Tecnología Genotype DNA•STRIP® causadas por micobacterias Diagnóstico de laboratorio: • Coloraciones que denotan ácido resistencia • Cultivo • Técnicas de biología molecular

Tecnología Genotype

DNA•STRIP®

Infecciones causadas por micobacterias

• Género Mycobacterium: BAAR, aerobios

• Pared celular compleja: exigente desde el punto de vista

nutricional, la mayoría crecen lentamente

• Algunas especies son patógenos (intracelulares obligados) de

humanos, y otras especies oportunistas.

Enfermedades causadas por Micobacterias:

• Tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis

• Lepra: Mycobacterium leprae

• Micobacteriosis: infecciones debido a otras micobacterias

Infecciones causadas por micobacterias

Diagnóstico de laboratorio:

• Coloraciones que denotan ácido resistencia

• Cultivo

• Técnicas de biología molecular

• Las infecciones por Micobacterias son difíciles de tratar. Son

naturalmente R a varios atb y pueden desarrollar resistencia

a otros atb.

• La mayoría son susceptibles a claritromicina y rifampicina,

pero se conocen cepas resistentes a estos antibióticos.

Evaluación

Aislamiento de ADN

PCR multiplex

Hibridización reversa

Revisión de la tecnologíaDNA••••STRIP®

Tecnología DNA•Strip®

Aislamiento del ácido nucleico

AMPLIFICACION selectiva de varios fragmentos del

AN aislado utilizando primers específicos

marcados com biotinaPCR multiplex


Hibridizacion:

El DNA amplificado se coloca en la matriz de DNA•STRIP® donde se

encuentran sondas de ADN específicas

La reacción de hibridización lleva al desarrollo de

bandas visibles en la matriz del DNA•STRIP®

Evaluación

Aislamiento de ADN

PCR multiplex



Aislamiento del DNA

Aislamiento del DNA

Extracción del ADN: GenoLyse

500µl de muestra decontaminada

100µl de lisisbuffer

15 min 10.000 gDescartar sobrenadante

5 min 95°C100µl de buffer de neutralización

5 min Máxima velocidad

5µl de sobrenadantea PCR

Evaluación

Aislamiento de ADN

PCR multiplex



Amplificación por PCRpara Mycobacterium CM/AS/MTBC

Amplificación por PCRpara MTBSRplus v2.0

Evaluación

Aislamiento de ADN

PCR multiplex



Union del conjugado streptavidina -fosfatasa alcalina a la biotina de los hibridos

Tinción enzimática con el sustrato de la fosfatasa alcalina

Separación de amplicones en DNA simple cadena

Remoción del AN pegado inespecíficamente a las sondas

Pegado de los amplicones marcados con biotina a las sondas del strip

Sustrato

Desnaturalizaciónde los productos de PCR

Hibridización

Lavado astringente

Conjugado

Hibridización Reversa

Desnaturalización

Separación de los amplicones en DNAsc

(labelled, double-stranded DNA)PCR product

chemical denaturation

labelled, single-stranded DNA

Hibridización

Pegado de los productos de PCR

Son de

Membra nstreifen

45 °C

Son de

Membra nstreifen

45 °C

Sond e

Memb ranstreifen

45 °C

probe

45°C

Lavado Astringente

de productos de PCR pegados inespecíficamente

45°C

no mismatch

misma tch !

Lavado Astringente

de productos de PCR pegados inespecíficamente

Conjugado

Pegado de los complejos conjugados

conjugate

Reacción del Sustrato

Coloración enzimática

substratecolorless

substratebrown

DNA•STRIP®

Evaluación

Aislamiento de ADN

PCR multiplex



Evaluación

Linea Positiva: la intensidad es mayor o igual que la del control universal (UC).


Interpretación de Resultados

La interpretación es realizada

comparando el perfil de bandas

desarrollado en el DNA•Strip® con

un templado para evaluación



Comparación del perfil de bandas de DNA strip con el cuadro de interpretación



Utilización del polimorfismo de los genes

• Todos los ensayos DNA•STRIP® se denominan “GenoType”.

• “GenoType” porque usa el polimorfismo de la estructura genética de la Mycobacteria.

• El uso de PCR es para lograr máxima sensibilidad.

DNA•Strip® technology es principalmente usada para:

• Enfermedades asociadas al polimorfismo genético

• Diferenciación de especies microbianas

• Determinación de Resistencia antibiótica

• Diagnóstico dental: determinación de marcadores periodontopatogénicos y riesgo genético de desarrollo de periodontitis.


Aplicaciones

Material Requerido

– Cabina de seguridad Clase II

- Baño termostático

- Baño sonicador (opcional)

- Microcentrífuga

– Plataforma de agitación/TwinCubator®

– Termociclador

- Material descartable

– DNA polymerasa termoestable (hot start) con bufferIncluída en MTBDRplus v2.0

� Flexibilidad: Permite varias amplificaciones en la misma corrida

� No requiere purificación de AN (excepto en MYCO Direct)

� No requiere TB viable (excepto en MYCO Direct)

� Puede realizarse aún cuando el cultivo/muestra este contaminada

� Resultados rápidos (6 hs)

� Permite detección de infecciones mixtas

DNA•Strip® technology

Fortalezas

GenoType® Series Micobacterias

GenoType® Mycobacterium CM/AS

GenoType® MTBC

GenoType® MTBDRplus

GenoType® MTBDRsl

GenoType® Mycobacteria Direct (RNA)

Evaluación

Aislamiento de ADN

PCR multiplex


GenoType Mycobacterium CM/AS

• CM: identificación de14 especies de Mycobacterias

atípicas más comunes, y complejo Mycobacterium

tuberculosis

• AS: identificación de 16 especies de Mycobacterias atípicas

adicionales

• A partir de bacterias en medio sólido o líquido.

• No aplicable para muestras clínicas

• Controles:

� Control de conjugado (CC)

� Control Universal (UC)

� Control de género (GC)

GenoType Mycobacterium CM/AS

GenoType Mycobacterium CM

Diferenciación entre 14 especies de Mycobacterias atípicas más comunes y M. Tuberculosis complex

GenoType Mycobacterium AS

Diferenciación entre 16 especies adicionales de Mycobacterias atípicas

Evaluación

Aislamiento de ADN

PCR multiplex


GenoType MTBC

• Diferenciación dentro del complejo M. tuberculosis


• No aplicable para muestras clínicas

• Controles:


� Control Universal (UC)

� Sonda específica de MTBC

GenoType MTBC

GenoType MTBC

Diferenciación dentro del complejo M. tuberculosis

Evaluación

Aislamiento de ADN

PCR multiplex


GenoType MTBDRplus v2.0

Bases Moleculares de R en MTBC

Drug Gene Locus Gene function Percentage of

Resistance

Isoniazid katG

inhA

ahpC-Promoter

Catalase-Peroxidase

Enoyl-ACP-Reduktase

Alkyl-Hydroxid-Peroxidase

40 - 100 %

appr. 25 %

appr. 10 %

Rifampicin rpoB ß-Subunit of RNA-Polymerase

> 90 %

Pyrazinamide pncA Pyrazinamidase appr. 95 %

Streptomycin rpsL

rrs

ribosomal Protein S12

16S rRNA

appr. 60 %

appr. 20 %

Ethambutol embB Arabinosyl-Transferase appr. 60 %

Chinolone gyrA DNA-Gyrase A appr.80-90%

Aminoglycoside

Cyclic Peptide

rrs 16S rRNA No exact data

MTBDR plusMTBDR sl

Región de R a Rifampicina del gen rpoB

en MTBC

511 513 516 518 522 526 531 533

rpoB WT2 rpoB WT4 rpoB WT6rpoB WT8rpoB WT7

rpoB MUT1 (D516V)rpoB MUT3 (S531L)

rpoB MUT2B (H526D)

514 515

rpoB WT1 rpoB WT3 rpoB WT5

509508505

rpoB-Wildtype-probes: WT 1 to WT 8

rpoB-Mutation-probes: MUT D516V, H526Y, H526D, S531L

Detección de mutaciones por ausencia de señales wildtype

Detección de mutaciones por presencia de señales de mutación

Zonas de Reacción del GenoType®

MTBDRplus v2.0

Conjugate Control (CC)Amplification Control (AC)

complex (TUB)M. tuberculosisrpoB

rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB

rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB

Locus ControlWT1)WT2)WT3)WT4)WT5)WT6)WT7)WT8)

mutation probe 1 ( MUT1)MUT2A)MUT2B)

MUT3)

rpoBrpoBrpoBrpoBrpoBrpoBrpoBrpoB

rpoB rpoB

rpoB

wild type probe 1 ( wild type probe 2 ( wild type probe 3 ( wild type probe 4 ( wild type probe 5 ( wild type probe 6 ( wild type probe 7 ( wild type probe 8 (

mutation probe 2A ( mutation probe 2B ( mutation probe 3 (

katGkatGkatG katG katG

WT) mutation probe 1 ( MUT1)

MUT2)

Locus Controlwild type probe (

mutation probe 2 (

katG

katG inhAinhA inhA inhA inhA inhA inhA

WT1)WT2)MUT1)MUT2)

MUT3A)MUT3B)

colored marker

Locus Controlwild type probe 1 (wild type probe 2 (mutation probe 1 (mutation probe 2 (mutation probe 3A (mutation probe 3B (

inhA inhA inhA inhA

inhA inhA

Control de conjugado (CC)Control de conjugado (CC)Control de conjugado (CC)Control de conjugado (CC)

Debe desarrollar una línea en esta zona, documentando la eficiencia del pegado

del conjugado y de la reacción del sustrato.

Control de amplificación (AC)Control de amplificación (AC)Control de amplificación (AC)Control de amplificación (AC)

Cuando el test es realizado correctamente, el amplicón control generado durante

la amplificación se unirá a la zona de control de amplificación. Si la banda está

ausente, indica que hubo errores durante la preparación de la amplificación, o

indica la presencia de inhibidores de la PCR en el extracto de ADN. Esta banda

puede dar una señal débil.

M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis complex (TUB)complex (TUB)complex (TUB)complex (TUB)

Esta zona hibridiza con amplicones generados a partir de todos los miembros

conocidos del complejo Mycobacterium tuberculosis. Si la banda TUB es negativa,

la bacteria testeada no pertenece al complejo M. tuberculosis y no puede ser

evaluada por este test.

Sondas Sondas Sondas Sondas rpoB rpoB rpoB rpoB , , , , katG and inhAkatG and inhAkatG and inhAkatG and inhA

Estas zonas de reacción detectan la región de los genes respectivos documentando

por presencia o ausencia la resistencia a rifampicina y/o isoniazida. .Si un patrón

se desvía del patrón wild type indica resistencia de la cepa testeada.

• Evaluación de la resistencia del complejo M. tuberculosis a

Rifampicina e Isoniazida (Diferencia la R de bajo y alto

nivel)


• Muestras pulmonares con ZN + y ZN -

• Controles:


� Control de amplificación (UC)

� Control complejo MTBC (TUB)

� Control de zona del Locus para cada gen



GenoType MTBDRplus

MTBC y su Resistencia a Rifampicina y/o Isoniazida

Ejemplos de resultados

Evaluación

Aislamiento de ADN

PCR multiplex


GenoType MTBDRsl

Bases Moleculares de R en MTBC

Drug Gene Locus Gene function Percentage of

Resistance

Isoniazid katG

inhA

ahpC-Promoter

Catalase-Peroxidase

Enoyl-ACP-Reduktase

Alkyl-Hydroxid-Peroxidase

40 - 100 %

appr. 25 %

appr. 10 %

Rifampicin rpoB ß-Subunit of RNA-Polymerase

> 90 %

Pyrazinamide pncA Pyrazinamidase appr. 95 %

Streptomycin rpsL

rrs

ribosomal Protein S12

16S rRNA

appr. 60 %

appr. 20 %

Ethambutol embB Arabinosyl-Transferase appr. 60 %

Chinolone gyrA DNA-Gyrase A appr.80-90%

Aminoglycoside

Cyclic Peptide

rrs 16S rRNA No exact data

MTBDR plusMTBDR sl

Región de R a Fluoroquinolonas del gen gyrAen MTBC

gyrA WT3

gyrA MUT2

gyrA MUT3A

gyrA

gyrA

gyrA

M

M

M

UT3B

UT3C

UT3D

gyrA UT1 M

gyrA WT1

gyrA WT2

88 91 92 94

GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCCTAACCCTCGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGT

1401 1402

1484

…

…

Región de R a Aminoglucósidos/P. cíclicos del gen rrsen MTBC

WT1

WT2

306

WT

embB MUT 1AembB MUT 1B

Región de R a Etambutol del gen embBen MTBC

Conjugate Control (CC)Amplification Control (AC)

complex (TUB)M. tuberculosisgyrA (gyrA)gyrA gyrAgyrA gyrAgyrA gyrAgyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA

Locus Control WT1)WT2)WT3)

mutation probe ( MUT )

wild type probe 1 ( wild type probe 2 ( wild type probe 3 ( mutation probe 1 ( MUT1) mutation probe 2 ( MUT2) mutation probe 3A ( MUT3A) mutation probe 3B ( MUT3B) mutation probe 3C ( MUT3C)

3D 3D

rrs (rrs)rrs rrsrrs rrsrrs rrsrrs rrs

Locus Control wild type probe 1 ( wild type probe 2 ( WT2)

mutation probe 2 (

WT1)

mutation probe 1 ( MUT1)MUT2)

embB (embB)embB embBembB embBembB embB

Locus Controlwild type probe 1 (mutation probe 1A (mutation probe 1B (

WT1)

MUT1A)MUT1B)

colored marker

GenoType® MTBDRsl

Gen gyrA: resistencia a fluoroquinolonas

Gen embB: resistencia aetambutol

Gen rrs: resistencia a péptidos cíclicos y aminoglucósidos

MTBC y su resistencia a Fluoroquinolonas y/o Péptidos cíclicos y/o Etambutol

GenoType MTBDRsl

Evaluación

Purificación del ARN

Amplificación por NASBA


GenoType® Mycobacteria Direct

• Detección simultanea del complejo M. tuberculosis y de 4 especies de Mycobacterium no tuberculosis: M. avium, M. intracellulare M.malmoense, y M. kansasii

• A partir de la muestra clínica (pulmonar y extrapulmonar –excepto sangre), con ZN + ó ZN -.

• Target: rRNA de Mycobacterias

• Amplificación por reacción de NASBA

• ARN Control Interno (AC) para monitorear los pasos de extracción y amplificación.

• ARN Control Positivo incluído en el kit (*)

• Tiempo total del ensayo: ~ 4 horas



M. malmoenseM. malmoenseM. malmoenseM. malmoense

Conjugate Control (CC)Conjugate Control (CC)Conjugate Control (CC)Conjugate Control (CC)

M. intracellulareM. intracellulareM. intracellulareM. intracellulare

M. aviumM. aviumM. aviumM. avium

M. kansasiiM. kansasiiM. kansasiiM. kansasii

M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis complexcomplexcomplexcomplex

Amplification Control (AC)Amplification Control (AC)Amplification Control (AC)Amplification Control (AC)Amplificación del Control interno

GenoType® Mycobacteria DirectVentajas

• Detección simultanea de 5 especies clínicamente relevantes de mycobacterias a partir de muestras clínicas pulmonares y extrapulmonares, ZN+ ó ZN-

• Control Interno y Control Positivo

• No requiere equipos costosos: TwinCubator®, termociclador

• Admite procesar pocas muestras (4 a 24)

• Aislamiento de RNA de alto grado de pureza para prevenir inhibiciones de la reacción NASBA

• Tiempo del ensayo: 4 h

• Detección de CELULAS VIVAS → Conveniente en pacientes tratados

Geno Type Performance

Geno Type Performance

Geno Type MTBDRplus v2.0 Performance

Geno Type MTBDRplus v2.0 Performance

Automatización

GT-48-Blot® or GT-20-Blot®

Algunas publicaciones…

• AJRCCM January 2008Rapid Molecular Screening for Multidrug-Resistant Tuberculosis in a High-Volume Public Health Laboratory in South AfricaMarinus Barnard1, Heidi Albert2, Gerrit Coetzee3, Richard O’Brien2, and Marlein E. Bosman11National Health Laboratory Services (NHLS), Greenpoint, Cape Town, South Africa; 2Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), Geneva, Switzerland; and 3National TB Reference Laboratory, NHLS, Sandringham, Johannesburg, South Africa

• JCM August 2006Evaluation of the GenoType Mycobacteria Direct Assay for Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex and Four Atypical Mycobacterial Species in Clinical SamplesF. Franco-A´ lvarez de Luna, P. Ruiz, J. Gutie´rrez, and M. Casal*Microbiology Service, Reina Sofia University Hospital, and Mycobacteria Reference Center, Faculty of Medicine, Cordoba University, Cordoba, Spain

• ERJ 2008 GenoType MTBDR assays for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a meta-analysisD.I. Ling*, A.A. Zwerling* and M. PaiDept of Epidemiology, Biostatistics and Occupational Health, McGill University, and Respiratory Epidemiology and Clinical Research Unit, Montreal Chest Institute, Montreal, QC, Canada

• JCM February 2006Evaluation of the New GenoType Mycobacterium Assay for Identification of Mycobacterial SpeciesCristina Russo,1 Enrico Tortoli,2* and Donato Menichella1Microbiology Laboratory, Bambino Gesu` Hospital, Rome,1 and Regional Reference Center for Mycobacteria, Microbiology and Virology Laboratory, Careggi Hospital, Florence,2 Italy

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Tecnología Genotype DNA•STRIP® causadas por micobacterias Diagnóstico de laboratorio: • Coloraciones que denotan ácido resistencia • Cultivo • Técnicas de biología molecular