutos77. Aproximaciones similares con SMBG completamente
integrados, en los que los canales del sistema permiten a las gotas alternar entre zonas a diferentes
temperaturas han sido reportados y, a partir de ellos, ha sido posible cuantificar ADN del virus de la
hepatitis B en serum78,79 e investigar la sobreexpresión de HER2 en 2 líneas celulares de cáncer80.
Estas tecnologías permitieron una reducción de hasta 200 veces en costos de análisis por paciente, en
entornos clínicos, y son capaces de analizar más de 100 muestras diferentes en menos de 20 minutos.
El calentamiento asistido por láser también ha sido explorado y ha demostrado ser altamente selectivo
para calentar gotas individuales sin afectar las que se encuentran a su alrededor81. Wang y
colaboradores diseñaron un SMBG que aprovecha este tipo de calentamiento para completar ciclos
de PCR en menos de 30 segundos cada uno82.
5.1.2 Amplificacion isotérmica
Los cambios de temperatura requeridos para realizar una PCR pueden resultar difíciles de incorporar
en un microsistema. Afortunadamente, la PCR no es la única manera de amplificar una sección de
material genético. Las técnicas de amplificación isotérmica permiten replicar material genético sin la
necesidad de realizar cambios de temperatura en el sistema, lo cual ofrece como ventaja, respecto a
una PCR tradicional, reducciones en el tiempo y la complejidad, ya que no requiere de equipos
especializados para realizar los ciclos térmicos83. Múltiples técnicas de amplificación isotérmica han
sido reportadas, y la mayoría de estas han sido incorporadas en sistemas microfluídicos84.
Rolling circle amplification (RCA) Esta técnica, comúnmente utilizada en diversas áreas de la
medicina, ciencia de materiales y biología molecular, es un proceso enzimático isotérmico que utiliza
como plantilla ADN o ARN circular85. Para ello, un fragmento de ADN (o ARN) es circularizado con
ayuda de un primer y una DNAligasa (o RNAligasa, dependiendo del tipo de material genético a
amplificar) y una polimerasa, como la φ29 polimerasa, se encarga de realizar la replicación, lo que
produce un concatémero que contiene cientos o miles de secciones complementarias al material
genético circular86. Debido a que esta técnica no requiere calentamiento, se han reportado múltiples
reportes de su incorporación a los sistemas microfluídicos87–89. Chiu y su equipo demostraron la
aplicabilidad de esta técnica en un SMBG, al monitorear la presencia de topoisomerasa I de
Plasmodium (pTopI) presente en saliva humana90. De forma similar, Juul et al. reportaron un SMBG
capaz de detectar la pTopI en sangre y saliva de pacientes con un límite de detección inferior a un
parásito por µL91. Para ello, aprovecharon la especificidad de la pTopI para circularizar un fragmento
único de ADN, el cual posteriormente fue amplificado, con ayuda de una φ29 polimerasa.
Posteriormente, el concatémero es detectado y cuantificado de forma manual, a través de microscopia
de fluorescencia. Si bien los autores indican que el método de detección descrito puede no ser el más
adecuado para su implementación en puntos de atención, esta tecnología es mucho más rápida y
simple de usar que las técnicas actuales para detección de malaria, además de ser económica y
adecuada para zonas con bajos recursos. La técnica de RCA también ha sido utilizada para cuantificar
20
marcadores moleculares en la superficie de células cancerígenas. Konry y colaboradores reportaron
la cuantificación de EpCAM en la superficie de células de la línea CP3 a través de una amplificación
de la señal, mediada por RCA92. Esto consiste en la conjugación de un anticuerpo específico para
EpCAM con un primer y su adición, junto con φ29 polimerasa, un fragmento de ADN circular
complementario al primer conjugado, análogos fluorescentes de nucleótidos y otros reactivos
necesarios para la reacción de amplificación, a una gota con una única célula de la línea CP3. De esta
forma, el anticuerpo se ancla al marcador (EpCAM) y el ADN circular se hibrida con el primer
conjugado, de manera que la polimerasa pueda elongar la cadena de nucleótidos. Dado que algunos
de los nucleótidos presentes son en realidad análogos fluorescentes, se genera una señal fluorescente
en el punto en el que se encuentra el marcador objetivo. Este método permitió la identificación visual
de 1-10 moléculas de proteínas de membrana por célula, con una amplificación de ~103 veces, con
respecto al marcaje directo.
Loop mediated isothermal amplification (LAMP) Esta técnica, reportada por primera vez en el año
2000, se basa en el uso de una ADN polimerasa capaz de desplazar hebras existentes y utiliza sets de
4 o 6 primers por cada secuencia objetivo93,94. Estos primers se eligen de manera tal que el producto
de la replicación pueda formar un loop en sus extremos, lo cual, en conjunto con la polimerasa
desplazante, permite la rápida amplificación del material genético, sin la necesidad de los ciclos
térmicos propios de la PCR95. Esta reacción puede ser llevada a cabo a temperatura constante, entre
los 60 y 65 °C, y produce pirofosfato de magnesio como subproducto, el cual forma un precipitado
blanco e incrementa la turbulencia del medio conforme se acumula96. Esto facilita la detección de la
amplificación a través de métodos turbidimétricos, electroquímicos o visuales84,97. La integración de
esta tecnología a los SMBG dio origen la técnica conocida como Droplet Digital LAMP (ddLAMP),
la cual ha sido propuesta como tecnica basica para el diagnóstico médico en entornos de bajos
recursos, debido a la facilidad de uso y lectura, rapidez y versatilidad de la tecnica, suamado a su
manufactura de bajo costo98–102. Un claro ejemplo de la facilidad de lectura y rentabilidad de
manufactura fue reportado por Hu et al., con su diseño de un dispositivo microfluidico completamente
integrado que permite extraer, purificar y cuantificar ADN de plasma a través de ddLAMP, en menos
de 60 minutos103. El dispositivo, además, usa un teléfono inteligente como detector, lo cual permite
la movilidad del dispositivo y da cuenta de su robustez y facilidad de uso. Si bien este tipo de sistemas
han demostrado ser sumamente versátiles, se encuentran limitadas a analizar una sola muestra y un
solo objetivo molecular a la vez, lo que reduce las posibles aplicaciones en términos de diagnóstico
en puntos de salud que requieren el procesamientos de múltiples muestras en paralelo104.
Además de las técnicas LAMP y RCA, existen otras técnicas de amplificación isotérmicas que han
sido miniaturizadas e incorporadas en sistemas microfluídicos para su aplicación en el diagnostico e
investigación de enfermedades infecciosas, genéticas e incluso cáncer. Zanoli y Spoto revisaron
técnicas como la amplificación de pendiente de helicasas (HDA), la amplificación de recombinasa-
polimerasa (RPA) o la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) en dispositivos
microfluídicos, sin embargo, han sido pocas sus incorporaciones en SMBG84.
5.2 DETECCIÓN
5.2.1 SiC-seq
Los SMBG pueden ser utilizados antes del análisis genético para facilitar el análisis de secuencias
individuales o poder discriminar entre células individuales que hacen parte de una población,
haciendo uso de TSNG para el análisis genómico per se. Lan et al. presentan un protocolo que
consiste en el aislamiento de células individuales a través de SMBG, marcaje de cada gota con un
código de barras y su posterior secuenciación con Illumina105. Para ello los fragmentos que se originan
21
de un mismo genoma son marcados con una secuencia única, lo cual se logra al combinar una gota
con el lisado de una sola célula y otra con las secuencias de marcaje (códigos de barras), seguido de
una PCR. Las secuencias quiméricas resultantes se componen de un fragmento del genoma de la
célula, el código de barras molecular (15 bases) y el adaptador Illumina P7. Posteriormente las gotas
son mezcladas y secuenciadas con Illumina, tras lo cual se realiza una reconstrucción de cada uno de
los genomas, con ayuda de los códigos de barras previamente introducidos.
5.2.2 Förster resonance energy transefer (FRET) ligation assay
Los análisis también pueden ser llevados a cabo directamente al interior de las gotas, sin necesidad
del uso de técnicas de secuenciación adicionales. Abate y colaboradores desarrollaron esta técnica
que permite determinar la presencia de ADN con una secuencia especifica en la muestra, de forma
análoga a un microarreglo 106. Para ello se realiza en ensayo de ligamiento con dos sondas, una de 6
y una de 9 pb. El extremo 3’ de la sonda 3’ es marcado con FAM, mientras que el extremo 5’ de la
sonda 5’ se marca con Negro Iowa, los cuales constituyen un par FRET. FAM es un fluoróforo cuyo
máximo de emisión se encuentra en los 488nm, sin embargo, el negro Iowa es capaz de interferir con
la emisión, actuando como terminador. De manera que, si las sondas hibridan con el ADN de la
muestra, una ligasa las unirá y por lo tanto la fluorescencia de FAM no será observable. Esto hace
que la técnica sea altamente especifica (Figura 11).
Figura 11. Esquema del principio de FRET. El par de sondas marcadas con FAM y Negro Iowa se hibridan con
el ADN objetivo. FAM es fluorescente, sin embargo, este es inhibido cuando el Negro Iowa se encuentra
suficientemente cerca. La distancia se fija solo cuando la ligasa une ambas sondas, lo cual no sucede en caso
de que se presente uno de los mismatches que se muestran en la tabla de la derecha.
Esta aproximación permite identificar rápidamente si una secuencia especifica de 15 nucleótidos está
presente en una muestra, sin embargo, esto no es suficiente para discriminar entre las diferentes
secuencias que hacen parte de la librería. Para ello se utilizan diferentes moléculas fluorescentes cuya
longitud de onda de excitación es de 488 nm, como Alexafluor 610 y Alexafluor 680, cuyos máximos
de emisión son 630nm y 702 nm respectivamente. Al combinar estos colorantes adicionales, es
posible marcar diferencialmente cada una de las diferentes secuencias de la librería, lo cual facilita la
posterior identificación de la secuencia durante el ensayo106.
5.2.3 DNA Beads
Esta técnica utiliza microesferas, usualmente de sílice, las cuales tienen fragmentos de ADN anclados
a su superficie. El análisis se lleva a cabo entonces colocando una o varias esferas y una célula (o
molécula de ADN) por cada gota, posteriormente se lisa la célula y se lleva a cabo una PCR. En 2008,
Kumaresan y colaboradores reportaron el uso de esta técnica para el análisis unicelular del gen
gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa en linfocitos humanos y del gen gyr B en Escherichia coli.107
22
Para ello anclaron el primer reverse a la superficie de las microesferas y marcaron el primer forward
con un marcador fluorescente, de manera que tras realizar la PCR fueron capaces identificar la
presencia de los genes de interés con ayuda de un citómetro de flujo. Este protocolo es muy similar
al conocido como BEAMing, con la diferencia de que el ultimo utiliza microesferas magnéticas, las
cuales son purificadas antes de la citometría, con ayuda de un campo magnético108. Sin embargo,
actualmente existen tecnologías comerciales que se basan en estos principios, tales como Chromium
(10X genomics), inDrop (Illumina) o Drop-Seq (Fluigent). La disponibilidad comercial de estas
técnicas agrega un alto nivel de simplificación su implementación, puesto que ya no es necesario
diseñar el microsistema ni optimizar las condiciones de operación del mismo. Estas estrategias
también se han utilizado para detectar, analizar y cuantificar ARN en poblaciones y los perfiles
diferenciales de expresión en células individuales109–111. Cabe mencionar que, estas técnicas requieren
de la precisa manufactura de microesferas con códigos de barras moleculares que permitan la fácil
identificación de la procedencia de las secuencias para poder reconstruir la información requerida,
sin embargo, se han reportado pequeñas imperfecciones en las perlas112. Lo anterior sugiere que estas
tecnologías aun requieren un cierto nivel de procesamiento posterior para asegurar la calidad de la
información obtenida, así como un ajuste en los procesos de manufactura para reducir la cantidad de
microesferas imperfectas y así lograr una mejor calidad en los análisis111. Aun así, estas tecnologías
han resultado de gran utilidad para realizar estudios de variación genética de alta precisión, lo cuales
serían imposibles utilizando técnicas de secuenciación tradicionales, como muestran Bell y
colaboradores, al analizar 31228 genomas de espermatozoides individuales, provenientes de 20
donantes, en busca de una mayor comprensión de los fenómenos asociados con la meiosis, tales como
la aneuploidía y la recombinación113,114.
6 HETEROGENEIDAD CELULAR
La mayoría del conocimiento que existe en el campo de la microbiología se ha obtenido a partir del
estudio de poblaciones, ya sean de organismos o de células en un organismo. Sin embargo, en la
última década han aparecido cada vez mas estudios que demuestran la importancia de analizar las
poblaciones celulares de manera individual, debido a la alta heterogeneidad que existe entre una
célula y otra de la misma comunidad. Esta heterogeneidad celular puede tener un origen genético,
donde cada una de las células en una población tienen ligeras diferencias en su código genético, lo
que les permite mantener una variabilidad genética, necesaria para que la población pueda adaptarse
a cambios en el medio. Sin embargo, un linaje monoclonal también puede presentar variabilidad
fenotípica, incluso a pesar de que todas las células de la población cuenten con la misma información
genética. Estas diferencias pueden estar relacionadas con sutiles cambios en el entorno inmediato de
cada una de las células. Si bien las aplicaciones genómicas, mencionadas en el capitulo anterior, son
una poderosa herramienta para estudiar la heterogeneidad genética de una población celular, estas
pueden llegar a incrementar significativamente los costos y tiempos requeridos para un estudio. Por
esta razón es importante contar con alternativas que permitan identificar rápida y efectivamente
características fenotípicas relevantes, ya sea que su origen sea de carácter genético, epigenético o
transcriptómico.
6.1 PLANTAS El desarrollo de organismos genéticamente modificados para incrementar la eficiencia de los cultivos
o la resistencia de estos a plagas requiere en muchas ocasiones de la manipulación de células
individuales o protoplastos115. Estos últimos son células que han sido despojadas de su pared celular,
facilitando así permeabilidad de moléculas como el ADN. El uso de este tipo de células es la base de
23
las transformaciones nucleares estables, pero también puede facilitar el cruce de especies que no son
compatibles reproductivamente115,116. Sin embargo, debido a la ausencia de pared, estos organismos
son muy frágiles y por tanto, difíciles de manipular116. Encapsular protoplastos resulta ser entonces
una excelente estrategia para la manipulación de este tipo de células, pues las herramientas de
manipulación de gotas que ofrecen los SMBG permiten controlar de forma muy precisa gotas
individuales y sus contenidos, además de clasificarlas y analizarlas, todo esto sin ejercer mayor estrés
a las células contenidas en su interior. Kumar y colaboradores aprovecharon los SMBG, en conjunto
con micropartículas magnéticas, para estudiar la permeabilidad del agua en protoplastos individuales
de Arabidopsis thaliana, como prueba de concepto117. Yu et al. reportaron el uso de un SMBG para
el análisis de la respuesta celular a factores ambientales en organismos transgénicos. Para ello
encapsularon protoplastos de Marchantia polymorpha en un sistema W/O y detectaron, a través de
fluorescencia inducida por láser, la concentración de clorofila y proteína amarilla fluorescente, asi
como su variación en función de la temperatura, en células modificadas118. Estos ejemplos abren
nuevas posibilidades, que en conjunto con librerias de ARN o herramientas de edición genética como
CRISPR-cas9, podrían tener un gran impacto en la biotecnología de plantas y en la industria agrícola.
6.2 RESISTENCIA BACTERIANA Como en cualquier otro organismo, la heterogeneidad fenotípica en las poblaciones bacterianas es un
factor clave en su capacidad de adaptación a cambios en el medio119,120. Existe una gran variedad de
mecanismos que pueden influenciar en la diversidad de fenotipos que se pueden presentar en una
población bacteriana, tales como su ubicación relativa en la comunidad o cambios en el ambiente
percibido por algunas de las células en una ubicación determinada. Se han encontrado múltiples
ejemplos de cooperación entre subpoblaciones bacterianas, en las que una subpoblación produce una
proteína o un factor que promueve el crecimiento de otra, como algunas poblaciones patógenas en las
que solo una pequeña parte de la población total produce proteínas capaces de combatir al sistema
inmune y son suficientes para proteger a toda la comunidad119. Esta diferenciación fenotípica puede
ser meramente estocástica, mediada por factores externos o dirigida por sistemas como el quorum
sensing (QS), el cual utiliza un SMBG con Escherichia coli encapsulada en un sistema W/O para
estudiar las propiedades espaciales de la comunicación intercelular, como la capacidad de difusión
de AHL en medios oleosos, y si la comunicación sucede entre gotas adyacente por contacto directo,
o si el alcance de la comunicación depende de la difusión del AHL en la fase oleosa de la
emulsión121,122. A través de este sistema pudieron concluir que la manera en que se transporta el AHL
en la emulsión efectivamente permite la activación de genes de forma diferencial en función de la
distancia. Este modelo puede ser utilizado para el estudio de la diferenciación celulares en durante el
desarrollo, en el cual la diferenciación esta mediada por gradientes de concentración de señales
moleculares. La heterogeneidad fenotípica en las poblaciones microbianas es de interés clínico e
industrial, puesto que este fenómeno puede estar asociado con resistencia a medicamentos123,
reincidencias de infecciones124,125 y problemas en bioprocesos a escala industrial120.
Uno de los problemas más importantes en la actualidad es la resistencia microbiana a los tratamientos
antibióticos con los que contamos. Se estima que para el 2050 las infecciones resistentes a antibióticos
podrían matar a 10 millones de personas al año en todo el mundo123. Gran parte de los problemas
relacionados con infecciones resistentes se deben a la manera en que se diseñan terapias para su
tratamiento actualmente126. Para seleccionar un medicamento adecuado es necesario realizar un
aislamiento de la infección y someterlo a un Test de Susceptibilidad Antimicrobiana (TSA), el cual
puede tardar entre 16 y 24 horas, razón por la cual, los pacientes son tratados inicialmente con
antibióticos de amplio espectro (AAE). En ocasiones, los TSA ni siquiera son llevados a cabo, debido
a los costos y gran cantidad de pacientes que requieren de atención, de manera que el tratamiento se
24
limita al uso de AAE. La Organización Mundial para la Salud ha reportado la prevalencia de
resistencia múltiple a patógenos como Klebsiella pneumoniae y E. coli, lo cual se puede ver reflejado
en un fallo del 50% de los tratamientos a pacientes infectados con estas bacterias127. Se han reportado
diferentes sistemas que permiten encapsular, incubar y analizar células bacterianas individuales,
demostrando que los SMBG pueden ser una herramienta muy útil en el análisis este tipo de
organismos128–130. Kaushik y colaboradores reportaron un SMBG integrado para separar y encapsular
bacterias, incubarlas y detectar su sensibilidad frente a antibióticos en menos de 1 hora. Esta
tecnología, bautizada DropFAST, se basa en el crecimiento acelerado y detección por fluorescencia
mediada por resarzurina131. Recientemente, Kang et al. reportaron un dispositivo capaz de realizar
TSA para 4 antibióticos o patógenos en paralelo y ofrece resultados en menos de 30 minutos. Con
esta plataforma fue posible determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diferentes
antibióticos para Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. coli y K. pneumoniae132. Estas
plataformas ofrecen una gran reducción en los tiempos y costos, además de una fácil operación, para
el diseño de terapias mas efectivas y personalizadas contra infecciones bacterianas, reduciendo así
problemas asociados al mal uso de antibióticos. Es importante reevaluar la manera en la que se
diseñan las terapias para el tratamiento de enfermedades, e incluir factores de heterogeneidad celular,
tales como la heterorresistencia y la persistencia, con el fin de asegurar la efectividad de los
tratamientos y evitar la propagación de poblaciones resistentes y su establecimiento133.
Figura 12. Representación de los fenómenos asociados al fallo de tratamientos antimicrobianos133. La
resistencia implica la supervivencia de una subpoblación que no es sensible al tratamiento con antibiótico (AB)
y su capacidad para replicarse en presencia del mismo. La persistencia se logra cuando una subpoblación de
bacterias isogénicas reduce su tasa metabólica y entran en un estado de resistencia que puede ser revertido tras
eliminar el AB del medio. La heterorresistencia sucede cuando una subpoblación isogénica expresa factores
que le permiten sobrevivir al tratamiento y se puede reproducir en presencia del mismo, sin embargo, al retirar
el AB del medio, el fenotipo se revierte.
6.2.1 Heteroresistencia
La heterorresistencia se refiere a un fenómeno en el que una subpoblación de una comunidad
bacteriana, aparentemente homogénea genéticamente, presenta un espectro de resistencia a un
antibiótico134. Sin embargo, el termino ha sido utilizado para describir una gran variedad de
resistencias, lo que hace difícil delimitar acertadamente su definición y, por tanto, dificulta el estudio
de su importancia clínica, así como de la formulación de terapias adecuadas para su prevención123,134.
Los ensayos tradicionales para la identificación de resistencia microbiana, como CMI, son incapaces
de detectar efectivamente heterorresistencia, puesto que analizan poblaciones bacterianas como un
todo, razón por la cual se hace necesario el análisis de células individuales para identificar linajes
25
subrepresentados que puedan ser fuentes de heterorresistencia135,136. Lyu et al.reportaron un método
para cuantificar la heterorresistencia a ampicilina, kanamicina, norfloxacina y tetraciclina de E.coli.
La metodología involucra la encapsulación de células bacterianas individuales en gotas con el
antibiótico, tinción con un marcaje para células metabólicamente activas y la posterior evaluación de
fluorescencia a través de microscopia confocal137. A partir de estos estudios fueron capaces de
detectar heterorresistencia en fracciones de hasta una millonésima parte de la población total. Además,
realizaron análisis de los efectos evolutivos que implica la exposición de las comunidades
heterorresistentes a concentraciones de antibiótico no letales. Recientemente Scheler y colaboradores
reportaron el uso de SMBG para la cuantificación de la distribución fenotípica de resistencia contra
cefotaxima en E. coli136. Sus resultados sugieren que la cantidad de antibiótico por bacteria requerida
para lograr la inhibición del crecimiento es constante, sin importar la densidad de la población, es
decir, lo que determina la inhibición es la relación entre la cantidad de antibiótico y de bacteria, mas
no la concentración absoluta del antibiótico en el medio. Adicionalmente, pudieron observar
tendencias de asociación celular cuando las poblaciones son expuestas a concentraciones inferiores a
las letales. Estos hallazgos son sumamente importantes para el diseño de nuevas terapias, mas
eficientes y focalizadas para el tratamiento de infecciones heterorresistentes, así como en el estudio
de la formación de biofilms.
6.2.2 Persistencia
Otro de los factores asociados al fallo de los tratamientos son las llamadas células persistentes. Estas
son células que persisten tras el tratamiento con antibióticos, usualmente debido a que se encuentran
expresando tasas metabólicas inferiores a las del resto de la población125. Sin embargo, las células
persistentes siguen siendo susceptibles al antibiótico, a diferencia de las células resistentes, razón por
la cual pueden ser eliminadas tras reestablecer las tasas metabólicas basales y someterlas de nuevo al
tratamiento con antibiótico124. Algunos de los mecanismos moleculares conocidos asociados a este
fenómeno se basan en la tasa de expresión de “proteínas de persistencia”, de manera que cuando estas
superan una concentración específica, la célula reduce su tasa metabólica y entra en estado de
persistencia133. Sin embargo, aun no se conoce mucho sobre estos, por lo que Verpoorte reportó el
diseño y aplicación de un sistema microfluídico que permite rápidos cambios en la composición del
medio, para la identificación de factores genéticos asociados con este fenómeno en Mycobacterium
smegmatis, partiendo del fenotipo138. Iino et al. reportaron el uso de un SMBG para la encapsulación
y análisis individual de Pseudomonas aeruginosa en busca de células persistentes139. El sistema
propuesto es abierto, lo que permite una fácil recuperación y manipulación posterior de las células
encapsuladas, sin embargo, limita su automatización al requerir un manejo por lotes. Los autores
también demostraron la posibilidad de utilizar el SMBG en el estudio del sistema de expulsión activa
de AcrAB-TolC en P. aeruginosa, obteniendo resultados en menos de 30 minutos.
6.2.3 Fagoterapia
La fagoterapia consiste en el uso de bacteriófagos (virus que solo infectan células bacterianas) para
el tratamiento o la prevención de infecciones bacterianas, la cual se propuso hace casi cien años en
Europa140. Desde la llegada de los antibióticos se redujo significativamente la investigación y uso de
este tipo de terapias, sin embargo, con el acelerado incremento en la resistencia bacteriana que
estamos viviendo actualmente la fagoterapia ha recuperado atención, como alternativa al uso de
antimicrobianos, para luchar contra infecciones en humanos y animales141. Recientemente se
demostró la efectividad e inocuidad de una mezcla de bacteriófagos para el tratamiento y prevención
de Salmonella en pollos en una granja colombiana142. El producto SalmoFREE® fue capaz de
controlar la incidencia de la bacteria en pollos, sin afectar su crecimiento, ni los factores de
producción de la granja en la que se realizó el estudio. Si bien las bacterias también pueden generar
resistencia a los fagos, estos pueden evolucionar para contrarrestarla. Adicionalmente, se han
26
realizado combinaciones sinérgicas de fagos y antibióticos que prometen una mayor efectividad que
las terapias por separado, así como una menor posibilidad de resistencia por parte de las bacterias143.
A pesar de que existen múltiples ejemplos del uso de fagoterapia en animales y humanos144, los fagos
no suelen ser muy estables en solución, por lo que es necesario desarrollar formulaciones que faciliten
la conservación del titulo viral durante el almacenamiento y dosificación145.
Una de las aproximaciones para la estabilización y administración de fagos consiste en su
encapsulación en microgotas o microcápsulas, con medios acuosos que incrementen su estabilidad,
los cuales pueden estar suplementados con antibióticos para obtener el efecto sinérgico mencionado
anteriormente. Recientemente se han propuesto y estudiado varias estrategias de nebulización de
fagos en suspensión para el tratamiento de infecciones en las vías respiratorias con P. aeruginosa146,147
y Mycobacterium turberculosis148. Estas estrategias utilizan métodos como nebulización de malla
vibratoria, nebulización de niebla fina y nebulización de jet, para suspender en aire microgotas de
fagos en solución, permitiendo así la inhalación por parte del infectado, sin reducir demasiado el titulo
viral. Leung et al. estudiaron los efectos del tamaño y la forma de los fagos en la eficiencia de su
encapsulación en liposomas, creados con ayuda de un SMBG149. A través de un sistema Flow-
focusing encapsularon fagos de P. aeruginosa, pertenecientes a las familias Podoviridae y
Myoviridae, sin embargo, la eficiencia de la encapsulación no fue muy distinta (59% y 50%
respectivamente). Cinquerrui y colaboradores utilizaron un sistema similar para encapsular fago T3
de E. coli y fago K de Staphylococcus aureus y evaluar los liposomas como posible método de
administración oral para el tratamiento de infecciones en el tracto gastrointestinal150. Se demostró que
los fagos K de S. aureus pueden interactuar con la membrana lipídica y quedar orientados hacia el
exterior del liposoma, lo que permitiría su inactivación en pH acídico, como el del estómago y podría
generar una reducción significativa en el titulo efectivo que es entregado en el intestino, factor
importante a tener en cuenta a la hora de formular la concentración del fago para su uso terapéutico.
El tratamiento de infecciones intestinales con Salmonella151 y Clostridium difficile152 vía oral, usando
capsulas de polímeros sensibles al pH, ha sido estudiado recientemente en fluidos que simulan el
entorno estomacal e intestinal. Las plataformas utilizadas para estos análisis permitieron comprobar
la elevada protección que ofrecen las capsulas poliméricas, generadas en SMBG, contra el bajo pH
encontrado en el estómago, además de la efectiva liberación de los fagos cuando el pH se encuentra
por encima de 7, lo cual corresponde con el encontrado en el intestino grueso153. Estas metodologías
prometen novedosas formas de aplicar la fagoterapia en zonas específicas del cuerpo con gran
precisión en términos de localización del tratamiento y titulo viral, los cuales son factores
determinantes en la efectividad de la terapia.
6.3 CÉLULAS HUMANAS En seres humanos también es posible evidenciar altos niveles de heterogeneidad celular, incluso entre
células isogénicas. Un excelente ejemplo de heterogeneidad en humanos son las poblaciones celulares
que componen los tumores cancerígenos, lo cual juega un papel vital tanto en el diagnóstico del cáncer,
como en su tratamiento154. Por una parte, se ha propuesto una gran cantidad de marcadores
moleculares para el diagnóstico de cáncer, sin embargo, ninguno ha demostrado ser completamente
efectivo155. Siempre existe algún pequeño porcentaje de células que no cuenta con estos marcadores,
lo que retrasa el diagnostico adecuado de estas condiciones. Por otra parte, la heterogeneidad en la
población celular intratumoral puede tener repercusiones en términos de expresión proteica, tasa de
crecimiento e incluso de respuesta a los tratamientos. En cualquier caso, el que un pequeño grupo de
células subrepresentadas en la población escape al tratamiento o diagnóstico implica una gran
amenaza para la vida del paciente156. Por ejemplo, la leucemia y los mielomas en humanos suelen ser
oligoclonales, por lo que es común observar reincidencias debidas a clones subrepresentados que
27
escapan al tratamiento157. Una de las aproximaciones en el estudio del cáncer a nivel de células únicas
es el western blot, a través del cual se han estudiado respuestas a tratamientos de glioblastoma cerebral
en ratones, permitiendo así identificar resistencia a terapias incluso antes de que esta se manifieste
clínicamente158,159. Por otra parte, Ramji et al. diseñaron un microsistema para romper agregados
celulares, organizar y encapsular células de la línea PC9 de cáncer pulmonar, así como su posterior
análisis en términos de tolerancia a un fármaco inhibidor de tirosin quinasa160. Mediante un ensayo
de actividad de quinasa, realizado en el mismo dispositivo, fueron capaces de observar una gran
heterogeneidad en los niveles de resistencia al fármaco, lo cual puede tener implicaciones importantes
en la manera en la que se trata el mismo, para evitar que pequeñas poblaciones resistentes sobrevivan
a un tratamiento inicial y generen un nuevo tumor más difícil de tratar en el futuro.
Por otra parte, el sistema inmune (SI) está diseñado para responder a una gran variedad de organismos
potencialmente patogénicos. La respuesta del SI adaptativo a una infección se basa en sistemas de
comunicación y selección complejos, los cuales se encargan de identificar subpoblaciones celulares
capaces de reconocer y enfrentar al patógeno atacante. Las células del sistema inmune cuentan con la
posibilidad de reordenar los genes que codifican para muchos de los receptores asociados con su
función, tales como anticuerpos y complejos CD3, con el fin de diversificar los antígenos que pueden
ser reconocidos y así tener un mayor espectro de acción a la hora de combatir posibles
infecciones161,162. Las técnicas tradicionales, tales como ELISA y western blot son insuficientes a la
hora de estudiar el SI, debido a la gran cantidad de patrones de expresión distintos que pueden
encontrarse en una misma población celular163,164. Los SMBG han demostrado ser de gran utilidad en
el análisis de células individuales, por lo que han sido ampliamente utilizados en el área de la
inmunología para estudiar con mayor detalle los fenómenos que se encuentran asociados a la
heterogeneidad celular164. Sarkar et al. diseñaron un sistema de este estilo para estudiar señalización
de calcio en linfocitos T primarios y los efectos en el transporte de este ion, producidos por la
interacción con células dendríticas165. Lo anterior les permitió encontrar que las concentraciones de
calcio en el interior del linfocito incrementan cuando interactúa con una célula dendrítica, incluso
cuando no hay contacto entre ellas, en cuyo caso el incremento es menor. Recientemente los SMBG
han sido utilizados, en conjunto con TSNG, para estudiar la diversidad de células involucradas en la
reparación de órganos como los pulmones y riñones166 en modelos animales. A partir de estos estudios
Conway y colaboradores pudieron identificar una gran variedad de células mieloides, que no habrían
sido detectadas con métodos de citometría tradicional, como monocitos Arg1+, macrófagos Mmp12+,
así como el origen de la acumulación de macrófagos Ccr2+ en las etapas tardías de la reparación, las
cuales parecen tener un efecto negativo en la resolución de condiciones como la fibrosis renal. Por
su parte, Ysasi et al. analizaron el cambio en el transcriptoma de 6 clúster celulares, tras la remoción
quirúrgica de un pulmón en un modelo murino167. A partir de ello pudieron identificar la expresión
de factores asociados con angiogénesis y reparación celular, lo que permite identificar grupos de
interés en el análisis del fenómeno de regeneración pulmonar que tiene lugar en muchos mamíferos
adultos. Por otra parte, los SMBG también han sido utilizados para estudiar y clasificar células en
función de sus patrones de secreción de citoquinas o su reactividad frente a otras células. Para ello se
han utilizado sistemas de encapsulación que permiten introducir una célula linfoide, una célula
activadora (APC o cancerígena) y un sistema de marcaje fluorescente en una sola gota, para su
posterior clasificación en función de su activación o no activación. Por otro lado, Yuan y
colaboradores clasificaron células NK activadas por la presencia de células K562 y las clasificaron
con este tipo de sistemas, con lo cual incrementaron drásticamente la precisión con relación a los
métodos tradicionales168. Al co-encapsular las células NK con sus activantes (K562) en gotas
individuales fueron capaces de evitar la difusión del IFN-γ secretado tras su activación, y utilizar
anticuerpos anti- IFN-γ marcados para la clasificación por fluorescencia de las células de interés. De
forma similar, Sarkar y colaboradores analizaron la interacción de células NK primarias y de la línea
28
NK-92 con células cancerígenas de linfoma no Hodgkin, encontrando así que las últimas son mucho
más eficientes en la destrucción de las células de este tipo de cáncer. Este trabajo también les permitió
identificar marcadores moleculares relacionados con la activación de células NK, así como
caracterizar la heterogeneidad que se puede presentar en las interacciones de las células NK con las
cancerígenas en términos de cantidades de contactos, duración del contacto y la relación entre estos
factores y la tasa de destrucción de la célula cancerígena169. Finalmente, Segaliny et al. propuso una
manera efectiva para identificar linfocitos T con actividad de interés para su uso en inmunoterapia, la
cual somete a prueba linfocitos T individuales contra la célula patógena de interés y selecciona las
gotas en las que se evidencia la activación del linfocito para su posterior análisis genético170. Esto
permite obtener una librería de receptores de células T capaces de reconocer un antígeno en particular,
las cuales pueden posteriormente ser amplificadas y administradas al paciente como terapia. Este tipo
de estudios permiten comprender mejor las dinámicas propias del proceso de respuesta inmune y el
papel de los actores participantes en procesos de infección y reparación tisular, lo que a su vez puede
ayudar a mejorar el enfoque de las terapias para el tratamiento de múltiples enfermedades y lesiones
que actualmente son difíciles de tratar o cuyos tratamientos son poco efectivos o exitosos.
29
7 CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
La gran variedad de materiales y la versatilidad de las metodologías de manufactura de microsistemas
hacen que estos puedan ser diseñados y manufacturados de acuerdo a las necesidades específicas de
cada laboratorio o proyecto de investigación. Sin embargo, su manufactura a gran escala sigue siendo
complicada y costosa. Si bien se ha reportado la posibilidad de utilizar una gran variedad de distintos
materiales en la manufactura de este tipo de dispositivos, la mayoría de las aplicaciones biológicas
dependen de la fotolitografía y el PDMS, lo cual dificulta su escalamiento. Algunas compañías, como
Illumina, 10x Genomics, Fluigent, µFluidix, entre otras, han desarrollado versiones comerciales de
sistemas microfluídicos para el análisis genómico lo que ha permitido incrementos en la sensibilidad
de muchos de los ensayos, hasta el punto de sobrepasar las habilidades de las metodologías estándar.
La comercialización también abre la puerta a la implementación de estos sistemas en más laboratorios
e instituciones de salud, pues elimina la necesidad de diseñar y fabricar sus propios dispositivos.
Aspectos como la cantidad de células que se pueden analizar al mismo tiempo, la posibilidad de
analizar interacciones individuales célula a célula, el análisis de células individuales y las diferencias
fenotípicas entre células isogénicas, entre otros hacen que la tecnología de gotas haya logrado
sobrepasar, en muchos casos, a las técnicas tradicionales y que cada vez se incorporen a nuevas
aplicaciones en la biología y la medicina. A pesar de ello, algunos ensayos siguen dependiendo de la
reinyección de gotas y otro tipo de intervenciones manuales, de manera que en trabajos futuros es
necesario desarrollar diseños que sean más versátiles y permitan incorporar los módulos requeridos
en un solo circuito, con el fin de seguir incrementando la eficiencia de los sistemas y reducir los
posibles errores experimentales. Por otra parte, se debe tener en cuenta que otro factor limitante a la
hora de obtener procesamientos mayores es la detección por fluorescencia. Si bien existen técnicas
en las que múltiples gotas pueden ser detectadas y analizadas por fluorescencia al mismo tiempo, esto
no aplica para los casos en los que la clasificación de las mismas está involucrada. En un mismo
circuito se pueden encontrar múltiples canales en paralelo, que permiten la creación y manipulación
de gotas, sin embargo, la clasificación basada en fluorescencia requiere el colapso de estos canales
paralelos en uno solo para realizar un análisis y discriminación secuencial de las gotas, lo que limita
la capacidad de procesamiento de los sistemas. Trabajos futuros podrían explorar distintas propuestas
que permitan mejorar la capacidad de detección y clasificación de los SMBG. Así mismo, estos
podrían evaluar alternativas orientadas a reducir la dificultad para la implementación de procesos de
lavado y muestreo. Aunque se han reportado algunos ejemplos en los que se pueden realizar
fraccionamientos de las gotas en línea e intercambio de material al interior de la gota, se requieren
diseños complejos y difíciles de incorporar a los módulos principales.
Uno de los problemas que se han podido observar en el manejo de la pandemia actual es la dificultad
para realizar muestreos masivos, debida a los largos tiempos de espera y los altos costos asociados a
las pruebas de RT-qPCR, dificultades que podrían ser solucionadas al implementar metodologías
basadas en sistemas microfluídicos. Los SMBG ofrecen grandes ventajas sobre las tecnologías
actuales para la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas, en términos de costos de
análisis por paciente, tiempos de espera y preparación de la muestra. Esto da cuenta de la urgencia y
necesidad de encontrar métodos viables para la estandarización y fabricación de dispositivos
microfluídicos en masa. La tecnología de los SMBG tiene un gran potencial, pero es necesario hacer
estos dispositivos mas accesibles, no solo al publico en general, sino también a la misma comunidad
científica para poder explotar al máximo esta tecnología.
30
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