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Tcnica de CGH-array
Mara Rodrguez-Rivera Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Cncer-IMIM. Barcelona
Introduccin a los microarrays
Arrays genmicos
Condiciones del ADN
Tcnica de CGH-array
Aplicaciones
ndice
Introduccin
Qu es un microarray?
Tipos de microarrays
Introduccin
Qu es un microarray?
Tipos de microarrays
Mikro (del griego,pequeo) y array (del ingls,distribucin ordenada)
Coleccin de biomolculas ordenadas en filas y columnas sobre un soporte slido miniaturizado.
Introduccin: Qu es un microarray?
Introduccin
Que es un microarray?
Tipos de microarrays
Tejido (TMA)
Protenas
Clulas
Genmicos
Expresin
miRNA
Metilacin
Introduccin: Tipos de microarrays
Tejido (TMA)
Protenas
Clulas
Genmicos
Expresin
miRNA
Metilacin
Introduccin: Tipos de microarrays
Microarrays genmicos
Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte slido que permiten detectar alteraciones en el genoma
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Array de oligos comerciales:
- Oligonucletido: secuencias pequeas de ADN 50pb
- Agilent TechnologiesTM, NimbleGen (RocheTM), BlueGnomeTM
- Diferentes formatos
- Microarrays prefabricados o custom
Array de BACs:
- BAC: Bacterial Artificial Chromosome
- Puede ser casero
- Perkin ElmerTM, BlueGnomeTM
Microarrays genmicos: Arrays de CGH
Microarrays genmicos: Arrays de CGH
Estudio de hibridacin comparativa (ADN tumoral vs ADN control) que permite detectar ganancias y/o prdidas de material gentico
Microarrays de CGH
Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Microarrays genmicos: Arrays de SNPs
Contiene adems sondas de oligonucletidos
correspondientes a variantes allicas de SNPs seleccionados
(oligoarray).
SNP ( Single nucleotide polymorphism ):
- Variacin de la secuencia de ADN que afecta a una
sola base
- 1 SNP cada 1000 bases
Microarrays genmicos: Arrays de SNPs
Permite obtener el nmero de copias de ADN y el
genotipo (seal de fluorescencia para cada alelo)
Hibridacin no competitiva:
- La muestra problema y control (si disponible) se hibridan
en arrays independientes
- Posterior comparacin de resultados
Microarrays de SNP
Microarrays genmicos: Arrays de SNPs
Prdida de heterocigosidad sin cambio en el nmero de copias (CNN-LOH)
Importancia en genes supresores de tumores:
mutacin heterocigota mutacin homocigota
Genes supresores de tumores: p53
Mutacin p53
Proliferacin clulas anormales
CGH SNP Hibridacin competitiva Hibridacin no competitiva
Muestra y control en Muestra y control se hibridan
un mismo array por separado
Ganancias y prdidas Ganancias y prdidas
LOH
CGH vs SNP
No detecta alteraciones equilibradas
No detecta diferentes clones
>30% clulas tumorales
CGH y SNP:Limitaciones
Protocolo tcnico
arrays CGH
ADN:
Sangre perifrica o mdula sea Separacin de poblaciones celulares (microbeads)
Tejido en fresco
Tejido congelado (OCT) Micro-Macrodiseccin del tumor
Parafina Micro-Macrodiseccin del tumor
Microarrays genmicos: ADN
Extraccin automatizada
Extraccin manual
Kits columnas
Kit manual
ADN: Tipos de extraccin
Extraccin automatizada
Extraccin manual
Kits columnas
Kit manual
ADN: Tipos de extraccin
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
Cantidad ADN:
500ng
Calidad ADN:
Espectofotmetro
ADN: Criterios de calidad
Espectofotmetro: NanoDrop 1000
ADN: Criterios de calidad
Ratio ADN/ARN (A260/280) > 1.80
Ratio ADN/alcoholes, fenoles (A260/230) > 1.80
Concentracin
Integridad ADN
ADN: Criterios de calidad
ADN no degradado ADN degradado (smear)
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
Marcaje del ADN
ADN tumoral
ADN control
Desnaturalizacin
Marcaje
Cy5 -dUTP Cy3 -dUTP
Marcaje del ADN
Marcaje aleatorio (Random Priming)
Marcaje del ADN
Marcaje aleatorio (Random Priming)
Marcaje del ADN
Marcaje aleatorio (Random Priming)
Marcaje del ADN
Marcaje aleatorio (Random Priming)
Preparacin del array e hibridacin (muestra y control)
Hibridacin
Muestra (Cy5)
Control (Cy3)
Hibridacin
Unimos el mixer con el array
Hibridacin: Preparacin del array
Pipeteamos la muestra dentro del mixer
Hibridacin
Horneado
Hibridacin
48-72h
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
Lavados de astringencia
Lavados y secado
Secado
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
Plataforma MS200 NimbleGen, ROCHE TM
Escaneado del array
Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
Se obtiene una imagen con la lectura de los dos fluorocromos (Cy3 y Cy5)
Se genera un archivo por cada fluorocromo para poder analizar en forma de datos
Visualizacin de datos
Anlisis
ADN tumoral > ADN control
Ganancia
ADN tumoral < ADN control
Prdida
ADN tumoral = ADN control
Normal
Software para la visualizacin de los datos
Anlisis paralelo con tablas de datos
Anlisis de datos
Software para la visualizacin de los datos
Anlisis paralelo con tablas de datos
Anlisis de datos
Anlisis de datos: Principios
Sonda
Cromosoma Ideograma Cariotipo molecular
Anlisis visual: Ejemplos
DEVA
Anlisis visual: Ejemplos
Nexus
Anlisis visual: Ejemplos
Nexus
Ganancia
Prdida
Software para la visualizacin de los datos
Anlisis paralelo con tablas de datos
Anlisis de datos
Anlisis datos: Ejemplos
N sondas: > 5 Log2 Ratio: < - 0.2 (Prdidas) > 0.2 (Ganancias)
Aplicaciones arrays genmicos
Oncohematologa Diagnstico
Pronstico
Investigacin
Post-natal y Pre-natal Sndromes asociados a ganancias/prdidas de material gentico:
Deleciones: ej sndrome de Cri-du-chat (5p-)
Aneuploidias: +21 (Sd.Down), +13 (Sd.Patau), +18 (Sd.Edwards), +X/Y (Sd.Turner, )
Alteraciones en genes asociados a retraso mental y autismo
Nuevos sndromes
Aplicaciones arrays genmicos
Estudio de carcinomas de clulas renales (CCR) mediante arrays de CGH y cariotipo N=24
16 CCR de clulas claras
5 CCR papilares
2 CCR cromfobos
1 Oncocitoma
Tejido fresco: Estudio citogentico
Extraccin ADN
Aplicaciones arrays genmicos: Ejemplos
Poster SEAP- 081. M.Salido
CCR-CC: Citogentica
45,X,add(X)(p28),der(1)t(1;1)(p36;q12),del(3)(p14),-14
CCR-CC: CGH-arrays
CCR-CC: CG vs CGH-arrays
Buena herramienta complementaria
Diferentes formatos
Limitaciones
Coste cada vez menor
Resumen
Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Cncer-IMIM. Barcelona
Agradecimientos: Dra.Blanca Espinet Dra.Marta Salido Dra.Anna Puiggros Carme Melero Dra.Silvia de Muga Dra.Nuria Juanpere Dr.Josep Lloreta Dr.Josep M Corominas Prof.Sergi Serrano
Agradecimientos: