Estructura tridimensional Estructura tridimensional de de macromolmacromolééculas culas : :

su determinacisu determinacióón usando n usando difraccidifraccióón n de de rayos rayos XX

o se trata de biología estructural…?

mioglobina

Proteína A

Las estructuras secundarias y terciarias de las macromoléculas, conllevan información clave para determinar las funciones bioquímicas y celulares

Sitios activos en 3D

Diagrama 2D

Ecosistemas

Comunidades Ecología

Poblaciones

Organismos

Tejidos

Células

Moléculas

Atomos

Fisiología

Histología

Biología celular

Biología molecular / bioquímicaBiología estructural

In v

ivo

In v

ivo

In v

itro

In v

itro

Biología estructural Técnicas biofísicas :•Cristalografía de rayos X

•Calorimetría

•Microscopía electrónica

• ≠ técnicas espectroscópicas (CD, EPR, …)

•RMN

•Espectroscopía de masa

•Dispersión de luz

•Espectrofluorometría

•………….

Biología estructural

La estructura 3D de moléculas biológicas nos permite contribuir a entender :

•qué moléculas interactúan? cómo?

•rearreglos conformacionales disparados por la interacción

•cómo hacen las enzimas para catalizar reacciones?

…para describir la forma (y la topología) de algo, lo mejor es…

MIRARLO!

Es muy pequeño?…

usá un microscopio …lenteslentes

objetoobjeto

imagenimagen

… pero… el problema del límite de resolución!

Tamaños relativos entre el objeto a estudiar y la longitud de onda

Espectro electromagnético

La longitud de onda de los rayos X usados en cristalografía :1Å - 3Å (Å = 10-10m) ; lo más típico 1.54Å (Cu )

Frecuencia = c/λ =(3x108m/s) /(1.54x10-10m) ≈ 2x1018 s-1

… pero, no podemos (aún?) fabricar un microscopio de rayos X :

•no hay lentes

•aun si las tuviéramos, deberíamos poder pulirlas con una precisión mejor a 0.1Å!!

Necesitamos aprender a interpretar los patrones de difracción de rayos X (no

refocalizados), para reconstruir la distribución de densidad electrónica que

difractó

Proteína purificada

Cristales

Difracción de rayos X

Obtención de fases

Mapa de densidad electrónica

Construcción de modelo

Refinamiento

Validación

Institut Pasteur de Montevideo

X RAY DIFFRACTION FACILITY

Setup experimental para hacer difraccion de cristales unicos

Resultado experimental: estructuras a resolucion atomica

QuQuéé es es un un cristalcristal??

•La materia se clasifica en gases, líquidos y sólidos

•(también hay mezclas homogéneas que están digamos "en el medio"!! coloides, sólidos amorfos, etc)

•Sólidos: volumen fijo, incompresibles, comportamientos anisotrópicos

interaccionesintermoleculares

fuertes orden

OrdenOrden

•Explica el comportamiento anisotrópico(óptico, mecánico, magnético, eléctrico, etc)

•Arreglo ordenado a largas distancias entre moléculas (simetría, capas o planos moleculares)

Estructura cristalina = motivo * red cristalina

OrdenOrden

Estructura cristalina = motivo * red cristalina

molécula celda unidad

cristal

TeorTeorííaa

Los diagramas de fase grafican la solubilidad de las proteínas bajo distintas condiciones

TeorTeorííaa•Saturación las velocidades de pérdida/ganancia de las fases sólida y líquida son iguales, el sistema está en equilibrio•Salting-out región derecha del diagrama, la solubilidad de la proteína se reduce a medida que la concentración de sal aumenta•Salting-in región izquierda del diagrama, la solubilidad de la proteína aumenta con la concentración de sal

Qué es lo que queremos?Agregación ordenada!

La sobresaturación controlada aumenta la probabilidad de nucleación

MMéétodostodos

Experimento de difusión de vapor

pequeños volúmenes de precipitante y de proteína son mezclados en una gota que se deja equilibrar contra un reservorio de mucho más volúmen conteniendo precipitante u otro agente deshidratante

gota colgante

gota sentada

sandwich

Tipico setup de difusión de vaporExperimentos de diálisis

Experimentos en batchSe pueden usar diferents relaciones prot/precipitante

Veamos un experimento de difusión de vapor

Aún sin cristales…

Cristales creciendo!!!

…o un experimento en batch…

Ahora A, B y C son distintos experimentos

…o diálisis

región de salting-in

región de salting-outcambiando buffers

Condiciones Condiciones de screeningde screening

Los parámetros que típicamente son variados:

•Concentración de proteína (comenzar lo más alto posible)

•Precipitante (PEG’s, SA, solventes, sales concentradas, etc)

•Presencia de sales (u otros “aditivos”)

•pH y tipo de buffer

•Temperatura

Condiciones Condiciones de screeningde screening

Estrategias de screening :

•Factorial completa

•Factorial incompleta

•Aleatoria

•Rala ("sparse")

Calidad Calidad de la de la proteproteíínana•Está pura?

•el requisito más importante•hacer (SDS-PAGE, MS) + (SEC, IEC)

•Está plegada correctamente? •testear actividad si se tiene un ensayo •testear el espectro CD (o PAGE nativo)

•Es fresca?

•Es monodispersa? •monodispersión significa que la proteína existe en solución como una única especie de estructura terciaria/cuaternaria determinada (homogeneidad conformacional)•usar una columna de exclusión por tamaño (SEC) como último paso de purificación•usar dispersión de luz (DLS o SLS) como control de calidad

ObservaciObservacióónnHay ± 9 cosas distintas que se pueden llegar a ver, a veces

combinando más de una en la misma gota

1. Gotas claras 2. Materia 3. Precipitado 4. Geles 5. Piel 6. Separación de fases7. Aceites 8. Esferulitas 9. Cristales

Precipitado microcristalino 1D - agujas 2D - placas 3D - gemas

Algunas fotos…

…algunas más…

OptimizaciOptimizacióónn

Cuando se llega a identificar algo "interesante" se procede a

•Rastrear alrededor de la condición ("afinar")

•Usar aditivos

•Sembrar gotas frescas preequilibradas, con el material "interesante" : micro and macro-seeding

un un cristal demasiado observado nunca crececristal demasiado observado nunca crece!!!!

Tomar Tomar la primer la primer fotofoto!!El único requerimiento para considerar un cristal de proteína como 'bueno' es que difracte

La difracción depende de :Tamaño

•La intensidad de dispersión es proporcional al número de celdas unidad en el cristal•El N° de celdas unidad es proporcional al volúmen del cristal (duplicando todas las dimensiones de un cristal cúbico daráreflexiones ~8 veces más intensas) •El N° de celdas unidad de un cristal depende del tamaño de las celdas (tamaño de la proteína, cuan compacto sea el empaquetamiento, N° de proteínas en la unidad asimétrica, simetría)

Orden •La difracción depende de cuan idénticas son las celdas unidad.

•Colectar una imagen con un ángulo de oscilación grande. Si el cristal es de sal, los puntos van a estar bien alejados y podrían

no verse si se toma un ángulo pequeño.

Si lamentablemente es sal, se verán puntos muy intensos difractando aun a muy alta resolución (celdas

unidad muy pequeñas, bien ordenadas)

Tomar Tomar la la primera fotoprimera foto!!

•Encontrar la concentración mínima de crio-protector para el licor madre (criocristalografía)

•Poner el cristal en la solución crioprotectora por x tiempo, y montarlo en un loop

Calidad de la difracción

Fuerza

Calidad

no hay difraccióndébil (anisotrópica) 10 Åprometedora 4.5-6 Åbuena < 3 Å

cristal múltiple / splitcristal único muy mosaicocristal único

Sabemos entonces por qué usamos rayos X …

Pero por qué obtenemos densidad electrónica?

Qué son los rayos X?

Fotones = un campo eléctrico oscilante*

*también un campo magnético oscilante de la misma frecuencia, pero ortogonal y desfasado 90°

Qué son los rayos X?

E

Fotones. Un campo eléctrico oscilante

Amplitud

long. de onda

E(t) = A cos(ωt + α)

αt

ω=2πc/λ

(fase)

Un electrón en un campo eléctrico oscilante

Los electrones e- orbitan a una velocidad aprox 1/100th c (≈2x106m/s),

Por lo que en un ciclo del haz de Rx, e- viajará2x106m s-1 / 2x1018s-1 = 10-12m = 0.01Å (no muchocomparado al tamaño del átomo)

En otras palabras, los Rx ven a los e- como si estuvieran quietos.

e- oscilan en un campo eléctrico...•la oscilación de e- tiene la misma frecuencia que los Rx

•la oscilación de e- es mucho más rápida que el movimiento de orbitado

•la amplitud de la oscilación de e- es grande porque la masa de e- es pequeña. Los núcleos atómicos no oscilan apreciablemente

Ee- e-

e-e-e-

e-e-e-e-

t

…cargas en oscilación crean fotones!

e-

Å

hν

…en todas direcciones

e-

Esto es DISPERSION!

En el fenómeno de dispersión hay al menos 3 efectos :•Fotoeléctrico --->> absorción

•Compton (interacción incoherente)

•Thompson o difracción de Bragg (coherente, elástica)

Dispersión de Thompson

e4

Iθ ≅ I0 (1 + cos2θ)2r2m2c4

Por quPor quéé necesitamos cristales para ver necesitamos cristales para ver difraccidifraccióónn??

•Amplificación de la señal….(efecto de interferencia a tener en cuenta!)

molécula celda unidad

cristal

DifracciDifraccióónn::Cada electrón dispersa

Las ondas emitidas se suman … y se restan!!

El resultado final depende de las fases relativas de las ondas adicionadas en cada dirección

Usar el sitio interactivo

http://www.journey.sunysb.edu/ProjectJava/Bragg/home.html

Ley de Bragg :

nλ = 2d sin θ