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Tema 3. Propiedades de los ácidos nucleicosMétodos de análisis

• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2)• Propiedades físicas: - absorción luz UV

- desnaturalización - reasociación - viscosidad

• Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot

- secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo

- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)

contenido

• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades físicas: - absorción luz UV

- desnaturalización - reasociación - viscosidad

• Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot

- secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo

- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)

contenido

Absorción de luz ultravioleta (UV)

desnaturalización y reasociación

Viscosidad del DNA en solución

disminuye al -fragmentarse: agitación mecánica, sonicación (ultrasonido)

-desnaturalizarse: calor, baja fuerza iónica, pH alcalino, urea, …

• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades físicas: - absorción luz UV

- desnaturalización - reasociación - viscosidad

• Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot

- secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo

- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)

contenido

efecto hipercrómico

efecto hipercrómico por desnaturalización del DNA

efecto hipercrómico

• Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad

• Propiedades químicas: vistas en estructura• Caracterización: - efecto hipercrómico

- curvas Cot - secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo

- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)

contenido

desnaturalización y reasociación

cinética de reasociación

Curvas Cot

X = a Cot 1/2

1/2 = 1/(1 + k Cot )1/2

Cot1/2 = 1/k

X R = f NX = a Cot 1/2

1/2 = 1/(1 + k Cot )1/2

Cot1/2 puro = f Cot1/2 mezcla

genoma nuclear humano

no todo el DNA codifica proteínas

Britten y Kohne, 60’s

• Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad

• Propiedades químicas: vistas en estructura• Caracterización: - efecto hipercrómico

- curvas Cot - secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo

- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)

contenido

rotores y centrífugas

centrifugación

centrifugación diferencial

separación por tamaño

centrifugación zonalgradiente de sacarosa

centrifugación isopícnica

gradiente de CsCl

separación por densidad

0

SeparaciónDNA2c y DNAss

1. centrifugación isopícnica2. tratamiento con nucleasas específicas de DNA2c o DNAss 3. columnas de hidroxiapatito: retienen DNA2c y pasa el DNAss (el DNA2c puede ser eluido aumentando la temperatura o la concentración salina)

4: filtros de nitrocelulosa: unen DNAss y no DNA2c

electroforesis

electroforesis

• Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad

• Propiedades químicas: vistas en estructura• Caracterización: - efecto hipercrómico

- curvas Cot - secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo

- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)

contenido

marcaje radiactivo

isótopos pesados

- isótopos más usados en biología: N14 y N15; C12 y C13; H y D

- uso en centrifugación isopícnica

desnaturalización y reasociación

hibridaciónmolecular

hibridación DNA/RNA

hibridación en filtro

hibridación en colonia

FISH

telómeros

centrómeros

FISH

cariotipo espectral humano

chips de DNA

microarrays

Southern

pocillos con DNA

electroforesis

esponja

solución salina

gel filtro

gel

la solución sube a través del gelal filtro y a la pila de papeles absorbentes

DNA enel filtro

la sonda hibridacon las secuenciascomplementarias

hibridacióncon una sonda

el filtro se expone auna película o una placa sensibles

transferencia

electroforesis +transferencia +hibridación =Southern

Southern

electroforesis hibridación

Southern (DNA)

Northern (RNA)

Western (proteínas)

1 h de clase: 6-noviembre-2009

capítulo 1

2ª ed.: 14-24 (el 23 no)3ª ed.: 14-23

problemas

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

Laboratorio virtual en http://learn.genetics.utah.edu/Aislar DNA, PCR, chip DNA y electroforesis y mas….

papelera

satéliteminisatélitemicrosatélite

SINEsLINEstransposones

genoma humano

Estudios con DNA

Análisis

Detección

Aislamiento

hipercromicidadreasociación

hibridaciónPCR

centrifugaciónelectroforesis

PCR

cebadordirecto

cebadorinverso

PCR

Southern

electroforesis +transferencia +hibridación

Southern

electroforesis +transferencia +hibridación

Southern

Northern

Western