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Mecánicos
Licuadora
Sonicador
Prensa francesa
Perlas de vidrio
Arena de mar
Homogenizador
Químicos/TermicosLisis por lisozima
Lisis por Detergentes
Nitrógeno liquido
Masa (m)
Densidad de la solución (p)
Radio del tubo (r)
Velocidad angular (w- rad.s-1)
Volúmen de la partícula (V) (Vp)
PolysomesMicrosomes
Cromatografías
CM – Carboxi-metilCromatografía de intercambio catiónico
DEAE – Dietil-aminoetilCromatografía de Intercambio aniónico
-CH3-CH2-NH+(CH2CH2)2+
NaCl
Na+
Cl-
-CH2-COO-
NaClNa+
Cl-
Línea de Origen
Placa de Sílica o Celulosa
Frente del solvente
Cromatografía de capa delgada (TLC)
Metionina
Isoleucina
Leucina
Fenilalanina
Valina
Triptófano
Tirosina
SerinaAlanina
Glicina
Homocisteína
Cisteína
Origen
3H2O H+
C OH
O
O
C
COH
COH
O
O
C
COH
C H
R
COO-
H3N++ +
CO2
OC
HR+
C
O
O
C
C=N-C
O-
O
C
C + +
NinhidrinaAminoácido
Pigmento púrpura
Ninhidrina
DIALISIS
. .Eppendorf
Membrana
Vm = volúmen de la muestraCsm = concentración de sales muestraVt = volúmen tampónCst = concentración de sales tampónVT = volúmen totalCsf = concentración de sales finales.
Tiempo recomendado de 16 a 24 horas
No. de cambios Vs. Tiempo
Se trabaja a 4°C (cuarto frío)
Manejo: con guantes para evitar contaminación con proteasas, DNAsas, RNAsas
(Vm) * ([Csm]) + (Vt) * ([Cst])
VT= ([Csf])
Volúmen tampón diálisis Vs. Concentración sales
Tto.Tto.Urea ó Urea ó ββ-ME-ME
DiálisisDiálisis
Bradford – A595 nm25 – 200 µg/ml
Prot. Basicas (R)
Lowry – A660 nm5 – 100 µg/ml(Y – W – H)
BCA– A562 nm10 – 1.200 µg/ml
0.5 – 10 µg/ml(C – W – Y)
(NH4)2S2O8) Persulfato de Amonio
(PA)
C6H16N2
N`N`N`N`-Tetramethylethylenediamine
(TEMED)
% Acrilamida Resolución de Separación – kDa.
15 15 a 45
12.5 15 a 60
10 18 a 75
7.5 30 a 120
5 60 a 212
Gradientes
5 - 20 15 - 200
3 - 30 13 - 950
Coomassie Brillant Blue.Afinidad por proteínas Básicas: Lys, Arg.
AgNO3Afinidad proteínas ácidas ácido aspártico, ácido glutámico
7.4
21.9
30.2
36.3
52.2
PM1 2 3 4 5 6 7 8 9 10PM
21
30
36
52
85
MW 1 2 3 4 5 6 7
1 - 500 ng, 2 - 250 ng, 3 - 125ng, 4 - 62.5ng, 5 - 31.2ng, 6 - 15.6ng y 7 - 7.8ng.
Curva BSA (promega)
No Proteína No. Proteína
1 Pepsin 10 β-amilasa
2 Ovalbumina 11 Nicotinamida deaminasa
3 α-amilasa 12 α-ureasa
4 Albumina 13 Catalasa
5 Transferrina 14 Xantina oxidasa
6 Ovotransferrina 15 Apoferritina
7 Hexoquinasa 16 Ureasa
8 Lactato deshidrogenasa 17 Ribulosa difosfato carboxilasa
9 Cetona-1-fosfato aldolasa
37
25
15
10
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
37
25
15
10
PM 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
G1: 19 – 22 kDa G2:23 – 25 kDa
G3: 26 – 29 kDa G4: 30-36 kDa
BSA Estandarización
Proteínas de Mtb
Condiciones Corrido:
Tiempo Volts. mA Watts(2) 10 min 200V 4mA 4W(3) 10 min 450V 3mA 4W(4) 10 min 750V 2mA 4W(5) 5 min 1200V 1mA 4W(6) 5 min 1600V 1mA 4W(7) 2 hrs 2000V 1mA 4W
Equilibrar las tirillas:Equilibrar las tirillas:Buffer 4X LDS (invitrogen)Buffer 4X LDS (invitrogen)
Incubar con agitación 10 min a T. amb.Incubar con agitación 10 min a T. amb.
Condiciones Corrido: Gel 4-12% Bis-Tris (invitrogen)Gel 4-12% Bis-Tris (invitrogen)
Tiempo Volts. mA Watts50 – 55 min 200 190 - 170 38
Buffer de corrido: MES-SDS (invitrogen)Buffer de corrido: MES-SDS (invitrogen)
75
50
37
25
20
Guanidina-6M: 2D-PAGE– 200 µg (10-05-06)
Guanidina-6M: 200 µg (10-10-06) 2% SDS: 200 µg (10-10-06)
Triton 4% Fase acuosa: 200 µg (10-10-06)Triton 114 4% Fase deterg.: 200 µg (10-10-06)
75
50
37
25
20
15
10
100
150
250
75
50
37
25
20
15
10
100
150
250
75
50
37
25
20
15
10
100
150
250
75
50
37
25
20
15
10
100
150
250
1
2
3
4
5
6
+-
0rigen
Pozos
Proteínas del suero en geles de agarosa
37
49
64
82
115
180
26
19
C/ND LES/ND LES +A/NDC/D LES/D LES +A/DPM
Hemoglobina + Igs = 75% - 80%
Suero Control
Suero LES Suero LES + Anemia
2% SDS: 2D-PAGE– 200 µg (10-05-06)
75
50
37
25
20
15
10
100
150250
10090608bfrB
10090615Control 1
HsPx
10090610phoS1
10090612 Control 2
Ald (Rv2780)
Triton 4% Fase acuosa: 2D-PAGE – 200 µg (10-05-06)
75
50
37
25
20
15
10
100
150
250
1010060301rpmC
10090616Control 1
HsPx
1010060313ppiA (19 kDa) +
rplF (19 kDa)
1010060306lsr2
1010060309rplT (15 kDa) + rplR (13 kDa)
1010060311Possible HsPx
1010060303HP: Rv1738
10090613 Control 2
Ald (Rv2780)
Toma de la muestraToma de la muestra
Se corta la puntaSe corta la punta
Servilleta Servilleta BlancaBlanca
VidrioVidrio
GelGel
Eliminar todo el liquidoEliminar todo el liquidotomado con la muestratomado con la muestra
Auto-samplerAuto-sampler Capillary-HPLCCapillary-HPLC
ES-Ion Trap-MSES-Ion Trap-MS
Sheath GasSheath Gas
LC FlowLC Flow
Auxiliary GasAuxiliary Gas
ESI NeedleESI Needle
HeatedHeatedCapillaryCapillary
Tube LensTube Lens
OctapoleOctapoleEndcapEndcap
RingRingElectrodeElectrode ConversionConversion
DynodeDynode
Electron Electron MultiplierMultiplier
Workings of the Electrospray-Ion Trap Mass SpectrometerWorkings of the Electrospray-Ion Trap Mass Spectrometer
Cátodo (Cátodo (-)-)
Anodo (+)Anodo (+)
Papel de filtro (3M)Papel de filtro (3M)
GelGel
Membrana de Membrana de nitrocelulosanitrocelulosa
Proteínastransferidas
1er. Ac.2do. Ac.
Unido a laenzima
Revelado
Inmunotransferencia
ANTICUERPOS ANTICUERPOS MONOCLONALES????MONOCLONALES????
Monoclonales
VS Policlonales
Balb/c
Epitopes
Lineales
Conformacionales
De NOVO
Día= -30 -15 -3 -2 -1 0 -45
Ag + ACF Ag + AIF Ag
Desarrollos Biotecnológicos
QuiméricoFC humano/Fab murino
ximab
Anticuerpo humanizadoFC humano/
Fab Humano-murinozumab
Humano100% humano
umab
Factores variables de cadena simple
ScFv
Anticuerpos humanizados
Proteína de fusiónFC Ig/Receptor de una proteína humana
cept
Proteínas de Fusión con el Fc
Proteínas de Fusión con el Fc
Aislamiento y marcaje para su
Identificación
To be or not to be?
Anticuerpos específicos
Inhibidores TNFα
Proteína de fusión dimérica ⇒ Ligando de la porción extracelular de TNF p75 ⇒ Fracción Fc de la IgG1
Ac monoclonal quimérico 75% / 25%
Anticuerpos específicos• “Inmunoterapia Sérica”• Von Behring y Kitasato Premio Nobel• Generación de anticuerpos monoclonales
(Kohler, Milstein, Jerne)
Monoclonales murinos
Corta vida mediaInmunogénicosReacciones alérgicas
Anticuerpos recombinantesQuiméricos
Anticuerpos Humanizados
Von Behring
Kitasato
Antitoxina del tetano (1890)Descubrieron que al inyectar el suero sanguíneo de un animal afectado por el tétanos a otro, se genera inmunidad a la enfermedad en el segundo.
En 1891 trataron con suero a una niña enferma de difteria salvando su vida. Esto le hizo sospechar a Behring la existencia de unas sustancias (que llamó antitoxinas) que eliminaban las toxinas segregadas por las bacterias lo que supuso un gran avance en el conocimiento de las defensas corporales.
Por este trabajo obtuvo el primer Premio Novel de fisiología y Medicina en 1901.
Niels K. Jerne
Georges Kohler
Cesar Milstein
N. K. Jerne junto con César Milstein y Georges J.F. Kohler obtuvieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en el año 1984, por sus teorías sobre la especificidad en el desarrollo y control de los sistemas inmunitarios y por el descubrimiento del principio activo de la producción de ANTICUERPOS MONOCLONALES
Gerald Maurice Edelman ''Por sus descubrimientos de la estructura química de los anticuerpos"( compartido con Rodney Robert Porter)Premio Novel Medicina 1972
"Por su descubrimiento del principio genético para la generación de la diversidad en los anticuerpos“premio Nobel de Medicina y Fisiología en 1987
Gerald Maurice Edelman
Susumu Tonegawa
RodneyRobert Porter
