MICROSCOPIA DE LUZPreparación de los tejidosLos pasos necesarios para la preparación de tejidos paramicroscopia de luz incluyen a) fijación, b) deshidratacióny aclaramiento, c) inclusión, d) corte y e) montaje y tinciónde los cortes.Se han desarrollado diversas técnicas para preparar lostejidos con el fin de estudiarlos, de tal manera que semejencuanto más su estado natural en vivo. Las etapas incluidasson fijación , deshidratación y aclaramiento, inclusiónen un medio estable, sección en cortes delgados parapoderlos observar mediante transiluminación, montajeen una superficie para facilitar su manipulación y tinciónpara diferenciar los diversos componentes tisulares y celulares.FijaciónLa fijación se refiere al tratamiento del tejido consustancias químicas que no sólo retardan las alteracionestisulares subsecuentes a la muerte (o después de su remocióndel organismo) sino que también conservan su configuraciónnormal. Los agentes para fijación usados más amenudo en microscopia de luz son formalina amortiguaday fijador de Bouin. Estas dos sustancias permiten elentrecruzamiento de las proteínas y por tanto conservanuna imagen del tejido similar al vivo.Deshidratación y aclaramientoDebido a que una gran parte del tejido está constituidapor agua, se aplica una serie gradual de baños de alcoholiniciando con alcohol al 50% y alcanzando de manerapaulatina el alcohol al 100% para eliminar el agua (deshidratación).A continuación, el tejido se trata con xileno,una sustancia química que es miscible con parafina fundida.Este proceso se conoce como aclaramiento, ya que eltejido se torna transparente en xileno.InclusiónCon objeto de distinguir entre sí las células superpuestasen un tejido y la matriz extracelular, el histólogo debeincluir los tejidos en un medio apropiado y a continuaciónseccionarlos en cortes delgados. Para la microscopia de luz,el medio habitual de inclusión es la parafina. Se coloca eltejido en un recipiente adecuado con parafina fundida hastaque se inflltra por completo. Una vez que se impregna eltejido con parafina, se coloca en un receptáculo pequeño,recubierto con parafina fundida y se deja endurecer paraformar un bloque de parafina que incluya al tejido.SecciónUna vez que se rebajan los bloques de tejido paraeliminar el material de inclusión redundante, se montan

para seccionarlos. Esta labor se lleva a cabo medianteun micrótomo, un aparato equipado con una hoja y unbrazo que desciende en el bloque de tejido en incrementosespecíficos iguales. Para la microscopia de luz, el grosorde cada corte fluctúa entre 5 y 10 pm.También es posible efectuar los cortes en especímenescongelados, sea en nitrógeno líquido o en un portamuestraspara congelación rápida en un crióstato. Estos cortes semontan con un medio para montaje de congelación rápiday se seccionan a temperaturas inferiores a cero medianteuna hoja de acero enfriada con anterioridad. Los cortes secolocan en portaobjetos de vidrio previamente enfriados,se permite que alcancen la temperatura ambiente y setiñen después con colorantes específicos (o se tratan paraestudios histoquímicos o inmunocitoquímicos ).Montaje y tinciónLos cortes de parafina se montan (colocan) en portaobjetosde vidrio y a continuación se tiñen mediante coloranteshidroso/ubles que permiten diferenciar los diversoscomponentes celulares.Los cortes para microscopia de luz convencional, seccionadosmediante hojas de acero inoxidable, se montanen portaobjetos de vidrio recubiertos con un adhesivo.Debido a que muchos constituyentes de los tejidos tienencasi las mismas densidades óptimas, deben teñirse para lamicroscopia de luz. La tinción para microscopia de luz sellevó a cabo principalmente con colorantes hidrosolubles.En consecuencia, primero es necesario eliminar la parafinadel corte, después de lo cual se re hidrata y tií'ie el tejido.Una vez teñido, se deshidrata el corte de nueva cuentade tal manera que pueda fijarse de modo permanente elcubreobjetos con un medio adecuado para montaje.El cubreobjetos no sólo protege el tejido de algún dañosino que también se requiere para observar el corte conel microscopio.Aunque existen varios tipos de colorantes para observarlos múltiples componentes de células y tejidos, puedenagruparse en tres clases:• Colorantes que diferencian los componentes ácidos ybásicos de la célula• Colorantes especializados que distinguen los componentesfibrosos de la matriz extracelular• Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y formandepósitos de metales en ellosLos colorantes empleados con más frecuencia en histologíason hematoxilina y eosina (H y E). La hematoxilinaes una base que tiñe de manera preferencial los

componentes ácidos de la célula de un color azuloso.Puesto que casi todos los componentes ácidos son ácidodesoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA), elnúcleo y las regiones del citoplasma ricas en ribosoma setiñ en de color azul oscuro; estos elementos se denominanbasofílicos. La eosina es un ácido que tiñe los componentesbásicos de la célula de color rosado. Debido a que muchosconstituyentes del citoplasma tienen un pH básico, lasregiones del citoplasma se tiñ en de color rosa; se dice queestos elementos son acidófllos. También se usan muchosotros colorantes en la preparación de especímenes paraestudio histológico (cuadro 1-1).Las moléculas de algunos colorantes, como el azul detoluidina, se polimerizan entre sí cuando se exponen aconcentraciones altas de polianiones en el tejido. Estosagregados son de un color diferente al de sus moléculasindividuales. Por ejemplo, el azul de toluidina tiñe de azullos tejidos, excepto los que son ricos en palian iones (p.ej ., matriz de cartílago y gránulos de células cebadas),que se tiñen de color púrpura. Se dice que un tejidoo un componente celular que se tiñe de color púrpuraes metacromático y que el azul de toluidina muestrametacromaSI•a .Microscopia de luzLos microscopios compuestos están constituidos por unadisposición especifica de lentes que permiten una granamplificación y una buena resolución de los tejidosobservados.En el microscopio de luz actual se utiliza una disposiciónespecífica de grupos de lentes que amplifican una imagen(fig. 1-1). Como resultado del uso de más de una lentesimple, este instrumento se conoce como un microscopiocompuesto. La fu ente de luz es una bombilla eléctricacon un filamento de tungsteno cuya luz se reúne en unhaz enfocado por la lente condensadora.El haz de luz se localiza abajo y se enfoca en el espécimen.La luz que pasa a través de este último penetra en unade las lentes del objetivo; estas lentes están asentadas una torreta movible localizada justo arriba del espécimen.Por lo general se dispone de cuatro lentes objetivos enuna torreta, que proporcionan amplificaciones baja, media,alta y con aceite. En la mayor parte de los microscopioslas tres primeras lentes suelen amplificar, cuatro, 10 y 40veces, respectivamente, y se utilizan sin aceite; la lentepara aceite amplifica la imagen 100 veces.La imagen de las lentes del objetivo se reúne y laslentes del ocular la amplifican de manera adicional. Estas

lentes aumentan la imagen en un factor de 10 - paraamplificaciones totales de 40, 100, 400 Y 1 000 y enfocanla imagen resultante en la retina del ojo.El enfocamiento de la imagen se realiza medianteperillas indentadas que mueven las lentes del objetivo haciaarriba y abajo sobre el espécim en. La perilla de enfoqueamplio las mueve en incrementos mayores que la perillade enfoque fino. Resulta de interés que la imagen que seproyecta en la retina está invertida de derecha a izquierday al revés.La calidad de una imagen no sólo depende de la capacidadde una lente para amplificar sino también de suresolución -la capacidad de la lente para mostrar quedos objetos distintos están separados por una distancia. Lacalidad de una lente depende de qué tan cerca se aproximasu resolución al límite teórico de 0.2.5 pm, una restriccióndeterminada por la longitud de onda de la luz visible.Existen varios tipos de microscopios de luz, que sediferencian por el tipo de luz que utilizan como fuenteluminosa y la forma en que la emplean. Sin embargo, lamayoría de los estudiantes de histología deben reconocersólo las imágenes obtenidas de los microscopios de luzcompuesto, electrónico de transmisión y electrónico debarrido; en consecuencia, no se comentan aquí los otrostipos de microscopios.Técnicas de imágenes digitalesEn las técnicas de imágenes digitales se empleauna computadora para capturar y manipular imágeneshistológicas.El advenimiento de la computadora proporcionó unmedio para capturar imágenes en forma digital, sin utilizaruna película. Aunque este método de captura de imágenesaún no puede competir con la tecnología fílmica, tienemuchas ventajas que la constituyen en una herramientavaliosa, por ejemplo:• Observación inmediata de la imagen adquirida• Modificación digital de la imagen• Capacidad para realzar la imagen mediante el uso deprogramas de computadora disponibles en el comercioAdemás, debido a que estas imágenes se guardan enun formato digital, es posible archivar cientos de ellas en unsolo disco CD-ROM Y su recuperación es casi instantánea.Por último, su forma digital hace posible la transmisiónelectrónica de estas imágenes mediante correo electrónicoo su distribución a través de Internet.Interpretación de cortes microscópicosUna de las habilidades más difíciles, fru strantes y

demoradas en histología es la de aprender a interpretarun corte bidimensional como si fu era tridimensional. Si seimagina una manguera para el jardín, como en la figura1-2, y a continuación se practican cortes delgados, se tornaobvio que el objeto tridimensional no necesariamentese distingue de cualquiera otra de las representacion esbidimensionales. Sin embargo, observando todos los cortesextraídos de la manguera arrollada, es posible reconstruirmentalm ente la imagen tridimensional.Procedimientos avanzadosde observaciónHistoquimicaLa histoquímica es un método de tinción de tejidosque proporciona información sobre la presenciay localización de macromoléculas intracelulares yextra celulares.Es posible localizar los constituyentes químicos específicosde tejidos y células por los métodos de histoquímicay citoquímica. Estos métodos aprovechan la actividadenzimática, re actividad química y otros fenómenos fisicoquímicosrelacionados con el elemento en cuestión. Lasreacciones de interés se tornan evidentes mediante laformación de un precipitado insoluble que toma ciertocolor. Con frecuencia, la histoquímica se efectúa en tejidoscongelados y puede aplicarse tanto en la microscopia deluz como en la electrónica.En una reacción histoquímica se utiliza el reactivoácido peryódico de Schiff (PAS ), que forma un precipitadode color magenta con moléculas ricas en glucógeno ycarbohidratos. Para asegurar que la reacción sea específicadel glucógeno, los cortes consecutivos se tratan con amilasa.Por consiguiente, los cortes no tratados con amilasamuestran un depósito magenta, en tanto que en los cortestratados no se observa tinción en la misma región.Aunque es posible localizar enzimas mediante procedimientoshistoquímicos, se observa el producto de lareacción enzimática y no la enzima en sí misma. El reactivoestá diseñado de tal manera que el producto se precipitaen el sitio de la reacción y se reconoce como un depósitometálico o de color.InmunocitoquímicaEn la inmunocitoquímica se utilizan anticuerpos marcadoscon fluoresceína y antianticuerpos para identificar unalocalización intracelular y extra celular de lasmacromoléculas más precisa de la que es posible con lahistoquímica.Aunque los procedimientos histoquímicos permiten

ubicar relativamente bien ciertas enzimas y macro moléculasen células y tejidos, es posible obtener una localización másexacta con la inmunocitoquímica. Este procedimientoexige desarrollar un anticuerpo contra la macromoléculaparticular a localizar y marcar el anticuerpo con un colorantefluorescente (fluoresceína o rodamina).Existen dos métodos de marcado con anticuerpo:directo e indirecto. En el método directo (fig. 1-3)se marca el anticuerpo contra la macromolécula con uncolorante fluorescente. A continuación se permite quereaccione el anticuerpo con la macromolécula y puede observarse el complejo resultante con un microscopio defluorescencia (fig. 1-4).En el método indirecto (fig. 1-3) se prepara un anticuerpomarcado con fluorescencia contra el anticuerpoprimario específico para la macromolécula de interés . Unavez que reacciona el anticuerpo primario con el antígeno,se lava la preparación para eliminar el anticuerpo primariono unido; en seguida se añade el anticuerpo marcadoy reacciona con el complejo antígeno-anticuerpo original,con lo cual se forma un complejo secundario visiblecon microscopia de fluorescencia (fig. 1-5). El métodoAnticuerpofluoresceinadoAntígeno indirecto es más sensible que el directo porque se unenmúltiples antianticuerpos marcados con el anticuerpo primario, cuya observación es más fácil. Además, el métodoindirecto no requiere marcar el anticuerpo primario, quemuchas veces sólo se encuentra disponible en cantidadeslimitadas .La inmunocitoquímica puede utilizarse con especímenespara microscopia electrónica si se marca el anticuerpocon ferritina, una molécula densa en electrones, en lugarde un colorante fluorescente. El marcado con fe rritinapuede aplicarse en los métodos directo e indirecto.Antianticuerpo fluoresceinado adicionado Directo Indirecto

AutorradiografíaLa a u torra diogra fía es un método en el que seincorporan isótopos radiactivos en macromoléculas, que acontinuación se observan con el uso de una película deemulsión superpuesta.La autorradiografía (radioautografía) es un métodoparticularmente útil para localizar e investigar una secuenciatemporal específica de fenómenos. El método exigeincorporar un isótopo radiactivo casi siempre tritio(3H) en el compuesto estudiado (fig. 1-6). Un ejemplo

es el empleo de un aminoácido tritiado para observar lasíntesis y agrupamiento de proteínas. Después de inyectarel compuesto radio marcado en un animal se obtienenespecímenes de tejido a intervalos de tiempo seleccionados.Se procesa el tejido en la forma usual y se coloca en unportaobjetos de vidrio; sin embargo, en lugar de sellar eltejido con un cubreobjetos, se aplica sobre él una capadelgada de emulsión fotográfica. Se coloca el tejido en unacaja oscura durante unos cuantos días o semanas, durantelos cuales las partículas emitidas del isótopo radiactivoexponen la emulsión sobre los sitios celulares en los quese localiza el isótopo. Se revela y fija la emulsión mediantetécnicas fotográficas y se dejan pequeños gránulos deplata sobre las porciones expuestas de la emulsión. Acontinuación se sella el espécimen con un cubreobjetosy se observa con un microscopio de luz. Los gránulosde plata se hallan sobre las regiones del espécimen queincorporó el compuesto radiactivo.Se usa una autorradiografía para vigilar el tiempo deincorporación de prolina tritiada en la membrana basalsubyacente a células endodérmicas del saco vitelino (fig.1-6). Se ha empleado una adaptación del método de autoradiografíade la microscopia electrónica para demostrarque la prolina tritiada aparece primero en el citosol delas células endodérmicas, se desplaza a continuación alretículo endoplásmico rugoso, después al aparato de Golgi,a continuación hacia vesículas y por último a la matrizextracelular (fig. 1-7). De esta forma se demostró visualmentela secuencia de fenómenos que tiene lugar en lasíntesis de colágena de tipo IV -la proteína principal enla lámina densa de la lámina basal.MICROSCOPIA ELECTRONICAEl uso de electrones como fuente de luz en la microscopiaelectrónica permite lograr una amplificación y resoluciónmucho mayores que las obtenidas con la microscopia de luz.En los microscopios de luz, las lentes ópticas enfocanluz visible (un haz de fotones ). En los microscopios electrónicos,los electromagnetos tienen la función de enfocarun rayo de electrones. Debido a que la longitud de ondade un rayo de electrones es mucho más corta que la dela luz visible, los microscopios electrónicos son en teoríacapaces de obtener la resolución de dos objetos separadospor 0.005 nm. Sin embargo, en la práctica la resolucióndel microscopio electrónico de transmisión (MET)es alrededor de 0.2 nm, aún más de 1 000 veces mayorque la resolución del microscopio de luz compuesto. Laresolución del microscopio electrónico de barrido

(MEB) se aproxima a 10 nm, considerablemente menorrespecto de los instrumentos de transmisión. Más aún, losmicroscopios electrónicos modernos pueden amplificar unobjeto hasta 150 000 veces; esta amplificación es lo bastantepotente para observar macromoléculas individuales comoDNA y miosina.Microscopia electrónica de transmisiónEn la microscopia electrónica de transmisión se utilizancortes mucho más delgados, en comparación con 105 de lamicroscopia de luz, para teñir 105 tejidos y se requierentécnicas de precipitado de metales pesados en lugar decolorantes hidrosolubles.La preparación de especímenes de tejido para microscopiaelectrónica de transmisión incluye las mismas etapasbásicas que las de la microscopia de luz. Se han desarrolladofijadores especiales para la microscopia de luz de transmisión,ya que el poder de resolución mayor del microscopioelectrónico requiere enlaces cruzados de proteínas másfinos y específicos. Estos fijadores, por ejemplo solucionesamortiguadas de glutaraldehído, paraformaldehído,tetróxido de osmio y permanganato de potasio, nosólo preservan los detalles estructurales finos sino quetambién actúan como colorantes electrodensos, que permitenobservar el tejido con el haz de electrones.Puesto que estos fijadores penetran en tejidos frescos,incluso en los que se emplean para la microscopia de luz,se infiltran piezas relativamente pequeñas de tejidos engrandes volúmenes de fijadores. Los bloques de tejidopara microscopia electrónica de transmisión no suelen sermayores de 1 mm3 Se han creado medios de inclusiónadecuados, como la resina epóxica, de tal modo que pue-den cortarse los tejidos incluidos en plástico en cortesextremadamente delgados (ultradelgados) (25 a 100 nm)que no absorben el haz de electrones.Los haces de electrones se generan en una cámara devacío mediante calentamiento de un filamento de tungsteno,el cátodo. A continuación se atraen los electrones alánodo de carga positiva, una placa metálica en forma derosquilla con un agujero central. Con una carga diferencialde alrededor de 60 000 voltios colocada entre el cátodoy el ánodo, los electrones que pasan a través del agujeroen el ánodo tienen una alta energía cinética.Se enfoca el haz de electrones en el espécimen medianteelectro magnetos, que son análogos a las lentes condensadorasde un microscopio de luz (fig. 1-1). Debido a que eltejido está teñido con metales pesados que se precipitan demanera preferencial en membranas lípidas, los electrones

pierden parte de su energía cinética a medida que interactúancon el tejido. Cuanto más pesado sea el metalque encuentra un electrón, menos energía retendrá elelectrón.Los electrones que salen del espécimen se someten alos campos electromagnéticos de varios electro magnetosadicionales, que enfocan el haz en una placa fluorescente. Amedida que los electrones chocan con la placa fluorescente,se convierte su energía cinética en puntos de luz, cuyaintensidad es una función directa de la energía cinética delelectrón. Es posible llevar a cabo un registro permanentede la imagen resultante sustituyendo la placa fluorescentecon una película sensible a electrones y produciendo unnegativo a partir del cual pueden imprimirse una fotomicrografíaen blanco y negro.Microscopia electrónica de barridoLa microscopia electrónica de barrido proporcionauna imagen tridimensional del espécimen.A diferencia de la microscopia electrónica de transmisión,la de barrido se usa para observar la superficie deun espécimen sólido. Con esta técnica es posible ver unaimagen tridimensional del objeto. Por lo general, el objetoque se observa se prepara en una forma especial quepermite depositar en la superficie del espécimen una capadelgada de un metal pesado, como oro o paladio.Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas ___ 9A medida que el haz de electrones explora la superficiedel objeto, se reflejan algunos (electrones retrodispersos):' se expulsan otros (electrones secundarios) desde lacapa de metal pesado. Los electrones retrodispersos ysecundarios son capturados por detectores de electronesy se interpretan, comparan y muestran en un monitor comouna imagen tridimensional (fig. 1-1). Es posible representaruna imagen permanente fotografiándola o digitalizándolapara guardarla en una computadora.Técnica de fractura por congelación(criofractura)La estructura macromolecular de las superficies internasde la membrana se revela mediante el método defractura por congelación o criofractura (fig. 1-8).Los especímenes congelados con rapidez que se trataronmediante criopreservadores no form an cristales de hielodurante el proceso de congelación; en consecuencia, eltejido no sufre un daíio mecánico. A medida que chocaen el espécimen congelado una hoja de corte sumamentefría, fractura a lo largo de planos de segmentación, queson regiones de menor unión molecular; en las células la

fractura ocurre con frecuencia entre las hojas interna yexterna de la membrana.La cara de la fractura se recubre en un ángulo medianteplatino y carbón evaporados; con ello se forman acumulacionesde platino en un lado de una proyección pero no enel lado opuesto cerca de la proyección, generando así unaréplica de la superficie. A continuación se digiere el tejido)' se examina la réplica mediante microscopia electrónicade transmisión. Este método permite mostrar las proteínastransmembranales de membranas celulares (fig. 1-8) .