Métodos para generar y analizar diversidad:

Polinización y fertilización in vitro

Ejm: Nicotiana tabacum • 1 flor: 5 anteras: 30 000 microesporas

• 8%: 7200 plántulas

• Doble fecundación

• Interacciones (señales entre polen y tejido del pistilo)

• Polen debe adherirse, hidratarse y germinar (tubo polínico).

Polen: célula generativa (origina 2 células espermáticas •1 formará embrión (2n) • el otro el endospermo (3n)

Saco embrionario- megaespora

Fusión

Dificultades

• Limitaciones fisiológicas o genéticas

• Barreras de pre-fertilización o pre-cigóticas- superadas por la polinización in vitro.

• Problemas de fertilización- fertilización in vitro

• Barreras pos fertilización o pos-cigóticas – rescate de embriones

• Fertilización: unión de gametas

• Fin: lograr el proceso completo de desarrollo del embrión – semillas completa- plantas fértiles.

• Conocimiento de proceso de reconocimiento gamético , fusión y activación de señales intracelulares.

Polinización in vitro

• Barreras pre-fertilización

• Incapacidad de germinación de polen propio o extraño (incompatibilidad):

1.Tubo se deshace.

2.Tubo no alcanza el ovulo (lento o largo estilo).

• Aborto de ovario.

Incompatibilidad

• Esporofítica: genotipo de la planta de donde proviene el polen. (exina alélica con receptor). Produce bloqueo.

• Gametofítica: señales que desencadenan la muerte del polen, degradación de ARN del polen.

• Técnicas in vitro: para desarrollo completo por distintos métodos

• Polinización o fertilización in vitro:

P. de óvulos, P. placental, P. estigmática. P. estilo

• P. estigmática: cultivar pistilo, poner polen en estigma

P. placental: contacto del óvulos con polen, por corte en el ovario. P. óvulos aislados: se cultivan solos en medio P. estilo: grano de polen sobre un estilo compatible y luego se pone en planta deseada

• Fin: fertilización de la gameta femenina (medios con sacarosa y ácido bórico).

• Conocer: periodo florar, estigma receptivo, tiempo de polinización, recolección de polen.

Polen mentor: mezcla con polen inviable (sustancias proteicas).

Fertilización in vitro

• In vivo: doble fecundación

• In vitro: aislarse gametas, e inducir la fusión.

• Formación de embrión y endospermo individuales

• Se obtiene una planta completa y fértil

• In vitro: la fusión del núcleo espermático puede ser los polares o secundarios

1.Aislamiento y selección

a)Conocer morfología floral

b)Aislar gametas masculinas (choque osmótico, pH)

c) Gametas femeninas por microdisección, maceración enzimática

2. Fertilización in vitro: • Microinyección de C. espermáticas en C.

aisladas

• Colocadas en pares

• Medio con CaCl2 y manitol

• 48 horas se dividen las células

Electrofusión: células en contacto en cámara.

3.Fusión de gametas:

• Granos de polen por shock de pH (osmótico)

• Ovocélulas: por enzimas y microdisección manual.

Éxito del proceso

• Polen fisiológicamente desarrollado

• Conocer estadios de desarrollo de gametas.

– Antesis, dehiscencia, polinización

– Estigma receptivo

– Momento para polinización

– Polen maduro

Cultivo de óvulos y embriones

• Ovulo pequeño, hidratado, difícil manipulación

• Cruzamientos inter-específicos.

Rescate de embriones

• Aislar embriones cultivarlos en medios, para concluir desarrollo

• Mas maduros mayor sobrevivencia

Aplicaciones

• Superar barreras auto-compatibilidad y pre-cigóticas.

• Rescate de óvulos fecundados.

• Plantas resistentes a estreses ambientales.

• Producción de plantas hapolides.

• Cultivo de embriones: plantas con abortos (inconpatibilidad de endospermo) y falta desarrollo de endospermo.

• Intercambio de material

• Callo embriogénicos a partir de nucelas

• Cigotos transgénicos

• Estudios de estadios embriogénicos