T i Vi lTropismo Viral

Federico GarcíaFederico GarcíaHU San Cecilio, Granada

Contenidos

Tropismo del VIH: ImportanciaTropismo del VIH: ImportanciaCómo se puede determinar el tropismoControversias en 2009:

Existen alternativas a Trofile?Existen alternativas a Trofile?Que hacer con pacientes con CV Indetectable (simplificación toxicidad )Indetectable (simplificación, toxicidad,...)

Ent ada de VIHEntrada de VIH

La unión a correceptores desencadena los cambios en gp41 que conducen a la fusión y a la entradagp41 que conducen a la fusión y a la entrada

Att h tTriggered by coreceptor M bAttachment

to CD4+ cellcoreceptor Membrane

fusion1

23

Ti d CTipos de Correceptores

NF G

YS Q Y Q F

WKN

H

PF

EFFGL N N C

SSS

QVNI K Q C

PES

TYYNIDYIPSS V Q Y D M - NH2 CCR5

DW

CCR5

C

LAD

TF

F

H

LL

S

PL

A

F

NY

I

VL

W

L

LF

I

G

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V

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II

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F

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F

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L

L

I

LIN

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F

C

TV

M

A

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V

TL

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G

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NTFQE N

R

DQ

L

KF L L

V

AA

AQ

AAI

QK

R31-

-57 67-

-89 102-

-125 146-

-168 -197

219- -235

-258

303-

TL

R

PL

D

K

R

277-

352

C D

L

KR M

T

K S

YLAVV

A F A K ARTVTF

HV L

LL

HR

KKENRCR

CK

FFR N

YL V

HIAKRF

F

QK

ACC S I

F Q Q

SVYTRS

TG

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PE

RASEQE - COOH

RA

I S V G L

Acidic

Basic

CCR5 = CXCR4

FLC

N

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CD

N D L W VVVFQF

F

PY

R

SFILLEII K Q G

C EFENT

HK

VVA

ANW

KNF

NANE E R F C

PEKM

SDYD

GSGME

ETYND S T Y I S I G E M - NH2

*

*

*

282

CXCR-4CXCR4

Q

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TF

F

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A

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V

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L

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H

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L

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T

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D K

DRYLAI K

LLA

KE

VYI Q

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KLAKRKS

H

DS K

L

K

LFK T

SA Q H

VSRGSS

A

TS

KN

Cytoplasmic

39-

-65 75-

-97 110-

-133 154-

-176 -202

224- -239

-262-282

308-

F

IV

N S R PR

HT Q

KQHGKS LK

GIL S

KG K R

TESESSS

F

G

HSSVSH

S S

Ser/Thr rich

-352

A

= Predicted G-protein binding domains

Ti d VIHTipos de VIH

Menos Prevalentes

P ió

Más prevalentes.

R5X4 DTProgresión

de la enfermedad

Transmisión de VIH

CXCR4 CCR5CD4

CD4+ naive CD4+ Memoria Macrofagos

Esté JA, et al. Lancet. 2007;370:81-88.

History of Tropism ResearchLate 1980s: correlation found between infected cells’ tendency

1985 R5 (NSI) X4 (SI)y

to cluster (syncytia) and HIV progression

NSI virus mostly in patients with asymptomatic HIV 1990 Light microscope KE Schneweis Virology Bonnwith asymptomatic HIV infectionSI virus mostly in patients with AIDS

1990

May 1996: fusin (CXCR4) identified as a coreceptor for

Light microscope, KE Schneweis, Virology Bonn

December 1995: RANTES, MIP1α MIP1ß identified as HIV

pT-tropic (X4) HIV[2]

June 1996: CCR5 identified as a coreceptor for M-tropic (R5) HIV[3]

1995

2000

MIP1α, MIP1ß identified as HIV suppressive factors in CD8+ cells[1]

(R5) HIV[3]

August 1996: CCR5 ∆32identified as HIV resistance factor[4]

1. Cocchi F, et al. Science. 1995;270:1811-1815. 2. Feng Y, et al. Science. 1996;272:872-877. 3. Dragic T, et al. Nature. 1996;381:667- 673. 4. Liu R, et al. Cell. 1996;86:367-377.

factor

Tropism confirmed as aTropism confirmed as a marker of HIV progresionp g

Kaplan-Meier curves showing progression to AIDS for

i i h R5 D/M iR5 virus

0.91.0

e

0.6

patients with R5 or D/M virus• BL tropism measured

in 126 children and adolescents

virus

0.70.8

AID

S fr

ee

0.40.5

adolescents• D/M virus at BL

associated with lower BL CD4+ cell count and

D/M virus

0.3op

orti

on A

higher VL• BL D/M virus

associated with 3.8- 0.00.10.2P

ro

fold higher risk of progression to AIDS

0 1 2 3 4 5 6 7 8Time, years

Conclusion: coreceptor tropism

Daar ES, et al. ICAAC 2003. Abstract 1722c.Daar ES, et al. Clin Infect Dis. 2007;45:643-649.

p pindependently influences natural history of HIV disease.

Ent ada de VIHEntrada de VIH

La unión a correceptores desencadena los cambios en gp41 que conducen a la fusión y a la entradagp41 que conducen a la fusión y a la entrada

Att h tTriggered by coreceptor M bAttachment

to CD4+ cellcoreceptor Membrane

fusion1

23Maraviroc

Vicriviroc Enfuvirtide

Inhibidores de la entrada

Pacientes pretratados

50%TORO 1 and 2

ENF trials[1] 48% 2%

R5 en el 50% a 60% de los pacientes

50%

50%

ENF trials(N = 612)

ACTG A5211[2]

(N = 391)

48%

46% 4%

2%

59%SCOPE cohort[3]

(N = 186) 39.5% 0.5%

56% 41%MOTIVATE 1 and 2 MVC trials[4] (N = 2560) 3%

76% 24%Subestudio AllegroN=106

1. Melby J, et al. J Infect Dis.2006;194:238-246. 2. Wilkin TJ, et al. Clin Infect Dis. 2007;44:591-595. 3. Hunt PW, et al. J Infect Dis. 2006;194:926-930. 4. Coakley E, et al. International Workshop on Targeting HIV Entry 2006. Abstract 8.

R5 DT X4

Contenidos

Tropismo del VIH: ImportanciaTropismo del VIH: ImportanciaCómo se puede determinar el tropismoControversias en 2009:

Existen alternativas a Trofile?Existen alternativas a Trofile?Que hacer con pacientes con CV Indetectable (simplificación toxicidad )Indetectable (simplificación, toxicidad,...)

Ensayos para la determinación y pdel Tropismo

Ensayos para la determinación y pdel Tropismo

Fenotipo:Enhanced Sensitivity Trofile Assay (ESTA)TropiTest (ISCIII)TropiTest (ISCIII)

Genotipo:Secuenciación de V3:

Secuenciación de poblacionesSecuenciación masiva de genomas (UDS)

Ensayos Fenotípicos: y pVirus Recombinantes

CD4+Vector de Vector de TROPISMO X4CXCR4+

++++

detección**Expresión* TROPISMO X4(la infección se Inhibe por anti-

CXCR4)

InfecciónTransfección

Pseudovirus

CD4+CCR5+

*Env, amplificada por RT-PCR del plasma

Whitcomb J, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2007;51:566-575.* Luciferasa

Ensayos Fenotípicos: y pVirus Recombinantes

CD4+Vector de Vector de CXCR4+

++++

detección**Expresión*

InfecciónTransfección

PseudovirusTROPISMO R5

(la infección se Inhibe po anti

CD4+CCR5+

Inhibe por anti-CCR5)

*Env, amplificada por RT-PCR del plasma

Whitcomb J, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2007;51:566-575.* Luciferasa

Ensayos Fenotípicos: y pVirus Recombinantes

CD4+Vector de Vector de TROPISMO X4CXCR4+

++++

detección**Expresión* TROPISMO X4(la infección se Inhibe por anti-

CXCR4)

InfecciónTransfección

TROPISMO R5Pseudovirus TROPISMO R5(la infección se Inhibe por anti-

CCR5)CD4+CCR5+

CCR5)

TROPISMO DUAL/*Env, amplificada por RT-PCR del plasma

Whitcomb J, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2007;51:566-575.* Luciferasa

TROPISMO DUAL/TROPISMO MIXTO

TropitestDetección X4R5S:75%, E:89%, , ,VPP:77%, VPN:88%

González N, 1er Congreso GESIDA, OR-2

Ensayos genotípicosAlternativa a Trofile, sobretodo en cuanto a logística y coste.Los determinantes genotípicos del Tropismo se encuentran en gp120 (V3, V1-V2) pero su estudio es difícil por la gran variabilidad de esta regióndifícil por la gran variabilidad de esta región.Los estudios se han centrado en V3, una región de 35-40 aa localizada en el gen env

Predicción del tropismo en base aPredicción del tropismo en base a la secuencia genética de V3

11/25 Rule: basic aa (R or K) at 11 or 25 position of the V3 region ------ CXCR4 co-receptor usagethe V3 region CXCR4 co receptor usage.

Net Charge Rule: (K+R) – (D+E) ≥ 5 ------- CXCR4 co-receptor usage11

25

Websites de acceso público que predicen el uso del correceptor a partir de la secuencia de nucleótidos o aa de V3:p• http://genomiac2.ucsd.edu:8080/wetcat/v3.html• http://www.geno2pheno.org• http://ubik.microbiol.washington.edu/computing/pssm

Región V3

• Secuenciación de poblaciones (pop`n sequencing)Secuenciación de poblaciones (pop n sequencing)• Secuenciación masiva de genomas (UDS)

Contenidos

Tropismo del VIH: ImportanciaTropismo del VIH: ImportanciaCómo se puede determinar el tropismoControversias en 2009:

Existen alternativas a Trofile?Existen alternativas a Trofile?Que hacer con pacientes con CV Indetectable (simplificación toxicidad )Indetectable (simplificación, toxicidad,...)

Therapy outcomes of casesreclassified as D/M by ESTAreclassified as D/M by ESTA

(N= 48)

N t ll ti t ith D/M b ESTA f il d!Not all patients with D/M by ESTA failed!

At 48 weeks 45 % had HIV RNA < 50 copies

no quantitative data on proportion of X4 are available

Swenson et al, CROI 2009, Abstract 680

Dual-tropic Virus Clones from Patients Enrolled in the MOTIVATE Studies may respond differently inthe MOTIVATE Studies may respond differently in vivo to Maraviroc Based on their V3 Sequence

Clones Dual R pueden responder a MVC in vivo (coexisten con Dual X) Genotipo V3 se podría usar para diferenciar cepas Dual R de Dual X, en

aquellos pacientes con Trofile D/M

Lewis M, et al. Eur HIV DR Workshop 2008, #50; CROI 2008 #871

aquellos pacientes con Trofile D/M

Massively parallel ultra-deep Pyrosequencingto characterize V3 genetic diversity in 10 dual-mixed tropic HIV-1 isolates

2

0Dual-R5+ Dual-X4+Dual-R5/X4

-4

-2

X4‐Minority

X4‐ Predominant

se se

8

-6

M score

ed CCR

5 us

d CX

CR4 us

-10

-8

PSSM

Increase

Increased

-12

-16

-14

ACV CLV SFV PLV AMV MMS BCS RSV A32SP A126SPACV CLV  SFV PLV AMV MMS BCS RSV A32SP A126SP

Distribution of the PSSM scores within each dual-tropic HIV-1 primary isolates. Red circles are the consensus sequences thatare predicted as R5-using by the PSSM algorithm, while green circle are the consensus sequences predicted as X4-using.Larger circle represent the predominant consensus sequence. Perno CF, CROI 2009 #434

Possible Outcomes in Patients With D/M Viruses Treated With CCR5 Antagonist

Hypothetical Virologic Responses to CCR5 Antagonist

CC i

Initial Virus Pool

al L

oad

R5

CCR5 Antagonist

Vir

a

X4

ad R5

R5/X4

Vir

al L

oa

R5

X4

R5/X4

CCR5Antagonist al

Loa

d R5

Vir

aX4

ConclusionsLevel III Expert opinion: Of the available

ESTA h f d ll iassays, ESTA has performed well in predicting activity of CCR5-antagonists in

ti t ith R5 ltpatients with an R5 resultLevel III Expert opinion: However, use of this assay may exclude a number of experienced patients with low level X4 who could benefit from CCR5 antagonist treatment

Clinical management of HIV-1 tropism testing: development of European guidelines 7th Eur DRW, 2009

Genotipo V3 vs Trofile: pMuestras Clínicas

6 herramientas bioinformáticasLa sensibilidad para detectar X4 es insuficienteLa sensibilidad para detectar X4 es insuficiente La especificidad está en torno al 90%, aunque esto para algunos expertos también es insuficiente

Algorithm, % Sensitivity Specificity

11/25 rule 30 5 93 4

para algunos expertos también es insuficiente

11/25 rule 30.5 93.4

Neural network method 44.4 87.5

WebPSSM SI/NSI 33.8 95.3

WebPSSM X4/R5 24.5 96.9

SVM genomaniac 21.8 89.6

SVM geno2pheno 44.7 90.6SVM geno2pheno 44.7 90.6

Low A, et al. HIV Resistance Workshop 2007. Abstract 149.;AIDS. 2007 Sep 12;21(14):F17-24.

La expansión de secuencias pmejora la predicción

Chueca N, et al. 7th Eur HIV DRW. 2009, Abst: 52

Combinación de Algoritmos

%

Elaboración de un índice con SVM PSSM geno2 C4 5

X4X4%

Correctly classified

S(%) SP(%)

PPV(%) NPV(%) X4 R5 ALL

SVM, PSSM, geno2, C4.5Geno2+SVM

*81.5 96.3 88 94 81.5

22/2796.379/82

92.7

SVM+Geno2+

PSSMsinsi* 83.3 90.6 75.8 93.983.325/30

90.577/85

88.7

Area under ROC curve (AUC) 0,970Standard error 0,013795% Confidence interval 0,936 to 0,989Significance level P (Area=0 5) 0 0001

PSSMsinsi*

25/30 77/85

PSSMsinsi 50 90.5 65.5 83.350

19/3890.5

95/10582.5

Geno2 84.2 81 61.5 93.484.2/

80.985/105

81.8Significance level P (Area=0.5) 0,0001

Geno 84.2 81 61.5 93.432/38 85/105

81.8

SVM 60.5 91.4 71.9 86.560.523/38

91.496/105

83.2

Chueca et al, J Med Virology, 2009, 81: 763-767 Garcia F et al , 4th HIV Entry Workshop, 2008

Remodelación de Herramientas

80

100

40

60 SensitivitySpecificity

0

20

PSSM scoreR5 X4

ALLEGRO t i l Th iti it / ifi it t d t t X4

Poveda et al, JAC 2009 May;63(5):1006-10

ALLEGRO trial. The sensitivity/specificity to detect X4 variants was 93%/69% for PSSMX4R5-8 and 93%/70% for PSSMSINSI-6.4.

Ultra Deep Sequencing (454)

Luke C, et al; ICAAC 2009

Ultra Deep Sequencing (454)

Vandekerchove L, et al; ICAAC 2009

Eficacia Virológica de MVC y % g yde cepas X4 (UDS-454)

0

-1

-0.5

L

10-30% X4

30-100% X42

-1.5

ean

PV

L

-2.5

-2

Me

<10% X4

-3.5

-3

0 2 4 8 120 2 4 8 12Time (weeks)Croi 2009, # 680. Swenson et al.

Cut-off clínico para la pdeterminación de cepas no R520 multiexperienced patients:

• screened as R5 by Standard Trofile, y ,• pop´n sequencing and UDS + Web PSSM

Median GSS: 3 (1-5). Raltegravir (95%), Darunavir (60%) and Etravirine (35%)Etravirine (35%).

Week 24, 12 (71%) CV<50; (82%) CV <400 copies/ml. Week 24 CD4 gain 162 cells/ul.UDS Results (median/per patient):UDS Results (median/per patient):

2892.5 sequences [IQR: 2186-3378] .202 [IQR: 154-245] different strains.N CCR5 1 69% (0 7 3 3%)Non-CCR5 usage 1.69% (0.7-3.3%).

No relation % CCR5 usage and clinical response to a Maraviroc containing regimen: CUTOFF>3%

Chueca N, et al, EACS 2009

Volver a empezar?Correlación V3/Respuesta clínica

Volver a empezar?Correlación V3/Respuesta clínica

Harrigan PR et al, IAS 2009

Sensibilidad y Especificidad en y prelación a Respuesta Clínica

Harrigan PR et al, IAS 2009

Limitaciones

Berlin Maraviroc Cohort

Week 12 (n=63)Week 12 (n 63)75% were successfully treatedSuccessful treatment was defined as VL <50 or VL-decline of at least 3 log10 levelsSubgroup: only genotypic tropism result available

N=23N=2318 patients (78%) were successfully treated

Week 24 (N=59)Still 75% were successfully treated

Obermeier M, et al,. 7th Eur HIVDR, 2009

Estudio UveTresV3: 75 muestras; 63 muestras ESTA. N CCR5 V3 18% ESTA 21%Non CCR5: V3-18%; ESTA-21%. No reportables: V3-3%; ESTA-13%. 12 pacientes estudio piloto UveTres12 pacientes estudio piloto UveTres,

V3-R5. ESTA NR: 2; ESTA DM-1. Mediana de 3 fármacos activosMediana de 3 fármacos activos3 pac. S4, 5 S12, 2 S24.Sólo 2 pacientes no se encuentran indetectablesSólo 2 pacientes no se encuentran indetectables

1 en semana 4, descenso de 2.91 Log1 24 CV 70 i / l1 en semana 24, CV=70 copias/ml.

Alvarez M, et al. SAEI 2009 (enviado)

Conclusions

Level III Expert opinion:p p

G2P V3 loop based genotyping is increasingly used i di ias a tropism prediction test.

The e is g o ing e idence fo a good co elationThere is growing evidence for a good correlation between tropism prediction based on V3 loop genotyping and therapy outcome (G2P), however g yp g py ( ),the number of cases evaluated is still limited.

Clinical management of HIV-1 tropism testing: development of European guidelines 7th Eur DRW, 2009

ContenidosTropismo del VIH: ImportanciaCó d d t i l t iCómo se puede determinar el tropismoControversias en 2009:

Podemos usar ya el genotipo V3? Es mejor UDS?UDS?Que hacer con pacientes con CV Indetectable (simplificación toxicidad )Indetectable (simplificación, toxicidad,...)

Paredes R et al, personal comunication

Seclén E, et al, 7th Eur HIV DRW 2009

Conclusions

Level III Expert opinion: If switch to Maraviroc is planned in patients with HIV RNA <50 copies/ml

retrospective testing of the latest sample with HIV RNA > 1000 may be consideredAlternatively, genotypic testing from proviral DNA may be consideredHowever, no clinical study data on Maraviroc efficacy in this setting are available

Clinical management of HIV-1 tropism testing: development of European guidelines 7th Eur DRW, 2009

“Take home message”

Fenotipo: útil en determinadas situaciones, en función al tipo de paciente y el tipo de régimen.paciente y el tipo de régimen.

La hipersensibilidad para X4, sin posibilidad de cuantificar y sin puntos de cortede cuantificar, y sin puntos de corte clínicos, es su principal defecto.

“Take home message”

El genotipo ha demostrado su utilidad, íespecialmente en regímenes en los que MVC

va acompañado de fármacos activos:Facilidad, coste y tiempo a resultados inclinan la balanza a favor del genotipo.

ó áLos estudios de validación que se están llevando a cabo son el principal argumento para su introducción en la rutina asistencialintroducción en la rutina asistencialSu detección en ADN proviral en pacientes con CV indetectable puede ser utilizado para apoyar laindetectable puede ser utilizado para apoyar la toma de decisiones clínicas.

Agradecimientos

Natalia Chueca, Pepi López, Marta Alvarez,Natalia Chueca, Pepi López, Marta Alvarez, Vicente Guillot, Alex Peña (HUSC, Granada)Eva Poveda (H. Carlos III), Roger Paredes (IrsiCaixa), Victoria Sánchez (H. Elche)Pfizer y a los investigadores y pacientes Estudio ALLEGRO, Estudio Granada UDS y Estudio UVETRES