Separacin de clulasyfraccionamiento subcelular

Mtodos fsicos de SEPARACION DE CELULAS

* Necesarios para estudiar: - Tejidos con diferentes tipos celulares- Clulas con diferente funcionalidad/ actividad biolgica- Subpoblaciones celulares con diferentes marcadores moleculares- Alternativa a la clonacin: + rpidos, + rendimiento, (- pureza)

* Los ms empleados explotan diferencias en: Tamao celular Densidad Carga/Qumica superficial Dispersin de la luz (light scatter) Emisin de Fluorescencia

b

Beckman J2-21M, centrfuga equipada con un rotor y sistema de elutriacin

Rotor de elutriacin (Beckman)

Cmara de separacin del rotor de elutriacin

Apariencia de las clulas aisladas de una fraccion de elutriacin de clulas sanguneas de la mdula sea humana cultivadas durante 8 das (a, b). Las clulas predominantes son de tipo fibroblastoide con un ncleo central, citoplasma difuso y pseudopodos aderentes y clulas grandes, redondas con un estrecho citoplasma y un ncleo central redondo. (tincin con hematoxilina). (a) x200; (b) x400. (c) Apariencia de las clulas aisladas de la misma fraccin de elutriacin y cultivadas en DMEM+20% FCS suplementado con dexametasona, cido ascorbico y b-glicerofosfato durante 8 das. En esas condiciones, las celulas presentan una morfologia redondeada o cuboidal con un ncleo central, x200. Separacion de clulas por elutriacin

Separacin de clulas sanguneas con Ficoll-HypaqueCentrifugacin

Separacin inmunomagntica

SeleccinpositivaSeleccinnegativa

Absorcin de luz por un e- y la subsiguienteemisin de E como calor y fluorescencia

Esquema de un Citmetro de Flujo (FACS)

Funcionamiento de la boquilla vibradora de un citmetro de flujo

Green fluorescenceRepresentacin de los datos en citometra de flujo

Esquema de un Citmetrode Flujo clasificador (sorter)Puede seleccionar 1/1000clulas y clasificar miles/s

Microdiseccin con lserSperm Tail RemovalBiopsy at the Single Cell Level

Fraccionamiento de componentes subcelularesDiseados inicialmente para comprender el papel bioqumico de cada orgnulo en la clula

La lisis (rotura) celular se suele realizar por: Potter, homogeneizador mecnico de tejidos, sonicacin, cavitacin, soluciones hipotnicas

La separacin de los componentes subcelulares se realiza generalmente por centrifugacin

Homogeneizacinde la muestraCentrfuga de alta velocidadPotter

1000 x g, 10 min20.000 x g, 20 min80.000 x g, 1 h (ultracentrfuga)150.000 x g, 3 hFraccionamiento subcelular por centrifugacin diferencialcitosol

Comparacin dela sedimentacinpor velocidad (A)y por equilibriode sedimentacin(isopcnica, B)5-20%

Purificacin de orgnulos por centrifugacin en gradiente de densidad

NcleosMicrosomas (RER)PeroxisomasControl de calidad del fraccionamiento: TEM