1

Taller de Licenciatura

EFECTO DEL REGIMEN TÉRMICO Y FENOTIPO SOBRE LA GERMINACIÓN DE LAS SEMILLAS DE GLANDULARIA SPP E INDUCCIÓN DE POLIPLOIDÍA A

TRAVÉS DE COLCHICINA

Alumna: Carla Leiva Pizarro.

Quillota,Chile 2008

Pontificia Universidad Católica de Valparaíso Fundación Isabel Caces de Brown Estación Experimental La Palma

Casilla 4-D, Quillota-Chile Teléfonos 56-32-274501- 56-33-310524

Fax 56-32-274570, 56-33-313222 http://www.agronomia.ucv.cl

2

Dedicado a mis padres Y hermana

3

Agradecimientos Agradezco principalmente a las personas que me dieron la vida: Eugenio Leiva Romero y Rebeca Pizarro Brito. Padre, crecí viendo tu esfuerzo, pasión, valentía, y principalmente tu amor incondicional a las tierras, esas que te provocaron penas y tantas alegrías. Me siento orgullosa de ti y de lo que has logrado, dedico este trabajo especialmente a ti, el hombre más importante en mi vida, por haberme heredado esta hermosa labor. Mamita, gracias por tu apoyo incondicional, por tu amor, paciencia y principalmente gracias por ser tú. Hoy supero una etapa en mi vida y es gracias a ti porque ocupaste las palabras adecuadas un día para decirme 0 lucha y sigue adelante, yo siempre te apoyaré*. A ti hermana, mi alma gemela, por estar siempre a mi lado, por entregarme alegría, confianza, cariño y por sobre todo por ser mi gran amiga, mi confidente. Muchas gracias nanito! A mi tía Julita, es imposible agradecer en tan pocas palabras todo lo bello y sincero que has sabido compartir y entregar a mi familia. A mi gran compañera y amiga Magdalena Céspedes, por ser mi pilar en estos años de universidad, por entregarme su confianza, alegría y apoyo. Y por último a las personas que participaron directamente en la realización de este trabajo, Loreto, por haberme ayudado constantemente en este escrito, por su tiempo y entusiasmo y por la entrega desinteresada de sus conocimientos. A mi profesora guía Gabriela Verdugo, por su apoyo y buena disposición. También agradezco a Cristina por ayudarme constantemente en la realización de este escrito.Muchas gracias a todos ustedes!

Índice Resumen Summary

4

1. Introducción 1 2. Revisión bibliográfica 3 2.1. Descripción del género 3 2.1.1 Distribución 4 2.1.2. Germinación de semillas de glandularia 4 2.1.3 Citogenética de glandularia spp 5 2.2. Germinación 6 2.2.1 Efecto de las temperaturas 6 2.2.2 Efecto de las temperaturas fluctuantes 8 2.3 Poliploidia 10 2.3.1 Métodos de inducción 11 2.3.2 Colchicina 12 2.3.3 La colchicina: dosis y efectos 12 2.3.4 Métodos para medir poliploidia 14 3. Materiales y métodos 15 3.1 Ubicación del ensayo 15 3.2 Material experimental 15 3.3 Tratamientos 15 3.3.1 Desinfección 15 3.3.2 Tratamientos de germinación con temperaturas fluctuantes. 16 3.3.2.1 Indices de germinación 16 3.3.2.2 Curvas de germinación 17 3.3.3 Inducción de poliploidia a través de la aplicación de colchicina a semillas

germinadas de Glandularia spp. y descripción de un ejemplar poliploide. 18 3.4 Diseño Experimental 19 4. Resultados y discusión 21 4.1 Efecto de las temperaturas fluctuantes y ecotipo en la germinación de

Glandularia spp 21 4.1.1 Curvas de germinación 24 4.2 Sobrevivencia de semillas germinadas tratadas con colchicina 27 4.3 Caracterización morfoanatómica de planta poliploide 29 5. Conclusiones 31 6. Literatura citada

Resumen

Glandularia spp es una especie nativa que posee características morfológicas llamativas para el uso ornamental, destacando la diversidad de sus colores y la abundante y prolongada floración, pero con un bajo porcentaje de germinación de sus semillas.

5

Para la introducción de esta especie al mercado es importante conservar y mejorar el germoplasma para así obtener variedades con mayor valor comercial; siendo una de las técnicas más utilizadas la duplicación del material genético o poliploidización a través de colchicina. En este estudio se evaluó la influencia del régimen térmico y el fenotipo en la geminación de las semillas de glandularia, además se determinó el efecto de las dosis y tiempo de exposición a colchicina en semillas germinadas. Se caracterizó morfoanatómicamente una planta poliploide. La investigación se realizó en la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. El primer ensayo fue llevado a cabo en el Laboratorio de Fitogenética, donde se expusieron las semillas a diferentes regimenes térmicos (20ºC ; 26ºC/14ºC y 18ºC/12ºC), en dos fenotipos: blanco y rosado. En el segundo ensayo las semillas germinadas fueron puestas en papel empapado con colchicina a distintas concentraciones (0.01,0.05 y 0.1%) y tiempos: tres y seis horas. Los resultados del primer ensayo indican que la interacción de la temperatura y el fenotipo influyen en la germinación de las semillas de Glandularia spp.y que el tiempo medio de germinación es de 27 días, con una germinación variable. En el segundo ensayo la sobrevivencia de las semillas germinadas expuestas a colchicina fue de 13,5%, debido al efecto tóxico. Finalmente se concluyó que la interacción del rango térmico y el fenotipo es fundamental en la germinación de glandularia, por lo que es importante conocer la procedencia de cada especie de este género cuando se quiera someter a un régimen térmico determinado. Por otro lado, la planta poliploide evaluada presentó un mayor tamaño de hojas y flores.

Summary Glandularia spp is a native species with good morphological characteristics for ornamental use. The plant stands out for the diversity of colors and the abundant and extended flowering period, but it has a low percentage of seed germination. For the introduction of this species into the markets, it is important to preserve and improve germplasm in order to obtain varieties with greater commercial value; with the

6

replication of genetic material, also known as polyploidization through the colchicine, being one of the most used techniques. In this work the influence of the thermal regime and phenotype on the germination of Glandularia seeds was evaluated. Furthermore, the effect of doses and exposure to colchicine on germinated seeds was determined, and a polyploid plant was morpho-anatomically characterized. The study was carried out at the Faculty of Agricultural Sciences of Pontificia Universidad Catolica de Valparaiso. The first trial was made in the plant genetics laboratory, where the seeds were exposed to different thermal regimes (20ºC; 26ºC/14ºC and 18ºC/12ºC) in two phenotypes: white and pink. In the second trial the germinated seeds were placed on a paper soaked with colchicine at different concentrations (0.01, 0.05 and 0.1%) and times (three and six hours). The results from the first trial indicate that the temperature and phenotype interaction has an influence on the Glandularia spp. seeds germination and that the average time for germination is 27 days, with a variable germination. In the second trial the survival of the germinated seeds exposed to colchicine was 13.5%, due to the toxic effect of colchicine. In addition, the evaluated polyploid plant presented a larger size in leaves and flowers. In conclusion, the interaction between thermal range and phenotype is fundamental on the Glandularia germination, which is why it is important to know the origin of each species of this genus when being subjected to a particular thermal regime. In addition, the evaluated polyploid plant presented a larger size of leafs and flowers.

1. Introducción

Chile es un país muy diverso en climas, altitudes y latitudes; por lo cual ha desarrollado

una gran diversidad de plantas nativas que se caracterizan por su variedad en formas y

7

colores susceptibles de emplear en diversos usos, sea como flor cortada, planta de

maceta, paisajismo, etc.

Dentro de las variadas especies nativas, se puede mencionar el género Glandularia

perteneciente a la familia de las Verbenaceae, que comprende alrededor de 50 especies

que se distribuyen en las regiones templadas y subtropicales de América del Norte y de

América del Sur (Botta, 1993). Se caracteriza por poseer flores con colores muy

llamativos y en general características morfológicas que la hacen ser una especie muy

interesante en jardinería, paisajismo y en la que se pueden generar cultivares.

Según Cubrero (1999) una de las formas de generar variación y con ello posibilidades

para seleccionar nuevos genotipos con valor ornamental patentables es la poliploidización

inducida. El aumento del nivel de ploidía suele producir gigantismo, aumento de tamaño

de órganos como las flores e intensificación de colores.

La inducción artificial de poliploidia puede ser realizada a través de varios métodos pero el

más usado es la colchicina, que es una sustancia soluble en agua y recomendada en

bajas concentraciones por su alta toxicidad. Escandón et al., (2005) afirman que este

alcaloide ha sido aplicado durante los últimos treinta años, en muchas especies como

bananas, uvas, papa, arándanos, algodón y varias especies ornamentales, obteniendo

excelentes resultados.

Otro punto de gran importancia en la introducción de especies nativas al mercado es el

completo conocimiento de las formas de multiplicación de las especies, ya que para

satisfacer la demanda del comprador, éstas deben permanecer en oferta el mayor tiempo

posible. En el caso de Glandularia spp., la propagación se puede realizar por esquejes o

semillas, pero estudios realizados en Argentina y en la Pontificia Universidad Católica de

Valparaíso, Chile, han demostrado su lenta y dificultosa germinación.

8

De acuerdo a lo expuesto anteriormente, en el presente estudio se comprobará el efecto

que podría tener el fenotipo y régimen térmico en la germinación de las semillas y se

evaluará el efecto que tendría la colchicina en bajas dosis en Glandularia spp.

Objetivo general:

• Determinar la influencia de las condiciones térmicas y fenotipo en la germinación

de semillas y establecer una dosis adecuada de colchicina para la producción de

poliploides en Glandularia.

Objetivos específicos:

• Definir los requerimientos térmicos para aumentar el porcentaje de geminación en

semillas de Glandularia spp.

• Evaluar la influencia del fenotipo en la germinación de las semillas

• Determinar el tiempo medio de germinación, índice de sincronización y velocidad

de germinación en Glandularia spp.

• Definir dosis de colchicina que permitan sobrevivencia de semillas germinadas.

• Evaluar las características fenológicas de una planta poliploide.

2. Revisión Bibliográfica

2.1 Descripción del género

9

La mayoría de las Glandularias son herbáceas perennes con yemas de renuevo cerca del

nivel del suelo, sus órganos aéreos mueren durante la época más fría y las ramas son

ascendentes o bien decumbentes, con o sin raíces adventicias (Botta, 1993).

Los tallos son rastreros de hasta 50 cm, cubiertos de tricomas (Riedman y Aldunate,

2001), tienen forma tetragonal, con columnas de colénquima y esclerénquima en los

ángulos, separados por parénquima cortical continuo (Botta, 1993).

Riedman y Aldunate (2001) afirman que las hojas son partidas, verdes cenicientas y

opuestas. Por otra parte, Botta, (1993) agrega que estas poseen un pecíolo breve y poco

diferenciado de la lámina. Esta lámina puede ser entera o dividida en forma irregular o

regular, desde tri- lobada, pinnatilobada hasta pinnatífida y bipinnatífida; glabra o

pubescente.

Las flores son hermafroditas, zigomorfas (Navas, 1973), primaverales, tubulares;

aparecen dispuestas en cabezuelas apretadas de 2-4 cm de diámetro y con una

diversidad de colores como: amarillo, rosa, lila, blanco, púrpura o azul. El fruto está

formado por dos a cuatro nuececitas que maduran durante el verano (Riedman y

Aldunate, 2001).

Se destacan por ser excelentes cubresuelos, de floración abundante y prolongada,

además, se usan como plantas en macetas, balcones o jardines (Riedman y Aldunate,

2001).

2.1.1 Distribución

Se distribuye en las regiones templadas y subtropicales de América del Norte y América

del Sur. Es frecuente en lugares abiertos: campos graminosos o praderas en bordes de

10

caminos, laderas de cerros, margen de la selva o de los bosques, llegando hasta

aproximadamente los 2000 m.s.n. (Botta, 1993).

Existen 40 especies nativas en América, de las cuales 11 especies y seis variedades se

encuentran en Chile (Navas, 1973); desde la II a la IX Región (Riedman y Aldunate,

2001).

2.1.2 Germinación de semillas de glandularia

La propagación por semillas es lenta y dificultosa (San Martino y Beeskow, 2006), estos

autores realizaron ensayos de germinación en Glandularia araucana, Glandularia

aurantiaca y Glandularia macrosperma, las semillas fueron sembradas en oscuridad con

una temperatura que se mantuvo entre 22 ºC y 25ºC Los mericarpos fueron sometidos a

los siguientes tratamientos: escarificación mecánica, despunte, escarificación y lavado,

escarificación y remojado, despunte y lavado, despunte y remojado. Los porcentajes de

germinación no superaron el 12,2%.

G. macrosperma tuvo una respuesta germinativa más baja (4,4%) que las otras dos

especies y no se observaron diferencias entre los valores de germinación de G.

aurantiaca (11,9%) y G. araucana (12,2%). Estos autores afirman que estos valores no se

pueden tomar como referencia del potencial germinativo de la especie, ya que las semillas

no fueron sometidas a ninguna prueba de viabilidad y además se trató un número bajo de

semillas.

Por otro lado en la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de

Valparaíso, se realizaron una serie de ensayos durante los años 2005 y 2006, donde las

semillas de Glandularia fueron sometidas a una serie de tratamientos químicos y físicos:

agua caliente, nitrato de potasio (KNO3), ácido sulfúrico, ácido giberélico, etileno y

escarificación, sin obtener resultados satisfactorios. Recientemente (marzo 2007), se

11

realizaron ensayos con temperaturas fluctuantes (20/10ºC), obteniendo resultados

aproximados a un 40% de germinación. (Verdugo, 2007)*

Este bajo porcentaje de germinación puede estar explicado por la morfología de las

semillas. Estudios realizados por Maekawa y Carpenter (1991) en semillas de Verbena x

híbrida, especie perteneciente a la misma familia de Glandularia, señalan que la entrada

de agua a las semillas esta influenciada por la naturaleza y la morfología de la testa,

ingresando principalmente por la zona del hilum y del micrópilo, donde la testa es más

delgada. Además, afirman que el aumento de las paredes del hilum en presencia de agua

libre en el medio, se puede relacionar con la reducida germinación.

2.1.3 Citogenética de glandularia spp

En Norteamérica, las especies de Glandularia están representadas por entidades tetra y

hexaploides, no habiéndose encontrado entidades diploides (Lewis y Oliver, 1961).

Lewis y Oliver (1961) afirman que en Sudamérica, estas especies están representadas

casi exclusivamente por entidades diploides, con número básico de cromosomas x =5; y

que es en donde la variabilidad genética es mucho mayor, ya que es una consecuencia

del conservatismo evolutivo propio de los poliploides.

*Verdugo, G. 2007.Ingeniera Agrónomo Msc. Comunicación personal.

2.2 Germinación

La germinación está definida como un proceso que se inicia con la absorción de agua por

parte de la semilla deshidratada, etapa también conocido como imbibición y termina

12

cuando una parte de ésta se extiende y atraviesa las estructuras que la rodean, es decir la

aparición de la radícula (Matilla, 2000)

Este proceso incluye una serie de actividades tanto anabólicas como catabólicas,

incluyendo respiración, síntesis de proteínas y movilización de reservas (Desai, 1997).

Fisiológicamente, la germinación comienza con las etapas iniciales de reactivación

bioquímica y termina con la emergencia de la radícula (Hartmann y Kester, 1995).

Morfológicamente y para el estudio de semillas y propagación de plantas, la definición

debe incluir la producción de una plántula normal (Hartmann y Kester, 1995).

Desde el punto de vista agronómico y ecológico ha de considerarse, que la semilla está

situada en el suelo o sustrato. Por ello, es muy importante distinguir entre germinación y

nascencia, dada la gran influencia que en ésta última tienen los factores edáficos. Se

considera, por tanto, que la germinación termina cuando las plántulas se han desarrollado

lo suficiente para emerger del terreno (Besnier, 1989).

2.2.1 Efecto de las temperaturas

La temperatura, es tal vez el factor ambiental más importante en el proceso de la

germinación (Hartmann y Kester, 1995), ya que regula el flujo de oxígeno disponible para

el embrión (The Enciclopedia of Seeds Science, Technology an Uses, 2006) e influye

sobre las enzimas que regulan la velocidad de las reacciones bioquímicas que ocurren en

la semilla después de la imbibición (Universidad Politécnica de Valencia, 2003).

13

La actividad de cada enzima tiene lugar entre un máximo y un mínimo de temperatura,

existiendo un óptimo intermedio. Por ello, las semillas sólo germinan dentro de un cierto

rango de temperaturas. Si las temperaturas no se encuentran dentro del rango requerido,

la semilla no germinará, aunque se encuentre en condiciones favorables (Universidad

Politecnica de Valencia, 2003).

Los rangos de temperaturas dentro de la germinación varían considerablemente entre las

especies, variedades y origen geográfico de éstas (The Enciclopedia of Seeds Science,

Technology and Uses, 2006).

En el caso de semillas provenientes de climas tropicales, la Universidad Politécnica de

Valencia (2003) afirma que éstas suelen germinar mejor a temperaturas elevadas,

superiores a 25ºC.

Sin embargo, las semillas de especies de zonas frías germinan mejor a temperaturas

bajas, entre 5ºC y 15ºC y en la región mediterránea, las temperaturas más adecuadas

para la germinación son entre 15ºC y 20ºC (Universidad Politécnica de Valencia, 2003).

AOSA (2000) recomienda para Glandularia X hybrida, especie proveniente de climas

templados y subtropicales, un rango de temperatura que va de 20ºC a 30ºC, con una

temperatura óptima de 20ºC.

2.2.2 Efecto de las temperaturas fluctuantes

14

Las semillas de muchas especies requieren temperaturas fluctuantes para una óptima

germinación (Copeland y Mc Donald, 2001) y desarrollo de plantas (Hartmann y Kester,

1995).

Esta condición suele ser más frecuente en especies silvetres, como por ejemplo, las

semillas de muchos árboles y hierbas nativas germinan mucho mejor en condiciones de

temperaturas fluctuantes; ya que la mayoría de éstas germinan sobre o cerca de la

superficie del suelo en ausencia de la vegetación circundante, donde las temperaturas

fluctuantes son comunes (Copeland y Mc Donald, 2001).

Aunque no se conoce con certeza la razón de los efectos de éstas en el proceso, el efecto

más comúnmente citado es su influencia sobre los pasos secuenciales de germinación

(Copeland y Mc Donald, 2001).

Las temperaturas fluctuantes crean un cambio en el equilibrio promotor-inhibidor,

disminuyendo las hormonas inhibidoras durante las bajas temperaturas y aumentando las

promotoras con las altas, conduciendo así a la germinación (Copeland y Mc Donald,

2001).

Por otra parte, Mayer y Poljakoff-Mayber (1983), agregan que en la naturaleza la

exposición de las semillas a temperaturas fluctuantes induce a una contracción de las

capas externas, produciendo así, una contracción a bajas temperaturas y expansión en

las altas, logrando finalmente el quiebre de la testa y el ingreso del agua necesaria para la

germinación.

Guenni et al. (1999) estudiaron el efecto de las temperaturas fluctuantes sobre el grado de

rompimiento de la dureza seminal de la leguminosa forrajera tropical Stylosonthes

hamaca. Estas semillas fueron sometidas a temperaturas diarias constantes (63º C) y

15

fluctuantes (25ºC -63ºC) por un período de más de tres meses. Los resultados obtenidos

fueron una reducción significativa del porcentaje de semillas duras, alcanzando un 64 y

82% de germinación. Lo que evidenció una vez más, el papel fundamental que ejercen las

fluctuaciones naturales de las temperatura del suelo durante el período seco,

constituyendo entonces el factor clave para incrementar la germinación.

Hernández (2004) rompió la inhibición de la germinación de las semillas de Capsicum

annuum por las temperaturas fluctuantes de 20-35ºC. Este autor afirma que la luz y la

temperatura fluctuante interactúan de manera positiva para aumentar la capacidad de

germinación de dicha especie.

Jansen van Vuuren y Lubbe (2000), sometieron las semillas de Verbena x hybrida,

especie perteneciente a la familia de Glandularia, a temperaturas constantes y

temperaturas fluctuantes en condiciones de oscuridad, con el fin de evaluar la tasa y el

porcentaje final de germinación. Estos autores concluyeron que las temperaturas

fluctuantes presentaron mejores resultados en la germinación que las temperaturas

constantes, afirmando que se debía al pequeño tamaño de la semilla y su sensibilidad

frente a la humedad. Finalmente recomendaron que la semilla de Verbena x hybrida, en

condiciones de laboratorio debe ser germinada en oscuridad, sin agua libre y con

temperaturas fluctuantes de 28ºC de día y 14ºC de noche, para así obtener un 80 % de

germinación.

Sin embargo, no en todas las especies las temperaturas fluctuantes han dado buenos

resultados (Azócar, 2006). Estudios realizados por Bewley (1985) demostraron que al

exponer semillas de Sysimbrium officinale a temperaturas fluctuantes y luego a

temperaturas contantes, la germinación final se vio reducida

2.3 Poliploidía

16

Un organismo monoploide tiene solamente un complemento del juego básico de

cromosomas de la especie; un diploide tiene dos juegos, un triploide tres juegos

completos, un tetrapolide cuatro, un pentaploide cinco, un hexaploide seis, así

sucesivamente (Allard, 1967).

Los diploides se consideran como un cuerpo o célula somática, donde hay generalmente

dos cromosomas de una clase, uno de cada progenitor. Los gametos femeninos y

masculinos, en condición haploide, se unen para formar cigotos diploides En algunos

casos, la reducción de cromosomas falla en ambos gametos y los cigotos resultantes de

esta unión pueden contener el doble del número somático de cromosomas,

desarrollándose así un tejido tetraploide (Elliot, 1964).

Brauer (1969) define plantas poliploides como aquellas con un número de cromosomas

mayor que el número normal diploide.

Los efectos morfológicos y fisiológicos de la polipliodía varían en los distintos materiales

(Allard, 1967). Las plantas con número bajo de cromosomas es más probable que

respondan bien a la duplicación que aquellas plantas con número alto de cromosomas,

así como también es más probable tener éxito con plantas autógamas que alógamas

(Elliot, 1964).

Un efecto morfológico de la poliploidía es aumentar el tamaño de las porciones

vegetativas de la planta, haciendo que sean más frondosos y algo más vigorosos que sus

correspondientes diploides (Allard, 1967). Fisiológicamente, en cuanto al comportamiento

reproductivo libera la reserva de variabilidad más lentamente que uno diploide, y esto es a

causa de la herencia tetrásomica (Grant, 1989).

Por otra parte, Nohra et al. (2006), comprobaron el efecto de la poliploidia en la expresión

fenotípica de una planta, para lo cual caracterizaron el cariotipo de cinco ecotipos de la

uchuva (Physalis peruviana): tres silvestres, con dotación cromosomica de 2n=24 y dos

17

nativos, 2n=32 y 2n=48. Es así como los ecotipos nativos presentaron variaciones en las

características morfológicas y anatómicas como: mayor altura de plantas, área foliar,

número de estomas, número de cloroplastos, diámetro del fruto y peso seco del fruto.

Estos autores afirman que estas características son un reflejo del nivel de ploidía.

2.3.1 Métodos de inducción

La poliploidia es de gran importancia en los programas de mejoramiento de plantas, ya

que permite expresar una gran diversidad genética (The Enciclopedia of Seeds Science,

Technology and Uses, 2006). Es por esta razón, que los fitotécnicos se interesaron en la

inducción de poliploides como método de mejoramiento. Uno de los primeros métodos

para la obtención de poliploides fue el método de gemelos. En una baja proporción de

semillas en germinación, ocasionalmente se encuentran embriones dobles que producen

plantas heteroploides. También varios investigadores utilizaron tratamientos térmicos y

mediante regeneración de nuevos brotes del tejido calloso, se han logrado inducir cierto

número de sectores con doble número de cromosomas en especies e híbridos de tabaco

(Elliot, 1964).

También se ha experimentado con diferentes sustancias químicas, incluyendo algunas

drogas y otras sustancias tan simples como el gas hilarante, NO2 (Elliot, 1964).

Ninguno de los procedimientos anteriores era muy satisfactorio. No fue si no hasta la

aplicación práctica de la técnica de la colchicina propuesta por Blakeslee y Avery y por

Nebel en 1937, que abrió el camino para la producción de poliploides en cantidades

virtualmente ilimitadas (Elliot, 1964).

2.3.2 Colchicina

18

La colchicina es un alcaloide (C22 H25 NO6 ) extraído de las semillas o los bulbos del

azafrán de otoño o azafrán de prado (Colchicum autumnale), es altamente tóxico para los

animales y es usado en los cultivos de plantas para inducir poliploidia (The Enciclopedia

of Seeds Science, Technology and Uses, 2006). Esta sustancia, inhibe en la mitosis, el

mecanismo del huso y propicia la formación de células con el doble o más del doble del

número de cromosomas (Elliot, 1964), impidiendo la formación del huso acromático, de

modo que los cromosomas no se separan en la anafase, formándose así una célula que

mantiene el doble del número de cromosoma de la célula original (Brauer, 1969).

Muchas plantas pueden soportar concentraciones bajas de este alcaloide, sin que resulte

tóxico, además es una sustancia soluble en agua, lo que favorece su uso en varios

programas de investigación (Brauer, 1969).

2.3.3 La colchicina: dosis y efectos

La colchicina como agente inductor de duplicación cromósomica, no depende sólo de su

efecto antimitostático sobre el tejido meristemático, sino que está en función de la

concentración empleada y el tiempo de penetración en el tejido (Imery-Buiza y Cequea-

Ruíz, 2001).

Rose et al. (2000), aplicaron este alcaloide en brotes de hibridos de Syringa vulgaris x

Syringa, realizando tres tratamientos, el primero con tres concentraciones (0.025;1.25;2.5

mM) por uno, dos o tres días, no obteniéndose tetraploides. En un segundo experimento

se agitaron los brotes en 0.25 mM de colchicina por uno o dos días, los resultados fueron

sólo un tetraploide y por último se utilizaron cuatro concentraciones de 0.05 a 0.20 mM

por uno o dos días, dando como resultado 11 tetraploides, de los cuales cinco provienen

de la concentración de 0,05 mM por dos días.

19

Imery-Buiza y Cequea-Ruíz, (2001) analizaron las características cromósomicas de

plantas de Aloe vera inducida mediante la inmersión completa de rizomas en solución de

colchicina, obteniendo mayor eficiencia en la duplicación del número de cromosomas con

una dosis de 0,15% durante 24 horas.

Thao et al. (2003), obtuvieron tetraploides de plantas de Alocasia (2n=28), sumergiendo

los brotes apicales en distintas concentraciones de colchicina (0,01; 0,05; 0,1 %) y

tiempos 24, 48 y 72 horas. El resultado fue de seis plantas tetraploides, cuatro de ellas

provenientes de la inmersión en 0,01% de colchicina durante 24 horas.

Las diferencias fenotípicas observadas entre plantas diploides y las plantas tetraploides,

son el mayor diámetro y forma más ovalada de las hojas en éstas últimas.

Escandón et al. (2005) realizaron tratamientos antimitóticos en base a distintas

concentraciones de colchicina en segmentos nodales de Scoparia montevidiensis (planta

nativa de Argentina con un interesante potencial ornamental). Las concentraciones de

colchicina usadas fueron: 0,01-0,05% por 24 y 48 horas. Se obtuvieron cuatro

tetraploides, dos de estos provenientes de 0,01% de colchicina por 24 horas y los restante

de las concentraciones: 0,01 y 0,05% por 48 horas.

Las características morfoanatómicas de las plantas poliploides comparada con los

controles fueron, mayor diámetro de los tallos y mayor tamaño de flores y hojas.

Astudillo (2005) preparó dos soluciones de colchicina 0,05 y 0,1% y las utilizó en plantas

de Leucocoryne. Estas concentraciones las aplicó durante la prefloración durante 12

horas. Los resultados obtenidos fueron, una duplicación total o parcial del número de

cromosomas utilizando ambas concentraciones, no resultando tóxicas para las plantas.

20

2.3.4 Métodos para medir la poliploidía

Los tejidos u órganos poliploides se pueden identificar a través de diferentes métodos:

relación entre ploidia y número de cloroplastos por célula estomática, diámetro y número

de poros en el polen, morfología, conteo de cromosomas y citometría de flujo (Ollitrault-

Sammrcelli, 1999; Cubrero,1999 y Cramer,1999).

Ollitrault-Sammrcelli et al. (1999) afirman que la técnica más rápida y directa es la

citometria de flujo, que consiste en medir la cantidad de DNA en los núcleos y

compararlos con los niveles de ploidia del testigo.

3. Materiales y métodos

3.1 Ubicación del ensayo

21

Las pruebas de laboratorio se llevaron a cabo en el Laboratorio de Fitogenética y Flores

de la Facultad de Agronomía perteneciente a la Pontificia Universidad Católica de

Valparaíso ubicada en la Comuna de Quillota (32º 52` latitud Sur, 71º 15` longitud Oeste).

Las mediciones en el campo se realizaron en invernaderos pertenecientes a la misma

Universidad.

3.2 Material experimental

Se usaron semillas de dos fenotipos de Glandularia spp., una de color blanco y otra

rosada, recolectadas de plantas mantenidas en cultivo por tres años.

3.3 Tratamientos

3.3.1 Desinfección

Los materiales de vidrio, incluyendo las placas con el papel absorbente, fueron

autoclavadas a 121ºC durante 10 minutos.

Las semillas fueron sumergidas en hipoclorito de sodio al 4% durante cinco minutos y

enjuagadas tres veces durante un minuto, para posteriormente sembrarlas. Dicho

procedimiento fue realizado en cámara de flujo laminar.

3.3.2 Ensayo 1: Tratamientos de germinación con temperaturas fluctuantes.

Se realizaron los siguientes tratamientos:

22

- T0: Temperatura constante 20ºC, semillas color blanco y rosado

- T1: Temperaturas fluctuantes de 26ºC/14ºC, semillas color blanco y rosado

- T2: Temperaturas fluctuantes de 18ºC/12ºC, semillas color blanco y rosado

Las plantas en tratamiento fueron ingresados a una cámara de germinación con

fotoperiodos 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, estas últimas coincidieron con las

bajas temperaturas (12ºC y 14ºC)

Se consideró semilla germinada a toda aquella semilla con radícula visible.

3.3.2.1 Indices de germinación

Con los resultados obtenidos se calcularon los siguientes índices de germinación,

propuestos por Marli (2006).

Tiempo medio de germinación ( t ):

t = ∑ ni ti / ∑ ni

Donde:

ti : Tiempo que transcurre de la siembra a la primera germinación.

ni: Número de semillas germinadas en el ti

Coeficiente de velocidad (CV)

CV = 100(A1 +A2 +A3 +A4+……….A)/ (A1 T1 +A2 T2 +A3 T3 +……AX TX )

Donde:

23

AX: número de semillas germinadas en el primer día, segundo día, hasta el último día (x)

TX: número de días transcurridos de la siembra a la germinación observada.

Sincronización de la germinación (Z)

Z = ∑ Cn i / N ; N = ∑ ni(∑ ni – 1)/2

Donde:

Cn i: Sumatoria de las semillas germinadas en el tiempo i.

3.3.2.2 Curvas de germinación

Los resultados de germinación son difíciles de comparar y analizar, pero al realizar un

ajuste por regresión lineal simple en las curvas de germinación con un número mínimo de

parámetros biológicamente importantes, puede analizarse satisfactoriamente. (De la

Cuadra, 1999). La ecuación que se ajusta a muchas curvas de germinación observada es:

p = A [1-exp{-k(t- t0 )}] ; Mobayen (1980) y De la Cuadra (1999)

Donde:

p: porcentaje de germinación en el tiempo (t)

A: porcentaje final de germinación

t0: tiempo estimado de la germinación de la primera semilla

k : medida de la extensión en la población del tiempo de germinación.

3.3.3 Ensayo 2: Inducción de poliploidía a través de la aplicación de colchicina a semillas

germinadas de Glandularia spp. y descripción de un ejemplar poliploide.

Tratamiento de poliploidización en semillas germinadas

24

Las semillas germinadas (con radícula visible), fueron colocadas en papel empapado con

colchicina a distintas concentraciones de 0,01. 0,05 y 0,1% por dos tiempos de

exposición, tres y seis horas.

Posteriormente cada semilla fue trasplantada a una bandeja speedling y dejado en un

invernadero. Se observó diariamente la emergencia y sobrevivencia de las semillas

tratadas.

Caracterización morfoanatómica de una planta poliploide

Se caracterizó una planta poliploide proveniente de los ensayos realizados por Mena

(2006), donde evaluó los efectos de las dosis y tiempos de exposición a la colchicina de

microestacas de plantas de Glandularia spp. Obteniendo mayor sobreviviencia y

enraizamiento con una dosis 0,01% de colchicina por 24 horas.

El resultado del ensayo fue una planta poliploide por 30 accesiones que recibieron el

tratamiento, lo que se determinó a través del conteo directo de cromosomas (Calvo, 2007)

(Figura 1).

Figura 1. Cariotipo Tetraploide 4n=20, correspondiente a accesiones tratadas con

colchicina al 0,01% por 24 h. (Calvo, 2007)

25

Para evaluar el efecto morfoanatómico de la duplicación de cromosomas se evaluó un

ejemplar tetraploide versus seis plantas no poliploides (diploides), analizando: largo y

ancho de las hojas, diámetro del tallo floral, distancia entrenudos, diámetro de la

inflorescencia, largo del tubo polínico y largo de sépalos.

3.4 Diseño Experimental

En ambos ensayos, previo al análisis de varianza se analizaron los datos de cada una de

las variables mediante un test de normalidad, en caso de no ser significativos se aplicaron

transformaciones.

El ensayo 1 fue analizado mediante un modelo Factorial con un Diseño completamente al

azar. En las variables se realizó un análisis de varianza de dos vías y se aplicó una

separación de medias utilizando el test de Tukey en los casos en que se encontraron

diferencias significativas.

Factor 1: Temperaturas fluctuante (tres niveles)

Factor 2: Fenotipo (dos niveles)

La unidad experimental la constituyó una placa petri con 20 semillas y se establecieron

cinco repeticiones.

En el ensayo 2, donde se evaluó la sobrevivencia de las semillas tratadas con

colchicina,se analizaron los resultados usando el estadístico Chi cuadrado con un 5% de

significancia, ya que se trató una variable con respuesta dicotómica (semilla viva o

muerta), en la caracterización de la planta poliploide, las variables morfológicas fueron

analizadas mediante un Diseño Completamente al Azar (DCA), realizándose separación

de medias a través de Tukey.

Para los análisis estadísticos se uso el SPSS versión 14.0 y MINITAB 13.2

26

4. Resultados y discusión

4.1 Efecto de las temperaturas y ecotipo en la germinación de Glandularia spp.

La germinación de Glandularia spp depende de los dos factores analizados: temperaturas

fluctuantes y ecotipo. Siendo significativa la interacción de éstas (Cuadro1).

27

Cuadro1. Efecto de las temperaturas y ecotipo en el porcentaje de germinación de Glandularia spp

Fenotipo

Temperatura Blancas Rosadas

Germinación (%)

20ºC 20 b* 39 a b 26ºC/14ºC 62 a 23 b 18ºC/12ºC 22 b 67 a

*Medias con igual letra no presentan diferencias significativas según Andeva (p ≤ 0,05). The Enciclopedia of Seeds Science, Technology and Uses (2006) afirma que los rangos

de temperaturas dentro de la germinación varían considerablemente entre las especies,

variedades y origen geográfico de éstas.

La semillas de Glandularia spp fueron recolectadas de plantas mantenidas en un cultivo

por tres años en el jardín nativo de la Facultad de Agronomía, como estas plantas fueron

compradas en un vivero, el verdadero origen es desconocido, pero al ver los resultados se

puede inferir que el fenotipo rosado proviene de zonas costeras, ya que en estos lugares

hay una influencia oceánica que da origen a un régimen térmico moderado con poca

amplitud térmica tanto diaria (frío de noche y calor de día) como anual, es decir una

menor oscilación térmica. (Dirección Metereológica de Chile, 2008), lo que está

representado por la mínima diferencia de temperaturas usadas: 18ºC de día y 12ºC de

noche.

El fenotipo blanco respondió mejor a un rango más amplio de temperatura, por lo que este

fenotipo está asociado a lugares con una fuerte oscilación térmica: zonas desérticas,

precordillera, interior, etc.

Es importante mencionar, que los resultados obtenidos no coincidieron con la

recomendación de AOSA (2002), que afirma que la temperatura óptima para la

germinación de glandularia es 20ºC, sin mencionar los requerimientos específicos para

28

esta especie, como: origen, temperaturas fluctuantes y material genético que según

Herrera (1995), está estrechamente relacionado con la respuesta a la germinación.

Con respecto a los valores del coeficiente de velocidad (Cuadro 2), al realizar el análisis

estadístico sólo resultaron ser significativos para el factor temperatura y de estos

resultados se puede inferir que la velocidad de germinación está directamente relacionada

con la temperatura, ya que estos valores fueron mayores en los tratamientos que se

usaron temperaturas iguales o mayores a 20ºC.

Cuadro 2. Efecto de la temperatura en el coeficiente de velocidad en la germinación de Glandularia spp

*Medias con igual letra no presentan diferencias significativas según Andeva (p ≤ 0,05). Según Bewley (1982), las temperaturas altas (dentro de los límites de la actividad

biológica) aumentan la rapidez con que el agua penetra en las semillas y favorecen la

disolución temprana de solutos, lo que acelera diversos procesos enzimáticos que en

muchos casos, provocan una emergencia más pronta de la radícula.

En el Cuadro 3 se puede observar que no hay diferencias significativas de los tiempos

medios de germinación entre los tratamientos, por lo que se puede afirmar que el tiempo

medio de germinación de Glandularia spp varía de 20 a 33 días.

Los resultados de los valores de Z indicados en el Cuadro 4, señalan que no existe

diferencia significativa en los índices de sincronización obtenidos en cada tratamiento.

Marli y Garcia (2006) afirman que los valores de Z están en el rango de cero a uno y que

cuando Z =1, la germinación de las semillas ocurre al mismo tiempo, por lo que se puede

Temperaturas Coeficiente de

velocidad

20ºC 0,03731 a 26ºC/14ºC 0,03738 a 18ºC/12ºC 0,02557 b

29

decir que la germinación de las semillas de glandularia ocurre más bien de una manera

dispersa, ya que los valores se acercaron mas a cero que a uno.

Cuadro 3. Efecto de la temperatura y fenotipo en el tiempo medio de germinación (días) de Glandularia spp.

Fenotipo Temperatura Blancas Rosadas

Tiempo medio de germinación

20ºC 33,01 ns 23,05

26ºC/14ºC 27,06 27,28 18ºC/12ºC 20,51 20,27

*Medias con igual letra no presentan diferencias significativas según Andeva (p ≤ 0,05).

Cuadro 4. Índice de sincronización (Z) de la germinación de Glandularia spp.

Fenotipo Temperatura Blancas Rosadas

Índice de sincronización (Z)

20ºC 0,19 ns 0,27

26ºC/14ºC 0,30 0,14 18ºC/12ºC 0,14 0,28

*Medias con igual letra no presentan diferencias significativas según Andeva(p ≤ 0,05).

4.1.1Curvas de germinación

Las curvas de germinación (Anexo 1) fueron ajustadas por regresión lineal simple (Figura

1) según la ecuación p = A [1-exp{-k(t- t0 )}] (Mobayen,1980 y De la Cuadra,1999) y los

valores de los parámetros porcentaje final de germinación (A), tiempo estimado de

germinación de la primera semilla (t0 ), extensión en la población del tiempo de

germinación (k) y velocidad de germinación de la mitad del total de semillas que germinen

(1/tA/2) se presentan en la Cuadro 5.

30

Cuado 5.Efecto de ecotipo y temperatura sobre los valores parámetros A (%), t0 (d), k (d-1)

y 1/t0/2 que caracterizan la curva de germinación (k)

(*)Los datos fueron analizados estadísticamente en cada columna de forma independiente

(ns) no existen diferencias significativas (p > 0,05)

Los mayores porcentajes finales de germinación alcanzados (A), fueron en el ecotipo

blanco y temperaturas de 26ºC/14ºC y ecotipo rosado y temperaturas fluctuantes de

18ºC/12ºC (Figura 1), siendo éste último casi tres veces mayor que el valor de A , en el

ecotipo blanco con las mismas temperaturas. Por lo que se puede afirmar que a

condiciones de temperatura 18ºC/12ºC la germinación es diferenciada en los ecotipos de

Glandularia spp.

Con respecto al tiempo estimado de la germinación de la primera semilla difiere

considerablemente con lo indicado por la AOSA (2002), que informa que debe transcurrir

ocho días para empezar a observar semillas con la aparición de la radícula, aunque en el

ecotipo rosado a 20ºC se calculó un t0 de 9,16 días, acercándose considerablemente a lo

consultado en la literatura, el valor promedio de los tratamientos fue de 16,3 días.

Los valores k en general fueron muy bajos, lo que se traduce en un largo tiempo

transcurrido entre la primera y última germinación siendo desventajoso, ya que los lotes

presentan una desuniformidad en su emergencia. Cabe mencionar que el fenotipo de

flores blancas y temperaturas fluctuantes de 18ºC/12ºC, se escapó considerablemente de

Ecotipo y temperatura A (%) t0 K 1/tA/2

Blancas 20ºC 25 a 14,6 a 0,05 a 0,03 ns Rosadas 20ºC 42 a b 9,16 a 0,08 a 0,05 Blancas 26ºC/14ºC 62 b 14,1 a 0,10 a 0,04 Rosadass 26ºC/14ºC 23 a 12,7 a 0,10 a 0,05 Blancas 18ºC/12ºC 23 a 30,3 b 0,20 b 0,02 Rosadas18ºC/12ºC 67 b 16,9 a b 0,09 a 0,04

31

los valores de K obtenidos en los otros tratamientos, por lo tanto, este lote de semillas

posee una mayor concentración en la germinación de las semillas tratadas.

0

10

20

30

40

50

60

70

13 17 20 21 22 27 30 34 37 41

Tiempo, t (días)

Ger

min

ació

n, p

Curva 1Curva 2Curva 3Curva 4Curva 5Curva 6

FIGURA 1. Curvas de germinación descritas por el modelo exponencial p = A [1-exp{-

k(t- t0 )}] para el porcentaje de germinación influenciados por ecotipo y temperatura.

Curva 1 fenotipo blanco 20ºC : p = 23 [1-exp{-0.1021(t- 12.77)}] Curva 2 fenotipo rosado 20ºC : p = 42 [1-exp{-0.08(t- 9.16)}]

32

Curva 3 fenotipo blanco 26ºC/14ºC : p = 62 [1-exp{-0.1045(t- 14.16 )}] Curva 4 fenotipo rosado 26ºC/14ºC : p = 23 [1-exp{-0.1021(t- 12.77)}] Curva 5 fenotipo blanco 18ºC/12ºC : p = 23 [1-exp{-0.202(t- 30.35)}] Curva 6 fenotipo rosado18ºC/12ºC : p = 67 [1-exp{-0.0928(t- 16.94 )}]

La velocidad de germinación del 50% de las semillas (1/tA/2) tendió a ser igual en la

germinación de las semillas tratadas.

Los resultados de este ensayo, en términos generales indican que Glandularia spp.

germinada a temperaturas de 12ºC a 26ºC, presentó un porcentaje de germinación

promedio de 40%, con un valor mínimo de 23% y un máximo de 67%, estos resultados

superan a los presentados por San Martino y Beeskow (2006), que sólo obtuvieron un

máximo de 12% en especies pertenecientes a este género.

4.2 Sobrevivencia de semillas germinadas tratadas con colchicina

De las 480 semillas germinadas de Glandularia spp tratadas con las distintas

concentraciones de colchicina, se observó sobrevivencia de sólo 65 semillas, un 13,5% de

las semillas tratadas.

Este bajo porcentaje es una respuesta esperada ya que en otros estudios realizados,

donde se aplicó similares dosis de este alcaloide no superaron el 40 % de sobrevivencia.

Portuluppi et al (1995), sumergieron semillas germinadas de Habranthus martinezii en

0,02%, 0,05% y 0,1% de colchicina y la sobrevivencia total de las semillas fue de un 35%.

Así también Sartor et al. (2004), trataron 150 semillas de Paspalum plicatulum en 0.1% de

colchicina logrando sobrevivir sólo el 8% de estas, acercándose notablemente a los

resultados obtenidos en este estudio.

33

Estos últimos autores afirman que la baja sobrevivencia está explicada por la sensibilidad

a repiques y trasplantes de la especies usadas, y además el estrés ocasionado por la

exposición a la colchicina y el alto grado de toxicidad que ésta presenta.

Con respecto a la sobrevivencia según el tiempo de exposición (Cuadro 6), los resultados

obtenidos no coinciden con los reportados por Portuluppi et al (1995), Rose et al. (2000) y

Thao et al. (2003), que a mayor tiempo de exposición de colchicina en semillas, plántulas,

brotes, callos embriogénicos, la sobrevivencia fue menor; esto puede deberse a que el

máximo tiempo usado en este ensayo (seis horas) es bajo con respecto de los tiempos

usados por los autores citados, 24, 48 y 72 horas.

Cuadro 6. Porcentaje de semillas que sobrevivieron a las dosis (0,01;0.,5 y 0,1%) y tiempos (3 y 6 horas) de exposición a colchicina.

(ns) No existen diferencias significativas (p > 0,05)

(s) Existen diferencias significativas (p ≤ 0,05)

Al comparar los tratamientos entre sí (Cuadro 6), se puede afirmar que al sumergir las

semillas en 0.05 % de colchicina y con un tiempo de exposición de tres horas, la

sobrevivencia alcanzada fue la menor.

Infiriéndose además que los porcentajes de sobrevivencia de las semillas en las dosis y

tiempos estudiados no siguen un patrón como en los ensayos de Mena (2007), Thao et al.

Dosis

3 horas

6horas

Porcentaje de sobrevivencia (%) 0,01 13,8 ns 19 ns 0,05 5 s 9,09 ns 0,1 9,4 ns 18,2 ns

34

(2003), que trataron explantes, y la muerte de éstas se incrementó a medida que se

aumentaban las dosis del alcaloide.

4.3 Caracterización morfoanatómica de planta poliploide

La planta poliploide de Glandularia spp obtenida de los ensayos realizados por Mena

(2007), presentó una notable diferencia morfológica al compararla con otras seis plantas

no poliploides (Cuadro 7).

Cuadro 7.Comparación morfológica entre una planta poliploide y seis diploides

(*)Los datos fueron analizados estadísticamente en cada columna de forma independiente

(ns) no existen diferencias significativas

*Medias con igual letra no presentan diferencias significativas según Andeva (p ≤ 0,05

Hoja Tallo Floral Inflorescencia Corola

Plantas Largo Ancho DiámetroDist. Entrenud Diámetro Largo tubo

Largo sépalos

Medición (mm)

Poliploide 15,9 a 12,3 a 1,4ns 7,3ns 17,5 a 15,0 a 9,3 a

Diploide1 9,9 b 9,00 ab 1,0 7,1 12,3 b 11,6 b 7,3 b

Diploide2 10,6 b 9,02 ab 0,9 3,9 14,3 b 11,9 b 7,7 b

Diploide3 7,8 b 8,6 b 1,1 6,0 13,3 b 12,2 b 7,2 b

Diploide4 8,3 b 8,7 b 1,0 7,0 11,6 b 12,6 a b 6,5 b

Diploide5 10,2 b 9,2 ab 1,2 7,6 12,6 b 10,6 b 7,0 b

Diploide6 8,3 b 8,3 b 0,9 3,7 12,3 b 11,2 b 6,8 b

35

Al analizar estadísticamente los resultados, se puede decir que el largo de la hoja, largo

de sépalos y el diámetro de la inflorescencia son mayores que los medidos en las plantas

diploides (Figura 2). Con respecto al ancho de las hojas, el tetraploide es igual al diploide

uno y diploide dos y el largo del tubo polínico del poliploide no presenta una gran

diferencia con el largo del diploide cuatro. El tallo floral no presento diferencias

significativas.Varios autores han informado en diferentes especies que el incremento de

ploidia se manifiesta en plantas más frondosos, de mayor altura, peso seco, área foliar y

mayor tamaño de flores (Allard, 1967; Escandón et a,. 2005 y Mensah et al, 2007) lo que

apoya los resultados obtenidos en este estudio.

Figura 2 Glandularia spp poliploide comparada con plantas diploides; izquierda: diploide, Derecha: poliploide

36

5. Conclusiones

La interacción del rango térmico y el fenotipo es fundamental en la germinación de

semillas de glandularia, por lo que es importante conocer la procedencia de cada especie

de este género cuando se quiera someter a un régimen térmico determinado.

A pesar de la influencia del tratamiento térmico y fenotipo, no se detecta diferencia en el

tiempo medio de germinación, el cual estuvo entre los 20 y 33 días. El índice de

sincronización tampoco es influenciado por las temperaturas y fenotipo y sus valores son

más bien bajos, presentando una germinación variable.

La velocidad de germinación es incrementada cuando se incluyen temperaturas de 20ºC o

más, por lo que las temperaturas influyen directamente en este índice, no así el fenotipo

tratado.

La sobrevivencia de las semillas tratadas con colchicina fue baja, alcanzando sólo un

13,5%.

La plodía en plantas de glandularia provoca mayor tamaño de hoja (largo) y mayor

tamaño de flor, la aplicación no modificó la expresión de los tallos.

37

6. Literatura citada Allard, R. 1967. Principios de la mejora genética de las plantas. 498 p. Omega S.A., Barcelona, España. Association Of Official Seed Analysts. 2002. Rules for Testing seeds. Contribution N° 32. 89. Astudillo, L. 2005. Inducción de poliploidia en plantas del género Leucocoryne. 52p. Taller de Licenciatura Ingeniero Agrónomo. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Facultad de Agronomia. Quillota, Chile Azócar, M.P. 2006. Caracterización de la germinación y de la dormancia de las malezas acuñaticas Alisma plantago-aquatica L, Cyperus diffomis L.y Shoenoplectus mucronatus L. y su respuesta a la temperatura y luz. 53 p. Tesis Ingeniero Agrónomo.Pontificia Universidad Católica de Chile, Facultad de Agronomia. Santiago, Chile. Besnier, F. 1989. Semillas: biología y tecnología. 697 p. Mundiprensa, Madrid, España Bewley, J. 1982. Physiology and biochemistry of seeds in relation to germination. 375 p. Springer, Berlin, Germany. Botta, SM. 1993. Notas en el género Glandularia (Vervenaceae-Varevenoideae). III. Estudio taxonómico de las especies patagónicas. Paraodiana 8(1):9-36

Brauer, O. 1969. Fitogenética aplicada. 518 p. Limusa, México, D.F., México. Calvo, E. 2007. Determinación del cariotipo de Glandularia spp que crecen en Chile. 33 p. Taller de Licenciatura. Pontificia Universidad Católica de Valparaiso, Facultad de Agronomia, Quillota, Chile. Copeland, L., and M. Mc Donald. 2001. Seed science and Technology. 467p. 4th ed. Klumer Academic Publishers, Boston, USA. Cubrero, J. 1999. Introducción a la mejora genética vegetal. 365 p. Mundi Prensa, Madrid, España. Cramer, S. 1999. Laboratory techniques for determining ploidy in plants. HortTechnology 9(4):594-596

38

De la Cuadra, C. 1999. Estudios en Huilli (Leucocoryne spp): I. Efecto del tiempo de almacenaje sobre la germinación; II Descripción del crecimiento y desarrollo en la primera temporada del cultivo. 71 p. Taller de Licenciatura. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Facultad de Agronomía. Quillota, Chile. Desai, B., P. Kotecha, and D. Salunkhe. 1997. Seed Handbook: biology, production, processing and storage. 627 p. Marcel Dekker, New York, USA. Dirección Meteorológica de Chile.2007. Climas de Chile. Disponible en http://www.meteochile.cl/climas/climas.html. Leído el 25 de enero de 2008. Elliot, F. 1964. Citogenética y mejoramiento de plantas. 474 p. Continental, México. D.F., México. Escandón, A., I. Miyajima, M. Alderete, J. Hagiwara. Facciuto, D. Mata, and S. Soto. 2005. Wild ornamental germplasm exploration and domestication based on biotechnological approaches. In vitro colchicines treatment to obtain a new cultivar of Scoparia montevidiensis. Electronic Journal of Biotechnology 8(2): 205-212. Grant, V. 1989. Especiación vegetal. 587 p. Noriega Editores, México D.F, México. Gueni, O., C. Don, E. Les, y R. Calvin. 1999. Efecto de la temperatura sobre la disminución de la dureza seminal en Stylosanthes Hamaca. Ecotropicos 12(2):69-82. Hartmann, H. y D. Kester. 1995. Propagación de plantas: principios y prácticas. 760 p. 2a.ed. Continental, México, D.F., México Hernández, S. 2004. Efecto de luz, temperatura y ácido giberélico sobre la germinación de semillas de poblaciones de chile silvestre. Disponible en http://www.world- pepper.org/2004/memorias2004/441_hernandez_verdugo_wpc2004.pdf. Leído el 12 de Abril de 2007. Herrera, J., y R. Alizaga. 1995. Efecto de la temperatura sobre la germinación de la semilla de china (Impatiens balsamia) Agronomía Costarricense 19(1):79-84. Imery-Buiza, J., y H. Cequea-Ruíz 2001. Evaluación citogenética de la generación M1V2 de tetrapolides experimentales en sábila (Aloe vera L.).UDO Agrícola 1 (1):1-5 Jansen van Vuuren, P., and A.C. Lubbe. 2000. The influence of temperature on the germination off seed of a commercial Vervena hybrid. Acta Horticulturae 515:185-192 Lewis, W., and R. Oliver. 1961. Cytogeography and phylogeny of the North American species of Verbena. American Journal of Botany 48: 638-642 López, J. Gónzalez, A. Martinez, M. Imhof, L. Bañón, S. Fernández, J. Franco, J. 2003. Gladiolus italicus, especie silvestre con posibilidades de aprovechamiento para flor de corte. p. 219-228 In L. Mascarini et al. (ed). Floricultura en la Argentina, Investigación, tecnología y producción. EditorialFacultad Agronomia. Buenos Aires, Argentina

39

Maekawa, S., and W. Carpenter. 1991. Verbena seed hilum morphology contributes to irregular germination. HortScience 26(2): 129-132 Marli, A., and D. García de Santana. 2006. How and why to measure the germination process?. Revista Brasil 29(1): 1-11 Matilla, A. 2000. Germinación y dormición de las semillas. p. 435-449. In. J Azcón Bieto y M. Talón. (ed). Fundamentos de Fisiologia Vegetal.Mc Grank Hill interamericana, Barcelona, España. Mayer A.M., and A. Poljakoff-Mayber 1983. The Germination of Sedds. 211 p. 3rd.ed. Pergamon Press, Oxford. UK. Mena, C. 2007. Establecimiento de una metodología de aplicación de colchicina en Glandularia spp. 32 p. Taller de Licenciatura. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Facultad de Agronomía, Quillota, Chile. Mensah, J., B. Odoni, P. Akomeah, B. Ikhajiagbe, and J Ajibolu. 2007. The effects of sodium azide and colchicines treatments on morphological and yield traits of sesame seed (Sesame indicum L.) African Journal of Biotechnology 6(5):534-538. Mobayen, R. 1980. Germination and emergente of citrus and tomato seeds in relation to temperatura. Journal of Horticultural Science 55(3):291-297 Navas, L. 1973. Flora de la cuenca de Santiago de Chile. 509 p. Universidad de Chile, Santiago, Chile. Norha, C., C. Rodriguez, A. Bueno. 2006. Estudio de la diversidad citogenética de Physalis peruviana L.. Acta Biológica Colombiana 11(2):75-85. Ollitrault-Sammrcelli, F., J. Legave, N. Michaux-Ferriere and A.M. Hirsh. 1994. Use of flow cytometry for rapid determination of ploidy level in the genus Actinidia. Scientia Horticulturae 57(4):303-313.

Portaluppi B.S., N. Frayssinet., M. Lucero., y G. Roitman. 2005. Inducción de poliploidía en Habranthus martinezii (AMARYLLIDACEAE . s.p. In VII Jornadas Nacionales en Floricultura, Trevelin, Chubut. Argentina. 19 - 21 de octubre de 2005 Municipalidad de Trevelin, CORFO-Delegación Regional Oeste. Subsecretaria de Asuntos Agrarios. EEA, INTA, Trevelin, Chubut, Argentina. Disponible en http://www.inta.gov.ar/esquel/info/documentos/agricola/jornadasfloricultura/38habranthusmartinezzi.pdf. Leído el 25 de septiembre 2007

Riedemann, P., y G. Aldunate. 2001. Flora nativa de valor ornamental: Chile zona centro. 566 p. Andrés Bello, Santiago, Chile.

40

Rose, J., J. Kubba, and K. Tobutt. 2000. Chromosome doubling in sterile Syringa vulgaris x S. pinnatifolia hybrids by in vitro culture of nodal explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63 (2): 127-132. San Martino, L., y A. M. Beeskow . 2006. Las especies patagónicas de Glandularia: un recurso potencial para el mejoramiento de variedades comerciales del género.. Disponible en http://www.maa.gba.gov.ar/agricultura_ganaderia/floricultura/GENETICA/16%20Las_especies_patagonicas_de_Glandularia_FINAL.doc. Leído el 18 de Marzo de 2007 Sartor, M. E., F. Espinoza, y C. L. Quarin. 2004. Inducción de autoploidía en Paspalum plicatulum. s.p. In Universidad Nacional del Nordeste (ed). Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. UNNE, Resistencia (Chaco), Argentina. Disponible en http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/com2004/5-Agrarias/A-016.pdf. Leído el 26 de noviembre 2007 Thao, N., K. Ureshino, I. Miyajima, Y. Ozaki, and H. Okubo. 2003. Induction of tetraploids in ornamental Alocasia through colchicines and oryzalin treatments. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 72(1): 19–25. The Enciclopedia of seeds: science, technology an uses. 2006. 828 p. CAB International, Washington, USA Universidad Politécnica de Valencia. 2003. Germinación de semillas. Disponible en http://www.euita.upv.es/varios/biologia/Temas/tema_17.htm#Temperatura. Leído el 4 de abril de 2007

41

ANEXOS

42

Anexo 1. Curvas de germinación

0

10

20

30

40

50

60

70

13 17 20 21 22 27 30 34 37 41

Tirmpo, t (días)

Ger

min

ació

n (%

) CurvaCurvaCurvaCurvaCurvaCurva

Curva 1 fenotipo blanco 20ºC Curva 2 fenotipo rosado 20ºC Curva 3 fenotipo blanco 26ºC/14ºC

43

Curva 4 fenotipo rosado 26ºC/14ºC Curva 5 fenotipo blanco 18ºC/12ºC Curva 6 fenotipo rosado 18ºC/12ºC