PROCEDIMIENTOS PARA LA SOBREPRODUCCIÓN

MICROBIANA DE METABOLITOS

POTENCIAL GENÉTICO

La información genética de los organismos les da a éstos las características de lo que son (fenotipo) y pueden ser (genotipo). Esta información va codificada en el ADN en prácticamente todos los organismos, a excepción de algunos virus y viroides que la portan en el ARN.

En los procariotes (bacterias y arqueas), el ADN se ubica en un cromosoma en el citoplasma celular, y muchos veces también existe ADN extracromosomal(PLÁSMIDO).

POTENCIAL GENÉTICO

En general, los microorganismos aislados de la naturaleza producen metabolitos de interés industrial en bajas concentraciones, por lo tanto se hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr una mayor rentabilidad de los procesos.

Formas de mejorar el rendimiento:•Optimización del medio de cultivo y condiciones de operación, limitada por la capacidad de síntesis máxima del producto deseado que tiene el organismo. •Mejoramiento genético de la cepa.

POTENCIAL GENÉTICO

Con el organismo mejorado, se reexaminan las condiciones del cultivo para lograr nuevamente la máxima productividad.

Programas de desarrollo involucran una continua modificación genética del microorganismo, seguida por una readaptación del medio de cultivo a los nuevos requerimientos, mejoras de las condiciones de operación y de los procesos de purificación.

MEJORAMIENTO GENÉTICO

Obtención de cepas modificadas genéticamente:

• Selección natural de variantes

• Mutación inducida

• Recombinación genética.

SELECCIÓN NATURAL

• En una gran masa celular la población es heterogénea (cambios al momento de reproducirse)

• Puede presentar problemas de rendimientos (las variantes con menor nivel de producción que la población parental)

• Cambios definitivos (mutaciones) diferente a las variaciones fenotípicas (condiciones ambientales y afectan a toda la población). Son estables y hereditarios, con una frecuencia estadísticamente medible (tasa de mutación).

MUTACION ESPONTÁNEA

Cambio ocurrido en la secuencia de las bases del genoma y que se transmite a su descendencia.

• La frecuencia de mutaciones espontáneas varía entre 10-6 a 10-9 mutaciones por genoma y por generación.

• Para un valor medio de 10-7 se deberán estudiar un gran número de organismos (> 107 ) en la búsqueda del tipo deseado.

• Útil observar las características morfológicas de las colonias, para seleccionar y estudiar los clones.

• Selección de cepas: medios de cultivo para cepas mutantes resistentes a drogas, metales, etc.

MUTACION INDUCIDA

Se emplea un agente mutágeno para generar mutaciones en una población de microorganismos.

Empíricamente el empleo de diferentes agentes resulta en el aislamiento de distintos "espectros" de mutantes.

El incremento de su productividad puede ser el resultado de una modificación en los mecanismos de control que limitan el nivel de producción y/o de una variación en los precursores que llevan al producto (Aconsejable conocer las rutas y mecanismos de control de la biosíntesis del

AGENTES MUTAGÉNICOS

Físicos: luz ultravioleta (λ de 200 a 300 nm y exposición entre 0.5 y 20 minutos), tratando de lograr un porcentaje de muerte entre el 90 y 99.9%.

2) Químicos: Concentraciones del orden de 0.05 M con exposiciones de 0.5 a 12 horas.

Acido nitroso (transiciones A-T o G-C) y/o deleciones por uniones cruzadas en el interior de la cadena.

N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), potente, produce alta tasa de mutación con bajo porcentaje de mortandad.

Análogos de base. Producen transiciones, como el 5-bromuracilo y la 2-aminopurina.

Mutágenos estructurales, como la proflavina o naranja acridinaque actuán como agentes de intercalado en la estructura, promoviendo adiciones o deleciones simples durante la síntesis

MUTACION INDUCIDAMutantes con niveles mejorados de metabolitos

primarios

• Inhibición por producto final, al evitar su síntesis se elimina el control de la ruta metabólica.Productos esenciales para el crecimiento, adicionar para cubrir solo el desarrollo celular evitando la inhibición o represión. MUTANTES AUXOTRÓFICOS candidatos a cepas altamente productoras, si la mutación ocurre en el sitio correcto.Selección de auxótrofos por técnicas de enriquecimiento o mediante la identificación visual de mutantes.

• Mutantes con la permeabilidad alterada. Mutante de Corynebacterium glutamicum, con bajas concentraciones de biotina (5 mg/L) puede excretar glutamato (50 g/L) Sugiere

MUTACION INDUCIDA

Mutantes con niveles mejorados de metabolitos primarios

• Mutantes productores de enzimas de interés industrial.Mutantes productoras de enzimas en ausencia de inductor y aún

en presencia de represores. Las mutaciones pueden tener lugar en un gen regulador,

eliminando la producción de un represor activo, o si se producen en el operador, se podría evitar la unión del represor.

Los mutantes que producen enzimas inducibles en ausencia de inductor se denominan mutantes constitutivos.

¿Cómo aislarlos?

MUTACION INDUCIDA

Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos secundarios

Represión catabólica por glucosa y/o la fuente de nitrógeno (en especial amonio). La producción de cefalosporinas por Streptomyces clavuligerus se reprime por amonio.

Síntesis de metabolitos secundarios regulada por mecanismos de control genéticamente, las mutaciones pueden tener efectos importantes en el mejoramiento de cepas.

Los programas iniciales en la industria de antibióticos inducían mutaciones con éxito. Caso de la penicilina, primeras cepas de Penicillum chrysogenum producían alrededor de 20 unidades/mL, en 1980 se tienen concentraciones cercanas a 60.000 U/mL (35 mg/mL ).

RECOMBINACIÓN GENÉTICA

Programa de mejoramiento reagrupando las potencialidades de distintas variantes con el objeto de seleccionar la mejor combinación de genes responsables de codificar la producción de determinado metabolito.

Recombinación genética, proceso que genere nuevas combinaciones de genes los cuales estaban originalmente en individuos diferentes.

El intercambio de material genético entre diferentes especies puede también ser alcanzado por fusión celular. Ejemplo, obtención de hibridomas por fusión de linfocitos con células de mieloma (cáncer de piel) de ratón u otro animal.

RECOMBINACIÓN GENÉTICA

Obtención de nuevas cepas por Ingeniería Genética.

La década de 1970 marca el comienzo de la unión entre las técnicas bioquímicas para manipular el ADN in vitro con las técnicas genéticas para transferir el ADN de una célula a otra. La nueva metodología resultante conocida con el nombre de Ingeniería Genética ha revolucionado el campo específico de la Biotecnología.

A través del procedimiento de clonado de ADN, genes de cualquier tipo pueden ser tomados de su ambiente natural, analizados, alterados y reinsertados en el mismo tipo de organismo o en otro diferente.

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO

PROCARIOTASGEN ESTRUCTURAL

DNA

mRNA

TRANSCRIPCION

TRADUCCION

PROTEINA

EUCARIOTAS I1 E1 I2 I3 E2 E3 I4 E5 I6 E6 I7

DNA

TRANSCRIPCION

mRNA primario

TRADUCCION

PROCESAMIENTO

E1 E2 E3 E4 E5 E6 MENSAJERO FUNCIONAL

PROTEINA

¿Porqué utilizar bacterias?

Las bacterias tienen cuatro ventajas importantespara los “experimentos de genética de tipotradicional“:

1. Son haploides (no hay enmascaramiento)2. Cada 20 minutos se produce una nuevageneración3. Fácil para crecer en ENORMES CANTIDADES4. Los individuos de estas grandespoblaciones son GENETICAMENTE IDENTICAS.

El cromosoma de Escherichia colies único, circular y contiene cerca de 4.7 millones de pares de bases. Tiene cerca de 1 mm de longitud pero solo 2 nm de ancho.

Cromosoma deEscherichia coli

ADN CROMOSOMAL

PLASMIDO. Material genético extracromosomal

Escherichia coli

Hay TRES TIPOS PRINCIPALES de transferencia genética en bacterias:

1. Transformación – la bacteria toma ADN externo.

2. Conjugación – el ADN es transferido de una célula bacteriana a otra, vía “pili sexual".

3. Transducción – el ADN se introduce a la bacteria mediante un bacteriofago.

Transformación

Es el proceso donde la bacteria controla la toma de una parte de un ADN. Usualmente, este proceso es utilizado en el laboratorio para introducir una pieza pequeña de ADN (como un PLASMIDO) dentro de una célula bacteriana.

Proceso de transformación

Conjugación bacteriana

Es el poceso donde el ADN es transferido de una célula bacterianadonadora a una célulareceptora por contactocélula – célula. Se ha observado en muchas especiesbacterianas y es bienentendido en Escherichia coli (descubierto porJoshua Lederberg in 1951).

“Generando un mapa genético“A través del proceso de conjugación, al hacerexperimentos con diferentes tiempos de duración, es posible generar un mapa genético de de E. coli!

azi – azida de sodio; ton – fago T1

Transducción

El genoma del fago se integra en el cromosoma bacteriano en un sitio específico.