Tema 11. Herramientas de la Objetivos gen tica moleculardarwin.uvigo.es/docencia/2004/genccmar04/11.herramientas.2x1.web.pdf · Clonaci n con fago lambda Gen tica CC Mar 2004/5 ¥

Tema 11. Herramientas de lagenética molecular

Genética CC. Mar 2004-05

Genética CC Mar 2004/5 • D. Posada, Universidad de Vigo 2

Objetivos

•Técnicas de clonación•Construcción de genotecas e

identificación de secuencias•Mapas de restricción•Amplificación (PCR)•Secuenciación


Clonación molecular

• La clonación molecular consiste en hacermuchas copias de un segmento de DNA:

1. Aislar el DNA de un organismo2. Cortar el DNA en pedazos con enzimas

de restricción, y insertar cadafragmento en un vector de clonación,creando una molécula de DNArecombinante.

3. Introducir la molécula de DNArecombinante en un hospedador (p.e.,E. coli, levadura, una célula vegetal oanimal) para que éste se replique,produciendo múltiples copias idénticasde la molécula de DNA recombinantedenominadas clones.

Amplificación del DNA recombinante


Definiciones

•Enzima de restricción: enzima capaz de cortar el DNAen un lugar determinado, denominado diana o sitio derestricción.

•Diana o Sitio de restricción: secuencia de DNA,generalmente simétrica, que es reconocida por unaenzima de restricción.

•Vector de clonación: molécula de DNA artificial capazreplicarse en un organismo hospedador (p.e. en unabacteria).

•DNA recombinante: molécula de DNA creadaartificialmente a partir de fragmentos con orígenesdistintos.

•Clon: Copias idénticas de la molécula de DNArecombinante.


Enzimas de restricción• Los enzimas de restricción o

endonucleasas reconocen unasecuencia de bases específica enel DNA denominada diana ositio de restricción, y la cortanhidrolizando un enlacefosfodiéster.

• Se encuentran de forma naturalen bacterias, con funcióndefensiva.

• En muchos casos los sitios derestricción son simétricos ypalindrómicos

Restricción del sitio EcoRI.

Este sitio es simétrico y palindrómico


Diversidad de las enzimas derestricción

•400+ enzimas

•Se nombran a partir delorganismos del que fueronaisladas (en itálica), a vecesindicando la cepa, másnúmero romanos

•La mayoría reconocensitios de restricción con 4 o6 pb.

Enzimas de restricción


Corte de restricción

• Cortes romos (p.e. SmaI) o “pegajosos”(p.e. BamHI, EcoRI)

• Fragmentos cortados con una mismaenzima pueden unirse entre sí.

• Sellando los huecos con una DNAligasa, estos fragmentos producen unamolécula completa de DNA con unsitio de restricción regenerado.

• Con suficiente ligasa se pueden unirfragmentos con extremos romos

Cortes de restricciónromos (SmaI) ypeg ajosos (B amHI, PstI).

Corte y lig amientos de frag mentos conEcoRI y DNA lig asa


Otras enzimas

• DNA ligasas: catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre el5' fosfato y el 3' OH de dos nucleótidos de DNA. Se usan paraunir covalentemente cadenas de DNA.

• RNA ligasas: catalizan la formación de enlaces fosfodiéster en elRNA. Se usan para unir covalentemente cadenas de RNA.

• Fosfatasas alcalinas: eliminan grupos fosfato de los extremos 3’ o 5’del DNA.

• Quinasas polinucleótido: añaden fosfato al extremo 5’ del DNA oRNA.

• Exonucleasa: eliminan nucleótidos del extremo 3’ del DNA• Transferasa terminal: añaden homopolímeros (e.g., poli(A)) al

extremo 3’ del DNA.


Vectores de clonación

• Un vector de clonación es una molécula deDNA artificial capaz replicarse en unorganismo hospedador.– Plásmidos– Fagos– Cósmidos– Cromosomas artificiales de levaduras (YACs)– Cromosomas artificiales de bacterias (BACs)


Plásmidos

• Los plásmidos bacterianos son elementosextracromosomales circulares que se replicanautónomamente en la célula.

• Deben incluir:– Una secuencia de origen de replicación (ori)– Un marcador dominante que permita su selección– Sitios únicos de restricción, de forma que se pueda

insertar un fragmento de DNA.


Plásmido pUC19

• Permite la clonación de fragmentos de 2-3kb, y en algunos casos 5-10 kb.

• Número de copia alto (E. coli admite 100).• Gen de resistencia a la ampicilina (ampR)• Cluster de sitios únicos de restricción para

múltiples enzimas (sitio de clonaciónmúltiple o “polylinker”).

• Gen lacZ+. Cuando se clona un fragmentode DNA en este sitio, no se puede producir!-galactosidasa funcional.

Plásmido de clonación pUC19


Clonación pUC19

1. Se corta el plásmido con un enzima de restricción.2. Se corta el DNA con el mismo enzima de restricción.3. Los fragmentos DNA se mezclan con el plásmido cortado. Por azar

algunos fragmentos se insertan en el plásmido.4. El plásmido recombinante se introduce en E. coli por

transformación.5. Las colonias de E. coli se cultivan en un medio con ampicilina (sólo

crecen las que lleven el plásmido), y con X-Gal (las que poseanclones recombinantes son de color blanco; las otras azules).


Vector de clonación del fago "

• Dos brazos en los extremos con losgenes necesarios para el ciclo lítico(ciclo lisogénico eliminado).

• Segmento central prescindibledelimitado por dos sitios EcoRI.

• Acomodan unos 15 kb de DNA.• Clonación:

– Se corta vector y DNA y semezclan.

– El DNA recombinante semezcla con partes de fago paraensamblar partículas viralescompletas (DNA 37-52 kb)

– Se infecta E.coli con estaspartículas

– Replicación hasta 1010-1011

fagos/mlClonación con fag o lambda


Cósmidos

• Combinan características deplásmidos y fagos

• Sitio ori, ampR, de clonación ycos.

• El sitio cos es dónde se corta elconcatámero de múltiplesgenomas " en fragmentos de 48Kb para su empaquetamientoen las cabezas virales

• El sitio cos permite empaquetar40-45 kb de DNA en unapartícula " que se replica comoun plásmido.

Cósmido


Cromosomas artificiales de levadura(YACs)

• Permiten clonar fragmentos de hasta 500 kb.• Presentan las siguientes propiedades:

– Un telómero de levadura a cada lado (TEL)– Una secuencia centromérica de levadura (CEN)– Un marcador seleccionable (p.e., TRP1, URA3)– Una secuencia de origen de replicación (ARS)– Sitios de restricción únicos

YAC


Cromosomas artificiales de bacteria(BACs)

• Útiles para clonar fragmentos de hasta 200 kben E. coli.

• Contienen el origen de replicación de unplásmido natural denominado factor F, unsitio de clonación múltiple, un marcadorseleccionable y otros elementos.

• Pueden ser manipulados como plásmidosbacterianos normales.


Librerías de DNA recombinante ogenotecas

• Una librería genómica o genoteca es unacolección de clones que contiene al menosuna copia de cada secuencia de DNA de ungenoma.

• Estas librerías pueden ser usadas para aislar oestudiar un clon particular, por ejemplo aquélque contenga un gen de interés.

• Hay varios tipos:– Librerías cromosómicas: contienen los fragmentos

correspondientes a cromosomas individuales.– Librerías de DNA complementario (cDNA)


Construcción de librerías genómicas

• Cortar DNA genómico conenzimas de restricción yclonar los fragmentosresultantes en un vector declonación– Digestión total: muchos

fragmentos; genesinterrumpidos.

– Digestión mecánica:fragmentos mayores conextremos romos.

– Digestión parcial: poblaciónde fragmentos solapantes querepresentan todo el genoma.

Dig estión parcial para la construcción de librerías


Representación en librerías

• Los sitios de restricción se distribuyen de formaheterogénea => No todas las secuencias de un genomaestán igualmente representadas en la librería.

• El número de clones (N) necesarios para incluir conprobabilidad (P) todas las secuencias de un genomadepende del tamaño del genoma (g) y de los fragmentosclonados (f):

• P=0.99, g(levadura)=12000 kb, f=15 kb => 3682 clones.Para una librería similar, g(humano)=3000000 kb, 920000clones.

N =ln 1! P( )

ln 1!fg( )


Librerías de cDNA• Una librería o genoteca de cDNA es

una colección de clones quecontiene al menos una copia deDNA de todos los mRNAs aisladosde una célula.

• Reflejan la actividad génica de untipo de célula en un momentoparticular.

• La cola poli(A) facilita el aislamientode los mRNAs y la obtención delcDNA:

– Se empareja poli(T) a la cola poli(A)– Se extiende el poli(T) con

retrotranscriptasa; híbrido DNA-RNA– Se degrada el RNA con RNasa– Síntesis de DNA con DNA

polimerasa– DNA ligasaSíntesis de cDNA


Clonación del cDNA

• Se añade ligador (“linker”),DNA 8-12 pb., con un sitio derestricción.

• Corte restricción produceextremos pegajosos.

• Inserción en vector• Si el cDNA contiene un sitio

de restricción como el de losligadores, se utilizanadaptadores, ligadores que yaposeen extremos pegajosos.

Clonación del cDNA


Análisis de librerías de cDNA

• En librerías de cDNA sepuede localizar el clon deinterés través de la proteínaque codifica.

• Vectores de expresión:contienen un promotor yuna señal de terminaciónentre los que se inserta elfragmento clonado

• Anticuerpos específicosmarcados radiactivamenteusados como sondas.

Localización de clonesmediante anticuerpos enlibrerías de cDNA


Localización de clones en plásmidos

• Transformación E. coli enmedio selectivo

• Replicado a filtro• Incubación filtro+sonda

marcada• Revelado:

autorradiografía,quimoluminiscencia odetección colorimétrica


Localización de clones en fago "

• Fagos recen en bacteriasformando placas de lisis

• Replicado a filtro(“levantado de placa”)

• Incubación filtro+sondamarcada

• Revelado:autorradiografía,quimoluminiscencia odetección colorimétrica


Otras técnicas de búsqueda

• Por complementación de mutaciones: sebasa en la expresión del gen salvajeintroducido en células con una formadefectuosa de ese gen.

• Con sondas heterólogas: se trata deutilizar genes de otros organismo comosondas. Tiene sentido entre especiespróximas y/o genes conservados.

• Con sondas de oligonucleótidos: si seconoce algo de la secuencia aminoacídicade la proteína codificada por un gen sepueden fabricar oligonucleótidos (~20nucleótidos) para ser utilizados comosonda.

Complementaciónde mutaciones


Análisis de secuencias clonadas

• Las secuencias clonadas se utilizan paraimplementar una diversidad de experimentos,relacionados con su expresión, su estructura,o su secuencia.– Mapas de restricción

• “Southern blots”

– mRNAS: “Northern blots”– Secuenciación del DNA– Amplificación del DNA: PCR


Mapas de restricción

• Mapa de restricción:número y distribución delos sitios de restricción.1. Cortar el fragmento de DNA

con una o varias enzimas porseparado.

2. Separar los fragmentos portamaño: electroforesis

3. Inferir tamaños porcalibración con controles

4. Construir el mapa

Construcción de unmapa de restricciónpara EcoRI yB amHI para unfrag mento clonado.


Electroforesis en gel

• La técnica de electroforesis en gelconsiste en aplicar una carga eléctricaa través de una matriz porosa(almidón, agarosa) para separarfragmentos de DNA (o proteínas) deacuerdo a su tamaño y conformación.

• Los fragmentos más pequeños migranmás rápido.

• Se utilizan como controles fragmentosde tamaño conocido (“ladder”).

• Se tiñe el gel con bromuro de etidio yse visualiza bajo luz UV.

Electroforesis de DNA en g el de ag arosa


Análisis de restricción de genes noclonados

• Los mapas de restricción de un fragmentode DNA también se puede construir sinclonarlo, siempre que se tenga una sondaadecuada (p.e., cDNA, gen clonado deotro organismo):

1. Se corta el DNA genómico con diferentesenzimas de restricción.

2. Separación por electroforesis3. Se pasan los fragmentos a una membrana por

“Southern blot”.4. Se añade una sonda marcada al filtro, la cual

hibrida con los fragmentos de DNAcomplementario, indicando su posición.

En breve el gen es empapado en una soluci ón alcalina para desnaturalizar el DNA de cadena doble en DNA de cadena única. El gel es neutralizado y se coloca sobre papel secante en una bandeja con tamp ón. Encima del gel se coloca la membrana y sobre ésta se colocan varias hojas de papel secante. El tamp ón pasar á a trav és del gel y la membrana hacia las hojas de papel, dejando el DNA pegado a la membrana.

Southern blot


Análisis de mRNAs

• El análisis de los tránscritos de genes es parecido alde los propios genes:

1. Se aíslan los mRNAs de una célula.2. Se separan los mRNAs por electroforesis3. Se pasan los fragmentos a una membrana nylon por

“Northern blot” (igual al “Southern blot”)4. Se añade una sonda marcada al filtro, la cual hibrida con

mRNAs complementarios, indicando su posición.

• Este tipo de análisis es útil para estudiar los tamañosde los RNAs, su presencia, cantidad, etc.


Secuenciación del DNA

• El método más común es elmétodo didesoxi o determinación de cadena.

1. Desnaturalización DNA por calor+ Cebador

2. 4 reacciones:– DNA+cebador– DNA polimerasa– dATP+dTTP+dCTP+dGTP– ddNTP (3’OH) para la síntesis

3. Separación en electroforesis deacrilamida

4. Revelado por autorradiografía

Secuenciación de terminación de cadena

Autorradiog ramade un g el desecuenciación


Secuenciación automática

• A día de hoy este procedimiento está automatizado. Seutilizan ddNTP con diferentes colores, y los fragmentosse separan por electroforesis en una única calle que esexaminada con un láser que determina que marcadorfluorescente aparece en cada posición.


Reacción en cadena de la polimerasa(PCR)

• Amplificación de fragmentos de DNAsin clonación

• Hacen falta cebadores• Ciclos

– desnaturalización del DNA (94-95 ºC)– emparejamiento de cebadores (37-65 ºC)– síntesis DNA con Taq polimerasa (90-75

ºC)

• 2nº ciclos moléculas. 20 ciclos (100’) =1048576 copias del DNA original

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

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