TEMA 8 LOCALIZACIÓN DE ANTÍGENOS

1) TISSUE PRINTING

Aprovechando que hay membranas que absorben proteínas, usamos esta característica

para hacer una impresión de un tejido consistente.

A) Tallo de un vegetal hacemos un corte y ese corte lo puedo imprimir sobre el papel.

B) Hacemos una réplica sobre el papel, una vez realizada la impresión dejamos secar y las

proteínas se quedan en el papel, ese papel lo puedo tratar, primero saturamos con unas

proteína inespecífica incubamos con el primario luego con el secundario y puedo

localizar proteínas y saber en qué estadio del desarrollo se expresa esa proteína.

Se puede hacer con tejidos animales, podemos saber en qué zona anatómica está

expresándose la proteína, también en patógenos para seguir como avanza la

patogénesis.

Lo más habitual son las técnicas de inmunohistoquímica, vamos a utilizar 3 tipos de técnicas, las histológicas, la

inmunológica y la bioquímica para localizar un determinado Ag en un corte histológico y vamos a ver dónde se

expresa o dónde están localizados. Se localizan por la reacción con su Ab correspondiente, debemos marcar el

Ab para poderlo detectar. Se mezcla la histología (inclusión,fijar,mo) con la reacción Ab-Ag y después detectar

la marca (reacción bioquímica) además de enzimas se pueden utilizar fluoróforos o metales. Muchas veces los protocolos histoquímicos llevan un paso de fijación pero se debe saber que las fijaciones son muy

invasivas para los Ags. A veces los Ab no reconocen a los Ag después de los tratamientos histológicos a los que

sometemos las muestras después de esos cortes finos. En los casos en los que se pueda se deberá evitar la fijación.

Es crucial tener en cuenta como son las fijaciones y es mejor usar la congelación.

Los marcajes enzimáticos: normalmente son indirectos (ab secundario marcado con una enzima) cuando es directo

se marca con enzima el ab primario, el indirecto amplifica la señal, cuando queremos aumentar la sensibilidad y hay

muy poco ag , debemos amplificar al máximo porque hay muy poca señal y por eso usamos los indirectos. Los

sustratos son de 3 tipos: cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes.

Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una reacción Ag-Ac específica, en la que el complejo inmune formado se

mide por una reacción colorimétrica catalizada por una enzima acoplada químicamente a uno de los reactivos, en

presencia del sustrato adecuado.

Muchas veces nos dan KITs en los protocolos, es muy importante al principio bloquear para aumentar la

especificidad con proteínas específicas de forma que el Ab no se pegue de manera inespecífica y busque el Ag.

Tabla de diferentes sustratos cromogénicos, la peroxidasa de rábano es la enzima que más se utiliza, lo que tienen

son sustratos comerciales. Muchos tejidos los debemos teñir y debemos tener en cuenta si el producto de reacción

lleva asociado un color. Debemos tener en cuenta el precipitado del producto de la reacción para elegir un tinte y

que se haga un buen contraste.

Un problema es la baja cantidad de Ag que tenemos y con ello problema de amplificación, lo

normal es hacer un marcaje indirecto a veces debemos hacer un tercer paso que es amplificar la

señal. Para visualizar mejor muchas veces se adicionan metales. Si le añadimos plata hacemos que

los precipitados se vean muy bien (aumentan la sensibilidad de la detección) otro sistema es tener

Ab contra el enzima que vamos a utilizar. Si pueden ser Ab hechos en el mismo organismo que

tenga el Ab primario. Cuando utilicemos los Ab 2 estos al tener 2 brazos por un lado m reconocen al

primario q tengo contra el Ag y el otro al primario asociado a la peroxidasa.

Otros métodos: Biotina/avidina en rojo los Ab primarios en gris los secundarios que son usados

para amplificar. Biotinizamos los ab secundarios y usamos Avidina que tiene el enzima, utilizando

ab secundarios y el sistema este puedo conseguir un montón de ab-enzima unido covalentemente

a la avidina

Sistema ABC: El complejo abc es aquel en el que la avidina forma una red entre el enzima

biotinilado y los ab biotinilados, la avidina hace de puente entre esas moléculas biotinilados.

Uso de fluoróforos marcando los ab, se usa en inmunofluorescencia , fotobleaching se deben tener

ciertas precauciones.

Se utiliza mucho microscopia confocal que permite eliminar el ruido de la fluorescencia no

enfocada.

Si es directa IF y si es indirecta IFI y marcamos un ab2. Se puede hacer la técnica de sándwich y se

consigue ampliar la señal cuando hacemos los test indirectos. Los fluoróforos que más se utilizan:

los Alexa fluor y FITC lo importante es que los espectros no sean solapantes.

Nos permite distinguir las células beta y alfa pancreáticas, tengo que tener un marcador específico

de cada una de las células. Tengo un fluoróforo asociado a un ab contra una carboxilasa que es

específica de un tipo celular. Debemos tener otro marcador que reconozca el otro tipo de célula y

marcar con otro fluoróforo distinto.

Estos marcajes multiples permiten hacer cosas como vienen ahí, en técnicas de localización nos piden que

tengamos los controles con sueros preinmunes porque nos puede dar ruido de fondo, este control negativo me

debe servir para ver como es la fluorescencia base. Es muy importante tener los controles negativos y los positivos y

ver una diferencia clara. Para tintar usamos dapi que me sirve para orientarme en el tejido y saber donde esta

localizado mi proteína. Debemos solapar esas imágenes y ver si realmente se ha marcado en el sitio de interés.

Análisis reciente de la parte inmunológica, pruebas de autoinmunidad.

Citometro de flujo: las poblaciones celulares se pueden distinguir porque expresan

diferentes marcadores. Podemos tener anticuerpos antiCD3..

Con una población celular podemos añadir ab marcador con distintos fluoroforos y

cada uno de ellos me reconocen un marcador celular. Las células quedaran marcadas

cada una con un fluoroforo según lo que estén expresando. Nos permite el citometro

pasar las células de una en una para que las células se alineen de una en una y nos

permite determinar los fluoroforos y nos dara un resultado de las poblaciones

celulares para saber que tipos tengo.

FACs separación de las células asociadas, estos tienen unos imanes que lo que hace

es que según la fluorescencia de esta celula se va a desviar, desvia las células según la

fluorescencia que llevan asociada. Podremos recoger y separar las células según la

marca que llevan.

Conjugación con metales que se utilizan para microoscopia electrónica, hay diferentes tipos de

microoscopios electrónicos, se dividen en transmisión y barrido, según el que sea deben ser cortes

ultrafinos, en el barrido es en la superficie. Se deben conjugar los ab en una proteína que almacena

hierro que se llama ferritina, el hierro es denso al paso de electrones y acumula un atomo de hierro

en su interior y nos permite verlo al microscopio.

La distancia si importa, queremos saber exactamente donde en una celula en un

determinado orgánulo se determina un ag, en mo electrónica a veces lo que se

utilizan son fragmentos de ab. Un nanoab debemos reducir al máximo el tamaño. Se

utiliza tradicionalmente oro coloidal, son sales de oro que al reducirla forma unos

coloides.

Como unir el oro a los ab se hace de manera covalente.

Podemos seguir el procesado de un determinado ag con una forma no procesada que lleva un tamaño de oro

diferente en el mismo corte

Puentes de metileno y tb entrecruzamientos de aldehídos entre las proteinas y esto impiden q los ab

puedan actuar con los ag, se llama enmascaramiento.

Solución: recuperación de la antigenicidad y hay dos tipos de técnicas:

enzimática: las proteasas que rompen las uniones covalentes y dejan los determinantes ag otra vez expuestos

Técnicas químicas: calentar y usar unos tampones adecuados haciendo que se recupere esta actividad antigénica