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TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS

El dogma central de la biologa molecular y el flujo de la informacin gentica

Transcripcin Traduccin

DNA RNA PROTEINA

Funciones del RNA

a) Material gentico: puede replicarse y retrotranscribirse a DNA. Ejemplos, virus del mosaico

del tabaco y retrovirus.

b) Funcional: RNA ribosmico (rRNA), transferente (tRNA) y otros. No se traducen y

constituyen productos finales de la expresin gnica; regulatoria y catlisis.

c) Informativa: RNA mensajero (mRNA). Se traduce a protenas.

Molculas de RNA en E.coli

Tipo Cantidad relativa (%) Coeficiente de

sedimentacin (S)

Masa (kDa) Nmero de

nucletidos

RNA ribosmico

(rRNA)

80 23

16

5

1.2 x 103

0.55 x 103

3.6 x 101

3700

1700

120

RNA de

transferencia (tRNA)

15 4 2.5 x 101 75

RNA mensajero

(mRNA)

5 Heterogneo

COMPARACION ENTRE REPLICACION Y TRANSCRIPCION

SIMILITUDES

FENOMENO PROCESIVO

POLARIDAD 53

SE UTILIZA COMO MOLDE UNA CADENA DE DNA

COMPLEMENTARIDAD DE BASES

DIFERENCIAS

REPLICACION TRANSCRIPCION

ADN POLIMERASA ARN POLIMERASA

dATP, dGTP, dCTP y dTTP ATP, GTP, CTP y UTP

TODO EL CROMOSOMA UNO O POCOS GENES

UNA RONDA POR CICLO VARIOS ARN POR GEN EN CADA CICLO

DOS CADENAS UNA CADENA

CON CEBADOR SIN CEBADOR

ACTIVIDAD CORRECTORA SIN ACTIVIDAD CORRECTORA

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Reaccin catalizada por la RNA polimerasa

Los tres tipos de RNA celular en E.coli son sintetizados por la misma RNA

polimerasa segn las instrucciones dadas por un DNA molde.

REACCION GLOBAL

RNA polimerasa

(NMP)n+ NTP (NMP)n + 1+ PPi

RNA RNA alargado

La RNA polimerasa de E. coli requiere los siguientes componentes para la

sntesis de RNA:

1)

Un molde. Preferentemente es un DNA de doble cadena. Tambin

puede servir como molde un DNA monocatenario.

2) Precursores activados. Se requieren los cuatro nuclesidos trifosfato;

ATP, GTP, CTP y UTP.

3) Un in metlico divalente. Son eficaces el magnesio y el manganeso.

La RNA polimerasa cataliza la iniciacin y la elongacin paso a paso de

las cadenas de RNA.

Mecanismo de la reaccin catalizada por la RNA polimerasa

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Composicin de la RNA polimerasa

Es un enzima con un peso molecular de unos 500 kDa formado por cinco clases de

subunidades. La composicin subunitaria del enzima completo, llamado holoenzima, es

2

70

y .

Subunidades de la RNA polimerasa de E. coli

Diferentes Factores reconocen promotores con diferentes secuencias consenso

Funciones de la RNA polimerasa.

a) Localiza en el DNA los centros de iniciacin.

b) Desenrrolla un tramo corto del DNA helicoidal para producir un molde de DNA de

un solo filamento, del cul tomara instrucciones.

c) Selecciona un ribonuclesido trifosfato correcto y cataliza la formacin de un

enlace fosfodister.

d) Localiza las seales de terminacine) Interacciona con las protenas activadoras y represoras que modulan la velocidad

de transcripcin.

Subunidad Gen Nmero Masa (kDa) Funcin

Rpo A 2 37 Iniciacin de la cadena, interaccin con las protenas

reguladoras y elementos promotores corriente arriba

Rpo B 1 151 Iniciacin y elongacin de la cadena, forma enlaces

fosfodister

Rpo C 1 155 Unin al DNA

70 Rpo D 1 70 Reconoce al promotor e inicia la sntesis

1 11 Desconocida

Gen Masa (kDa) Uso Secuencia - 35 Separacin Secuencia - 10

rpoD 70 General TTGACAT 16-18 pb TATAAT

rpoH 32 Choque trmico CCCTTGAA 13-15 pb CCCGATNTrpoN 54 Nitrgeno CTGGNA 6 pb TTGCA

fliA 28 Flagelar CTAAA 15 pb GCCGATAA

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Tecnica de huellas dactilares con DNasa I como herramienta para identificar los

lugares del DNA que unen protenas especficas.

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Estudios del promotor

Promotor A3 de T7

Promotor A3 de T7

- resistentes a la metilacin

- ms vulnerables a la metilacin

- * purinas metiladas que interfieren con la unin

- contactos de fosfatosLas dos regiones conservadas estn

separadas por dos vueltas de hlice

Identificacin de los residuos G que contactancon la RNA polimerasa en el promotor deltriptfano de E. coli

La RNApolimerasa de E.coli unida al DNA. Por

conveccin, el sitio de iniciacin de la transcripcin sueleanotarse +1. Los pares de bases que se extienden en ladireccin de avance de la transcripcin se dice que estncorriente abajo del sitio de inicio; los que se extienden

en la direccin opuesta estn corriente arriba. Lasubunidad

70 se une a secuencias especficas cerca de las

posiciones -10 y -35 en el promotor. Las subunidades se

ubican cerca del DNA en direccin corriente arriba. Lassubunidades y se asocian con el sitio de inicio.

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Visin general del proceso de transcripcin

La Sntesis de RNA comienza en los promotores y los acontecimientos ms importantes son:

Fase de Iniciacin:

a)

Unin a los sitios de iniciacin en el DNAb) Comienzo de la transcripcin

c) Desalojo del promotor

1 Unin de la RNA polimerasa al DNA y migracin hacia un lugar de iniciacin.

2 - Formacin de complejo promotor cerrado

- Complejo dbil Ka = 107108M-1

- Vida media de unos 10 seg- Unin de tipo electrosttico

(dependiente de la fuerza inica)

3 - Formacin de un complejo promotor abierto

-Se desenrolla el DNA desde 10 a + 1

-Complejo estable Ka = 1012M-1

-Estable al aumento de la fuerza inica

-Depende de la temperatura

-Isomerizacin dependiente de Mg

2+

,( aumenta la abertura desde 12 a + 2)

4 - 2 centros para la fijacin de NTP

- Iniciacin: especfico para nucletidos purnicos

semisaturacin 100 M

- Elongacin: semisaturacin 10 M

5 - Comienza la sntesis de RNA con una purina

- Direccin 53

- La mayor parte de las iniciaciones son abortivas

(complejos inestables?)

- Despus de la transcripcin de unos 10 nucletidos

se elimina la subunidad . Queda un complejo

estable y comienza la fase de elongacin.

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Fase de elongacin

BURBUJA DE TRANSCRIPCION

La fase de elongacin de la transcripcin comienza despus de la

formacin de unos pocos (9-10) enlaces fosfodister y la eliminacin de la

subunidad .

Modelo de una burbuja de transcripcin durante la elongacin del

transcripto de RNA. El DNA dplex se desenrolla en el extremo anterior dela RNA polimerasa y se rebobina en su extremo posterior. La hlice hbrida

RNA-DNA gira sincrnicamente.

Se han calculado las longitudes del DNA desenrollado y del hbrido

DNA-RNA a partir de las reactividades de los complejos de transcripcin

con reactivos como el KMnO4, que oxida las bases en los cidos nucleicos

de cadena simple. Mediante la tcnica de la huella se determina la longitud

del DNA en contacto con el enzima. Seis o siete nucletidos del RNA

detrs del DNA hbrido estn protegidos del ataque de la ribonucleasa

mediante su unin al enzima.

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Retroceso de un complejo de elongacin

Actividad RNasa intrnseca a la RNA pol. Protenas GreA y GreB

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Seales antiterminacin

N Protena codificada por el fago que impide la terminacin de la transcripcin

NUT(N-utilization) secuencia especfica entre el promotor y el sitio de terminacin

a) Un tallo asa (horquilla) llamado caja Bque interacta con N

b) Una secuencia lineal de unos 12 nucletidos llamada caja A, que interacta con

Nus B y S 10NUS(N-utilization substances) protenas celulares para la utilizacin de N

a) NUS Afactor de elongacin

b) NUS B ?

c) NUS E(S 10)protena de la subunidad pequea del ribosoma

d) NUS G?

Antiterminacin por la protena N del fago y protenas celulares de E. coli. Despus de

que se reconoce la caja del sitio Nut y se une a ella, la protena N interacta con el complejo

Nus A-polimerasa. La posterior fijacin rpida de Nus B, Nus G y S 10 produce un complejode antiterminacin estabilizado por mltiples contactos protena-protena. Mientras la

polimerasa se desplaza alo largo del molde de DNA alejndose del sitio Nut, de manera que

se forma un asa de RNA de tamao cada vez mayor. El complejo impide la terminacin, y la

transcripcin prosige. Se muestra la inhibicin de la accin de terminacin del factor

hexamrico; la antiterminacin tambin se produce en sitios independientes.

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INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCION

Rifampicina. Antibitico que inhibe la RNA polimerasa in vitro y bloquea la sntesis de

RNAr, RNAt y RNAm in vivo

-amanitina. Toxina contenida en la seta venenosa Amanita. Inhibe las RNApolimerasas eucariotas II y III, pero predominantemente la RNA polimerasa II

Cordicepina. Terminador de cadena de la transcripcin, el nucletido de la cordicepina

se incorpora a la cadena en crecimiento y esta se para, ya que carece del grupo 3 OH a

partir del cul continuar

Actinomicina D. Se une al DNA intercalandose entre los pares de bases G-C

adyacentes y los brazos del polipptido cclico llenan el surco estrecho prximo.

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Modificaciones post-transcrpcionales de los RNA ribosmicos y transferentes.

Procesamiento de transcritos de pre-rRNA en bacterias

-Siete copias en el genoma de E. coli. Difieren en nmero, localizacin e identidadde los tRNA incluidos en el transcrito primario.

Bases

1 RNasa III2 RNasa P

3 RNasa E

Nucleasas especficas

Promotores

Opern

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Modificaciones postranscripcionales de los tRNA en bacterias

Escisin y modificacin qumica

- Precursores mayores; transcriptos que poseen de uno a siete tRNA -

1- Endonucleasacorta por el lado 3.

2- RNasa D, exonucleasa, hasta dos nucletidos de la secuencia CCA- 3

3- RNasa P, genera el extremo 5

4- RNasa D, elimina los dos nucletidos del extremo 3, genera la secuencia CCA- 3

4a- Nucleotidil transferasaaade el trinucletido CCA al extremo 3, si ste est ausente

5- Modificacin enzimtica de las bases: pseudouridinas, 2 isopenteniladenosina,

o2-metil guanosina, 4-tiouridina, etc.

Maduracin del tRNAtyr

de E. coli

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Mtodo de extensin del cebador para localizar el extremo 5 de un transcrito

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15/17

Mtodo de cartografiado con nucleasa S1 para identificar el extremo 5 de un RNA

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MAXAM GILBERT

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SANGER