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TÉCNICAS MODERNAS EN MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

TÉCNICAS MODERNAS EN MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

Lina María López de Ávila, MSc.Docente Escuela de Microbiología

Universidad de Antioquia

METODOLOGÍAS MODERNAS

Rápidos Inmunológicos

Moleculares Biosensores

Métodos rápidos

Cualquier método para la detección, recuento, caracterización y

subtipificación de microorganismos mediante el cual se obtienen

resultados de manera sencilla, fiable y en menor tiempo que con los

métodos convencionales.

Rapidez

Exactitud

Bajo costo

Facilidad de uso

Aceptabilidad

Medios cromogénicos y fluorogénicos

Métodos de cultivo modificados

Basados en bioquímica

Medios de cultivo cromogénicos o fluorogénicos

Enumeración de coliformes fecales y E. coli

Enumeración de microorganismos patógenos: Salmonella, L. monocytogenes, S. aureus

Sustrato: carbohidrato, aminoácido, fosfato

Cromógeno o fluorogéno: derivados de indolil o sustratos 4-metilumbeliferil

Cromógeno / fluorogéno Nombre comercial Color /fluorescencia

5-Bromo-4-cloro-3-indoxil X Azul turquesa a verde menta

5-bromo-3-indoxil Lapis™ Azul

5-bromo-6-cloro-indoxil Magenta™ Morado a magenta

6-cloro-3-indoxil Salmon™ Rosa a salmón

N-metilindoxil Green™ Verde

2-Nitrofenil ONP Amarillo

4-metilumbeliferil MU Azul (UV 365 nm)

ELF® ELF® Bajo luz UV verde (377 nm)

Sustrato Microorganismo Cromogénico Fluorogénico

β-D-glucuronido E. coli si Si

β-D-galacto-piranosido Enterobacterias, coliformes Si No

β-D-glucopiranosido Klebsiella spp, enterobacter spp. Si No

N-acetil-β-D-glucosamida Candida albicans Si Si

Myo-inositol-1-fosfato B. cereus, Listeria sp. Si Si

Fosfato S. aureus Si Si

E. Coli /Coliformes E. Coli O157:H7 Salmonella spp. S. aureus L. monocytogenes

Grupo Bacillus cereus

Chromocult BCM E. coli O157:H7 Rambach agar CHROMagar S.

aureusBBL CHROMagar

Listeria BCM

RAPID´E. coli 2Flourocult E. coli O157:H7

AgarSM ID medium S. aureus ID Agar Rapid´L. mono R&F Bacillus

anthracis agar

CHROMagar E. coli O157:H7 ID-Medium CHROMagar SMS Agar ALOA

EMX-Agar Rainbow agar O157

BBL CHROMagar Salmonella

LIMONO-Ident-Agar

TBX agar

Coli ID medium

E. coli O157:H7

No fermentación de sorbitol

No posee β-D-glucuronidasa

S. aureus

Reducción de telurito

Proteolisis albúmina

L. monocytogenes

Detección de fosfolipasa C

No fermentación de xilosa

Salmonella spp.

Detección de Caprilato esterasa y β-glucosidasa

Métodos de cultivo modificados

Indicadores de calidad

Patógenos

Número mas probable

Simplate®Tecnología de detección binaria, múltiples enzimas.Requiere menos microorganismos para generar cambios de color.

Métodos de cultivo modificados

Tempo®

Métodos bioquímicos

ImpedanciaResistencia al paso de una corriente alterna a través de un material conductor.El metabolismo microbiano cambia este parámetro eléctrico.El tiempo de detección es inversamente proporcional al numero de bacterias en la muestra.

Recuento de viables

Pruebas de esterilidad

Detección y cuantificación de

indicadores

Screening de patógenos

Monitoreo ambiental

Screening de compuestos

antimicrobianos

Bioluminiscencia

ATP indicador de viabilidad celular

Inmunoensayos

Permiten la detección de: Células intactas, toxinas, productos

metabólicos.

No permiten la diferenciación de células vivas y muertas.

Condiciones de stress generan expresiones aberrantes de antígenos.

Anticuerpos policlonales

Anticuerpos monoclonales

Resultados presuntivos

Separación inmunomagnética

Partículas magnéticas cubiertas con Ac1. La suspensión del alimento se mezcla con las

partículas magnéticas 30-60 min2. El complejo magnético es puesto en un

separador magnético.3. El complejo magnético es lavado varias veces con

un buffer para eliminar contaminantes4. Las células son eluidas para posteriores análisis.

Inmunoensayos

Sistemas de flujo lateral - inmunocromatografíaEnsayo tipo “sandwich” en una membrana porosa (nitrocelulosa)

Anticuerpo de captura

Anticuerpo de detección

Singlepath®

DuPont™ Lateral Flow System

RapidChek® SELECT

Ensayo inmunoabsorbente asociado a enzima (ELISA)

Peroxidasa – Peróxido de hidrogeno(Fenilendiamina)

Fosfatasa alcalina – P-nitrofenilfosfato

β-Galactosidasa – O-nitrofenil-B-D-galactopiranósido

Indirecta

Sandwich

Inhibición competitiva

LOCATE® Biopharm

3M Tecra™

RIDASCREEN® Campylobacter

Métodos basados en bacteriófagos

Especificidad de los bacteriófagos

IMS con proteínas recombinantes

FENOTIPO

Genes

Condiciones ambientales

Cepas particulares

Condiciones cultivo

Aplicación Ventajas Problemas

Detección directa de patógenos

No requiere cultivo Puede detectar células muertas.Inhibición por componentes del alimento.Sensible a contaminaciones en el laboratorio

Confirmación a partir de pre-enriquecimiento

Rápido y sensiblePosible automatizaciónNo se afecta por la microbiota acompañante

Caracterización de patógenos

Identifica cepas virulentas y no virulentasCaracterización múltiple

Otras aplicaciones Identificación de organismos genéticamente modificados

MÉTODOS MOLECULARES

Aspectos importantes…

1. Preparación de la muestra

Componentes del alimentos pueden afectar la sensibilidad del método.

Calcio, grasas, glicogeno, compuestos fenólicos, enzimas.

Falla en la lisis celular

Captura y degradación de ácidos nucleicos

Inhibición de la polimerasa

Eliminación de inhibidores

Filtración

Adecuada extracción de ADN

Separación inmuno magnética (IMS)

Pre-enriquecimiento de la muestra

2. Blanco molecular

Presente en la célula en alto numero de copias.Suficientemente heterólogo.

Genes RNA ribosomal (rRNA)

Genes de virulencia

Genes codificantes de toxinas

Genes involucrados en el metabolismo celular

Aspectos importantes…

3. Tipo de metodologías

Basadas en PCR

Amplificación isotérmica

Basadas en hibridación

Electroforesis en campo pulsado

Ribotyping

Microarreglos

Aspectos importantes…

Metodologías basadas en PCR

PCR tradicional

Amplificación de una secuencia blanco y visualización por electroforesis en gel de

agarosa.

Cuantificación de punto final

Posibilidad de contaminación

PCR múltiple

PCR anidada

Metodologías basadas en PCR

PCR en tiempo real

Fragmento amplificado

Sistema de detección

Cuantificación absoluta vs.

Cuantificación relativa

Metodologías basadas en PCR

Agentes fluorescentes

No específicosNo reconocen secuencias especificasUnion al ADN - Intercalantes

- Unión al surco menorLa fluorescencia aumenta con la cantidad de producto amplificado

Dímeros de primers

Curva de melting (Tm)

Curva de meltingEvaluación rango de temperaturas (60-90°C)La fluorescencia disminuye gradualmente hasta que desaparece totalmente

Agentes fluorescentes

EspecíficosSondas especificas marcadas con fluoroforos

Taqman

Molecular beacons

Scorpions

Sondas TaqMan

Sondas de hidrólisis

Actividad exonucleasa 5´de Taq polimerasa

Reportero – Quencher

TaqMan = PacMan

Molecular beacons

Sondas de hibridación en horquilla

Bucle: 18-30 pb complementario a la

secuencia blanco

Tallo: 5-7 nt complementarios entre si

5´fluoroforo

3´qencher

Primers Scorpions

Primer unido covalentemente a una sonda

Equipos

PCR en tiempo real

Sistemas comerciales

Kit Formato Bacterias Casa comercial

BAX® Convencional Salmonella, E. coli 0157:H7, L. monocytogenes, Campylobacter Qualicon

LightCycler® Foodproof Tiempo real Listeria, Salmonella, E. coli Roche

Mericon Tiempo real L. monocytogenes, Campylobacter, Salmonella QIAGEN

TaqMan® Tiempo real Campylobacter, E. coli, L. monocytogenes Applied BioSystems

IQ-Check™ BioRad

R.A.P.I.D® LT Tiempo real L. monocytogenes, Salmonella, E. coli Idahotech

RAPD (DNA polimórfico amplificado aleatoriamente)

Primers arbitrarios (10 pb) de baja astringencia

Patrón de bandeo único para cada cepa

AFLP (Polimorfismos en longitud de los fragmentos amplificados)

Metodologías basadas en PCRGenotipificación

Metodologías basadas en hibridación

FISH (Fluorescent in situ hybridization)

Identificación de rRNA con sondas marcadas con fluorocromos

Detección por epifluorescencia

Limite de detección 104 UFC/ml

Ribotyping

Reconocimiento de genes ribosomales Procariotas: 5S, 16S y 23S rRNA RFLPs de genes rRNA

1. Purificación y digestión de DNA genómico2. Electroforesis en gel de agarosa3. Southern blot

Micro arreglos

Colección de moléculas biológicas sobre soporte solido.

BIOSENSORES

Dispositivos analíticos que combinan sistemas de reconocimiento biológico con

señalización física o electroquímica.

Alta sensibilidad, selectividad y reproducibilidad

Fácil manejo, bajo costo

Corto tiempo de análisis

Resultados en tiempo real

Fácil automatización

Biosensores

Bioreceptor(Reconocimiento)

TejidosMicroorganismos

OrganelasCélulasEnzimas

AnticuerposÁcidos nucleicos

Transductor(Señal medible)

ÓpticoElectroquímicoTermométricoPiezoeléctrico

Micro mecánico

CLASIFICACIÓN